Name: Klamra krosowa całej komórki do badania mechanizmów stymulacji neuronalnej w podczerwieni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę klamry krosowej całej komórki do badania stymulacji neuronalnej w podczerwieni u neuronów słuchowych. Technika ta pozwala mierzyć odpowiedzi elektryczne na impulsy laserowe i analizować wpływ parametrów oświetlenia na aktywność komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych w ramach grantu Linkage Project LP120100264.

1. Kultura neuronów spiralnych zwojów
<ol>
	<li>Sterylizuj małe okrągłe (np. o średnicy 10 mm) szklane szkiełka nakrywkowe i zakrzywione kleszcze w autoklawie. Przenieść wysterylizowane szkiełka nakrywkowe do pojedynczych dołków sterylnej 4-pierścieniowej płytki Petriego 35 mm lub 4-dołkowej płytki, używając wysterylizowanych kleszczy. Nanieść 150 μl poli-L-ornityny (500 μg/ml) i mysiej lamininy (0,01 mg/ml) na wierzchnią powierzchnię szkiełka nakrywkowego i umieścić w inkubatorze (37 °C) na maksymalnie 48 godzin. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe nie odpływają od dna studni.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml sterylnych pożywek neuropodstawowych (NBM) dla każdej hodowli nerwowej: 47,5 ml neurobazalu A, 0,5 ml suplementuN2, 1 ml suplementu B27, 0,5 ml L-glutaminy i 0,5 ml penicyliny-streptomycyny. Uwaga: Suplementy można zamrażać, przechowywać w temperaturze -20 °C i dodawać do podłoża w wymaganym dniu.</li>
	<li>Dysocjacja neuronów spiralnych od 4-7 dni po urodzeniu szczeniąt szczurów, jak opisano wcześniej 20,21, przy użyciu zarówno technik enzymatycznych (0,025% trypsyny i 0,001% DNazy I), jak i mechanicznych. Patrz Whitlon i wsp. 22 oraz Vieira i wsp. 23 dla szczegółowych procedur hodowli neuronów zwoju spiralnego, lub Parker i wsp. 24 w celu wykazania izolacji modiolus.</li>
	<li>Odessać pozostały roztwór poli-L-ornityny/lamininy ze szkiełek nakrywkowych i krótko przemyć NBM.</li>
	<li>Dodać 150-200 μl zdysocjowanej zawiesiny neuronów spiralnego zwoju do szkiełek nakrywkowych i umieścić w inkubatorze (37 °C, 10% CO2 ). Uwaga: z przeciętnego miotu 8 szczeniąt szczurów można przygotować do 20 szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Cztery godziny po posianiu neuronów odessać roztwór, aby usunąć resztki komórek i zastąpić 150-200 μl ogrzanego świeżego NBM. Uwaga: podłoże może wymagać codziennego uzupełniania, aby uniknąć odwodnienia.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy umieścić z powrotem w inkubatorze do czasu, gdy będą potrzebne do zapisów elektrofizjologicznych. Uwaga: zdysocjowane hodowle neuronów zwojowych spiralnych można wykorzystać do eksperymentów elektrofizjologicznych cztery godziny po dysocjacji i do dwóch dni po niej. Podczas analizy wyników należy wziąć pod uwagę czas spędzony in vitro. Uzupełniaj NBM co 24-48 godzin.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do nagrań z użyciem zacisków krosowych
<ol>
	<li>Przygotowywanie roztworów
	<ol>
		<li>Roztwór wewnątrzkomórkowy (mikropipeta): 115 mM K-glukonian, 7 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,05 mM EGTA, 2 mM Na2ATP, 2 mM MgATP, 0,5 mM Na2GTP (dostosować do pH 7,3 za pomocą KOH; dostosować do 295 mOsmol/kg z sacharozą). Przepuścić roztwór przez sterylny filtr (0,2 μm) i podzielić na 200 μl porcji, które będą przechowywane w temperaturze -20 °C do dnia rejestracji.</li>
		<li>Roztwór zewnątrzkomórkowy (kąpielowy): 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glukozy (dostosować do pH 7,4 za pomocą NaOH; dostosować do 300-310 mOsmol/kg z sacharozą). To rozwiązanie jest wykonywane w dniu nagrania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować mikropipety rejestrujące o rezystancji 2-6 MΩ. Używamy ściągacza laserowego CO2 (P-2000; Sutter Instruments) i szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,0 mm; średnica wewnętrzna 0,58 mm; długość 75 mm).</li>
	<li>Przygotuj laser. Protokół ten jest przeznaczony do użytku z laserem sprzężonym ze światłowodem, takim jak stymulator nerwów na podczerwień 1,870 nm firmy OptoTech P/L. Światłowód używany do dostarczania światła w naszych eksperymentach to włókno krzemionkowe o średnicy rdzenia/okładziny 200/220 μm o aperturze numerycznej 0,22 i złączach FC-PC na obu końcach (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0,22). krosowe zostały przecięte na pół, aby wytworzyć dwa warkocze światłowodowe (tj. złączone na jednym końcu i rozcięte na drugim). Wpływ średnicy rdzenia światłowodu i apertury numerycznej na zmiany temperatury wywołane laserem został szczegółowo omówiony przez Thompsona i wsp. 25
	<ol>
		<li>Rozciąć końcówkę światłowodu doprowadzającego światło przy użyciu standardowych technik i upewnić się, że uzyskana końcówka jest wysokiej jakości poprzez obserwację za pomocą mikroskopu optycznego (tj. końcówka powinna być prostopadła do osi włókna i wydawać się płaska po oględzinach). Podłącz światłowód dostarczający światło do sprzężonego ze światłowodem wyjścia lasera stymacyjnego za pomocą odpowiedniego złącza przelotowego (np. Thorlabs ADAFC2).</li>
		<li>Zmierz moc wyjściową lasera z rozszczepionej końcówki światłowodu dostarczającego światło za pomocą odpowiedniego przyrządu (np. Coherent FieldMate z głowicą detektora LM-3). Zaleca się sprawdzanie mocy lasera za każdym razem, gdy włókno doprowadzające światło jest rozszczepiane lub dokonywana jest znacząca regulacja lasera (np. transport z jednego laboratorium do drugiego).</li>
		<li>Włóż światłowód doprowadzający światło do uchwytu światłowodowego lub równoważnego urządzenia i przymocuj uchwyt do odpowiedniego mikropozycjonera. Ważne jest, aby móc dokładnie określić kąt θ, jaki światłowód tworzy ze szkiełkiem nakrywkowym. Kąt ten można zmierzyć, wykonując zdjęcie układu doświadczalnego i używając oprogramowania do przetwarzania obrazu (np. ImageJ) w celu uzyskania kąta. Kąt θ (lub zakres możliwych kątów) jest ograniczony przede wszystkim przez ograniczenia przestrzenne układu doświadczalnego - w szczególności mikroskopu. Typowe wartości θ w naszych eksperymentach (na podstawie mikroskopu pionowego) wynoszą około 36°, jednak optymalny kąt może się znacznie różnić w przypadku alternatywnych ustawień (np. z użyciem mikroskopu odwróconego).</li>
		<li>Wykonaj połączenia między laserem a systemem gromadzenia danych z zacisku krosowego (np. Digidata 1440A, Molecular Devices), jak pokazano na rysunku 2. Wyjście cyfrowe z systemu akwizycji danych patch clamp powinno być podłączone do lasera za pomocą zewnętrznego generatora funkcyjnego, co umożliwia określenie parametrów impulsu laserowego niezależnie od systemu akwizycji danych. Alternatywnie wyjście to można podłączyć bezpośrednio do sterownika laserowego (co wymaga ustawienia długości impulsu i częstotliwości powtarzania przez oprogramowanie do akwizycji danych). W obu przypadkach sygnał używany do wyzwolenia lasera powinien być podłączony z powrotem do wejścia systemu akwizycji danych, aby zapewnić, że czas i długość impulsów laserowych mogą być rejestrowane jednocześnie z sygnałem elektrofizjologicznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Nagrania z zaciskiem krosowym do badania INS
<ol>
	<li>Napełnij odpowiedni pojemnik systemu perfuzyjnego roztworem zewnątrzkomórkowym i dostosuj szybkość przepływu, aby zapewnić perfuzję kąpieli z szybkością 1-2 ml/min. Używamy systemu zasilanego grawitacyjnie (butelka aspiratora, zawór zaciskowy i rurka PE) z wbudowaną grzałką umożliwiającą szybkie podgrzanie roztworu oraz pompą perystaltyczną do usuwania zużytego roztworu przez odsysanie.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe z hodowanymi komórkami w komorze rejestracyjnej (kąpieli) mikroskopu pionowego. Korzystając z obiektywu zanurzonego w wodzie o dużym powiększeniu (np. 40X) i kontrastu fazowego (np. kontrast interferencyjny różnicowy lub kontrast gradientu Dott), wizualnie zlokalizuj neurony zwoju spiralnego w hodowli. Typowy neuron zwojowy spiralny jest jasny fazowo, okrągły i ma średnicę około 15 μm z wyraźnym jądrem, jak pokazano na rysunku 1a.</li>
	<li>Po zlokalizowaniu neuronu przełącz się na obiektyw o mniejszym powiększeniu (np. 10X) i zlokalizuj docelowy neuron w polu widzenia.</li>
	<li>Przesuń światłowód doprowadzający światło na miejsce, wykonując następującą procedurę (lub równoważną):
	<ol>
		<li>Użyj mikropozycjonera, aby przesunąć światłowód wyjściowy, aż końcówka znajdzie się blisko docelowego neuronu zarówno w płaszczyźnie poziomej, jak i pionowej. Pionowe położenie końcówki światłowodu można zweryfikować, przesuwając obiektyw w górę i w dół (skanowanie ostrości).</li>
		<li>Przełącz się z powrotem na obiektyw o dużym powiększeniu i umieść końcówkę światłowodu w przeznaczonej pozycji obok neuronu (patrz wstawka na rysunku 2). Podczas regulacji pionowego położenia włókna ważne jest, aby dolna krawędź włókna spoczywała na (tj. tylko dotykała) szkiełka nakrywkowego, aby zminimalizować niepewność co do położenia włókna. Optymalne wyrównanie w płaszczyźnie poziomej będzie zależało od kąta θ, jaki włókno tworzy ze szkiełkiem nakrywkowym i promienia włókna r. Aby ustawić włókno tak, aby środek neuronu docelowego leżał wzdłuż osi włókna, odległość pozioma między górną krawędzią włókna a komórką docelową powinna wynosić 
		Δcel = r (cosec θ - 2 sin θ), 
		gdzie wartości ujemne wskazywałyby, że światłowód wystaje poza ogniwo. Podczas wyrównywania włókna, odległośćcelu Δ między górną krawędzią włókna a środkiem neuronu można w przybliżeniu osiągnąć przez oględziny. Jednakże cel Δ został zaprojektowany jako jedynie przybliżona wytyczna. Ustawienie włókna w taki sposób, aby rzeczywista odległość Δ między górną krawędzią włókna a środkiem neuronu różniła się mierzalnie odcelu Δ (jak na rysunku 1) może zapewnić wgląd w efekt zarówno przemieszczenia promieniowego (tj. od środka wiązki), jak i przemieszczenia osiowego (tj. wzdłuż osi włókna) wiązki względem docelowego neuronu. Na przykład ustawienie Δ ≈ 0 powinno spowodować wzrost lokalnej temperatury w pobliżu ogniwa - tj. ponieważ profil wiązki dla typowych światłowodów wielomodowych jest dobrze przybliżony przez rozkład cylindra 26, spadek lokalnie pochłanianej energii (temperatury) spowodowany przemieszczeniem od środka wiązki jest minimalny w porównaniu ze wzrostem pochłoniętej energii wynikającej z przesunięcia czoła światłowodu bliżej ogniwa. 
Chociaż należy zachować ostrożność, aby ustawić włókno tak dokładnie i powtarzalnie, jak to możliwe za pomocą wskazówek wizualnych, precyzyjny pomiar położenia włókna względem docelowego neuronu (np. Δ) ma większe znaczenie niż ustawienie go w określonej odległości. Δ można wyznaczyć (z szacowaną maksymalną niepewnością wynoszącą ±3 μm) za pomocą analizy obrazu, jak opisano w kroku 3.8.2 protokołu. W niektórych eksperymentach 5,8 źródła białego światła zostały sprzężone przez światłowód w celu skierowania na pożądaną komórkę. Podejście to okazało się nieskuteczne w ustawieniu mikroskopu pionowego, ponieważ intensywność światła rozproszonego z obszaru docelowego była stosunkowo niska w tych płytkich kątach (θ).</li>
		<li>Gdy włókno znajdzie się na swoim miejscu, odsuń je o znaną ilość, aby umożliwić proste ustawienie mikropipety. Włókno można następnie przywrócić do pierwotnej pozycji, gdy zostanie osiągnięty zapis neuronowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij mikropipetę roztworem wewnątrzkomórkowym i bezpiecznie zamontuj na miejscu na płycie głównej wzmacniacza (np. Multiclamp 700B, Molecular Devices). Używając rurki przymocowanej z boku uchwytu mikroelektrody, zastosuj niewielką ilość nadciśnienia, aby zapobiec zatkaniu mikropipety.</li>
	<li>Za pomocą mikromanipulatora przesuń mikropipetę na pozycję tuż nad docelowym neuronem.</li>
	<li>Protokół dla zapisów całej komórki:
	<ol>
		<li>Zastosować impuls prostokątny o długości 10 ms, +10 mV (np. test uszczelnienia) w trybie cęgowym wzmacniacza i wyregulować potencjał mikropipet (przesunięcie pipety) sygnału linii podstawowej na 0 nA. Test szczelności powinien być również stosowany w celu określenia, czy rezystancja mikroelektrody mieści się w pożądanym zakresie (np. 2 - 6 MΩ).</li>
		<li>Monitorując rezystancję, użyj precyzyjnych regulacji mikromanipulatora, aby delikatnie ustawić mikropipetę na powierzchni docelowego neuronu. Gdy mikropipeta styka się z neuronem, rezystancja wzrośnie (o ~ 0,5 do 1 MΩ). Natychmiast po wzroście oporu usuń dodatnie ciśnienie płynu i zastosuj niewielkie podciśnienie. Gdy rezystancja przekroczy 10 - 20 MΩ, ustal potencjał membrany na poziomie zatrzymania (np. około -60 mV).</li>
		<li>Rezystancja elektrody powinna nadal rosnąć, aż przekroczy 1 GΩ, co oznacza, że między błoną komórkową a mikropipetą powstało skuteczne uszczelnienie (określane jako "gigaseal"). W tym momencie usuń całe ciśnienie płynu z mikropipety.</li>
		<li>Po uformowaniu gigaseal użyj krótkich impulsów prądowych (od 25 do 100 μs; +1 V) lub krótkich impulsów ujemnego ciśnienia płynu, aby rozerwać błonę komórkową i uzyskać konfigurację całej komórki.</li>
		<li>Zapisać pojemność membrany, rezystancję szeregową i rezystancję wejściową wyznaczoną na podstawie krzywej wykładniczej dopasowanej do prądu podczas impulsu testowego uszczelnienia. Zminimalizuj stany przejściowe pojemności, regulując elementy sterujące CpFast i CpSlow na wzmacniaczu, a następnie przełącz wzmacniacz w tryb całego ogniwa i skompensuj pojemność i rezystancję, aż podczas testu uszczelnienia zostanie zaobserwowany płaski prąd. Zastosuj kompensację rezystancji szeregowej (~70% korekty; 70% predykcji), dostosowując kontrolę pojemności i rezystancji, aby utrzymać płaską reakcję uszczelnienia testowego.</li>
		<li>Przełącz na tryb cęgów prądowych we wzmacniaczu. Zwróć uwagę na spoczynkowy potencjał błony (przy braku wtrysku prądu). Ustaw prąd podtrzymania, aby ustabilizować potencjał membrany na żądanym poziomie (np. -60 mV). Zneutralizuj pojemność pipety i wyreguluj balans mostka, aby zrównoważyć spadek napięcia.</li>
		<li>Sprawdź właściwości wypalania neuronu, stymulując go prądem depolaryzującym (+10 do +200 pA w krokach co +10 pA; czas trwania 300 ms).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Przesuń światłowód z powrotem na miejsce obok neuronu. Korzystając z oprogramowania do obrazowania sprzężonego z kamerą CCD, uchwyć obrazy położenia światłowodu w stosunku do docelowego neuronu, skupiając się najpierw na płaszczyźnie neuronu, a następnie na górnej krawędzi światłowodu (patrz rysunek 1).</li>
		<li>Poprzez późniejszą analizę uzyskanych obrazów (np. rys. 1b i 1c) możliwe jest precyzyjne określenie Δ (położenie górnej krawędzi światłowodu względem środka docelowego neuronu). Gdy Δ jest znane, parametry, takie jak odległość od czoła końca włókna do docelowego neuronu (wzdłuż osi włókna) z oraz promieniowe przemieszczenie neuronu od środka wiązki δr można obliczyć za pomocą prostych zależności trygonometrycznych: 
		z = r sin 2θ + Δ cos θ 
		δr = ((r cos 2θ - Δ sin θ)2 + δy2)1/2, 
		gdzie δy jest odległością między osią włókna a środkiem neuronu widzianym z góry (np. patrz rysunek 1). 
		Analiza powinna uwzględniać różnice w położeniu między komórkami, ponieważ dokładna wiedza na temat tych parametrów lokalizacji może być wymagana do rozwiązania ewentualnych różnic między procesami stymulacji 25.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Eksperymenty INS
<ol>
	<li>Podczas rejestrowania danych elektrofizjologicznych w konfiguracji cęgów prądowych lub napięciowych, należy uruchomić laser stymulacyjny z żądanymi parametrami (np. mocą, długością impulsu, częstotliwością powtarzania itp.). W przypadku naszego lasera moc optyczna jest kontrolowana za pomocą bezpośredniego sygnału wejściowego do sterownika lasera i jest określana ręcznie przed każdym nagraniem. Długość impulsu i częstotliwość powtarzania mogą być kontrolowane przez zewnętrzny generator sygnału lub oprogramowanie do akwizycji danych (zgodnie z opisem w kroku 2.3.4). Upewnij się, że dane są rejestrowane zarówno z kanału zacisku krosowego, jak i kanału wyzwalacza laserowego.</li>
</ol>
Impulsy laserowe o długości od około 500 μsec do 15 ms i energiach ~0,25-5 mJ na impuls zazwyczaj dają mierzalne odpowiedzi elektryczne. Ustawienie częstotliwości powtarzania impulsów laserowych na 1 Hz lub mniej może być przydatne w początkowych eksperymentach, ponieważ zminimalizuje wpływ tego parametru. Typowe wyniki obrazujące zmianę rejestrowanego sygnału przedstawiono w poniższym rozdziale.

<ol><li>Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+infrared+light+for+in+vivo+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Application of infrared light for in vivo neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).</li>
<li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stimulation+with+optical+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+%26+Photonics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).</li>
<li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trpv4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).</li>
<li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+mechanisms+of+transient+optical+stimulation+of+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve.</a> Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736(2012).</li>
<li>Bec, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+laser+stimulation+by+near+infrared+pulses+of+retinal+and+vestibular+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).</li>
<li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+auditory+neurons%3A+Effect+of+shorter+pulse+duration+and+penetration+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth.</a> Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).</li>
<li>Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+laser+versus+electrical+energy+for+peripheral+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).</li>
<li>Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+the+facial+nerve%3A+A+new+monitoring+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique.</a> Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).</li>
<li>Jenkins, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+pacing+of+the+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Optical pacing of the embryonic heart.</a> Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).</li>
<li>Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of the auditory nerve.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+neural+stimulation+in+the+auditory+system%3A+A+comparison+of+optic+and+electric+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli.</a> J. Biomed. Opt. 12, 021008(2007).</li>
<li>Richter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+auditory+neurons%3A+Effects+of+acute+and+chronic+deafening%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening.</a> Hearing Research. 242, 42-51 (2008).</li>
<li>Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+stimulation+of+single+auditory+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser stimulation of single auditory nerve fibers.</a> Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).</li>
<li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+parameter+variability+in+laser+nerve+stimulation%3A+A+study+of+pulse+duration%2C+repetition+rate%2C+and+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable-membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291, 1-14 (2012).</li>
<li>Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+hair+cell+explant+co-cultures+promote+the+differentiation+of+stem+cells+into+bipolar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons.</a> Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).</li>
<li>Whitlon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+morphology+of+auditory+neurons+in+dissociated+cultures+of+newborn+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion.</a> Neuroscience. 138, 653-662 (1016).</li>
<li>Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+stimulation+of+neurite+outgrowth+in+a+serum-free+culture+of+spiral+ganglion+neurons+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice.</a> Hearing Research. 230, 17-23 (2007).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti.</a> J. Vis. Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 17, 075002(2012).</li>
<li>Snyder, A. W., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSnyder%2C+AW+%22Optical+Waveguide+Theory%22">Optical Waveguide Theory</a>. , Chapman and Hall. (1983).</li>
<li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li>
<li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Korzystając z protokołów opisanych w tym artykule, możliwe jest wyodrębnienie i hodowla neuronów zwojowych spirali oraz zbadanie aktywności elektrycznej wywołanej laserem poprzez przeprowadzanie eksperymentów z klamrą całej komórki. W przypadku stosowania in vitro, technika patch clamp zapewnia poziom kontroli nad parametrami eksperymentalnymi, który nie jest osiągalny in vivo. Parametry stymulacji laserowej, takie jak długość fali, energia impulsu, długość impulsu, kształt impulsu i sekwencje powtarzan...

Dziedziny neurofizjologii i bioniki medycznej polegają głównie na technikach, które pozwalają na kontrolowaną stymulację reakcji elektrycznych w tkance nerwowej. Chociaż stymulacja elektryczna pozostaje złotym standardem w pobudzeniu neuronalnym, cierpi na szereg wad, takich jak obecność artefaktów stymulacji podczas rejestrowania odpowiedzi neuronalnych oraz brak specyficzności stymulacji spowodowany rozprzestrzenianiem się prądu do otaczającej tkanki 1.
W ciągu ostatnich dwóch dekad nastąpił rozwój technik stymulacji za pośrednictwem optycznie 2. Niektóre z tych technik wymagają modyfikacji tkanki docelowej, albo poprzez dodanie określonej cząsteczki (np. cząsteczek w klatce)" 3 lub jakąś formę manipulacji genetycznej (np. optogenetykę) 4 , z których żadna nie jest łatwa do zastosowania poza środowiskiem badawczym. Szczególnie interesująca jest zatem stymulacja neuronalna w podczerwieni (INS), w której tkanka nerwowa jest pobudzana przez pulsacyjne światło lasera w podczerwieni. INS ma potencjał, aby przezwyciężyć wiele wad stymulacji elektrycznej, umożliwiając wysoce specyficzną, bezkontaktową stymulację tkanki nerwowej 2. Jednakże, chociaż INS został z powodzeniem zademonstrowany w różnych warunkach in vivo, dokładny mechanizm wzbudzenia pozostaje niepewny.
Niektóre ostatnie publikacje wykazały postęp w odkrywaniu mechanizmu stojącego za INS 5-7. Szybkie nagrzewanie spowodowane absorpcją światła laserowego przez wodę wydaje się odgrywać kluczową rolę. Jednak poza tym konsensus nie został jeszcze osiągnięty. Shapiro i wsp. 7 proponują bardzo ogólny mechanizm, w którym szybkie nagrzewanie powoduje zaburzenia w rozmieszczeniu naładowanych cząstek przylegających do błony komórkowej, co prowadzi do zmiany pojemności błony komórkowej i późniejszej depolaryzacji. Ponadto Albert i wsp. 5 Twierdzą, że ogrzewanie indukowane laserem aktywuje określoną klasę kanałów jonowych wrażliwych na temperaturę (kanały waniloidowe o potencjale przejściowym receptora), umożliwiając jonom przejście przez błonę komórkową. Na tym etapie nie jest jasne, w jaki sposób te mechanizmy się łączą, ani czy istnieją jeszcze inne czynniki, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane.
Chociaż niewielka liczba publikacji (odnośniki 5,7-9) badała INS in vitro, zdecydowana większość prac opublikowanych w tej dziedzinie została przeprowadzona in vivo (np. referencje 1,6,10-18). Stymulacja neuronów słuchowych w podczerwieni jest obszarem szczególnego zainteresowania ze względu na potencjalne zastosowania w implantach ślimakowych 10,14-18. Podczas gdy eksperymenty in vivo są ważne dla zweryfikowania skuteczności tej techniki w różnych warunkach, oczekuje się, że zwiększony poziom kontroli zapewniony przez badania in vitro doprowadzi do bardziej szczegółowego zrozumienia mechanizmu odpowiedzialnego za INS. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie hodowanych neuronów spiralnych zwojów do badań nad klamrami łatkowymi, ponieważ można je wykorzystać do badania podstawowych mechanizmów, a jednocześnie połączyć się z dużą ilością istniejących danych z układu słuchowego.
Technika zacisku krosowego jest doskonałym narzędziem do badania zjawisk elektrofizjologicznych, dostarczając środków do rejestrowania aktywności elektrycznej w pojedynczych komórkach i badania wkładu poszczególnych prądów bazowych19. Kiedy technika ta jest stosowana do stabilnego przygotowania in vitro pierwotnych neuronów, takich jak hodowane spiralne neurony zwojowe, daje możliwość dogłębnego zbadania mechanizmów, za pomocą których aktywność neuronalna jest kontrolowana i manipulowana.
Protokoły określone w tej pracy opisują metody badania wpływu stymulacji laserowej na właściwości elektryczne neuronów spiralnych zwojów poprzez zapisy patch clamp. Podejście to opiera się na laserze sprzężonym ze światłowodem, a nie na laserze w wolnej przestrzeni, co pozwala na bezpieczniejszą pracę, a także łatwiejsze i bardziej powtarzalne wyrównanie bez konieczności modyfikowania standardowej konfiguracji mikroskopu. Na podstawie tych protokołów powinno być możliwe przeprowadzenie szerokiego zakresu eksperymentów w celu dokładniejszego określenia mechanizmu lub mechanizmów stojących za INS.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiały i sprzęt do hodowli komórkowych </td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Lomb Scientific</td><td>CSC 10 1 GP</td><td></td></tr><tr><td>4-pierścieniowe naczynie do hodowli komórkowych </td><td>VWR International</td><td>82050-542</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-ornityny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony kleszcze</td><td>WPI</td><td>14101</td><td>Pęseta Dumont #5 (końcówka kątowa 45&deg)</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>ThermoScientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Materiały i sprzęt do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasemedia</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement bez surowicy</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wewnątrzkomórkowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-glukonian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>LabServ</td><td>BSPPL738.500</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Roztwór zewnątrzkomórkowy </td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383147</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>LabServ</td><td>BSPSL740.500</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Roztwory do hodowli komórkowych i patch clamp. a) Pożywki neuropodstawne. b) Roztwór wewnątrzkomórkowy. c) Roztwór zewnątrzkomórkowy.</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Zeiss</td><td>AxioExaminerD1</td><td>Wyposażony w kontrastowy obiektyw Dodt </td></tr><tr><td>Zanurzenie w wodzie</td><td>Platforma Zeiss</td><td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>i stolik X-Y </td><td>ThorLabs</td><td>Burleigh Gibraltar</td><td></td></tr><tr><td>Komora nagraniowa</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Stół do tłumienia drgań</td><td>TMC</td><td>Micro-g 63-532</td><td></td></tr><tr><td>Przyrządy diagnostyczne</td> <td>do kamer CCD</td><td>Oprogramowanie kamery RT1200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Przyrządy diagnostyczne</td><td>SPOT Basic</td><td></td></tr><tr><td>Grzejnik liniowy</td><td>Warner</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz zacisków krosowych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk krosowy system akwizycji danych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-325</td><td></td></tr><tr><td>Szkło do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>GBF100-58-15</td><td>Szkło borokrzemianowe z żarnikiem</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Oprogramowanie do nagrywania Sutter Instruments</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pakiet AxoGraph</td><td></td><td>Lab i Narzędzia do elektrofizjologii</td></tr><tr><td>Butelka z aspiratorem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS12201L</td><td>1 L Butelka aspiratora Pyrex, z wylotem na rurkę</td></tr><tr><td>Rurka PE</td><td>Harvard</td><td>PolyE #340</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Masterflex</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07554-85</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3.Sprzęt do zacisków krosowych.</td></tr> <tr><td>1,870 nm dioda laserowa</td><td>Optotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200/220 &mu; Wielomodowy światłowodowy o średnicy m (FC/PC)</td><td>AFW Technologies</td><td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22</td><td>Światłowód dostarczający światło, rdzeń krzemionkowy i okładzina, 0,22 NA</td></tr><tr><td>Światłowód przez złącze (FC/PC)</td><td>Thorlabs</td><td>ADAFC2</td><td></td></tr><tr><td>Obcinak do światłowodów</td><td>EREM</td><td>FO1</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do zdejmowania izolacji z włókien (0,25 - 0,6 mm) </td><td>Siemens</td> Do zdejmowania osłony <td></td><td>światłowodu</td></tr><tr><td>Narzędzie do zdejmowania izolacji ze światłowodów (0,6 - 1,0 mm)</td><td>Siemens</td><td></td><td>Do usuwania zewnętrznej powłoki krosowego</td></tr><tr><td>Generator</td><td></td><td></td> sygnału <td>Każdy generator sygnału, który może wyprowadzać niezbędne kształty impulsów i może być wyzwalany zewnętrznie</td></tr><tr><td>Pozycjoner</td><td></td><td></td> światłowodowy <td>Niestandardowy pozycjoner. Może zastąpić standardowym mikropozycjonerem używanym do eksperymentów z zaciskami krosowymi</td></tr><tr><td>Uchwyt światłowodowy</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td></td></tr><tr><td>Miernik mocy lasera i głowica detektora</td><td>Coherent</td><td>FieldMate (miernik mocy) z LM-3 (głowica detektora)</td><td></td></tr> <tr><td colspan="4">Tabela 4. Sprzęt laserowy.</td></tr></tbody></table>

klamra krosowa całej komórki do badania mechanizmów stymulacji neuronalnej w podczerwieni

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

W ostatnich latach wykazano, że pulsacyjne, podczerwone światło laserowe może być używane do wywoływania reakcji elektrycznych w tkance nerwowej, niezależnie od jakiejkolwiek dalszej modyfikacji tkanki docelowej. Stymulacja neuronalna w podczerwieni została opisana w różnych obwodowych i czuciowych tkankach nerwowych in vivo, ze szczególnym zainteresowaniem wykazano stymulację neuronów w nerwie słuchowym. Jednakże, chociaż wykazano, że INS działa w tych warunkach, mechanizm (lub mechanizmy), za pomocą których światło podczerwone powoduje pobudzenie neuronalne, nie jest obecnie dobrze poznany. Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę zaciskania całej komórki, zaprojektowaną w celu ułatwienia badania stymulacji neuronalnej w podczerwieni w hodowanych pierwotnych neuronach słuchowych. Dzięki dokładnemu scharakteryzowaniu reakcji tych komórek na oświetlenie laserowe w podczerwieni in vitro w kontrolowanych warunkach, możliwe będzie lepsze zrozumienie podstawowych procesów fizycznych i biochemicznych leżących u podstaw stymulacji neuronalnej w podczerwieni.

Neurony zwoju spiralnego reagują na naświetlanie laserowe powtarzalnymi przebiegami falowymi zarówno w konfiguracji pomiarowej voltage-clamp, jak i current-clamp. Rysunek 3a przedstawia typowe zmiany przepływu prądu przez błonę komórkową w odpowiedzi na impuls laserowy o czasie trwania 2,5 msec i energii 0,8 mJ (średnia odpowiedź z 6 impulsów laserowych, powtarzanych w odstępach 1 sec), przy potencjale błony utrzymanym na poziomie -70 mV, -60 mV i -50 mV. W odpowiedzi na impulsy laserowe konsekwentnie wy...

Stymulacja nerwów w podczerwieni została zaproponowana jako alternatywa dla stymulacji elektrycznej w wielu typach nerwów, w tym związanych z układem słuchowym. Protokół ten opisuje metodę patch clamp do badania mechanizmu stymulacji nerwów w podczerwieni w kulturze pierwotnych neuronów słuchowych.

Klamra krosowa całej komórki do badania mechanizmów stymulacji neuronalnej w podczerwieni

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest stworzenie modelu systemu do badania wpływu naświetlania laserem podczerwonym na neurony słuchowe in vitro. Osiąga się to poprzez zastosowanie techniki patch clamp na hodowlanych neuronach słuchowych w konfiguracji whole-cell w celu zbadania ich charakterystyki elektrycznej. Następnie poddanie neuronów promieniowaniu laserowemu może wywołać odpowiedzi elektryczne w naświetlonej komórce, które można zmierzyć za pomocą zestawu do patch clampu.Następnie można zmieniać parametry oświetlenia oraz zmienne środowiskowe, aby zaobserwować ich wpływ na odpowiedzi elektryczne indukowane laserem. Neurony słuchowe poddane działaniu światła laserowego będą wykazywać powtarzalną aktywność elektryczną w odpowiedzi na każdy impuls lasera, co umożliwi późniejszą analizę. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów leżących u podstaw stymulacji podczerwienią neuronów zwoju spiralnego.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat stymulacji podczerwienią konkretnie komórek zwoju spiralnego, można ją również rozszerzyć na inne typy komórek lub uproszczone modele, takie jak dwuwarstwy lipidowe, aby dokładniej wyjaśnić zaangażowane procesy fizyczne. Wizualna demonstracja tej metody jest istotna w celu zapewnienia dokładnego rozmieszczenia światłowodu dostarczającego światło, ponieważ wynikająca z tego ekspozycja na promieniowanie jest parametrem krytycznym. Należy przygotować mikro-pipety rejestrujące o oporności od dwóch do sześciu mega omów. Można je wyciągnąć ze szkła borokrzemianowego za pomocą wyciągacza laserowego CO2.Przygotuj laser z łącznikiem światłowodowym. Można zastosować szeroki zakres rodzajów światłowodów. Przecięcie na pół światłowodu w konfiguracji patchcord z konektorami FCPC pozwala uzyskać dwa odcinki światłowodu z konektorem na jednym końcu i odsłoniętym włóknem na drugim końcu.Są to tzw. pigtails (światłowody z końcówkami). Przygotuj końcówkę jednego pigtaila, usuwając osłonę włókna, oczyszczając ją etanolem i dokonując spallenia za pomocą odpowiedniego narzędzia pod mikroskopem. Sprawdź, czy czoło jest prostopadłe do osi włókna i czy wydaje się płaskie.Podłącz drugi koniec pigtaila światłowodowego do wyjścia lasera stymulującego, w razie potrzeby używając odpowiedniego konektora przejściowego. Na tym etapie należy zawsze zmierzyć moc wyjściową lasera z włókna. Czynność tę należy powtórzyć również po wszelkich dalszych manipulacjach przy końcówce.Następnie włóż światłowód do uchwytu, a uchwyt zamocuj w odpowiednim mikropozycjonerze. Potem wyznacz kąt, pod jakim światłowód styka się z szkiełkiem podstawowym. Wykonaj zdjęcie układu i oblicz kąt za pomocą programu ImageJ. Na koniec zabezpiecz połączenia synchronizujące laser z systemem akwizycji danych patch-clamp.Wyjście cyfrowe systemu akwizycji danych patch clamp należy podłączyć do lasera za pomocą zewnętrznego generatora funkcji, co umożliwia określenie parametrów impulsu laserowego niezależnie od systemu akwizycji danych; sygnał używany do wyzwalania lasera powinien zostać podłączony z powrotem do wejścia systemu akwizycji danych, aby zapewnić jednoczesną rejestrację czasu i długości impulsów laserowych wraz z sygnałem elektrofizjologicznym. Ustawić szybkość przepływu w systemie perfuzyjnym w zakresie od 1 do 2 ml/min. Odpowiedni będzie system grawitacyjny z wbudowanym podgrzewaczem do szybkiego ogrzewania roztworu oraz pompa perystaltyczna do usuwania zużytego roztworu za pomocą ssania. Umieścić szkiełko nakrywkowe z hodowlą komórek w komorze rejestracyjnej mikroskopu pionowego, korzystając z obiektywu imersyjnego wodnego o dużym powiększeniu oraz kontrastu fazowego, a następnie zlokalizować neuron zwoju spiralnego.Typowy neuron zwoju spiralnego ma jasną, okrągłą postać o średnicy około 15 mikronów z wyraźnym jądrem. Po zlokalizowaniu odpowiedniego neuronu należy przełączyć na obiektyw o mniejszym powiększeniu i odnaleźć docelowy neuron. Następnie za pomocą mikro pozycjonera należy przesuwać światłowód, aż jego końcówka znajdzie się blisko docelowego neuronu zarówno w płaszczyźnie poziomej, jak i pionowej.Przełącz z powrotem na obiektyw o dużym powiększeniu i ustaw końcówkę światłowodu w zamierzonym położeniu obok neuronu. Podczas regulacji pionowej pozycji światłowodu ważne jest, aby dolna krawędź światłowodu opierała się o krawędź szkiełka nakrywkowe. Aby zminimalizować niepewność co do położenia światłowodu, punkt styku można zidentyfikować na podstawie wskazówek wizualnych w obrazie mikroskopowym.Po ustawieniu włókna, przesuń je o określoną wartość wzdłuż jego osi podłużnej, aby nie wpłynąć na pozycjonowanie mikropipety. Mikropipeta powinna być wypełniona roztworem wewnątrzkomórkowym i bezpiecznie zamocowana w gnieździe wejściowym wzmacniacza. Za pomocą rurki przymocowanej do boku uchwytu mikroelektrody, zastosuj niewielkie nadciśnienie, aby zapobiec zapychaniu się mikropipety.Za pomocą mikromanipulatora przesuń mikropipetę w pozycję bezpośrednio nad docelowy neuron, a następnie przystąp do utworzenia uszczelnienia rzędu gigaoma. Zapisz wartość pojemności błony, rezystancji szeregowej oraz rezystancji wejściowej wyznaczonej na podstawie krzywej wykładniczej dopasowanej do prądu podczas impulsu testowego uszczelnienia.Zminimalizuj stan przejściowy pojemności, regulując pokrętła CP fast i CP slow na wzmacniaczu. Następnie przełącz wzmacniacz w tryb whole cell i modyfikuj kompensację pojemności oraz rezystancji, aż do momentu zaobserwowania płaskiego prądu podczas testu SEAL. Następnie zastosuj kompensację rezystancji szeregowej z korekcją około 70% i predykcją 70%, regulując pokrętła kompensacji pojemności i rezystancji w celu utrzymania płaskiej odpowiedzi testu seal.Następnie przełącz wzmacniacz w tryb clamp prądowy. Odnotuj potencjał spoczynkowy błony w warunkach braku wstrzykiwania prądu. Teraz ustaw prąd podtrzymujący, aby ustabilizować potencjał błony na pożądanym poziomie.Zneutralizuj pojemność pipety i dostrój balans mostka, aby zrównoważyć spadek napięcia. Sprawdź właściwości wyładowania neuronu, stymulując go prądem depolaryzującym. W tym momencie przesuń światłowód z powrotem na pozycję obok neuronu, korzystając z oprogramowania do obrazowania połączonego z kamerą CCD; wykonaj obrazy najpierw skupione na płaszczyźnie neuronu, a następnie na górnej krawędzi światłowodu.Przeanalizuj obrazy, aby wyznaczyć wartość delta, która określa położenie górnej krawędzi włókna optycznego względem centrum docelowego neuronu. Bardzo ważne jest dokładne określenie położenia włókna optycznego. Wynika to z faktu, że energia na jednostkę powierzchni lub ekspozycja na promieniowanie dostarczana do docelowej komórki jest krytycznym parametrem w przypadku podczerwonej stymulacji neuronów, a wartość ta może ulec znacznej zmianie w zależności od położenia włókna względem komórki.Moc optyczna tego lasera jest sterowana komputerowo poprzez bezpośrednie wejście do lasera i może być określana ręcznie przed każdym pomiarem. Długość impulsu oraz częstotliwość powtarzania mogą być kontrolowane za pomocą generatora funkcji, zgodnie z wcześniejszym opisem; należy upewnić się, że dane są rejestrowane zarówno z kanału patch clamp, jak i z kanału wyzwalania lasera. Impulsy laserowe o czasie trwania od 0,5 do 15 ms i energii od 0,25 do 5 mJ zazwyczaj wywołują mierzalne odpowiedzi elektryczne. Początkowo.W celu zminimalizowania niepożądanych efektów warto ustawić częstotliwość repetycji impulsów laserowych na 1 Hz lub mniej. Po ustawieniu wszystkich parametrów lasera można przystąpić do gromadzenia danych.Neurony zwoju spiralnego reagują na naświetlanie laserem powtarzalnymi kształtami fal zarówno w konfiguracji rejestracji voltage clamp, jak i current clamp w odpowiedzi na impulsy laserowe o czasie trwania 2,5 millisecond i energii 0,8 millijoules. Typowa komórka generuje wypadkowy prąd wewnątrzkomórkowy przy różnych potencjałach utrzymujących. Rejestracje w trybie current clamp wykazują stałą depolaryzację błony w czasie trwania tych impulsów laserowych, po której następuje w przybliżeniu wykładniczy spadek w kierunku potencjału spoczynkowego błony po zakończeniu impulsu.W niektórych przypadkach po impulsie laserowym występuje również niewielka dodatkowa depolaryzacja błony. Naświetlanie nadmierną energią lub narażenie na znaczne wzrosty temperatury może prowadzić do uszkodzenia komórek, co objawia się pogorszeniem ich właściwości elektrycznych lub natychmiastową śmiercią komórki. Postępując zgodnie z tą procedurą, można zmieniać szereg parametrów środowiskowych, takich jak temperatura roztworu czy czynniki chemiczne, aby przetestować ich wpływ na aktywność elektryczną indukowaną laserem.Należy pamiętać, że praca z laserami może być niebezpieczna i należy zastosować standardowe środki ostrożności. Obejmują one stosowanie okularów ochronnych do laserów, rozmieszczenie znaków ostrzegawczych oraz upewnienie się, że wiązka nie przecina nieumyślnie żadnych powierzchni o wysokim współczynniku odbicia.

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Całkowite zaciskanie łaty komórkowej do badania mechanizmów stymulacji nerwowej w podczerwieni

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Film demonstruje protokół do badania interakcji synaptycznych i odpowiedzi neuronalnych w transfekowanym wycinku mózgu hipokampa myszy. Polega na oświetlaniu neuronów czuciowych dalekiego zasięgu w celu wyzwolenia potencjałów czynnościowych i rejestrowaniu powstałych pobudzających potencjałów postsynaptycznych w zarejestrowanym neuronie za pomocą techniki patch-clamp dla całej komórki.

Fotostymulacja i zapisy klamer całokomórkowych neuronów w wycinkach hipokampa myszy

Ten film demonstruje technikę patch-clamp do pomiaru prądów jonowych w ciałach komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie i użycie polerowanej pipety z zaciskiem krosowym wypełnionej wewnętrznym roztworem zawierającym amfoterycynę B, która perforuje błonę, aby umożliwić ruch jonów przy jednoczesnym zachowaniu warunków wewnątrzkomórkowych. Impulsy napięciowe są stosowane do wyzwalania i rejestrowania aktywności kanałów jonowych, zapewniając wgląd w ich...

Perforowane nagrania patch-clamp ciał komórek neuronów czuciowych ucha wewnętrznego

Ten film demonstruje badanie pobudliwości neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego za pomocą techniki zacisku łatkowego do pomiaru potencjału reozasady i błony, analizując reakcje neuronów na przyrostowe wstrzyknięcia prądu.

Nagrania klamry krosowej całej komórki na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego szczura

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Ten protokół pokazuje, jak przeprowadzić zapis klamry całokomórkowej na neuronach siatkówki z preparatu do montażu płaskiego.

Zapis patch clamp komórek amakrynowych Starburst w płaskim preparacie bezkofeinowej siatkówki myszy

Technika zaciskania plastrów jest skuteczną metodą analizy wywołanych uczeniem się zmian wewnętrznych właściwości i plastyczności synaps pobudzających lub hamujących.

Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać automatyczne eksperymenty z zaciskami krosowymi sterowanymi obrazem przy użyciu niedawno opracowanego systemu dla standardowego sprzętu do elektrofizjologii in vitro.

Zastosowanie zautomatyzowanego zacisku krosowego sterowanego obrazem do badania neuronów w wycinkach mózgu

Poznaj metodę klamry krosowej całej komórki do badania stymulacji neuronalnej w podczerwieni u neuronów słuchowych. Technika ta pozwala mierzyć odpowiedzi elektryczne na impulsy laserowe i analizować wpływ parametrów oświetlenia na aktywność komórkową.

Klamra krosowa całej komórki do badania mechanizmów stymulacji neuronalnej w podczerwieni

Przeglądaj więcej filmów