Klamra krosowa całej komórki do badania mechanizmów stymulacji neuronalnej w podczerwieni

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest stworzenie systemu modelowego do badania wpływu oświetlenia laserowego w podczerwieni na neurony słuchowe in vitro. Osiąga się to poprzez zaciskanie łat, hodowlę neuronów słuchowych w całej konfiguracji komórkowej w celu zbadania ich charakterystyki elektrycznej. Następnie, wystawienie neuronów na promieniowanie laserowe może wywołać reakcje elektryczne w odsłoniętej komórce, które można zmierzyć za pomocą zestawu zacisków krosowych.

Parametry oświetlenia i zmienne środowiskowe mogą być następnie zmieniane, aby obserwować ich wpływ na reakcje elektryczne indukowane laserem. Neurony słuchowe wystawione na działanie światła laserowego będą wykazywać powtarzalną aktywność elektryczną w odpowiedzi na każdy impuls laserowy do późniejszej analizy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów leżących u podstaw stymulacji neuronów zwojowych spirali w podczerwieni.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w stymulację w podczerwieni komórek spiralnych zwojów, można ją również rozszerzyć na inne typy komórek lub uproszczone modele, takie jak dwuwarstwy lipidowe, aby dokładniej wyjaśnić procesy fizyczne, które są zaangażowane. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, aby zapewnić dokładne pozycjonowanie światłowodu dostarczającego światło, ponieważ wynikająca z tego ekspozycja na promieniowanie jest parametrem krytycznym, Przygotuj mikropipety rejestrujące o rezystancji od dwóch do sześciu megaomów. Można je wyciągnąć z pożyczonego szkła krzemianowego za pomocą ściągacza laserowego CO2.

Przygotuj laser sprzężony ze światłowodem. Sprawdzi się szeroka gama światłowodów. Przecięcie światłowodu w konfiguracji krosowego ze złączami FCPC na pół tworzy dwa ogniwa światłowodu ze złączem na jednym końcu i odsłoniętym włóknem na drugim końcu.

To są warkocze. Przygotuj końcówkę niedźwiedzia jednego warkocza, zdejmując osłonę z włókna, czyszcząc etanolem i rozłupując odpowiednim narzędziem pod mikroskopem. Sprawdź, czy końcówka jest prostopadła do osi światłowodu i czy wydaje się płaska.

Podłącz drugi koniec warkocza światłowodowego do wyjścia lasera stymulacyjnego za pomocą odpowiedniego złącza przelotowego, jeśli to konieczne. W tym momencie zawsze należy zmierzyć moc wyjściową lasera ze światłowodu. Zrób to również po dalszych manipulacjach końcówkami.

Teraz włóż włókno do uchwytu i przymocuj uchwyt do odpowiedniego mikropozycjonera. Następnie określ kąt, jaki światłowód tworzy za pomocą szkiełka nakrywkowego. Zrób zdjęcie układu i oblicz kąt za pomocą obrazu J.Teraz zabezpiecz połączenia, które synchronizują laser z systemem akwizycji danych o zacisku krosowym.

Wyjście cyfrowe z systemu akwizycji danych patch clamp powinno być podłączone do lasera za pomocą zewnętrznego generatora funkcyjnego, umożliwiającego określenie parametrów impulsu laserowego niezależnie od systemu akwizycji danych, sygnał używany do wyzwolenia lasera powinien być podłączony z powrotem do wejścia systemu akwizycji danych, aby zapewnić, że czas i długość impulsów laserowych mogą być rejestrowane jednocześnie z sygnałem elektrofizjologicznym, Ustaw natężenie przepływu systemu perfuzyjnego na od jednego do dwóch mililitrów na minutę. Sprawdzi się system zasilany grawitacyjnie z wbudowaną grzałką do szybkiego podgrzewania roztworu i pompą perystaltyczną do usuwania zużytego roztworu przez zasysanie. Studnia. Umieść szkiełko nakrywkowe z hodowanymi komórkami w komorze zapisu mikroskopu pionowego, używając obiektywu zanurzeniowego w wodzie o dużym powiększeniu i kontrastu fazowego, zlokalizuj spiralny neuron zwojowy.

Typowy neuron spiralnego zwoju jest fazowany jasnookrągły i ma średnicę około 15 mikronów z wyraźnym jądrem. Po zlokalizowaniu odpowiedniego neuronu przełącz się na obiektyw o mniejszym powiększeniu i zlokalizuj neuron docelowy. Następnie użyj mikropozycjonera, aby przesunąć światłowód, aż końcówka zbliży się do docelowego neuronu zarówno w płaszczyźnie poziomej, jak i pionowej.

Przełącz się z powrotem na obiektyw o dużym powiększeniu i ustaw końcówkę światłowodu w przeznaczonej pozycji obok neuronu. Podczas regulacji pionowego położenia włókna ważne jest, aby dolna krawędź włókna spoczywała na wardze pokrywy. Aby zminimalizować niepewność co do lokalizacji światłowodu, punkt styku można zidentyfikować na podstawie wskazówek wizualnych na obrazie mikroskopowym.

Gdy włókno znajdzie się na swoim miejscu, należy je wysunąć o znaną ilość wzdłuż jego osi podłużnej, aby nie wpływać na położenie mikropipety. Mikropipeta powinna być wypełniona roztworem wewnątrzkomórkowym i bezpiecznie zamocowana na miejscu na głównym stopniu wzmacniacza. Używając rurki przymocowanej z boku uchwytu mikroelektrody, zastosuj niewielkie nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu mikropipety.

Za pomocą manipulatora mikrom przesuń mikropipetę na pozycję tuż nad docelowym neuronem i przystąp do wykonania gigaomowego uszczelnienia. Zapisz rezystancję szeregową pojemności membrany i rezystancję wejściową wyznaczoną na podstawie krzywej wykładniczej dopasowanej do prądu. Podczas impulsu testowego uszczelnienia.

Zminimalizuj przejściowy stan nieustania pojemności, regulując szybkie i wolne CP na amplifier. Następnie przełącz wzmacniacz w tryb całego ogniwa i zmodyfikuj kompensację pojemności i rezystancji, aż podczas testu SEAL zostanie zaobserwowany płaski prąd. Następnie zastosuj kompensację rezystancji szeregowej z około 70% korektą, 70% przewidywaniem, dostosowując elementy sterujące pojemnością i kompensacją rezystancji, aby utrzymać płaską reakcję uszczelnienia testowego.

Następnie przełącz wzmacniacz w tryb cęgów prądowych. Zwróć uwagę na spoczynkowy potencjał błony w przypadku braku wtrysku prądu. Teraz ustaw prąd podtrzymujący, aby ustabilizować potencjał membrany na żądanym poziomie.

Zneutralizuj pojemność pipety i wyreguluj balans mostka, aby zrównoważyć spadek napięcia. Sprawdź właściwości wypalania neuronu, stymulując go prądem depolaryzującym. W tym momencie przesuń światłowód z powrotem na miejsce obok neuronu za pomocą oprogramowania do obrazowania sprzężonego z kamerą CCD, przechwytując obrazy początkowo skupione na płaszczyźnie neuronu, a następnie skupione na górnej krawędzi światłowodu.

Przeanalizuj obrazy, aby określić wartość delta, czyli położenie górnej krawędzi światłowodu względem środka docelowego neuronu. Bardzo ważne jest, aby dokładnie znać położenie światłowodu. Dzieje się tak, ponieważ energia na jednostkę, obszar lub ekspozycja na promieniowanie dostarczana do komórki docelowej jest krytycznym parametrem stymulacji neuronalnej w podczerwieni, a na to może mieć znaczący wpływ położenie włókna względem komórki.

Moc optyczna tego lasera jest kontrolowana przez komputer za pośrednictwem bezpośredniego wejścia do lasera i może być określana ręcznie przed każdym nagraniem. Długość impulsu i częstotliwość powtarzania można kontrolować za pomocą generatora funkcyjnego, jak opisano wcześniej, upewnij się, że dane są rejestrowane zarówno z kanału zacisku krosowego, jak i kanału wyzwalania lasera od połowy do 15 milisekund impulsów laserowych przy 0,25 do pięciu. Milidżule zazwyczaj dają mierzalne odpowiedzi elektryczne. Początkowo.

Przydatne może być ustawienie częstotliwości powtarzania impulsów laserowych na jeden herc lub mniej, aby zminimalizować niepożądane efekty. Po ustawieniu wszystkich parametrów lasera. Kontynuuj zbieranie danych.

Neurony zwojów spiralnych reagują na oświetlenie laserowe powtarzalnymi kształtami fal zarówno w cęgach napięciowych, jak i cęgowych prądowych Konfiguracje nagrywania w odpowiedzi na impulsy laserowe o długości 2,5 milisekundy i mocy 0,8 milidżuli. Typowe ogniwo wytwarza prąd wewnętrzny netto o różnych potencjałach utrzymywania. Obecne zapisy cęgów pokazują stałą depolaryzację membrany w trakcie tych impulsów laserowych, po której następuje w przybliżeniu wykładniczy spadek w kierunku spoczynkowego potencjału błony po impulsie.

W niektórych przypadkach występuje również niewielka dodatkowa depolaryzacja membrany po impulsie laserowym. Oświetlenie nadmierną energią lub wystawienie na duży wzrost temperatury może spowodować uszkodzenie komórek obserwowane poprzez pogorszenie właściwości elektrycznych ogniw lub natychmiastową śmierć komórki. Postępując zgodnie z tą procedurą, można zmieniać szereg parametrów środowiskowych, takich jak temperatura roztworu lub czynniki chemiczne, aby przetestować ich wpływ na aktywność elektryczną indukowaną laserem.

Nie zapominaj, że praca z laserami może być niebezpieczna i należy wprowadzić standardowe środki ostrożności. Należą do nich używanie laserowych okularów ochronnych, znaków ostrzegawczych i upewnienie się, że wiązka nie przecina się przypadkowo z żadnymi silnie odbijającymi światło powierzchniami.