Name: Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-25T08:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj technikę podwójnego knockdownu genu i pomiaru percepcji smakowej u pszczół miodnych Apis mellifera za pomocą testu PER. Ta metoda pozwala badać interakcje genów w sieciach regulacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Erin Fennern za pomoc w eksperymencie. Praca ta została sfinansowana przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych (180504, 185306 i 191699), PEW Charitable Trust oraz National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

Część 1: Podwójne nokautowanie genu za pośrednictwem RNAi
1. Synteza dsRNA
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery dsRNA ukierunkowane na vg, usp i gen kontrolny kodujący białko zielonej fluorescencji (GFP), którego nie ma w genomie pszczoły miodnej: startery zostały zaprojektowane przy użyciu bezpłatnego oprogramowania online Primer3 (<a href="http://frodo.wi.mit.edu/" target="_blank">http://frodo.wi.mit.edu/</a>).</li>
	<li>Synteza dsRNA dla vg, usp i GFP: do transkrypcji in vitro użyj systemu produkcji RNA RiboMax T7 firmy Promega.</li>
	<li>Oczyszczanie dsRNA:
	<ol>
		<li>Denaturacja i renaturacja: podgrzewać dsRNA do temperatury 85 °C przez 5 minut i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Leczenie DNazą I: dodaj 1 μl DNazy I do każdej reakcji dsRNA i wymieszaj je, przesuwając probówki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Do każdej reakcji dodać 150 μl wody wolnej od nukleaz i 750 μl TRizol - LS i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Dodać 200 μl chloroformu do każdej próbki. Mieszać energicznie przez 20 sek. Odwirowywać próbki przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść fazę sklarowaną nad osadem do każdej nowej probówki i dodać 500 μl alkoholu izopropylowego do każdej probówki. Wymieszaj je, odwracając rurkę. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze -20 °C. Odwirowywać przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć supernatant i użyć 1 000 μl 75% etanolu do przepłukania granulatu. Po odwirowaniu probówki przez 5 minut w temperaturze 7 500 x g w temperaturze 4 °C, wysuszyć na powietrzu osad dsRNA i użyć wody wolnej od nukleaz do rozpuszczenia osadu. Aby zapewnić skuteczność regulacji w dół genów, stężenie dsRNA powinno wynosić około 9 -10 μg/μl.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie do brzucha dsRNA
Dla knockdownu podwójnego genu istnieją dwie strategie: 1) pojedyncze wstrzyknięcie: wymieszanie dsRNA dwóch genów i wstrzyknięcie mieszaniny; 2) wstrzyknięcie dwudniowe: pierwszego dnia wstrzyknąć pierwsze dsRNA ukierunkowane na jeden gen, a drugiego dsRNA tym samym pszczołom drugiego dnia.
<ol>
	<li>Nowo powstałe pszczoły schłodzić w lodówce o temperaturze 4 °C przez 1-2 minuty. Kiedy pszczoły są unieruchomione, zamontuj 3-4 pszczoły równolegle na szalkach Petriego pełnych stałego wosku z szpilkami owadów skrzyżowanymi między ich odwłokami i klatką piersiową.</li>
	<li>Ponownie schłodzić pszczoły w lodówce o temperaturze 4 °C. Upewnij się, że pszczoły są całkowicie nieruchome. Zajmuje to około 1-2 min. Pszczoły powinny wyglądać na luźne. Jeśli pszczoły stają się zwijane lub wykrzywione, oznacza to, że są zbyt długo schładzane, czego należy unikać. Zbyt duże wychłodzenie powoduje wysoką śmiertelność, ale całkowite unieruchomienie jest ważne, ponieważ każdy ruch zwiększa rozmiar rany i śmiertelność.</li>
	<li>Umieścić jednorazową igłę 30 G (BD) na mikrostrzykawce Hamiltona. Weź 3 μl dsRNA i upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. Igła jest wprowadzana z boku brzucha, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych. Powoli naciskać tłok strzykawki, aby umożliwić wchłonięcie dsRNA. Ponieważ dsRNA jest bardzo lepkie, potrzeba 2-3 sekund, aby całkowicie wydalić go ze strzykawki. Po całkowitym wciśnięciu tłoka, należy pozostawić igłę w ranie na 4-5 sekund. Obserwuj pszczoły przez 3-5 sekund po wstrzyknięciu. Jeśli z rany wycieknie kropla hemolimfy, wyrzuć pszczołę.</li>
	<li>Użyj różnych kolorów, aby oznaczyć ich klatkę piersiową odpowiadającą różnym zabiegom. W tym momencie, jeśli zastosowano strategię pojedynczego wstrzyknięcia, pszczoły można umieścić z powrotem w kolonii po 1 godzinie obserwacji. Jeśli jednak zastosowano strategię dwudniowego wstrzykiwania, po wstrzyknięciu pierwszego dsRNA, pszczoły powinny zostać umieszczone w klatce z siatki cylindrycznej z miodem dostarczonym z boku i trzymane w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności 80%.</li>
	<li>Drugiego dnia wykonaj kroki 2.2 i 2.3, aby schłodzić pszczoły w klatkach siatkowych i zamontować je na płytkach woskowych. Wykonaj iniekcje z drugim dsRNA, jak opisano w kroku 2.4.</li>
	<li>Pozwól pszczołom dojść do siebie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i wprowadź je do kolonii.</li>
</ol>
Uwaga: Efekty knockdown można wykryć za pomocą ilościowego RT-PCR (qRT-PCR) i western bloting. Ogólnie rzecz biorąc, skuteczność knockdown jest różna i zależy od wielu czynników. W naszym badaniu knockdown podwójnego genu można wykryć 7 dni po pojedynczych wstrzyknięciach i dwudniowych wstrzyknięciach.
Część 2: Test odpowiedzi na przedłużenie trąby (PER)
1. Zbieranie pszczół z ula
W 6 dniu po wstrzyknięciach, zbierz leczone pszczoły z kolonii bez użycia palacza. Zbieraj pszczoły w klatkach cylindrycznych z metalowej siatki. Trzymaj 3 pszczoły w każdej klatce.
2. Montaż pszczół dla PER
Schłodź pszczoły w temperaturze 4 °C, aż zostaną całkowicie unieruchomione. Zamontuj każdą pszczołę pionowo w plastikowej rurce specjalnie zaprojektowanej dla PER. Trzymaj brzuch wewnątrz rurki za pomocą dwóch małych kawałków taśmy i utrzymuj głowę wystającą z rurki. Umieść probówki na stojaku z dwoma rzędami małych plastikowych kolumn i przypisz każdej tubie (pszczółce) numer identyfikacyjny. Następnie umieść leczone pszczoły na stojakach w inkubatorze (34 °C i 80% wilgotności) i trzymaj je w inkubatorze przez 2 godziny.
3. Przygotowanie serii roztworów wodnych z sacharozy
Przygotuj 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% i 30% roztwory sacharozy i załaduj roztwory do strzykawek z igłami 15-20 G.
4. Test PER
Dotknij anteny pszczoły kroplą 0% roztworu (wody), a następnie 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% i 30% roztworem wody sacharozowej. Najpierw przetestuj wszystkie pszczoły wodą i odczekaj co najmniej dwie minuty, ponieważ używany jest odstęp między każdym roztworem. Dlatego zwykle mamy co najmniej 20 pszczół na każdą próbę. Jeśli pszczoła całkowicie rozciągnie trąbkę, liczona jest pozytywna odpowiedź.
5. Zarządzanie danymi
Zsumuj całkowitą liczbę pozytywnych odpowiedzi dla każdej osoby dla oceny odpowiedzi smakowej (GRS). Przeprowadź odpowiednią analizę statystyczną danych.
Część 3. Walidacja knockdownu genu
Tłuste ciała są wycinane z innego zestawu 7-dniowych pszczół leczonych. Do ekstrakcji RNA stosuje się standardową procedurę TRizol, po której następuje leczenie DNazą I 24. Ekspresję genów Vg i usp analizuje się za pomocą dwuetapowego qRT-PCR. Aktyna jest używana jako gen referencyjny, ponieważ ma stabilną ekspresję w różnych tkankach pszczół miodnych. W tym eksperymencie wykorzystano opublikowane startery PCR w czasie rzeczywistym dla genu vg i usp 24. Dane są analizowane przy użyciu metody CT Delta-Delta 25.

<ol><li>Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Argonaute+proteins+in+small+RNA-directed+RNA+cleavage+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways.</a> Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).</li>
<li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+RNAi+for+the+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mammalian RNAi for the masses.</a> Trends Genet. 19, 9-12 (2003).</li>
<li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review.</a> J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).</li>
<li>Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+developmental+gene+silencing+in+the+honey+bee+using+a+homeobox+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif.</a> Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).</li>
<li>Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+vitellogenin+gene+function+in+adult+honeybees+by+intra-abdominal+injection+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA.</a> BMC Biotechnol. 3, 1(2003).</li>
<li>Patel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+a+queen%3A+TOR+pathway+governs+diphenic+caste+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development.</a> PLoS ONE. 6, e509(2007).</li>
<li>Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+vitellogenin+gene+activity+increases+the+gustatory+responsiveness+of+honey+bee+workers+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera).</a> Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+honey+bee+IRS+gene+biases+behavior+toward+food+rich+in+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein.</a> PLoS Genet. 6, e1000896(2010).</li>
<li>Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+perception+and+fat+body+energy+metabolism+are+jointly+affected+by+vitellogenin+and+juvenile+hormone+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees.</a> PLoS Genet. 8, e1002779(2012).</li>
<li>Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+dsRNA+into+Female+A.+aegypti+Mosquitos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos.</a> J. Vis. Exp. (5), e215(2007).</li>
<li>Mussig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).</li>
<li>Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+gene+knock-down+by+a+single+lentiviral+vector+expressing+an+array+of+short+hairpin+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs.</a> Electron J. Biotechnol. 19, 13(2006).</li>
<li>Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-miRNA+hairpin+method+that+improves+gene+knockdown+efficiency+and+provides+linked+multi-gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech%22%5BJournal%5D)">Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown.</a> Biotech. 41, 59-63 (2006).</li>
<li>Ament, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+ultraspiracle+influences+honey+bee+social+behavior+and+behavior-related+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression.</a> PLoS Genet. 8, e1002596(2012).</li>
<li>Amdam, G. V., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hive+bee+to+forager+transition+in+honeybee+colonies%3A+the+double+repressor+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis.</a> J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).</li>
<li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+to+sucrose+predict+foraging+division+of+labor+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Ecol.+Sociobiol%22%5BJournal%5D)">Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).</li>
<li>Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+communal+crop%3A+modulation+of+sucrose+response+thresholds+of+pre-foraging+honey+bees+with+incoming+nectar+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Ecol.+Sociobiol%22%5BJournal%5D)">The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).</li>
<li>Jaycox, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Changes+in+Worker+Honey+Bees+%28Apis+mellifera+L.%29+after+Injection+with+Synthetic+Juvenile+Hormone+%28Hymenoptera%3A+Apidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Kan.+Entomol.+Soc%22%5BJournal%5D)">Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae).</a> J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).</li>
<li>Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+changes+in+worker+honey+bees+%28Apis+mellifera%29+induced+by+injections+of+a+juvenile+hormone+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Entomol.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic.</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).</li>
<li>Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+pharmacology+of+octopamine%2C+tyramine+and+dopamine+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees.</a> Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).</li>
<li>Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+juvenile+hormone+analogue+on+honey+bee+foraging+behaviour+and+alarm+pheromone+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production.</a> J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).</li>
<li>Giurfa, M., Malun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+mechanosensory+conditioning+of+the+proboscis+extension+reflex+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Lear+Memory%22%5BJournal%5D)">Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees.</a> Lear Memory. 11, 294-302 (2004).</li>
<li>Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+genotype%2C+foraging+role%2C+and+sucrose+responsiveness+on+the+tactile+learning+performance+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.).</a> Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDK1+and+HR46+gene+homologs+tie+social+behavior+to+ovary+signals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals.</a> PLoS ONE. 4, e4899(2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+behaviorally+associated+gene+networks+in+worker+honey+bee+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries.</a> J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).</li>
<li>Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+social+behaviour+derived+from+maternal+reproductive+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits.</a> Nature. 439, 76-78 (2006).</li>
<li>Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmdam%2C+GV+%22Hormones%2C+Brain+and+Behavio%22">Hormones, Brain and Behavio</a>. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).</li>
<li>Guidugli, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+regulates+hormonal+dynamics+in+the+worker+caste+of+a+eusocial+insect%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect.</a> FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).</li>
<li>Corona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((juvenile+hormone%2C+insulin+signaling%2C+and+queen+honey+bee+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).</li>
<li>Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+scan+for+cis-regulatory+DNA+motifs+associated+with+social+behavior+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).</li>
<li>Amdam, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+control+of+the+yolk+precursor+vitellogenin+regulates+immune+function+and+longevity+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees.</a> Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).</li>
<li>Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+antiviral+weapon+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">RNA interference: antiviral weapon and beyond.</a> World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).</li>
<li>Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Argonaute+family%3A+tentacles+that+reach+into+RNAi%2C+developmental+control%2C+stem+cell+maintenance%2C+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis.</a> Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).</li>
<li>Hunt, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genomics+of+honeybee+foraging+and+nest+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense.</a> Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).</li>
<li>Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+sucrose+response+thresholds+in+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%3A+influence+of+genotype%2C+feeding%2C+and+foraging+experience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience.</a> J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).</li>
<li>Pankiw, T., Page, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pheromones%2C+hormones%2C+and+handling+on+sucrose+response+thresholds+of+honey+bees+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A.+Neuroethol.+Sens.+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Nasze badanie jest pierwszą próbą jednoczesnego obalenia dwóch genów u dorosłych owadów. Nasze wyniki pokazują, że dwie strategie wstrzykiwań dsRNA (pojedyncze wstrzyknięcie i dwudniowe wstrzyknięcie) są skuteczne w przypadku podwójnej supresji genów, a jednoczesne wyciszanie genów vg i usp można przetestować 6 dni po wstrzyknięciu dsRNA pszczołom 8,9. Jednak skuteczność knockdownu genów różni się u różnych gatunków owadów w zależności od poziomu transkryptu genu docelowego, szybkości obrotu ...

Interferencja RNA (RNAi) to posttranskrypcyjne wyciszanie genów oparte na RNA, które występuje w wielu różnych organizmach eukariotycznych. Proces RNAi jest wywoływany przez endogenne lub egzogenne prekursory dwuniciowego RNA (dsRNA). dsRNA aktywuje białko rybonukleazy Dicer, które wiąże i rozszczepia dsRNA na małe fragmenty (20-25 pz). Następnie małe fragmenty dsRNA kierują rozpoznawaniem i szczepieniem komplementarnych mRNA przez białka argonaute, katalityczny składnik kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC)1. U ssaków dsRNA dłuższe niż 30 nt aktywują odpowiedź przeciwwirusową (odpowiedź interferonową, IFN), która prowadzi do niespecyficznej degradacji transkryptów RNA 2. Jednak długie dsRNA okazały się skuteczne i specyficzne dla owadów, ponieważ brakuje tego IFN 3.
Długie dsRNA były używane do obniżania docelowych genów u różnych gatunków owadów. Pszczoły miodne są jednymi z pionierskich organizmów owadzich, w których ujawniono funkcje wielu ważnych genów w rozwoju i zachowaniu dzięki zastosowaniu dsRNA 4,5. U pszczół miodnych zastosowano kilka metod dostarczania dsRNA: karmienie dsRNA skutecznie obniża ekspresję genów docelowych u larw pszczół miodnych 6, podczas gdy wstrzykiwanie dsRNA jest skutecznym podejściem do knockdownu genów w zarodkach pszczół miodnych 4 i dorosłych pszczołach 7,8.
Efekty knockdown genu wykazywane przez zastosowanie dsRNA do owadów są przejściowe i zlokalizowane. Badania wykazały, że zarówno zastrzyki dsRNA w jamie brzusznej, jak i wstrzyknięcia dsRNA w klatce piersiowej skutecznie hamują ekspresję genów docelowych w komórkach tłuszczowych jamy brzusznej owadów 9,10. DsRNA jest wstrzykiwane do jamy brzusznej i klatki piersiowej, a komórki tłuszczowe są w stanie pobrać dsRNA z hemolimfy, w której komórki są kąpane 10. Jednak geny w innych narządach, takich jak jajniki i mózg, nie mogą być celem ani zastrzyków w jamę brzuszną, ani w klatkę piersiową. W celu celowania w geny w mózgu pszczoły miodnej przeprowadzono również wstrzyknięcie do mózgu dsRNA, które skutecznie wpływa na ekspresję genów docelowych w lokalnych obszarach mózgu 11. Tutaj dokumentujemy tylko wstrzyknięcie dsRNA do jamy brzusznej, które jest częściej stosowane u dorosłych pszczół miodnych.
RNAi było przede wszystkim używane do celowania w pojedynczy gen i było potężnym narzędziem do ujawnienia funkcji genu. Jednak żaden gen nie jest izolowany od innych; Znajduje się w złożonych sieciach regulacyjnych. Kluczem do zrozumienia procesu biologicznego jest przeanalizowanie, w jaki sposób geny oddziałują ze sobą, co wymaga jednoczesnych manipulacji wieloma genami, a nie wyłączeniem pojedynczego genu. W liniach komórkowych ssaków naukowcom udało się jednocześnie zahamować dwa lub trzy geny za pomocą systemów dostarczania 12 lub spinek do włosów z wieloma mikroRNA (miRNA) 13. Ale u owadów wielokrotne knockdowny genów są nadal nieprzetestowane. W tym miejscu przedstawiamy różne strategie iniekcji, które mogą doprowadzić do podwójnego knockdownu genu. Naszym celem są dwa geny: witellogenina (vg), która koduje prekursor białka żółtka, oraz ultraspiracle (usp), który koduje przypuszczalny receptor dla hormonu juwenilnego (JH) i może służyć jako czynnik transkrypcyjny pośredniczący w odpowiedziach na JH 14 u pszczół miodnych. Vg i JH regulują się nawzajem w pętli sprzężenia zwrotnego 15 i są zaangażowane w regulację zachowania pszczół miodnych 9. Korzystając z podwójnego knockdownu, zaburzamy zarówno szlaki Vg, jak i JH i odkrywamy, w jaki sposób wspólnie wpływają one na zachowanie i fizjologię pszczół miodnych oraz jak vg, usp i JH oddziałują na siebie 9.
Percepcja smakowa jest behawioralnym predyktorem zachowań społecznych pszczół miodnych 16. Jeśli chodzi o rozwój behawioralny, pszczoły gniazdowe o wysokiej percepcji smakowej szybko dojrzewają behawioralnie i zwykle żerują we wczesnym okresie życia i wolą zbierać pyłek 16,17. Chociaż mechanizmy regulacyjne leżące u podstaw percepcji smakowej są nadal niejasne, badania wykazały, że percepcja smakowa jest powiązana z wewnętrznym metabolizmem energetycznym 9, wydzielaniem hormonów 18,19 i biogenetycznymi szlakami aminowymi 20. Zarówno Vg, jak i JH są ważnymi regulatorami hormonalnymi modulującymi percepcję smakową 7,21. W laboratorium zmienność percepcji smakowej u pszczół miodnych można ocenić, testując reakcję na rozszerzenie trąbki (PER) na różne roztwory sacharozy. Każda pszczoła jest testowana poprzez dotknięcie obu czułków kroplą wody, a następnie rosnącą serią stężeń 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% sacharozy. Pozytywną reakcję obserwuje się, jeśli pszczoła całkowicie wysuwa trąbkę, gdy kropla wody lub sacharozy zostanie dotknięta do każdej anteny. Na podstawie liczby pozytywnych reakcji na roztwory można określić poziom percepcji smakowej każdej osoby 16. Zastosowanie PER nie ogranicza się jednak do pomiaru percepcji smakowej. PER jest również skuteczną metodą badania stanu metabolicznego pszczół, takiego jak sytość vs. głód. Pszczoły z większą reakcją na sacharozę są ogólnie bardziej głodne (Wang i Amdam, dane niepublikowane). Co więcej, paradygmat PER może być również stosowany w uczeniu się asocjacyjnym i pamięci u pszczół miodnych. W takim przypadku pszczoły zostaną przeszkolone, aby kojarzyć obecność wody sacharozowej z zapachem. Kiedy pszczoły uczą się skojarzenia, tylko obecność zapachu może wywołać pozytywną reakcję trąbki bez nagradzania ich sacharozą 22,23. W tym filmie pokazujemy, jak wykonać PER, aby ocenić percepcję smakową, która została połączona z podwójnym nokdaunem vg i usp w poprzednim badaniu 9.

<table><tbody><tr><td>Koraliki GE Healthcare PCR w 96-dołkowej płytce</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9557-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>System produkcji RNA RiboMax T7</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform: alkohol izoamylowy 24:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>alkohol izopropylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Mikrostrzykawka Hamilton</td><td></td><td>Hamilton 80301</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe igły 30G BD</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>30960</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop preparacyjny</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6D</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>Płytka</td><td></td><td></td><td></td> woskowa</tr></tbody></table>

pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem rnai u pszczół miodnych (apis mellifera)

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

Ten film demonstruje nowatorskie techniki interferencji RNA (RNAi), które obniżają poziom dwóch genów jednocześnie u pszczół miodnych za pomocą wstrzyknięć z dwuniciowym RNA (dsRNA). Przedstawiono również protokół testu odpowiedzi na rozszerzenie trąbki (PER) do pomiaru percepcji smakowej.	
	Knockdown genów za pośrednictwem RNAi jest skuteczną techniką obniżającą ekspresję genów docelowych. Technika ta jest zwykle stosowana do manipulacji pojedynczymi genami, ale ma ograniczenia w wykrywaniu interakcji i wspólnych efektów między genami. W pierwszej części tego filmu przedstawiamy dwie strategie jednoczesnego knockdown dwóch genów (tzw. double gene knockdown). Pokazujemy, że obie strategie są w stanie skutecznie stłumić dwa geny, witellogeninę (vg) i ultraspiracle (usp), które znajdują się w regulacyjnej pętli sprzężenia zwrotnego. To podejście oparte na podwójnym nokaucie genów może być wykorzystane do analizy wzajemnych powiązań między genami i może być łatwo stosowane u różnych gatunków owadów.	
	Druga część tego filmu to demonstracja testu odpowiedzi na przedłużenie trąbki (PER) u pszczół miodnych po leczeniu knockdownu podwójnego genu. Test PER jest standardowym testem do pomiaru percepcji smakowej u pszczół miodnych, który jest kluczowym predyktorem szybkości dojrzewania behawioralnego pszczoły miodnej. Większa percepcja smakowa pszczół gniazdowych wskazuje na zwiększony rozwój behawioralny, który często wiąże się z wcześniejszym wiekiem na początku żerowania i specjalizacją żerowania w pyłku. Ponadto test PER może być stosowany do identyfikacji metabolicznych stanów sytości lub głodu u pszczół miodnych. Wreszcie, test PER w połączeniu z parowaniem różnych bodźców zapachowych w celu kondycjonowania pszczół jest również szeroko stosowany do badań nad uczeniem się i pamięcią u pszczół miodnych.

Zarówno strategia pojedynczego wstrzyknięcia, jak i strategia wstrzykiwań dwudniowych znacząco obniżyły poziomy transkrypcji vg (ANOVA jednoczynnikowa, p &lt; 0,001) (Rysunek 2A) oraz usp (ANOVA jednoczynnikowa, p &lt; 0,001) (Rysunek 2B) u pszczół miodnych sześć dni po wstrzyknięciu dsRNA. Supresja transkrypcji usp przy zastosowaniu pojedynczego wstrzyknięcia mieszaniny dsRNA oraz wstrzykiwań dwudniowych z najpierw vg, a następnie usp (vg...

W tym protokole opisujemy dwie strategie, które jednocześnie tłumią dwa geny (podwójny knockdown genu) u pszczół miodnych. Następnie przedstawiamy, jak wykorzystać test odpowiedzi na rozszerzenie trąby (PER) do zbadania wpływu knockdownu podwójnego genu na percepcję smakową pszczoły miodnej.

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Niniejszy protokół wideo demonstruje nowe techniki jednoczesnego wyciszania dwóch genów u dorosłych pszczół miodnych, a następnie przeprowadzania testu reakcji wysunięcia trąbki (PER), aby zmierzyć wpływ podwójnego wyciszenia genów na percepcję smakową pszczół miodnych. Jest to osiągane poprzez wstępną syntezę dwuniciowych RNA, celujących w geny trzech białek: vitelli, genin, ultras, spherical oraz białka fluorescencyjnego GFP.Ponieważ gen kodujący GFP nie występuje w genomie pszczoły miodnej, dwuniciowy RNA GFP służy jako kontrola negatywna. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie dwuniciowego RNA pszczołom miodnym przy zastosowaniu czterech strategii traktowania. Są to: wstrzyknięcie samego dwuniciowego RNA GFP, pojedyncze wstrzyknięcie mieszaniny dwuniciowych RNA VG i USP, wstrzyknięcie dwuniciowego RNA vg w pierwszym dniu, a następnie wstrzyknięcie dwuniciowego RNA USP w drugim dniu, oraz wstrzyknięcie dwuniciowego RNA USP w pierwszym dniu, a następnie wstrzyknięcie dwuniciowego RNA VG w drugim dniu. Po wykonaniu zastrzyków pszczoły oznaczono kropkami z farby w kolorach odpowiadających poszczególnym traktowaniom i zwrócono je do ula.Sześć dni później wyciszenie genów VG i USP u traktowanych pszczół zostaje potwierdzone za pomocą czasu rzeczywistego PCR, a wpływ podwójnego wyciszenia VG i USP na percepcję smakową określono za pomocą testu PER. Ostatecznie wykazano, że u pszczół z podwójnym wyciszeniem nastąpił znaczny spadek ekspresji genów VG i USP oraz znaczący wzrost percepcji smakowej w odniesieniu do sacharozy. Nasza metoda interferencji jest potężnym narzędziem, którego możemy użyć do ujawnienia funkcji genów.Zazwyczaj stosuje się tę metodę do celowania w pojedynczy gen. Jednak geny są częścią złożonej sieci regulacyjnej. Jednym ze sposobów na lepsze zrozumienie dowolnego procesu biologicznego jest poznanie tego, w jaki sposób geny oddziałują z siecią genetyczną.Aby to osiągnąć, musimy manipulować wieloma genami jednocześnie. Do tej pory byliśmy w stanie wyciszać tylko jeden gen naraz u owadów; tutaj, po raz pierwszy, chcemy pokazać, jak przeprowadzić knockdown dwóch genów u pszczół miodnych zamiast jednego. Odruch wyciągania proboscis (PER) jest bardzo użyteczną techniką pomiaru percepcji smakowej, która stanowi behawioralny predyktor zachowań społecznych pszczół miodnych.Na przykład pszczoły gniazdowe o wysokiej percepcji smakowej szybciej osiągają dojrzałość behawioralną, rozpoczynają żerowanie we wczesnej fazie życia i preferują zbieranie pyłku. Aby rozpocząć tę procedurę, zaprojektuj primery dwuniciowych RNA nakierowane na geny przeznaczone do wyciszenia, korzystając z bezpłatnego oprogramowania primer.Three. W tym doświadczeniu genami poddanymi wyciszeniu są vitelli, genin, lub VG oraz ultraspherical lub USP.Oprócz projektów dla VG i USP, zaprojektowano startery do dwuniciowego RNA celującego w gen kontrolny kodujący zielone białko fluorescencyjne, GFP, którego nie ma w genomie pszczoły miodnej. Następnie synteza dwuniciowego RNA dla VG, USP i GFP została przeprowadzona poprzez transkrypcję in vitro z wykorzystaniem systemu produkcji RNA Rib Max T7 firmy Promega.Po oczyszczeniu dwuniciowych RNA zgodnie ze standardowymi procedurami, każdy osad dwuniciowego RNA należy rozpuścić w wodzie wolnej od nukleaz; aby zapewnić skuteczność wyciszania genów, stężenie dwuniciowego RNA powinno wynosić około 9-10 µg/µL. Aby przygotować pszczoły do iniekcji, nowo wyklute osobniki należy schłodzić w lodówce w temperaturze 4 °C przez jedną do dwóch minut. Po unieruchomieniu pszczół, od trzech do czterech osobników należy przymocować równolegle do szalek Petri wypełnionych twardym woskiem, przebijając je szpilkami entomologicznymi między odwłokiem a tułowiem.Ponownie schłodź pszczoły w lodówce o temperaturze 4 °C przez około jedną do dwóch minut. Upewnij się, że pszczoły są całkowicie nieruchome. Ciała pszczół powinny być rozluźnione, a nie zwinięte lub wykręcone.Całkowite unieruchomienie jest istotne, ponieważ każdy ruch może zwiększyć rozmiar rany i podnieść śmiertelność. Pszczoły zwinięte lub wykręcone były chłodzone zbyt długo i nie powinny być wykorzystywane ze względu na wysoką śmiertelność. Na mikrosyringę Hamiltona nałóż jednorazową igłę o rozmiarze 30 gauge.Napełnić strzykawkę trzema mikrolitrami dwuniciowego RNA, upewniając się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. W przypadku zastosowania strategii pojedynczej iniekcji, strzykawkę napełnia się mieszaniną dwuniciowych RNA dwóch genów. W przypadku zastosowania strategii iniekcji dwudniowej, strzykawkę napełnia się jednym z dwóch dwuniciowych RNA.Wprowadź igłę w bok brzucha. Aby uniknąć uszkodzenia organów wewnętrznych, powoli naciskaj tłok strzykawki, aby umożliwić wchłonięcie dwuniciowego RNA. Ze względu na wysoką lepkość dwuniciowego RNA, jego całkowite wypchnięcie ze strzykawki trwa od dwóch do trzech sekund.Po całkowitym dociśnięciu tłoka pozostaw igłę w ranie na cztery do pięciu sekund. Obserwuj pszczoły przez trzy do pięciu sekund po iniekcjach. Jeśli z rany wycieknie kropla hemolimfy, odrzuć taką pszczołę; zaznacz tułowia pszczół różnymi kolorami odpowiadającymi poszczególnym wariantom traktowania.Na tym etapie, jeśli stosowana jest strategia pojedynczej iniekcji, należy obserwować pszczoły przez jedną godzinę w pojemniku z dostarczonym miodem, a następnie umieścić je z powrotem w kolonii. Jeśli natomiast stosowana jest strategia dwudniowej iniekcji i wstrzyknięto jedynie pierwsze dwuniciowe RNA, należy umieścić pszczoły w cylindrycznej klatce z siatki z dostarczonym z boku miodem. Pszczoły należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności 80% przez noc oraz w dniu następnym.Wstrzyknij tym samym pszczołom drugą dwuniciową cząsteczkę RNA, stosując tę samą procedurę, co w przypadku pierwszej dwuniciowej cząsteczki RNA. Pozostaw pszczoły do regeneracji w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w pojemniku z dostępnym miodem, a następnie wprowadź je do kolonii. Sześć dni po iniekcjach odłów potraktowane pszczoły z kolonii, nie używając podkurzacza do otwarcia ula.Nie stosuje się dymu, ponieważ mógłby on wpłynąć na percepcję smakową pszczół, która jest badana w tej procedurze. Pszczół zbiera się do klatek w formie cylindrów z metalowej siatki, używając miękkiej pęsety; w celu przeprowadzenia testu PER do każdej klatki umieszcza się nie więcej niż trzy pszczoły.Schładzaj pszczoły w temperaturze four degrees Celsius, aż zostaną całkowicie unieruchomione. Zamocuj każdą pszczołę pionowo w plastikowej probówce, specjalnie zaprojektowanej do PER. Użyj taśmy, aby utrzymać odwłok wewnątrz probówki, pozostawiając głowę wystającą na zewnątrz.Umieść probówki w statywie z dwoma rzędami małych plastikowych kolumn. Jeden rząd jest ponumerowany, aby możliwe było przypisanie numeru identyfikacyjnego zamocowanym pszczołom. Umieść statywy z potraktowanymi pszczołami w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności 80% na dwie godziny na czas inkubacji pszczół.Przygotować szereg roztworów sacharozy w wodzie. Przenieść roztwory do strzykawek z igłami o rozmiarze od 15 do 20 G do przeprowadzenia testu PER.Pszczoły są badane w grupach. Najpierw dotyka się czułka każdej pszczoły kroplą 0% roztworu, którym jest woda, a następnie przeprowadza się testy z roztworami sacharozy o stężeniach 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% i 30%. Pomiędzy każdym roztworem wodnym należy zachować odstęp co najmniej dwóch minut.Przetestowanie 20 pszczół przy użyciu jednego stężenia sacharozy zajmuje zazwyczaj około dwóch minut. W związku z tym w każdej grupie zawsze powinno znajdować się więcej niż 20 pszczół. Za reakcję pozytywną uznaje się pełne wysunięcie proboscis. W czasie rzeczywistym.Analiza PCR potwierdziła, że zarówno strategia pojedynczego wstrzyknięcia, jak i strategia wstrzykiwania rozłożonego na dwa dni, znacząco obniżyły poziomy transkrypcji Fiji i USP u pszczół miodnych. Na tych wykresach, sporządzonych sześć dni po wstrzyknięciu dwuniciowego RNA, wartość RQ oznacza poziom względnej kwantyfikacji transkryptów genu docelowego, a różne litery nad słupkami oznaczają istotne różnice między grupami badawczymi. Analiza post-hoc wykazała, że supresja transkrypcji USP przy zastosowaniu pojedynczego wstrzyknięcia mieszaniny dwuniciowego RNA oraz wstrzykiwań w dwa dni (najpierw VG, potem USP) była znacząco niższa niż w przypadku wstrzykiwań w dwa dni (najpierw USP, potem VG).Wskazuje to, że VG może być głównym regulatorem w pętli regulacyjnej VG i hormonu młodzieńczego. Wyniki GUA w stosunku do wyników odpowiedzi lub GRS dla traktowanych pszczół obliczono na podstawie wyników odruchu wyciągania trąbki (proboscis extension response) lub testu PER, jak pokazano tutaj. GRS u pszczół, którym wstrzyknięto mieszaninę dwuniciowego RNA dla VG i USP, był znacznie wyższy niż GRS u pszczół kontrolnych GFP, co wskazuje, że pszczoły z podwójnym wyciszeniem genów były bardziej wrażliwe na sacharozę.Różne litery nad słupkami oznaczają istotne różnice między grupami badawczymi. Przedstawiono tutaj możliwą sieć regulacyjną między vitellogeniną ultras, sferyczną a hormonem juwenilnym, ujawnioną poprzez jednoczesne wyciszenie genów VG i USP. Podczas gdy pojedyncze wyciszenie USP nie wywołuje żadnej zmiany poziomu hormonu juwenilnego, podwójne wyciszenie VG i USP powoduje większy wzrost poziomu hormonu juwenilnego niż pojedyncze wyciszenie VG.Sugeruje to, że vitelli nie tylko hamuje produkcję hormonu młodzieńczego, ale również hamuje odpowiedź zwrotną hormonu młodzieńczego na knockdown USP. W przypadku podwójnego knockdownu gwałtowny wzrost produkcji hormonu młodzieńczego wynika ze zmniejszenia inhibicji przez VI geninę wywołanej knockdownem VG oraz z odpowiedzi kompensacyjnej na zmniejszoną transdukcję hormonu młodzieńczego spowodowaną knockdownem USP. Bardziej szczegółowa dyskusja na temat tej sieci regulacyjnej znajduje się w towarzyszącym tekście protokołu.Stosując podejście polegające na podwójnym wyciszaniu genów, ujawniliśmy szczegółową zależność między genami vital, ultras, spherical oraz hormonem młodzieńczym, której nie udałoby się odkryć poprzez supresję tylko jednego genu. Obecnie, wykorzystując tę technikę, badacze mogą zgłębiać wzajemne relacje między genami w obrębie sieci regulacyjnych. PR jest standardową metodą stosowaną do pomiaru percepcji smakowej u pszczół miodnych, jest ona jednak bardzo wrażliwa na sposób manipulacji, dlatego należy zachować szczególną ostrożność w celu zapewnienia spójności warunków środowiskowych oraz sposobu obchodzenia się ze zwierzętami.Ponadto, jeśli badanie ma być prowadzone przez kilka dni, zaleca się sporządzenie krótkiego harmonogramu oraz monitorowanie warunków pogodowych i środowiskowych, aby upewnić się, że nie uległy one zmianie.

rnai-mediated-double-gene-knockdown-gustatory-perception-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mediane przez RNAi podwójne wyłączenie genu i pomiar percepcji gustatoryjnej u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

RNA (RNAi) są podstawą badań nad Tribolium. W tym miejscu przedstawiamy przegląd naszej techniki RNAi larwalnych w Tribolium castaneum. Larwalne RNAi to prosta, ale potężna technika, która zapewnia szybki dostęp do fenotypów utraty funkcji, umożliwiając naukowcom badanie funkcji genów w różnych kontekstach.

Interferencja larwalnego RNA u chrząszcza mącznego (Tribolium castaneum)

Korzystając z dwóch metod do oszacowania ekspresji genów w głównych wyrostkach smakowych Aedes aegypti, zidentyfikowaliśmy zestaw genów przypuszczalnie leżących u podstaw reakcji neuronalnych na gorzkie i odpychające związki, zgodnie z badaniem elektrofizjologicznym.

Zapisy fizjologiczne i sekwencjonowanie RNA wyrostków smakowych komara Aedes aegypti wywołującego żółtą febrę

Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół przygotowania jednokohortowych kolonii pszczół miodnych - użyteczne narzędzie do analizy fizjologii pracowników związanych z rolą. Opisujemy również szczegółowe protokoły leczenia pracowników hormonem juwenilnym i ekdyzonem, aby ocenić udział tych hormonów w regulacji zachowania i/lub fizjologii pracowników.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Prezentowany tutaj jest protokół użycia systemu CRISPR-Cas9 do zmniejszenia produkcji białka w mózgu dorosłej pszczoły miodnej w celu zbadania swoistości przeciwciał.

Testowanie przeciwciał przeciwko receptorom anty-RDL i anty-mGlutR1 w skrawkach mózgu pszczoły miodnej przy użyciu CRISPR-Cas9

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Tutaj opisujemy metody efektywnych iniekcji poczwarek i dorosłych osobników w Nasonia vitripennis jako dostępne alternatywy dla mikroiniekcji zarodków, umożliwiając funkcjonalną analizę interesujących genów za pomocą wyciszania RNA poprzez interferencję RNA (RNAi) lub nokautowania genów za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

Ten protokół został opracowany w celu lepszego zrozumienia, jak agrochemikalia wpływają na reprodukcję pszczół miodnych (Apis mellifera), poprzez ustanowienie metod wystawiania królowych pszczół miodnych i ich opiekunów na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych, laboratoryjnych warunkach i uważne monitorowanie ich odpowiednich reakcji.

Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Poznaj technikę podwójnego knockdownu genu i pomiaru percepcji smakowej u pszczół miodnych Apis mellifera za pomocą testu PER. Ta metoda pozwala badać interakcje genów w sieciach regulacyjnych.

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Przeglądaj więcej filmów