Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Ten protokół wideo demonstruje nowatorskie techniki jednoczesnego niszczenia dwóch genów u dorosłych pszczół miodnych, a następnie przeprowadzania odpowiedzi na przedłużenie trąby lub testu PER w celu zmierzenia efektu knockdownu podwójnego genu. O percepcji smakowej pszczoły miodnej. Osiąga się to poprzez pierwszą syntezę dwuniciowych RNA, ukierunkowanych na geny trzech białek: vitelli, geniny, ultras, białka sferycznego i zielonej fluorescencji.

Ponieważ gen kodujący GFP nie występuje w genomie pszczoły miodnej, dwuniciowy RNA GFP służy jako kontrola negatywna. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie dwuniciowego RNA pszczołom miodnym przy użyciu czterech strategii leczenia. Wstrzyknięcie z dwuniciowym GFP, samym RNA, pojedyncze wstrzyknięcie z dwuniciowym VG i USP, wstrzyknięcie mieszaniny RNA z dwuniciowym RNA vg pierwszego dnia, a następnie wstrzyknięcie dwuniciowego RNA USP drugiego dnia i wstrzyknięcie dwuniciowego RNA USP pierwszego dnia, a następnie wstrzyknięcie podwójnego niciowego RNA VG drugiego dnia po wstrzyknięciach oznaczono pszczoły kolorowymi kropkami farby odpowiadające zabiegom i zwróciły je do ula.

Sześć dni później knockdown genów VG i USP u leczonych pszczół jest weryfikowany za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, a wpływ podwójnego nokautu VG i USP na percepcję smakową określa się za pomocą testu PER. Ostatecznie wykazano, że pszczoły z podwójnym knockdownem mają znaczne zmniejszenie ekspresji genów VG i USP oraz znaczny wzrost percepcji smakowej sacharozy. Nasza interferencja jest potężnym narzędziem, którego możemy użyć do ujawnienia funkcji genów.

Zwykle jest używany do celowania w pojedynczy gen. Jednak geny są częścią złożonej sieci regulacyjnej. Jednym ze sposobów, w jaki możemy lepiej zrozumieć każdy proces biologiczny, jest nauczenie się, w jaki sposób gen oddziałuje z siecią genów.

Aby tego dokonać, musimy manipulować wieloma genami w tym samym czasie. Do tej pory po raz pierwszy byliśmy w stanie zaskoczyć tylko jeden gen na raz u owadów, chcemy pokazać, jak strącić dwie G u pszczół miodnych zamiast jednej. Odruch wydłużenia SCU lub PER jest bardzo przydatną techniką pomiaru percepcji smakowej, która jest behawioralnym predyktorem zachowań społecznych pszczół miodnych.

Na przykład pszczoły gniazdowe o wysokiej percepcji smakowej, szybko dojrzewają behawioralnie, wykuwają się we wczesnym okresie życia i wolą zbierać pyłek. Aby rozpocząć tę procedurę, zaprojektuj startery dwuniciowych RNA ukierunkowanych na geny do knockdownu przy użyciu startera wolnego oprogramowania. Trzy. W tym eksperymencie dwa geny przeznaczone do knockdownu to vitelli, genina lub VG i ultras sferyczny lub USP.

Oprócz konstrukcji VG i USP, startery dwuniciowego RNA są ukierunkowane na gen kontrolny kodujący białko zielonej fluorescencji lub GFP, którego nie ma w genomie pszczoły miodnej. Następnie podwójnie skręcone. Synteza RNA dla VG, USP i GFP odbywa się metodą transkrypcji in vitro przy użyciu systemu produkcji RNA rib max T seven firmy Promega.

Po oczyszczeniu dwuniciowych RNA przy użyciu standardowych procedur rozpuść każdą dwuniciową osadkę RNA w wodzie wolnej od nukleaz, aby zapewnić skuteczność regulacji w dół genów, stężenie dwuniciowego RNA powinno wynosić około dziewięciu do 10 mikrogramów na mikrolitr. Aby przygotować pszczoły do wstrzyknięcia, nowo pojawiające się pszczoły umieszcza się w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza na jedną do dwóch minut. Gdy pszczoły zostaną unieruchomione, zamontuj trzy do czterech pszczół równolegle na szalkach Petriego wypełnionych stałym woskiem z szpilkami owadów skrzyżowanymi między ich odwłokami a klatką piersiową.

Ponownie schłodzić pszczoły w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez około jedną do dwóch minut. Upewnij się, że pszczoły są całkowicie nieruchome. Pszczoły powinny wyglądać na luźne, nie zwinięte ani wykrzywione.

Całkowite unieruchomienie jest ważne, ponieważ każdy ruch może zwiększyć rozmiar rany i śmiertelność. Pszczoły, które są zwinięte lub wykrzywione, były zbyt długo schładzane i nie powinny być używane ze względu na wysoką śmiertelność. Umieść jednorazową igłę o rozmiarze 30 na mikrostrzykawce Hamiltona.

Napełnij strzykawkę trzema mikrolitrami dwuniciowego RNA i upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli stosowana jest strategia pojedynczego wstrzyknięcia, strzykawka jest napełniana mieszaniną dwuniciowych RNA dwóch genów. Jeśli stosowana jest strategia wstrzykiwania dwudniowego, strzykawka jest napełniana jednym z dwóch dwuniciowych RNA.

Wbić igłę w bok brzucha. Aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych, należy powoli naciskać tłok strzykawki, aby umożliwić wchłonięcie dwuniciowego RNA. Ponieważ dwuniciowy RNA jest bardzo lepki, całkowite wydalenie go ze strzykawki zajmuje od dwóch do trzech sekund.

Po całkowitym wciśnięciu tłoka, pozostawić igłę w ranie na cztery do pięciu sekund. Obserwuj pszczoły przez trzy do pięciu sekund po wstrzyknięciu. Jeśli z rany wycieknie kropla limfy krwinki, wyrzuć pszczołę, oznacz klatkę piersiową pszczół różnymi kolorami odpowiadającymi różnym zabiegom.

W tym momencie, jeśli stosowana jest strategia pojedynczego wstrzyknięcia, obserwuj pszczoły przez godzinę w pojemniku z dostarczonym miodem, a następnie umieść je z powrotem w kolonii. Jeśli jednak stosowana jest strategia dwudniowego wstrzykiwania i wstrzyknięto tylko pierwszy dwuniciowy RNA, należy umieścić pszczoły w klatce z siatki cylindrycznej z miodem dostarczonym z boku. Trzymaj pszczoły w inkubatorze w temperaturze 34 stopni Celsjusza i wilgotności 80% przez noc następnego dnia.

Wstrzyknij tym samym pszczołom drugi dwuniciowy RNA, stosując tę samą procedurę, co w przypadku pierwszego dwuniciowego RNA. Pozwól pszczołom dojść do siebie w temperaturze pokojowej przez godzinę w pojemniku z dostarczonym miodem, a następnie wprowadź je do kolonii. Sześć dni po zastrzykach zbiera się leczone pszczoły z kolonii bez użycia palacza do otwarcia ula.

Dym nie jest używany, ponieważ mógłby wpłynąć na percepcję smakową pszczół, która zostanie przetestowana w tej procedurze. Zbieraj pszczoły w klatkach cylindrycznych z metalowej siatki za pomocą miękkich kleszczy z nie więcej niż trzema pszczołami w klatce do montażu pszczół. Do testu PER.

Schładzaj pszczoły w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż zostaną całkowicie unieruchomione. Zamontuj każdą pszczołę pionowo w plastikowej rurce, specjalnie zaprojektowanej dla PER. Użyj taśmy, aby utrzymać brzuch wewnątrz rurki i utrzymać głowę wystającą z rurki.

Umieść rurki na stojaku z dwoma rzędami małych plastikowych kolumn. Jeden rząd jest ponumerowany, dzięki czemu zamontowanym pszczołom można przypisać numer identyfikacyjny. Umieść stojaki z leczonymi pszczołami w inkubatorze w temperaturze 34 stopni Celsjusza i wilgotności 80% na dwie godziny, podczas gdy pszczoły wysiadują.

Przygotuj serię sacharozy. Roztwory wodne. Załaduj roztwory do strzykawek z igłami o rozmiarze od 15 do 20 do testu PER.

Pszczoły są badane w grupach. Najpierw dotknij anteny każdej pszczoły kroplą 0% roztworu, którą jest woda po tym teście z 0,1%0,3%1%3%10% i 30% sacharozy. Roztwory wodne z zachowaniem co najmniej dwóch minut przerwy między każdym roztworem.

Zwykle potrzeba około dwóch minut, aby przetestować 20 pszczół przy użyciu jednego stężenia sacharozy. Dlatego w każdej grupie zawsze powinno być więcej niż 20 pszczół. Jeśli pszczoła całkowicie rozciągnie swoje trąbki, liczy się pozytywna odpowiedź. Czasu rzeczywistego.

Analiza PCR potwierdziła, że zarówno strategia pojedynczego wstrzyknięcia, jak i dwudniowego wstrzyknięcia znacznie obniżyła poziomy transkryptów Fidżi i USP u pszczół miodnych. Sześć dni po wstrzyknięciu dwuniciowego RNA na tych wykresach, RQ wskazuje względny poziom kwantyfikacji transkryptów genu docelowego, a różne litery nad słupkami oznaczają znaczące różnice między grupami leczonymi. Analiza po rozmowie wykazała, że supresja transkryptu USP przy użyciu pojedynczego wstrzyknięcia dwuniciowej mieszaniny RNA i dwudniowego wstrzyknięcia z VG pierwszym i USP drugim było znacznie niższe niż dwudniowe wstrzyknięcie z pierwszym USP i drugim VG.

Oznacza to, że VG może być głównym regulatorem w pętli regulacyjnej VG i hormonów juwenilnych. Wyniki GUA do odpowiedzi lub GRS dla leczonych pszczół obliczono na podstawie wyników odpowiedzi na rozszerzenie trąby lub testu PER, jak pokazano tutaj. GRS u pszczół, którym wstrzyknięto dwuniciową mieszaninę RNA VG i USP, był znacznie wyższy niż GRS u pszczół kontrolnych GFP, co wskazuje, że pszczoły z podwójnym knockdownem były bardziej wrażliwe na sacharozę.

Różne litery nad słupkami oznaczają znaczące różnice między grupami leczonymi. Pokazano tutaj możliwą sieć regulacyjną między ultrasami vi genin, sferycznym i hormonem juwenilkowym, która objawia się przez jednoczesne tłumienie genów VG i USP. Podczas gdy pojedynczy nokdaun USP nie wywołuje żadnych zmian w hormonie juwenilnym, podwójny nokaut VG i USP powoduje większy wzrost hormonu juwenilnego niż pojedynczy nokaut VG.

Sugeruje to, że vitelli nie tylko hamuje produkcję hormonów juwenilnych, ale także hamuje reakcję zwrotną hormonu juwenilnego na knockdown USP. W przypadku podwójnych nokdaunów dramatyczny wzrost produkcji hormonów juwenilnych wynika ze zmniejszonego hamowania geniny VI spowodowanego nokautem VG i kompensacyjnej odpowiedzi na zmniejszoną transdukcję hormonów juwenilnych spowodowaną nokautem USP. Bardziej szczegółowe omówienie tej sieci regulacyjnej znajduje się w załączonym tekście protokołu.

Stosując podejście knockdown z podwójnym genem, ujawniliśmy szczegółowy związek między hormonami genetycznymi, ultra, sferycznymi i juwenilicznymi, którego nie odkrylibyśmy, tłumiąc tylko jeden gen. Teraz, korzystając z tej techniki, naukowcy mogą badać wzajemne powiązania między genami w sieciach regulacyjnych. PR jest standardową metodą stosowaną do pomiaru percepcji smakowej U pszczół miodnych jest jednak bardzo wrażliwy na obchodzenie się z nim, dlatego należy być bardzo ostrożnym przy zachowaniu spójności między środowiskiem a obchodzeniem się ze zwierzętami.

Ponadto, jeśli esej ma być wykonywany przez kilka dni, dobrze jest zachować krótki harmonogram i mieć oko, aby upewnić się, że pogoda i środowisko się nie zmienią.