Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Niniejszy protokół wideo demonstruje nowe techniki jednoczesnego wyciszania dwóch genów u dorosłych pszczół miodnych, a następnie przeprowadzania testu reakcji wysunięcia trąbki (PER), aby zmierzyć wpływ podwójnego wyciszenia genów na percepcję smakową pszczół miodnych. Jest to osiągane poprzez wstępną syntezę dwuniciowych RNA, celujących w geny trzech białek: vitelli, genin, ultras, spherical oraz białka fluorescencyjnego GFP.

Ponieważ gen kodujący GFP nie występuje w genomie pszczoły miodnej, dwuniciowy RNA GFP służy jako kontrola negatywna. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie dwuniciowego RNA pszczołom miodnym przy zastosowaniu czterech strategii traktowania. Są to: wstrzyknięcie samego dwuniciowego RNA GFP, pojedyncze wstrzyknięcie mieszaniny dwuniciowych RNA VG i USP, wstrzyknięcie dwuniciowego RNA vg w pierwszym dniu, a następnie wstrzyknięcie dwuniciowego RNA USP w drugim dniu, oraz wstrzyknięcie dwuniciowego RNA USP w pierwszym dniu, a następnie wstrzyknięcie dwuniciowego RNA VG w drugim dniu. Po wykonaniu zastrzyków pszczoły oznaczono kropkami z farby w kolorach odpowiadających poszczególnym traktowaniom i zwrócono je do ula.

Sześć dni później wyciszenie genów VG i USP u traktowanych pszczół zostaje potwierdzone za pomocą czasu rzeczywistego PCR, a wpływ podwójnego wyciszenia VG i USP na percepcję smakową określono za pomocą testu PER. Ostatecznie wykazano, że u pszczół z podwójnym wyciszeniem nastąpił znaczny spadek ekspresji genów VG i USP oraz znaczący wzrost percepcji smakowej w odniesieniu do sacharozy. Nasza metoda interferencji jest potężnym narzędziem, którego możemy użyć do ujawnienia funkcji genów.

Zazwyczaj stosuje się tę metodę do celowania w pojedynczy gen. Jednak geny są częścią złożonej sieci regulacyjnej. Jednym ze sposobów na lepsze zrozumienie dowolnego procesu biologicznego jest poznanie tego, w jaki sposób geny oddziałują z siecią genetyczną.

Aby to osiągnąć, musimy manipulować wieloma genami jednocześnie. Do tej pory byliśmy w stanie wyciszać tylko jeden gen naraz u owadów; tutaj, po raz pierwszy, chcemy pokazać, jak przeprowadzić knockdown dwóch genów u pszczół miodnych zamiast jednego. Odruch wyciągania proboscis (PER) jest bardzo użyteczną techniką pomiaru percepcji smakowej, która stanowi behawioralny predyktor zachowań społecznych pszczół miodnych.

Na przykład pszczoły gniazdowe o wysokiej percepcji smakowej szybciej osiągają dojrzałość behawioralną, rozpoczynają żerowanie we wczesnej fazie życia i preferują zbieranie pyłku. Aby rozpocząć tę procedurę, zaprojektuj primery dwuniciowych RNA nakierowane na geny przeznaczone do wyciszenia, korzystając z bezpłatnego oprogramowania primer.Three. W tym doświadczeniu genami poddanymi wyciszeniu są vitelli, genin, lub VG oraz ultraspherical lub USP.

Oprócz projektów dla VG i USP, zaprojektowano startery do dwuniciowego RNA celującego w gen kontrolny kodujący zielone białko fluorescencyjne, GFP, którego nie ma w genomie pszczoły miodnej. Następnie synteza dwuniciowego RNA dla VG, USP i GFP została przeprowadzona poprzez transkrypcję in vitro z wykorzystaniem systemu produkcji RNA Rib Max T7 firmy Promega.

Po oczyszczeniu dwuniciowych RNA zgodnie ze standardowymi procedurami, każdy osad dwuniciowego RNA należy rozpuścić w wodzie wolnej od nukleaz; aby zapewnić skuteczność wyciszania genów, stężenie dwuniciowego RNA powinno wynosić około 9-10 µg/µL. Aby przygotować pszczoły do iniekcji, nowo wyklute osobniki należy schłodzić w lodówce w temperaturze 4 °C przez jedną do dwóch minut. Po unieruchomieniu pszczół, od trzech do czterech osobników należy przymocować równolegle do szalek Petri wypełnionych twardym woskiem, przebijając je szpilkami entomologicznymi między odwłokiem a tułowiem.

Ponownie schłodź pszczoły w lodówce o temperaturze 4 °C przez około jedną do dwóch minut. Upewnij się, że pszczoły są całkowicie nieruchome. Ciała pszczół powinny być rozluźnione, a nie zwinięte lub wykręcone.

Całkowite unieruchomienie jest istotne, ponieważ każdy ruch może zwiększyć rozmiar rany i podnieść śmiertelność. Pszczoły zwinięte lub wykręcone były chłodzone zbyt długo i nie powinny być wykorzystywane ze względu na wysoką śmiertelność. Na mikrosyringę Hamiltona nałóż jednorazową igłę o rozmiarze 30 gauge.

Napełnić strzykawkę trzema mikrolitrami dwuniciowego RNA, upewniając się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. W przypadku zastosowania strategii pojedynczej iniekcji, strzykawkę napełnia się mieszaniną dwuniciowych RNA dwóch genów. W przypadku zastosowania strategii iniekcji dwudniowej, strzykawkę napełnia się jednym z dwóch dwuniciowych RNA.

Wprowadź igłę w bok brzucha. Aby uniknąć uszkodzenia organów wewnętrznych, powoli naciskaj tłok strzykawki, aby umożliwić wchłonięcie dwuniciowego RNA. Ze względu na wysoką lepkość dwuniciowego RNA, jego całkowite wypchnięcie ze strzykawki trwa od dwóch do trzech sekund.

Po całkowitym dociśnięciu tłoka pozostaw igłę w ranie na cztery do pięciu sekund. Obserwuj pszczoły przez trzy do pięciu sekund po iniekcjach. Jeśli z rany wycieknie kropla hemolimfy, odrzuć taką pszczołę; zaznacz tułowia pszczół różnymi kolorami odpowiadającymi poszczególnym wariantom traktowania.

Na tym etapie, jeśli stosowana jest strategia pojedynczej iniekcji, należy obserwować pszczoły przez jedną godzinę w pojemniku z dostarczonym miodem, a następnie umieścić je z powrotem w kolonii. Jeśli natomiast stosowana jest strategia dwudniowej iniekcji i wstrzyknięto jedynie pierwsze dwuniciowe RNA, należy umieścić pszczoły w cylindrycznej klatce z siatki z dostarczonym z boku miodem. Pszczoły należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności 80% przez noc oraz w dniu następnym.

Wstrzyknij tym samym pszczołom drugą dwuniciową cząsteczkę RNA, stosując tę samą procedurę, co w przypadku pierwszej dwuniciowej cząsteczki RNA. Pozostaw pszczoły do regeneracji w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w pojemniku z dostępnym miodem, a następnie wprowadź je do kolonii. Sześć dni po iniekcjach odłów potraktowane pszczoły z kolonii, nie używając podkurzacza do otwarcia ula.

Nie stosuje się dymu, ponieważ mógłby on wpłynąć na percepcję smakową pszczół, która jest badana w tej procedurze. Pszczół zbiera się do klatek w formie cylindrów z metalowej siatki, używając miękkiej pęsety; w celu przeprowadzenia testu PER do każdej klatki umieszcza się nie więcej niż trzy pszczoły.

Schładzaj pszczoły w temperaturze four degrees Celsius, aż zostaną całkowicie unieruchomione. Zamocuj każdą pszczołę pionowo w plastikowej probówce, specjalnie zaprojektowanej do PER. Użyj taśmy, aby utrzymać odwłok wewnątrz probówki, pozostawiając głowę wystającą na zewnątrz.

Umieść probówki w statywie z dwoma rzędami małych plastikowych kolumn. Jeden rząd jest ponumerowany, aby możliwe było przypisanie numeru identyfikacyjnego zamocowanym pszczołom. Umieść statywy z potraktowanymi pszczołami w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności 80% na dwie godziny na czas inkubacji pszczół.

Przygotować szereg roztworów sacharozy w wodzie. Przenieść roztwory do strzykawek z igłami o rozmiarze od 15 do 20 G do przeprowadzenia testu PER.

Pszczoły są badane w grupach. Najpierw dotyka się czułka każdej pszczoły kroplą 0% roztworu, którym jest woda, a następnie przeprowadza się testy z roztworami sacharozy o stężeniach 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% i 30%. Pomiędzy każdym roztworem wodnym należy zachować odstęp co najmniej dwóch minut.

Przetestowanie 20 pszczół przy użyciu jednego stężenia sacharozy zajmuje zazwyczaj około dwóch minut. W związku z tym w każdej grupie zawsze powinno znajdować się więcej niż 20 pszczół. Za reakcję pozytywną uznaje się pełne wysunięcie proboscis. W czasie rzeczywistym.

Analiza PCR potwierdziła, że zarówno strategia pojedynczego wstrzyknięcia, jak i strategia wstrzykiwania rozłożonego na dwa dni, znacząco obniżyły poziomy transkrypcji Fiji i USP u pszczół miodnych. Na tych wykresach, sporządzonych sześć dni po wstrzyknięciu dwuniciowego RNA, wartość RQ oznacza poziom względnej kwantyfikacji transkryptów genu docelowego, a różne litery nad słupkami oznaczają istotne różnice między grupami badawczymi. Analiza post-hoc wykazała, że supresja transkrypcji USP przy zastosowaniu pojedynczego wstrzyknięcia mieszaniny dwuniciowego RNA oraz wstrzykiwań w dwa dni (najpierw VG, potem USP) była znacząco niższa niż w przypadku wstrzykiwań w dwa dni (najpierw USP, potem VG).

Wskazuje to, że VG może być głównym regulatorem w pętli regulacyjnej VG i hormonu młodzieńczego. Wyniki GUA w stosunku do wyników odpowiedzi lub GRS dla traktowanych pszczół obliczono na podstawie wyników odruchu wyciągania trąbki (proboscis extension response) lub testu PER, jak pokazano tutaj. GRS u pszczół, którym wstrzyknięto mieszaninę dwuniciowego RNA dla VG i USP, był znacznie wyższy niż GRS u pszczół kontrolnych GFP, co wskazuje, że pszczoły z podwójnym wyciszeniem genów były bardziej wrażliwe na sacharozę.

Różne litery nad słupkami oznaczają istotne różnice między grupami badawczymi. Przedstawiono tutaj możliwą sieć regulacyjną między vitellogeniną ultras, sferyczną a hormonem juwenilnym, ujawnioną poprzez jednoczesne wyciszenie genów VG i USP. Podczas gdy pojedyncze wyciszenie USP nie wywołuje żadnej zmiany poziomu hormonu juwenilnego, podwójne wyciszenie VG i USP powoduje większy wzrost poziomu hormonu juwenilnego niż pojedyncze wyciszenie VG.

Sugeruje to, że vitelli nie tylko hamuje produkcję hormonu młodzieńczego, ale również hamuje odpowiedź zwrotną hormonu młodzieńczego na knockdown USP. W przypadku podwójnego knockdownu gwałtowny wzrost produkcji hormonu młodzieńczego wynika ze zmniejszenia inhibicji przez VI geninę wywołanej knockdownem VG oraz z odpowiedzi kompensacyjnej na zmniejszoną transdukcję hormonu młodzieńczego spowodowaną knockdownem USP. Bardziej szczegółowa dyskusja na temat tej sieci regulacyjnej znajduje się w towarzyszącym tekście protokołu.

Stosując podejście polegające na podwójnym wyciszaniu genów, ujawniliśmy szczegółową zależność między genami vital, ultras, spherical oraz hormonem młodzieńczym, której nie udałoby się odkryć poprzez supresję tylko jednego genu. Obecnie, wykorzystując tę technikę, badacze mogą zgłębiać wzajemne relacje między genami w obrębie sieci regulacyjnych. PR jest standardową metodą stosowaną do pomiaru percepcji smakowej u pszczół miodnych, jest ona jednak bardzo wrażliwa na sposób manipulacji, dlatego należy zachować szczególną ostrożność w celu zapewnienia spójności warunków środowiskowych oraz sposobu obchodzenia się ze zwierzętami.

Ponadto, jeśli badanie ma być prowadzone przez kilka dni, zaleca się sporządzenie krótkiego harmonogramu oraz monitorowanie warunków pogodowych i środowiskowych, aby upewnić się, że nie uległy one zmianie.