Przygotowanie białka rekombinacji Mgm101 za pomocą strategii znakowania opartej na MBP

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie dużych oligomerycznych białek wiążących DNA, takich jak MGM 1 0 1, z wykorzystaniem strategii znakowania białkiem wiążącym maltozę (MBP). Osiąga się to poprzez klonowanie otwartej ramki odczytu MGM 1 0 1 w regionie downstream względem MBP w wektorze pMLC two E w celu ekspresji w e coli. Następnie białko fuzyjne MBP-MGM 1 0 1 jest oczyszczane z e coli za pomocą chromatografii powinowactwa AMLO.

Następnie MGM 1 0 1 jest uwalniane z MVP poprzez cięcie proteolityczne i oddzielane od MVP za pomocą chromatografii wymiany kationowej. Na koniec pierścienie MGM 1 0 1 są oczyszczane do homogeniczności metodą chromatografii wykluczania rozmiarów. Ostatecznie otrzymuje się około 0,8 miligramów rozpuszczalnego MGM 1 0 1.

Jeden litr hodowli bakteryjnej można wykorzystać do charakterystyzacji biochemicznej i strukturalnej tego białka, które odgrywa istotną rolę w naprawie DNA w mitochondriach. Główną zaletą zastosowania wersji białka MGM 1 0 1 z dodatkiem białka wiążącego malat jest fakt, że wersja ta jest mniej toksyczna, bardziej rozpuszczalna i stabilniejsza niż wersja nieoznaczona. W rezultacie możliwe jest uzyskanie wysokiego poziomu ekspresji natywnego białka MGM 1 0 1 w e coli.

Witajcie, nazywam się Sarah Vicki. Jestem starszym specjalistą ds. wsparcia badań w laboratorium dr. Jji TEN'S tutaj, na Uniwersytecie Medycznym SUNY Upstate. Razem z moją koleżanką, wan Wong, zaprezentujemy teraz ekspresję i oczyszczanie MGM 1 0 1. Rozpoczniemy generowanie białka fuzyjnego, wykorzystując metodę PCR do amplifikacji sekwencji kodującej dojrzałe MGM 1 0 1.

Należy pominąć pierwsze 22 reszty aminoterminalne MGM 1 0 1, o których wiadomo, że ulegają odcięciu. Po imporcie do mitochondriów, namnożone MGM 1 0 1 zostaje umieszczone za sekwencją MAL E, która koduje białko wiążące maltozę lub MVP w zmodyfikowanej wersji wektora ekspresyjnego PM MAL C two E. W ten sposób powstaje fuzja M-V-P-M-G-M 1 0 1 z łącznikiem zawierającym miejsce cięcia dla proteazy precyzyjnej. Plazmid jest najpierw konstruowany poprzez selekcję transformantów e coli bez zastosowania selekcji niebiesko-białej.

Otrzymany plazmid PLC2E, MGM101, wprowadza się następnie do szczepu E. coli, BL21(DE3), i hoduje na płytkach LB zawierających ampicylinę i chloramfenikol. Należy rozpocząć od zaszczepienia 10 ml świeżej, uzupełnionej pożywki LB transformantami E. coli, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 RPM. Następnego dnia należy zaszczepić 2 l uzupełnionej pożywki LB za pomocą 10 ml prekultury.

Hodować komórki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem. Gdy OD 600 osiągnie wartość 0,5, indukować ekspresję białka fuzyjnego M-B-P-M-G-M 1 0 1 poprzez dodanie IPTG do stężenia końcowego 0,3 mM; hodować komórki z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez pięć godzin. Po upływie pięciu godzin przenieść hodowle do butelek wirówkowych o pojemności 500 ml i zebrać komórki poprzez wirowanie.

Po odlaniu supernatantu dodaj 30 mililitrów buforu do lizy zawierającego inhibitory proteaz i resuspenduj osad komórkowy, pipetując go w górę i w dół. Następnie poddaj zawiesinę komórkową sonikacji na lodzie przez 20 sekund. Używając procesora ultradźwiękowego przy cyklu pracy 50%, pozwól komórkom ostygnąć na lodzie przez 30 sekund.

Następnie powtórz etapy sonikacji i chłodzenia jeszcze dwa razy. Utrzymując zawiesinę w lodzie, dodaj 1 mL roztworu o stężeniu 2 mg/mL.

Inkubuj lizat komórkowy w temperaturze 4°C przez dwie godziny. Po upływie dwóch godzin dostosuj końcowe stężenie soli do 500 mM, dodając 4 mL 5 M NaCl do 36 mL lizatu.

Następnie, aby usunąć szczątki komórkowe, odwiruj próbkę przy 10, 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Przenieś nadsącz do nowej probówki. Na tym etapie można pobrać 20 µL aliquotu w celu monitorowania wydajności lizy metodą sonikacji.

Na żelu SDS-PAGE. Następnie lizat komórkowy przepuszcza się przez kolumnę z amylozą. Aby oczyścić białko fuzyjne MVP MGM 1 0 1, należy zacząć od dodania 1,5 mililitra 50% zawiesiny żywicy AMLO do 15 mililitrowej probówki stożkowej.

Następnie, aby go zrównoważyć, dodać 13 ml buforu do lizy i wirować z przyspieszeniem 2000 ×g przez pięć minut. Powtórzyć to płukanie jeszcze cztery razy, a następnie zawiesić żywicę ponownie w 0,75 ml buforu do lizy. Dodać zrównoważoną zawiesinę AMLO do lizatu komórkowego i inkubować przy delikatnym kołysaniu w temperaturze 4 °C przez noc.

Następnego dnia nanieś mieszaninę lizatu z żywicą amylozową na kolumnę chromatograficzną typu econo, zainstalowaną w pomieszczeniu chłodniczym. Otwórz kurek spustowy, aby niezwiązane białka mogły spłynąć do probówki zbiorczej poprzez filtrację grawitacyjną. Następnie przemyj żywicę AMLO, dodając 300 ml buforu do płukania nr 1.

Po przepływie całej objętości powtórzyć płukanie przy użyciu 150 mililitrów buforu do płukania dwa. Po dodaniu buforu do elucji i zebraniu EIT zgodnie z opisem w protokole tekstowym, określić wydajność i czystość M-V-P-M-G-M 1 0 1, nanosząc alikwot EIT na żel SDS-PAGE.

Po przeprowadzeniu elektroforezy żelu należy wykonać barwienie Coomassie; powinna być widoczna główna pojedyncza prążek o masie około 70 kilodaltonów. Do M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs należy dodać 50 jednostek precision protease i umieścić w probówce dializacyjnej z buforem do dializy. Przecięcie białek należy przeprowadzić przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przeprowadź elektroforezę w żelu SDS-PAGE tak jak poprzednio. Aby ocenić wydajność cięcia, pełna proteoliza powinna doprowadzić do powstania dwóch prążków o masie 42 i 28 kilodaltonów, które odpowiadają odpowiednio MVP i MGM 1 0 1. Nałóż przecięte MVP MGM 1 0 1 za pomocą wielokrotnych iniekcji na kasetę Bio Scale Mini Macro Prep High S podłączoną do systemu FPLC Bio-Rad Biologic DUO Flow.

Rozpocznij kationowymienną chromatografię, stosując schodowy gradient solny NaCl o stężeniach 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM i 1000 mM. Gradient ten uzyskuje się poprzez mieszanie buforu A i buforu B. Ustaw szybkość przepływu na 0,5 ml/min. Zbieraj frakcje o objętości 2 ml za pomocą kolektora frakcji; zazwyczaj MGM 1 0 1 eluje przy stężeniu soli 500 mM.

Połączyć frakcje odpowiadające piku MGM 1 0 1 i sprawdzić czystość białka na żelu SDS-PAGE. Pik MGM 1 0 1 powinien wykazywać pojedynczy prążek o masie około 28 kilodaltonów po połączeniu frakcji białka z chromatografii wymiany kationowej i dializie białka w buforze równoważącym GF w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie przenieść białko do kolumny ultrafiltracyjnej Aveva spin 15 R i wirować przy 3000 ×g w temperaturze 4 °C w celu zagęszczenia białka.

Gdy objętość zostanie zredukowana do około 1 ml, nanieś MGM 1 0 1 na skalibrowaną kolumnę supra six klasy prep, równoważoną buforem chromatograficznym, a następnie rozpocznij chromatografię wykluczania za pomocą buforu chromatograficznego przy przepływie 0,5 ml/min. Duże białka oligomeryczne eluują w pierwszych frakcjach, natomiast małe białka w późniejszych frakcjach. Pierścienie MGM 1 0 1 eluują przy masie cząsteczkowej wynoszącej około 400 kDa.

Frakcje oczyszczonych pików MGM 1 0 1 należy zebrać za pomocą kolektora frakcji, a następnie nanieść alikwoty tych frakcji na żel SDS-PAGE 12%, aby sprawdzić końcową jakość białka. Następnie białko należy skoncentrować za pomocą zestawu Aveva. Próbki wirować w wirowarce z prędkością 3000 ×g w temperaturze 4 °C.

Następnie szybko zamroź alikwoty białka w probówkach do mikrowirówki, zanurzając je w ciekłym azocie na dwie minuty. Próbki przechowuj w temperaturze -80 °C przez okres od 6 do 12 miesięcy. Próbki MGM 1 0 1 wykorzystaj do analizy wiązania jednoniciowego DNA oraz do wizualizacji strukturalnej za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Wyniki analizy przesunięcia mobilności elektroforetycznej wykazują, że oczyszczone MGM 1 0 1 wykazuje silną aktywność wiązania z jednoniciowym DNA. Sonda jednoniciowego DNA jest w coraz większym stopniu zatrzymywana w studzienkach natywnego żelu poliakrylamidowego przez oligomeryczne MGM 1 0 1.

Podczas dodawania M GM 1 0 1 w stężeniu przekraczającym 400 nanomolar. Przedstawione mikrografie elektronowe ukazują strukturę organizacji wyższego rzędu M GM 1 0 1. Świeżo przygotowany M GM 1 0 1 występuje w formie wyraźnych pierścieni o średnicy 20 nanometrów, co można uwidocznić za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej z barwieniem negatywowym.

Po kilku tygodniach przechowywania w temperaturze 4°C MGM 1 0 1 tworzy supramolekularne filamenty helikalne. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu jednego tygodnia.

Dziękujemy za oglądanie.