Name: Ekstrakcja i analiza prostaglandyn w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji i analizy prostaglandyn w Caenorhabditis elegans przy użyciu chromatografii cieczowej ze spektrometrią masową LC-MS/MS. Technika ta oferuje wysoką czułość i specyficzność w badaniach metabolitów lipidowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Laboratorium Ukierunkowanej Metabolomiki i Proteomiki UAB, które było częściowo wspierane przez Centrum Badań nad Chorobami Skóry UAB (P30 AR050948 do C. Elmetsa), Centrum Ostrego Uszkodzenia Nerek UAB-UCSD O'Brien (P30 DK079337 do A. Agarwala) oraz Centrum Zdrowia Płuc UAB (R01 HL114439, R01 HL110950 do J.E. Blalocka). Wsparcie dla spektrometru mas pochodziło z grantu NCRR Shared Instrumentation (S10 RR19261 dla S. Barnesa). Dziękujemy również Rayowi Moore'owi za wsparcie techniczne. C. Szczepy elegans zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez NIH. Prace te były wspierane przez NIH (R01GM085105 do MAM, w tym suplement administracyjny ARRA).

Protokół opisany poniżej jest podzielony na trzy sekcje: hodowla robaków, ekstrakcja prostaglandyn i analiza prostaglandyn. Jak już wspomniano, istnieje wiele momentów, w których próbki mogą być tymczasowo przechowywane w temperaturze -80 °C lub -20 °C.
1. Kultura robaków
Zalecamy około 6 g robaków w fazie mieszanej dla kompleksowych LC-MS/MS. Powinno to zapewnić wystarczającą ilość materiału do wykrycia co najmniej sześciu oddzielnych wstrzyknięć. Do ilościowego określenia znanych PG za pomocą MRM w jednym lub dwóch wstrzyknięciach wystarczą 1-2 g. Możliwa jest również analiza ekstraktów z kultur zsynchronizowanych składających się z określonego etapu. Jednocześnie można uprawiać do 4 różnych odmian. Na przykład kontrola typu dzikiego i trzy różne zmutowane szczepy.
<ol>
	<li>Przygotuj 65 bardzo dużych (16 cm) płytek NGM i skoncentrowanych bakterii do dodatkowego karmienia. Do wysiewu użyj bakterii NA22. Aby wytworzyć skoncentrowane bakterie do dokarmiania, hoduj co najmniej cztery litry NA22 w podłożu LB przez 16-24 godziny. Odkręcić, usunąć supernatant i ponownie zawiesić bakterie w 100 ml buforu M9. Dla każdego szczepu robaków może być wymagane od 200 do 400 ml tego stężonego roztworu bakteryjnego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozpocznij hodowle robaków na 5 bardzo dużych płytkach. Hoduj robaki przez około 3 do 4 pokoleń, aż talerze będą pełne grawitacyjnych dorosłych. W razie potrzeby skoncentrowane bakterie należy dodać do talerzy, aby zapobiec głodowi (~ 1 ml / talerz i pozostawić do całkowitego wyschnięcia przed założeniem pokrywki).</li>
	<li>Zmyj grawitacyjne hermafrodyty z płytek buforem M9 i zbierz robaki do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Pozwól grawitacyjnym hermafrodytom osiąść na dnie (zwykle około 3-5 minut). Usuń supernatant, w tym bakterie, jaja i robaki w stadium larwalnym. Zawiesić w 15 ml buforu M9 i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Przenieś 200 μl zawiesiny ślimakowej na każdą z 60 płytek NGM z nasionami. Rozprowadź robaki po płytach. Utrzymuj roztwór robaka dobrze wymieszany, aż wszystkie płytki zostaną wysiane, aby upewnić się, że otrzymają mniej więcej równą liczbę robaków.</li>
	<li>W razie potrzeby uzupełnij skoncentrowanymi bakteriami (~1 ml / talerz / okres od 12 do 24 godzin), aby zapobiec głodowi. Pozostaw talerze do wyschnięcia na powietrzu przed założeniem pokrywek. Hoduj robaki przez 2-4 pokolenia, w zależności od pierwotnej liczby wysianych robaków lub do momentu, gdy talerze będą pełne grawitacyjnych dorosłych.</li>
	<li>Zbieraj płytki robaków po jednej odmianie na raz. Zmyj robaki z płytek buforem M9 i zbierz w 50 ml probówkach polipropylenowych (np. 6 probówek). Użyj bufora M9, aby umyć płytkę, a następnie przenieś wypełniony robakami bufor na następną płytkę. Po umyciu pewnej liczby płytek (np. 10tysięcy) należy przenieść bufor wypełniony robakami do probówki o pojemności 50 ml. Napełnij rurkę do góry buforem M9. Powtórz pranie dla pozostałych płytek.</li>
	<li>Gdy ciężarne dorosłe osobniki osiądą na dnie w ciągu 5-6 minut, usuń supernatant (~ 35 ml) i skonsoliduj w jednej lub dwóch probówkach. Napełnij probówki do 50 ml świeżym buforem M9, odstaw na 3-5 minut i usuń supernatant pozostawiając ciężkie dorosłe osobniki. Powtórzyć 3 razy lub do momentu, gdy supernatant stanie się przezroczysty.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura o dużym otworze przenieś jak najwięcej robaków do dwóch stożkowych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Wirować z prędkością 1,000 rcf (~3,500 obr./min w CentraSL2) przez 5 minut w wirówce klinicznej. Usunąć supernatant i powtarzać, aż wszystkie robaki zostaną przeniesione i granulowane w tej samej probówce. Usunąć jak najwięcej supernatantu i przechowywać robaki w temperaturze -80 °C. Czynność powtórzyć dla wszystkich szczepów.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja prostaglandyn
Odczynniki potrzebne do ekstrakcji są pokazane poniżej. Metoda jest zmodyfikowana w stosunku do metody Golovko i Murphy'ego17 i obejmuje ekstrakcję acetonem, a następnie oczyszczanie ciecz-ciecz, co zwiększa czułość LC-MS/MS. W procedurze używany jest homogenizator Bullet Blender 5, chociaż podobne wyniki można uzyskać za pomocą homogenizatora Dounce. Butylowany hydroksytoluen (BHT) i odparowanie w gazowym azocie (N2) są stosowane w celu zapobieżenia utlenianiu. Wszystkie naczynia szklane powinny być silikonowane (Sigmacote) w celu zmniejszenia wiązania lipidów. Ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi powinna odbywać się w kapturze chemicznym.
<ol>
	<li>Zważyć stożkową probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml. Przenieść około 6,0 g zamrożonych robaków z probówki stożkowej o pojemności 15 ml przechowywanej w temperaturze -80 °C, przecinając probówkę gorącą żyletką w pobliżu oznaczenia 6,5 ml. Szpatułka oczyszczona metanolem może być użyta do usunięcia zamrożonego granulatu robaka z dna tuby. Przecinając osad w celu odzyskania dolnej części, pozostawia się mniej gęstych larw robaków i szczątków bakterii z górnej części osadu.</li>
	<li>Przenieść zamrożone robaki do wstępnie zważonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Jeśli przetwarzanych jest wiele próbek, należy użyć tej samej ilości (6,0 g) tkanki do badań porównawczych. Gdy robaki rozmrażają się w pastę, dodaj lub usuń robaki za pomocą szpatułki, aby uzyskać pożądaną masę. Opcjonalnie: dodać 1,00 ng wzorca PGF2α-d4 jako wewnętrzną kontrolę wydajności ekstrakcji.</li>
	<li>Dodać 12 ml lodowatego acetonu/soli fizjologicznej w proporcji 2:1 z 0,005% BHT do zawiesiny ślimakowej i dobrze wymieszać przez wirowanie. Dozuj 1,5 ml gnojowicy robaków do każdej z dwunastu wolnostojących plastikowych probówek o pojemności 5 ml do użytku w Bullet Blenderze.</li>
	<li>Dodać 0,7-0,8 ml kulek z tlenku cyrkonu stabilizowanego tlenkiem cyrkonu o średnicy 0,5 mm do każdej probówki o pojemności 5 ml. Zamknij szczelnie nakrętki i załaduj 12 probówek do homogenizatora Bullet Blender 5. Uruchom blender na 3 minuty z prędkością 8-9 i umieść rurki na lodzie. Pamiętaj, aby bardzo szczelnie zamknąć nakrętki, w przeciwnym razie zawartość może się wylać. Sprawdzić 10 μl homogenatu z jednej probówki na szkiełku za pomocą stereoskopu. Powinno pozostać bardzo niewiele nienaruszonych robaków. W razie potrzeby powtarzaj z tą samą prędkością przez kolejną minutę.</li>
	<li>Równomiernie przenieść homogenaty do czterech stożkowych szklanych probówek o pojemności 10 ml za pomocą 9-calowej pipety Pasteura. Unikaj przenoszenia koralików. Umyj koraliki z trzech probówek kolejno 1 ml acetonu/soli fizjologicznej w stosunku 1:2 zawierającego BHT. Powtarzaj dla innych tubek, aż wszystkie koraliki zostaną umyte. Przenieś pozostały roztwór (~ 4 ml) do szklanych probówek o pojemności 10 ml i umieść je na lodzie.</li>
	<li>Odwirować szklane probówki o pojemności 10 ml w temperaturze 4 °C w wirówce klinicznej przy ~1 000 x g przez 10 minut. Przenieść supernatant z każdej probówki do czystej szklanej probówki stożkowej o pojemności 10 ml.</li>
	<li>W kapturze chemicznym dodaj równą objętość heksanu do każdej szklanej probówki o pojemności 10 ml. Na przykład dodaj 3,5 ml heksanu do 3,5 ml roztworu acetonu/soli fizjologicznej. Wiruj z maksymalną prędkością przez 30 sekund.</li>
	<li>Odwirować szklane probówki o pojemności 10 ml w temperaturze 4 °C w wirówce klinicznej przy ~1 000 x g przez 10 minut. Odrzucić górną fazę zawierającą heksan i obojętnie naładowane lipidy.</li>
	<li>Zakwasić dolną fazę do pH 3,5 za pomocą 2 M kwasu mrówkowego (około 100 - 150 μl). Przetestuj pH za pomocą pasków pH.</li>
	<li>Dodać równą objętość chloroformu do każdej probówki. Wirować z maksymalną prędkością przez 30 sekund i odwirowywać probówki w temperaturze 4 °C w wirówce klinicznej przy ~1,000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Usuń i wyrzuć górną fazę wodną. Wprowadzić końcówkę pipety przez resztkową interfazę mleczną do dolnej fazy chloroformowej, unikając interfazy. Zebrać dolną fazę z każdej z 4 probówek do czystej stożkowej szklanej probówki o pojemności 15 ml. Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 24 godziny. W tym momencie ekstrakt można przechowywać w temperaturze -20 °C do dwóch tygodni.</li>
	<li>Wyjmij ekstrakt z zamrażarki i wyrzuć pozostałą mleczną wodną warstwę wierzchnią, jeśli jest dostępna. Przenieść fazę chloroformową do znakowanej fiolki ze szkła 1/2-Dram wyłożonej teflonem za pomocą nowej pipety Pasteura. W okapie chemicznym odparować frakcję rozpuszczalną w chloroformie do sucha pod delikatnym przepływem gazuN2. Wysuszony ekstrakt można przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 tygodni. Ogólny schemat stosowany do ekstrakcji i analizy PG pokazano na rysunku 1.</li>
</ol>
3. Analiza prostaglandyn
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe poszczególnych referencyjnych prostaglandyn, takich jak PGF2α lub PGF2 α-d4 (1 μg/ml) w metanolu i rozcieńczyć metanolem: wodą (8:2 v/v) w celu uzyskania roztworu roboczego. Przygotować serię rozcieńczeń (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng/ml) w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Dodać 200 μl metanolu:wody (8:2 v/v) do wysuszonego ekstraktu lipidowego C. elegans i dokładnie wymieszać. Jeśli wyekstrahowano mniej niż 6 g tkanki robaka, wysuszony ekstrakt powinien być ponownie zawieszony w mniejszej objętości roztworu metanol:woda.</li>
	<li>Przygotować fazę ruchomą składającą się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie [A] i acetonitrylu zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego [B].</li>
	<li>Ustawić automatyczny podajnik próbek w temperaturze 4 °C i umieścić fiolki z próbkami w stojaku na fiolki o pojemności 1,5 ml z 70 zliczeniami.</li>
	<li>Równoważyć kolumnę Synergy hydro RP-C18 z 0,1% kwasem mrówkowym przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min przez około 5 minut.</li>
	<li>Wstrzyknąć próbkę (20-50 μl) do kolumny. Wykonuj elucję gradientową zaczynając od 10% B i przechodząc do 80% B od 0-11 min, 80-100% B od 11-14 min i wracając do 10% B po 16 min. Całkowity czas pracy wynosi 20 minut. Czasy przechowywania 13 autentycznych wzorców przedstawiono w tabeli 1 dla odniesienia3.</li>
	<li>Wprowadzić ścieki z kolumny do spektrometru mas za pomocą interfejsu ESI działającego w trybie jonów ujemnych. Azot jest stosowany jako nebulizator i gaz kurtynowy (CUR = 10). Gaz zderzeniowy, energia zderzenia i temperatura są ustawione odpowiednio na 10, -35 eV i 600 °C. Potencjał deklastrowania (DP), energia zderzenia (CE) i potencjał wyjścia komórki (CXP) są ustawione odpowiednio na -90, -35 i -10.</li>
	<li>W przypadku skanów pomiarowych (skany Q1) należy użyć trybu jonów ujemnych w zakresie mas m/z 315-360 dla większości PG (Rysunek 2). Zakres może być zmieniany w zależności od masy interesującego związku (związków). Ekstrahuj jony z całkowitego prądu jonowego (TIC) chromatogramów jonowych LC-MS i określ, czy wyekstrahowane jony odpowiadają jonom deprotonowanym lub adduktom, czy też jonom fragmentacyjnym</li>.
	<li>W przypadku eksperymentów MRM przejście masy m/z 355/311 służy do wykrywania klasy F1, m/z 353/193 jest używane do klasy F2, a m/z 351/193 lub 351/191 jest używane do klasy F3 (rysunek 3). MRM jest również używany do wykrywania wzorca wewnętrznego (na przykład m/z 357/197 dla PGF2α-d4) i do generowania krzywej wzorcowej. Zobacz Murphy et al., aby uzyskać dodatkowe informacje na temat przejść masy PG18.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów MS/MS należy użyć m/z 355 dla klasy F1, m/z 353 dla klasy F2 i m/z 351 dla klasy F3 PG. Dane C. elegans MS/MS dla PG serii F są dostępne na rysunku 4 i w tabeli 23,16. Dane MS/MS dotyczące eikozanoidów ssaków są dostępne pod adresem <a href="http://www.lipidmaps.org" target="_blank">www.lipidmaps.org</a>.</li>
	<li>Przetwarzaj dane analityczne za pomocą oprogramowania analitycznego (wersja 1.4.2, Applied Biosystems).</li>
</ol>

<ol><li>Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+synthesis+and+adiposity+regulation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans.</a> Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).</li>
<li>Marza, E., Lesa, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+and+neurotransmission+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li>
<li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP%283%29-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).</li>
<li>Kosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoid+formation+by+a+cytochrome+P450+isoform+expressed+in+the+pharynx+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. J. 435, 689-700 (2011).</li>
<li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).</li>
<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylethanolamine+signalling+mediates+the+effect+of+diet+on+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 473, 226-229 (2011).</li>
<li>Gerisch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bile+acid-like+steroid+modulates+Caenorhabditis+elegans+lifespan+through+nuclear+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).</li>
<li>Edison, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+pheromones+regulate+multiple+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).</li>
<li>Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandins+and+leukotrienes%3A+advances+in+eicosanoid+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology.</a> Science. 294, 1871-1875 (2001).</li>
<li>Wang, D., Dubois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).</li>
<li>Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+prostanoids%3A+deciphering+the+developmental+functions+of+cyclooxygenase-derived+prostaglandins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins.</a> Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).</li>
<li>Hata, A. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+and+signaling+of+prostaglandin+receptors%3A+multiple+roles+in+inflammation+and+immune+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation.</a> Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).</li>
<li>Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+function+of+prostanoid+receptors%3A+studies+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice.</a> Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).</li>
<li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprostanes%3A+novel+bioactive+products+of+lipid+peroxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation.</a> Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).</li>
<li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogenous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+C.+elegans+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271(2013).</li>
<li>Golovko, M. Y., Murphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+LC-MS%2FMS+procedure+for+brain+prostanoid+analysis+using+brain+fixation+with+head-focused+microwave+irradiation+and+liquid-liquid+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction.</a> J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).</li>
<li>Murphy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+and+tandem+mass+spectrometry+of+eicosanoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids.</a> Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).</li>
<li>Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+biochemistry+of+the+isoprostane+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human biochemistry of the isoprostane pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).</li>
<li>Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+of+anandamide+and+2-arachidonoylglycerol+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biodivers%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes.</a> Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).</li>
<li>Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-dependent+metabolism+of+eicosapentaenoic+acid+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).</li>
<li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Opisujemy procedurę ekstrakcji i analizy eikozanoidów, koncentrując się na PG serii F. Istnieje kilka części procedury, które mogą być problematyczne. Po pierwsze, bardzo ważne jest, aby kultury robaków nie głodowały, ponieważ głód może zmienić metabolizm PG. Do dokarmiania zaleca się bakterie NA22 zamiast częściej stosowanych bakterii OP50, ponieważ NA22 osiąga większą gęstość. Jednak szczep NA22 nie ma oporności na antybiotyki i jest bardziej podatny na zanieczyszczenie. Po drugie, robaki syntetyzują pojedyncze izomery PG w niewielkiej obfitości w stosunku do tkanek ssaków. Może to być częściowo spowodowane redundancją wśród licznych izomerów. Zalecamy około 6 g tkanki do kompleksowej analizy i silniejszych sygnałów. Mniej tkanki (1-2 g) można użyć, jeśli wysuszony ekstrakt zostanie ponownie zawieszony w roztworze mniejszej ilości metanolu: wody w celu zwiększenia stężenia PG. Można jednak wykonać tylko jedno lub dwa wstrzyknięcia. Granica wykrywalności naszego systemu LC-MS/MS wynosi około 10 pg PGF2α /ml. Jeden ml gęsto upakowanych robaków w stadium mieszanym (około 1 g) daje około 25-50 pg CePGF2. Bardziej czułe systemy spektrometrii mas mogą zmniejszyć ilość tkanki robaka wymaganej do analizy. Po trzecie, różnice w wydajności ekstrakcji PG między próbkami mogą powodować różne wyniki. Odkryliśmy, że wydajność ekstrakcji jest bardzo podobna, gdy tkanki są ekstrahowane równolegle. Aby określić wydajność, dodaj 1,0 ng PGF2α-d 4 na etapie homogenizacji jako kontrolę wewnętrzną. MRM z zastosowaniem przejścia masowego m/z 357/197 służy do pomiaru stężenia PGF2α-d4 w stosunku do roztworu wzorcowego 1 ng/ml. Następnie oblicza się ilość PGF2α-d 4 utraconego podczas ekstrakcji.
Uwzględnione przez nas parametry chromatograficzne i przejścia masowe mogą być zmieniane w celu wykrycia innych PG i eikozanoidów. Pomimo znacznych wysiłków nie udało nam się zidentyfikować PG serii D lub E w ekstraktach17. Ponadto nie wykryliśmy 8-iso PGF2α i 8-iso PGE2 , które są charakterystyczne dla peroksydacji inicjowanej przez wolne rodniki, która generuje nieselektywną mieszaninę stereoizomerów PG19. Nie wiadomo, czy robaki syntetyzują inne typy PG. W ekstraktach z C. elegans 5,7,20,21 znaleziono endokannabinoidy oraz różne epoksydowe i hydroksymetabolity kwasów arachidonowego i eikozapentaenowego. Zalecamy stosowanie zarówno MRM, jak i MS/MS w porównaniu z autentycznymi standardami odpowiednio do oznaczania ilościowego i identyfikacji. W przypadku nowych eikozanoidów analizy te powinny być połączone z badaniem porównawczym mutantów tłuszczów , które mają niedobór enzymów syntetyzujących PUFA22, a także, jeśli to możliwe, z testem funkcjonalnym. Zastrzeżeniem do analizy mutantów tłuszczowych jest to, że niewielkie ilości PUFA obecnych w robakach są wystarczające do syntezy PG. Na przykład mutanty tłuszczu-2 (wa17) mają niewielką aktywność desaturazy D12 (~ 5% dzikiego typu22) i te mutanty nadal wytwarzają PGs6. mutanty tłuszczu-3(wa22) i tłuszczu-4(wa14) nie syntetyzują PG pochodzących z kwasów arachidonowych i eikozapentaenowych16. Odkryliśmy również, że mutanty tłuszczowe kompensują utratę klas PUFA poprzez zwiększenie syntezy PG z pozostałych klas. Na przykład mutanty tłuszczu-3(wa22) nie syntetyzują większości PG pochodzących z 20-węglowych PUFA. Zamiast tego wydaje się, że regulują w górę nowe PG pochodzące z 18-węglowych PUFA16. Do tej pory nie zidentyfikowaliśmy szczepu C. elegans , który byłby całkowicie pozbawiony syntezy PG. Możliwe, że PG są niezbędne dla wzrostu lub rozwoju.

Prostaglandyny (PGs) to ważna klasa hormonów lipidowych, które zostały dokładnie zbadane i zaangażowane w regulację reprodukcji, odporności i rozwoju w szerokim wachlarzu organizmów12-14. PG idealnie nadają się do kompleksowych analiz biologii systemowej, ponieważ zawierają szereg lipidów pochodzących ze wspólnego prekursora (prekursorów). Nicień C. elegans jest jednym z najczęściej używanych organizmów modelowych do rozwiązywania podstawowych pytań w genetyce i biologii systemowej.
Wykazaliśmy, że C. elegans syntetyzuje PG serii F, które kierują ruchliwe plemniki do oocytów3,6,16. PG serii F pochodzące z 20-węglowych PUFA z trzema, czterema i pięcioma wiązaniami podwójnymi, obejmującymi odpowiednio klasy F1, F2 i F3, zostały zidentyfikowane3,16. Te PG są syntetyzowane niezależnie od enzymów cyklooksygenazy, ale stereoizomery PGF1α i PGF2α są nadal generowane. Do analiz jakościowych i ilościowych PG C. ELEGANS LC-MS/MS jest potężną i czułą techniką analityczną. Przed wykonaniem tej analizy ważne jest opracowanie zoptymalizowanej metody ekstrakcji, ponieważ wydajność procesu analitycznego w dużym stopniu zależy od jakości ekstraktu. Chromatografia cieczowa i spektrometria mas mogą zapewnić jedynie przewidywany stosunek masy do ładunku (m/z), a także pożądany kształt piku i czas retencji jonu macierzystego PG. Profilowanie metaboliczne PG u C. elegans jest trudnym zadaniem wymagającym różnych strategii nabywania SM.
Pełne skanowanie LC-MS lub skanowanie ankietowe (skanowanie Q1) ma tę zaletę, że zapewnia, że większość jonizowalnych PG wygeneruje odpowiedź spektrometrii mas. Podczas gdy skan ankietowy dostarcza użytecznych informacji na temat całkowitego profilowania PG w odniesieniu do dzikich i zmutowanych C. elegans, wykrywanie mniejszych PG jest utrudnione ze względu na niską czułość. Niemniej jednak, skanowanie ankietowe LC-MS może dać globalny wgląd w PG i jest szczególnie przydatne do analizy mutantów, które według przewidywań wpływają na metabolizm dużej populacji PG.
W identyfikacji metabolitów, najpierw przeprowadza się analizę LC-MS/MS chemicznie syntetyzowanych wzorców PG w celu uzyskania widm jonów produktu jako związków odniesienia. Widma te można porównać z widmem nieznanego metabolitu. Tryb monitorowania wielu reakcji (MRM) jest używany w celu zwiększenia czułości i swoistości. Eksperyment MRM przeprowadza się poprzez określenie przejścia masy jonu macierzystego/jonu produktu w związku. Znając masę i strukturę docelowych analitów, możliwe jest przewidzenie teoretycznych przejść MRM dla wielu nieznanych metabolitów.
Zoptymalizowana metoda LC-MS/MS do profilowania izomerycznych PG u C. elegans nie została zgłoszona. Tutaj opisujemy ekstrakcję i zintegrowane podejście do spektrometrii mas składające się z metod LC-MS i LC-MS/MS do wykrywania, oznaczania ilościowego i badania metabolitów PG C. elegans. Podejście to można zastosować do innych eikozanoidów.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>X-duże (16 cm) płytki</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli szczep NA22</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>NA22</td><td><a href="http://www.cgc.cbs.umn.edu" target="_blank">http://www.cgc.cbs.umn.edu</a></td></tr><tr><td>Aceton, 399,5%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A928-4</td><td></td></tr><tr><td>Butylowany hydroksytoluen</td><td>MP Biomedicals</td><td>101162</td><td></td></tr><tr><td>Heksan, klasa HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, 399%</td><td>Acros</td><td>AC27048-0010</td><td>Dostępne za pośrednictwem Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chloroform, klasa HPLC</td><td>Acros</td><td>AC26832-0010</td><td>Dostępne za pośrednictwem Fisher Naukowy</td></tr><tr><td>PGF2&alpha; -d4</td><td>Cayman Chemicals</td><td>316010</td><td>Cayman posiada szeroką gamę standardów dostępnych do zakupu</td></tr><tr><td>Sterylna zakrętka wolnostojąca tubka 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-651</td><td>Do użytku z kulkami</td></tr><tr><td>z tlenku cyrkonu Bullet Blender 0,5 mm</td><td>Następny> > > Advance</td><td>ZrOB05</td><td></td></tr><tr><td>10 ml szklane, stożkowe, wytrzymałe probówki wirówkowe z podziałką</td><td>Kimble Kimax</td><td>45200-10</td><td>Dostępne w szklanych</td></tr><tr><td>probówkach stożkowych Fisher Scientific 15 ml</td><td>Corning Pyrex</td><td>8082-15</td><td>Dostępne przez Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sigmacote (odczynnik silikonowyzujący)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka ze szkła 1/2 Dram z nakrętką wyłożoną teflonem</td><td>Fisher Scientific</td><td>V1235C-TFE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>CentraSL2 Wirówka kliniczna</td><td>Thomas Scientific</td><td>2517N92-TS</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender 5 niebieski homogenizator</td><td>Następny > > > Advance</td><td>BBY5MB</td><td>Homogenizator Dounce o pojemności 40 ml może być stosowany jako alternatywa</td></tr><tr><td>Synergi 4 &mu; m Hydro-RP 80 i #197; Kolumna LC 250 x 2,0 mm</td><td>Phenomenenex</td><td>00G-4375-B0</td><td>Kolumna HPLC</td></tr><tr><td>Wkłady SecurityGuard AQ C18 4 x 2,0 mm</td> Zestaw wkładów SecurityGuard <td>Phenomenenex</td><td>AJ0-7510</td><td></td></tr><tr><td>SecurityGuard Zestaw nabojów</td><td>Phenomenenex</td><td>KJ0-4282</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Prominence HPLC z chłodzonym automatycznym samplerem</td><td>Shimadzu Scientific Instruments, Inc.</td><td></td><td>Każdy standardowy system HPLC sprzężony z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym powinien być wystarczający</td></tr><tr><td>API 4000 potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy Applied</td><td>Biosystems/MDS SCIEX</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="2">M9 receptura bufora (4 litry)</td> </tr> <tr> <td>12 g</td> <td> KH2PO4</td> </tr> <tr> <td>24 g</td> <td>Na2HPO4</td> </tr> <tr> <td>20 g</td> <td>NaCl</td> </tr> <tr> <td>Do 4 litrów</td> <td>Woda dejonizowana</td> </tr> <tr> <td colspan="2">Porcja do ośmiu butelek o pojemności 1 litra. Autoklaw i schłodzić.</td> </tr> <tr> <td>0,5 ml/butelka</td> <td>1 M MgSO4</td> </tr> </tbody> </stół> </td></tr></tbody></table>

ekstrakcja i analiza prostaglandyn w caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans wyłania się jako potężny model zwierzęcy do badania biologii lipidów1-9. Prostaglandyny są ważną klasą eikozanoidów, które są sygnałami lipidowymi pochodzącymi z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA)10-14. Te cząsteczki sygnałowe są trudne do zbadania ze względu na ich niską liczebność i reaktywny charakter. Cechą charakterystyczną prostaglandyn jest struktura pierścienia cyklopentanowego zlokalizowana w obrębie szkieletu kwasów tłuszczowych. U ssaków prostaglandyny mogą być tworzone przez szlaki zależne od enzymów i niezależne od cyklooksygenazy10,15. C. elegans syntetyzuje szeroki wachlarz prostaglandyn niezależnie od cyklooksygenaz6,16,17. Zidentyfikowano dużą klasę prostaglandyn serii F, ale badania nad eikozanoidami są na wczesnym etapie i jest dużo miejsca na nowe odkrycia. Tutaj opisujemy procedurę ekstrakcji i analizy prostaglandyn i innych eikozanoidów. Naładowane lipidy są ekstrahowane z masowych kultur robaków przy użyciu techniki ekstrakcji ciecz-ciecz i analizowane za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas z jonizacją elektronrozpylania (LC-ESI-MS/MS). Do analizy ilościowej zaleca się włączenie deuterowanych analogów prostaglandyn, takich jak PGF2 α-d 4 jako wzorzec wewnętrzny. Monitorowanie wielu reakcji lub MRM może być stosowane do ilościowego określania i porównywania określonych typów prostaglandyn między zwierzętami dzikimi i zmutowanymi. Dekompozycja wywołana zderzeniem lub MS/MS może być wykorzystana do uzyskania informacji o ważnych cechach strukturalnych. Skany badawcze spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej (LC-MS) wybranego zakresu mas, takiego jak m/z 315-360, mogą być wykorzystane do oceny globalnych zmian poziomów prostaglandyn. Podajemy przykłady wszystkich trzech analiz. Metody te dostarczą naukowcom zestawu narzędzi do odkrywania nowych eikozanoidów i wyznaczania ich szlaków metabolicznych.

Przygotowanie próbek przeprowadzono metodą ekstrakcji ciecz-ciecz zaadaptowaną z Golovko i Murphy17. Zapewniła ona doskonały odzysk standardu wewnętrznego (PGF2α-d4). Ogólny schemat ekstrakcji PG z C. elegans przedstawiono na Rysunku 1. Warunki chromatograficzne zoptymalizowano tak, aby uzyskać rozdzielenie do linii bazowej dla &gt;30 standardów eikosanoidów (Tabela 1 przedstawia 13 standardów). Najlepszą rozdzielczość i czułość zapewniła kolumna Hydro-Rp (250 x 2,0 mm i.d) z wodą i acetonitrylem zawierającym 0,1% kwasu mrówkowego. Skanowania przeglądowe ekstraktów typu dzikiego oraz mutantów fat-3 pokazane na Rysunku 2 dokumentują globalne poziomy jonów w zakresie mas atomowych 315-360. Mutanty fat-3(wa22) nie posiadają większości wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA) o długości 20 atomów węgla. Zaznaczono PG klasy F3. Na Rysunku 3 analizy MRM ekstraktu typu dzikiego wykazują wiele izomerów PG klas F1 (Rysunek 3A), F2 (Rysunek 3B) oraz F3 (Rysunki 3C i 3D). Klasę F3 można wykryć za pomocą jednego z dwóch przejść masowych, m/z 351/193 lub m/z 351/191. CePGF2 składa się głównie z enancjomeru PGF2α. CePGF1 jest prawdopodobnie PGF1α lub jego enancjomerem. Rysunek 4 przedstawia rozkład indukowany zderzeniem CePGF2 (RT=11,8) w porównaniu ze standardem PGF2α (RT=11,8). Niewielkie różnice w jonach produktowych wynikają prawdopodobnie z niskiej zawartości CePGF2 i współeluujących związków w ekstrakcie.
<img alt="Ekstrakcja i oczyszczanie lipidów; schemat rozdziału chloroformowego; wirowanie; chromatografia cieczowa; analiza MS/MS." src="/files/ftp_upload/50447/50447fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schemat ekstrakcji PG z C. elegans oraz analiz LC-MS. Należy zwrócić uwagę, że zarówno aceton/sól fizjologiczna, jak i chloroform zawierają 0,005% BHT w celu zminimalizowania utleniania lipidów. Szczegóły znajdują się w tekście. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
<img alt="Schemat widm chromatografii masowej; intensywność w funkcji czasu retencji dla typu dzikiego i porównania fat-3(wa22)." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Skanowania przeglądowe m/z 315-360 ekstraktów typu dzikiego i mutantów fat-3(wa22). Czas retencji (RT) w chromatografii cieczowej przedstawiono na panelu [A]. Ekstrahowane jony przy RT = 11,3 przedstawiono dla ekstraktów typu dzikiego [B] oraz fat-3(wa22) [C]. Zaznaczono PG z klasy F3 o masie m/z 351. Cps, zliczenia/sek; a.m.u., jednostka masy atomowej.
<img alt="Chromatogramy spektrometrii mas; intensywność w funkcji czasu retencji; piki identyfikacji związków; analiza." fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Analizy MRM ekstraktów typu dzikiego. PG klasy F1 są wykrywane przy przejściu masy m/z 355/311 [A]. Należy zauważyć, że kilka związków hydrofobowych (RT &gt; 14 min), które prawdopodobnie nie są PG, jest również wykrywanych przy tym przejściu. PG klasy F2 są wykrywane przy przejściu masy m/z 353/193 [B]. PG klasy F3 są wykrywane przy przejściu masy m/z 351/193 [C] lub m/z 351/191 [D]. Należy zauważyć, że ekstrakty zawierają wiele izomerów PG z każdej klasy. Numery odpowiadają PG przedstawionym w Tabeli 2. Stężenie CePGF2 wynosi 1.8 ng/ml. RT, czas retencji; cps, zliczenia/s.
<img alt="Mass spectrometry data and chemical structure analysis diagram; lipid identification process." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50447/50447fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
 Rysunek 4. Rozpad wywołany zderzeniami chemicznie syntetyzowanego PGF2α oraz CePGF2. Strzałki w panelu [A] wskazanie wspólnych jonów produktowych lub fragmentacyjnych dla PGF2α oraz CePGF2 (RT=11,8). Jony produktowe przy m/z 309 i m/z 193 są generowane z wskazanych miejsc cięcia (wyróżnionych a i b), odpowiadają przedstawionym strukturom i są charakterystyczne dla prostaglandyn serii F [B]cps, zliczeń/s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Standard</td>
			<td >RT (min)</td>
			<td >[M-H]- m/z</td>
			<td >Kluczowe jony produktu w MS/MS</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >20-hydroksy PGE2</td>
			<td >9.43</td >
			<td >367</td >
			<td >349, 331, 287, 234, 189, 129, 109</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PGF3-</td>
			<td >11.26</td >
			<td >351</td >
			<td >333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tromboksan B2</td>
			<td >11.66</td >
			<td >369</td >
			<td >289, 191, 177, 169, 151</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PGF2-</td>
			<td >11.80</td >
			<td >353</td >
			<td >335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PGF1-</td>
			<td >11.79</td >
			<td >355</td >
			<td >337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Lipoksyna B4</td>
			<td >12.38</td >
			<td >351</td >
			<td >201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PGD2</td>
			<td >12.56</td >
			<td >351</td >
			<td >315, 271,203, 189</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >5(S), 6(R)- Lipoksyna A4</td>
			<td >12.83</td >
			<td >351</td >
			<td >235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PGA2</td>
			<td >14.02</td >
			<td >333</td >
			<td >315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Δ12-PGJ2</td>
			<td >14.20</td >
			<td >333</td >
			<td >271, 189, 123</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Leukotrien B4</td>
			<td >14.73</td >
			<td >335</td >
			<td >181, 109, 93, 71, 69, 59, 57</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >15d-Δ12,14-PGJ2</td>
			<td >16.80</td >
			<td >315</td >
			<td >297, 271, 217, 203, 158</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >5(S)-HpETE</td >
			<td >17.88</td >
			<td >335</td >
			<td >97, 83, 81, 57</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Czasy retencji i kluczowe jony produktów dla 13 wzorców eikozanoidów z metody LC-MS/MS3 . Do opracowania programu LC-MS/MS wykorzystano ponad 30 wzorców. Chromatograficzne czasy retencji (RT) różnią się od siebie, nawet w przypadku bardzo podobnych prostaglandyn (PG). Wyjątkiem są PGF1α oraz PGF2α. Niemniej jednak, prostaglandyny te można rozróżnić na podstawie mas jonów prekursorowych ([M-H]- m/z) oraz widm dysocjacji indukowanej kolizyjnie (MS/MS).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Klasa prostaglandyn</td>
			<td>Nr na rysunku 3</td>
			<td>[M-H]- m/z</td>
			<td>Kluczowe jony produktowe w MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1 (CePGF1)</td>
			<td>1</td>
			<td>355</td>
			<td>319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1</td>
			<td>2</td>
			<td>355</td>
			<td>311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2 (CePGF2)</td>
			<td>3</td>
			<td>353</td>
			<td>309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2</td>
			<td>4</td>
			<td>353</td>
			<td>309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3</td>
			<td>5</td>
			<td>351</td>
			<td>315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F3</td>
			<td>6</td>
			<td>351</td>
			<td>333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Jony produktów rozpadu indukowanego zderzeniami dla kilku głównych PGs F1, F2 i F3 C. elegans przedstawionych na rysunku 3. Nie przedstawiono widm MS/MS innych, mniej obfitych izomerów. Dane te pochodzą z wielu analiz i nie wszystkie jony produktów mogą być widoczne w danym pomiarze. Ze względu na złożoność ekstraktów, niektóre mniej obfite jony produktów mogą pochodzić od innego jonu prekursorowego o podobnym czasie retencji lub wynikać z interferencji. Pik 2 jest prawdopodobnie stereoisomerem CePGF1, a pik 4 prawdopodobnie stereoisomerem CePGF2. Dodatkowe dane znajdują się w pracy Edmonds, et al. (2010)3.

W tym artykule opisujemy zoptymalizowaną procedurę ekstrakcji i analizy prostaglandyn i innych eikozanoidów z C. elegans za pomocą LC-MS/MS.

Ekstrakcja i analiza prostaglandyn w Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Celem niniejszej procedury jest identyfikacja i pomiar prostaglandyn oraz innych eikozanoidów w ekstraktach z sea elegance. W pierwszej kolejności należy wyhodować nicienie w kulturach wielkoskalowych. Następnie, stosując technikę ekstrakcji ciecz-ciecz, należy wyekstrahować lipidy hydrofilowe z tkanek nicieni, a otrzymane ekstrakty lipidowe wstrzyknąć do kolumny HPLC sprzężonej ze spektrometrem mas.Następnie należy przeanalizować dane z ciekłej chromatografii z tandemową spektrometrią mas. Ostatecznie ta metoda LC-MS/MS stosowana do oczyszczonych ekstraktów z nicponiowców pozwala na identyfikację nowych metabolitów, a także pomiar znanych metabolitów, takich jak prostaglandyny z serii S. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunoanalizy enzymatyczne, jest jej wysoka czułość i specyficzność, przy jednoczesnym kompleksowym i elastycznym podejściu. Technikę tę zaprezentuje Hugh Hong, doktorant z mojego laboratorium. Do dodatniego karmienia nicponiowców należy użyć peletu OP50.Kulturę bakteryjną poddano wirowaniu, odrzucono nadsącz, a osad bakteryjny zawieszono ponownie w 100 mililitrach buforu M9. Skoncentrowany roztwór bakterii przechowywano w temperaturze 4°C. Hodowle nicieni rozpoczęto na pięciu ekstra dużych płytkach NGM.Kontynuuj propagację nicieni przez trzy do czterech pokoleń, aż szalki zostaną całkowicie zasiedlone. Aby zapobiec głodowaniu osobników dorosłych, w razie potrzeby dodawaj do szalek z nicieniami około 1 mL skoncentrowanych bakterii. Przed nałożeniem pokrywki odparuj nadmiar cieczy do całkowitego wyschnięcia.Następnie zmyj pobrane hermafrodyty z płytek buforem M9. Zbierz nicienie do 50 ml stożkowatej probówki polipropylenowej. Następnie poczekaj, aż nicienie opadną na dno.Odlej supernatant zawierający jaja bakterii i nicienie w stadium larwalnym. Następnie zawieś pozostałe nicienie w 15 mililitrach buforu M9 i delikatnie wymieszaj. Rozdziel po 200 µL zawiesiny nicieni na każdą z 60 wysianych płytek NGM.Należy dokładnie mieszać zawiesinę z niciami aż do momentu zaszczepienia wszystkich płytek, aby zapewnić im mniej więcej równą liczbę osobników. Rozmieścić nicie na płytkach. Hodować nicie przez dwie do czterech generacji, uzupełniając każdą płytkę o 1 mL stężonych bakterii w okresie od 12 do 24 godzin.Gdy szalki zostaną całkowicie zasiedlone przez dorosłe osobniki GR, należy zebrać nicienie, przetwarzając każdą szczep po kolei. Zmyć nicienie z szalek buforem M9 i przenieść je do sześciu polipropylenowych probówek o pojemności 50 ml. Napełnić probówki buforem M9, aby wypłukać nicienie.Gdy dorosłe osobniki opadną na dno, należy odessać około 35 mililitrów supernatantu. Następnie przenieść nicienie do jednej lub dwóch probówek. Procedurę płukania w buforze M9 należy powtórzyć trzykrotnie lub do momentu, aż supernatant stanie się przejrzysty, używając pipety Pasteura o szerokim otworze.Przenieś jak największą liczbę nicieni do 15 ml polipropylenowej probówki stożkowej. Wirowarkuj przy 1000 RCF przez pięć minut, a następnie odlej nadsącz. Powtórz etapy zbioru, przemywania i konsolidacji dla pozostałych szczepów.Przechowywać zapasy zebranych szczepów nicieni w temperaturze -80 °C. Odnotować wagę polipropylenowej probówki stożkowej, używając rozgrzanej do czerwoności żyletki. Przeciąć zamrożoną probówkę polipropylenową zawierającą zebrane nicienie w pobliżu oznaczenia 6 ml.W warunkach sterylnych przenieść około sześciu gramów zamrożonego osadu z nicieni do probówki z próbką. Dodać jeden nanogram standardu wewnętrznego oraz 12 mililitrów lodowatego roztworu soli fizjologicznej w acetonie.Używając mieszaniny BHT, rozdziel dokładnie po 1,5 mililitra zawiesiny z nicieni do 12 samostojących plastikowych probówek o pojemności pięciu mililitrów. Dodaj 0,7 mililitra stabilizowanych koralików z tlenku cyrkonu. W razie potrzeby ujednorodź zawiesinę z nicieni.Powtórz ten proces przez kolejną minutę, używając dziewięciocalowej pipety Pasteura, aż liczba nienaruszonych nicieni spadnie poniżej 10%. Ostrożnie przenieś homogenat, z wyłączeniem kulek, do czterech 10 mililitrowych stożkowych probówek szklanych. Połącz kulki z trzech probówek i przemyj je jednym mililitrem roztworu soli w acetonie zawierającego BHT.Powtórz to płukanie dla pozostałych probówek zawierających koraliki. Przenieś roztwór płuczący do szklanych probówek w lodzie. Następnie odwiruj homogenat przy 1000 Gs przez 10 minut.W temperaturze 4°C przenieść supernatant z każdej probówki do czystej szklanej probówki stożkowej o pojemności 10 ml. Następnie, pracując w dygestorium, dodać do każdej probówki taką samą objętość heksanu i mieszać w wortexie z maksymalną prędkością przez 30 sekund. Następnie odwirować w temperaturze 4°C przy 1000 Gs przez 10 minut.Odrzuć górną fazę zawierającą heksan i lipidy obojętne, a następnie dodaj kwas mrówkowy o stężeniu 2 mM, aby zakwasić dolną fazę wodną. Sprawdzając za pomocą pasków wskaźnikowych, upewnij się, że pH wynosi 3,5. Następnie do każdej probówki dodaj równą objętość chloroformu i mieszaj w wirówce typu vortex z maksymalną prędkością przez 30 sekund.Wiruj próbki w temperaturze 4 °C przy prędkości około 1000 ×g przez 10 minut. Wprowadź końcówkę pipety szklanej do dolnej fazy chloroformowej, starając się uniknąć warstwy przejściowej poprzez przechylenie probówki. Przenieś ekstrakty z czterech probówek do jednej szklanej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Wypierz powietrze z probówki szklanej azotem i inkubuj w temperaturze -20 °C od 24 godzin do dwóch tygodni. Po rozmrożeniu ekstraktu odlej pozostałą, mleczną, wodną warstwę wierzchnią, jeśli jest obecna. Użyj do tego nowej pipety Pasteura.Przenieś chloroform do opisanej probówki szklanej typu half DRM z wyściółką teflonową w wyciągu chemicznym. Odparuj rozpuszczalnik organiczny pod łagodnym strumieniem azotu i przechowuj próbki w temperaturze -20°C przez maksymalnie dwa tygodnie. Najpierw przygotuj roztwory zapasowe poszczególnych prostaglandyn referencyjnych w metanolu.Następnie sporządź krzywą wzorcową poprzez rozcieńczenia seryjne w 80% metanolu. Kolejno rozpuść wysuszone ekstrakty lipidowe z sea elegance w 200 µL 80% metanolu w celu przeprowadzenia analizy. Wstrzyknij od 20 do 50 µL próbki do kolumny fazy odwróconej i wykonaj analizę gradientową zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, wykorzystując interfejs ESI w trybie jonów ujemnych.Wprowadź eluat z kolumny do spektrometru mas. Ustaw gaz zderzeniowy na 10 elektronowoltów. Energię zderzenia ustaw na minus 35 elektronowoltów.Temperatura wynosi 600 °C. Potencjał odcinający (decluttering potential) na poziomie -90 oraz potencjał wyjścia z komórki na poziomie -11 generują krzywą wzorcową do analizy różnych klas prostaglandyn obecnych w ekstraktach próbek przy użyciu oprogramowania Analyst. Przetwarzamy dane w celu zidentyfikowania prostaglandyn obecnych w ekstraktach z nicieni.Skany przeglądowe ekstraktów z nicieni typu dzikiego oraz mutantów fat three pokazują globalne poziomy jonów w zakresie masy od 315 do 360 jednostek masy atomowej. W porównaniu z nicieniami typu dzikiego, mutanty fat three wykazują brak większości PFAS o 20 węglach, co obrazuje prostaglandyna z klasy F trzy. Przy zaznaczonym na szaro stosunku masy do ładunku 3 51, analizy MRM pozwalają zidentyfikować różne klasy prostaglandyn.Na przykład prostaglandyny klasy F1 są obecne w ekstraktach typu dzikiego, podobnie jak kilka innych związków hydrofobowych o dłuższych czasach retencji; zmiana przejścia masy pozwala na dalszą analizę prostaglandyn klasy F2 i F3, co wskazuje, że ekstrakty z nicieni zawierają wiele izomerów prostaglandyn z każdej klasy. Porównanie rozpadu indukowanego zderzeniem prostaglandyny z C. elegans ze standardową prostaglandyną może służyć do mapowania jonów produktowych w oczekiwanych miejscach pękania. W celu zapobiegania utlenianiu lipidów.Należy pamiętać o zachowaniu odpowiednich środków ostrożności. Na przykład należy dodać przeciwutleniacz VHT do wskazanego roztworu i przepłukać ekstrakt azotem.

prostaglandin-extraction-and-analysis-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje metodę preparowania gonad od dorosłych hermafrodytów C. elegans, w wyniku czego powstają tkanki odpowiednie do barwienia immunologicznego i obrazowania fluorescencyjnego.

C. elegans (C. elegans) Wytłaczanie gonad: technika szybkiej sekcji

C. elegans podczas składania jaj może dostarczyć ważnych informacji w badaniach rozwojowych, reprodukcyjnych i anatomicznych. Ten film przedstawia ważne etapy testu składania jaj i pokazuje próbkę eksperymentu, w którym lek jest testowany pod kątem toksyczności reprodukcyjnej.

Test składania jaj: metoda ilościowego określania zachowania C. elegans podczas składania jaj

Prezentujemy metodę obrazowania immunofluorescencyjnego opartą na przestrzennej i czasowej lokalizacji aktywnego ERK w wypreparowanej gonadzie C. elegans. Opisany tutaj protokół może być dostosowany do wizualizacji dowolnego białka sygnalizacyjnego lub strukturalnego w gonadzie C. elegans, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni odczynnik przeciwciała.

Analiza przestrzenna i czasowa aktywnego ERK w linii rozrodczej C. elegans

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Ten artykuł przedstawia metody generowania, oczyszczania i ilościowego oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans.

Oczyszczanie i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Caenorhabditis elegans

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest opis prostej i stosunkowo szybkiej izolacji genomowego DNA Caenorhabditis elegans od jednego lub kilku zwierząt przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu tkanek. Otrzymany preparat gDNA jest odpowiednią matrycą do PCR.

Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę ekstrakcji i analizy prostaglandyn w Caenorhabditis elegans przy użyciu chromatografii cieczowej ze spektrometrią masową LC-MS/MS. Technika ta oferuje wysoką czułość i specyficzność w badaniach metabolitów lipidowych.

Ekstrakcja i analiza prostaglandyn w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów