Name: Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna i obrazowanie fluorescencyjne Cytometria przepływowa w telefonie komórkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T09:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Poznaj metodę przekształcania aparatu telefonu komórkowego w platformę mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii obrazowej. Technika ta umożliwia analizę cytometryczną w warunkach ograniczonych zasobów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A. Ozcan z wdzięcznością dziękuje za wsparcie Prezydenckiej Nagrody Wczesnej Kariery dla Naukowców i Inżynierów (PECASE), Nagrody Młodego Badacza Biura Badań Wojskowych (ARO), Nagrody KARIERY Narodowej Fundacji Nauki (NSF), Nagrody Młodego Badacza Biura Badań Marynarki Wojennej (ONR) oraz Nagrody Dyrektora Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) dla Nowych Innowatorów DP2OD006427 przyznanej przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia.

W tej sekcji przedstawiamy eksperymentalne protokoły dla naszej szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej opartej na telefonie komórkowym13 i platformy cytometrii obrazowania optofluidycznego14. Użyjemy fluorescencyjnych kulek i znakowanych fluorescencyjnie białych krwinek do przetestowania tych platform obrazowania.
A. Przygotowanie szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego opartego na telefonie komórkowym i cytometru przepływowego do obrazowania optofluidycznego
Mikroskop fluorescencyjny lub cytometr przepływowy oparty na telefonie komórkowym składa się z dwóch głównych części: telefonu z kamerą i kompaktowej dodatkowej przystawki opto-fluidycznej.
1. Telefon z aparatem
Chociaż przedstawione techniki mają zastosowanie do prawie każdego telefonu z aparatem, wybraliśmy Sony Erickson Aino jako podstawę dla tych urządzeń. Ten telefon komórkowy ma zainstalowaną matrycę CMOS RGB o rozdzielczości ~ 8 megapikseli oraz wbudowany obiektyw o ogniskowej (f1) ~ 4,65 mm.
2. Przystawka opto-fluidyczna do szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej
Przystawka optyczna została zaprojektowana przez Autodesk i jest drukowana przez drukarkę 3D Dimension Elite przy użyciu materiału termoplastycznego ABSplus. W tym procesie drukowania materiały modelowe i pomocnicze są podgrzewane w głowicy wytłaczającej w drukarce i są osadzane warstwa po warstwie na podstawie modelarskiej. Po zakończeniu tego etapu materiał nośny można rozpuścić, pozostawiając solidny model 3D pożądanego prototypu Nasz projekt mocowania optycznego składa się z diod LED (środkowa długość fali przy ~ 470 nm, Digikey), plastikowego filtra (#NT54-46, Edmund Optics), tacki na próbki i soczewki płasko-wypukłej f2=15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Wszystkie diody LED i plastikowe filtry można łatwo wymienić w oparciu o widma fluoroforów. Kroki montażu tej nasadki optofluidycznej obejmują:
<ol>
	<li>Umieść obiektyw w nasadce w określonej pozycji uchwytu obiektywu.</li>
	<li>Umieść plastikowy filtr na tacy filtra i wsuń go do nasadki lub przyklej plastikowy filtr przed obiektywem aparatu telefonu komórkowego.</li>
	<li>Włóż tacę LED do nasadki.</li>
	<li>Umieść szkiełka podstawowe w tacce na próbki. Wsuń tacę na próbki do nasadki. Skieruj diody LED w stronę sample.</li>
	<li>Przypnij nasadkę do telefonu komórkowego tak, aby dodatkowy obiektyw stykał się bezpośrednio z obiektywem aparatu telefonu komórkowego.</li>
	<li>Użyj przełącznika na nasadce, aby włączyć diody LED.</li>
	<li>Wyobraź sobie interesującą próbkę za pomocą aparatu w telefonie komórkowym, korzystając z jego "trybu nocnego".</li>
</ol>
3. Przystawka opto-fluidyczna do cytometrii obrazowania fluorescencyjnego
Gdy zachodzi potrzeba badania dużych ilości próbek cieczy w celu wykrycia rzadkich zdarzeń, preferowane może być urządzenie do optofluidycznej cytometrii przepływowej. Możemy zmodyfikować naszą konstrukcję mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia i przekształcić go w cytometr przepływowy, w którym kanał mikroprzepływowy oparty na PDMS jest używany do ciągłego dostarczania próbki cieczy przez objętość obrazowania. Nasadka optyczna została również zaprojektowana przez Autodesk i wydrukowana na drukarce 3D Dimension Elite. Składa się również z diod LED (środkowa długość fali przy ~ 470 nm, Digikey), plastikowego filtra (#NT54-46, Edmund Optics), tacki na próbki i soczewki asferycznej (f = 4,5 mm) (produkt # C230TME-A; Thorlab). Kroki montażu tej nasadki optofluidycznej obejmują:
<ol>
	<li>Umieść soczewkę asferyczną w nasadce.</li>
	<li>Umieść plastikowy filtr na tacy filtra i wsuń go do nasadki lub przyklej plastikowy filtr przed obiektywem aparatu telefonu komórkowego.</li>
	<li>Wsuń kanał mikroprzepływowy do tej samej nasadki opto-fluidycznej.</li>
	<li>Przypnij nasadkę do telefonu komórkowego tak, aby dodatkowy obiektyw stykał się bezpośrednio z obiektywem aparatu telefonu komórkowego.</li>
	<li>Użyj przełącznika na nasadce, aby włączyć diody LED.</li>
	<li>Podłączyć kanał mikroprzepływowy do pompy strzykawkowej i dostarczyć próbkę cieczy do urządzenia mikroprzepływowego ze stałym natężeniem przepływu.</li>
	<li>Uchwyć film z fluorescencyjnymi komórkami/cząstkami przepływającymi przez kanał mikroprzepływowy w trybie wideo kamery telefonu komórkowego.</li>
</ol>
B. Przygotowanie próbki
4. Przygotowanie próbek mikrocząstek fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Koraliki fluorescencyjne o średnicy 10 μm (kulki czerwone: produkt #F8834 wzbudzeniu/emisji 580nm/605nm; kulki zielone: produkt #F8836: wzbudzenie/emisja 505nm/515nm) kupowane są w firmie Invitrogen (Karlowe Wary, Kalifornia).</li>
	<li>Zmieszaj 10 μl zielonych kulek fluorescencyjnych, 10 μl czerwonych kulek fluorescencyjnych z 40 μl wody DI.</li>
	<li>Umieść 10 μl tej mieszanki kulek na szkiełku podstawowym za pomocą mikropipety i umieść na niej kolejne szkiełko podstawowe, aby uzyskać strukturę warstwową.</li>
	<li>Włóż tę strukturę kanapkową do tacki na próbki i wsuń ją do nasadki telefonu komórkowego.</li>
</ol>
5. Przygotowanie znakowanych fluorescencyjnie białych krwinek
<ol>
	<li>Wyjmij zestaw do znakowania fluorescencyjnego kwasów nukleinowych SYTO16 (#S7578, Life Technology) i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z lodówki i doprowadź je do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przenieś 200 μl próbki krwi pełnej z probówki do pobierania krwi EDTA do probówki polistyrenowej o pojemności 1,5 ml (# 05-408-129, Fisher Scientific).</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (# R7757, Sigma-Aldrich) do próbki 200 μl krwi pełnej i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Po 5 minutach odwirować próbkę krwi poddanej lizie i usunąć roztwór sklarowany nad osadem.</li>
	<li>Zawiesić osad białych krwinek w buforze PBS o pojemności 200 μl i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Dodać 5 μl 1 mM roztworu SYTO16 do próbki białych krwinek. Owinąć próbkę folią aluminiową i inkubować w ciemnym otoczeniu przez ~ 30 min.</li>
	<li>Ponownie odwirować próbkę. Supernatant jest usuwany, a znakowane białe krwinki są ponownie zawieszane w buforze PBS.</li>
	<li>Umieść 5-10 μl znakowanej próbki płynnych krwinek białych na szkiełku nakrywkowym i umieść drugą szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki.</li>
	<li>Włóż szkiełko z próbką umieszczoną warstwowo do tacki na próbki i zobrazuj je za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w telefonie komórkowym.</li>
</ol>
Alternatywnie
<ol start="10">
	<li>Ciągłe dostarczanie znakowanych fluorescencyjnie białych krwinek przez kanał mikroprzepływowy za pomocą automatycznej pompy strzykawkowej, jednocześnie rejestrując fluorescencyjny film mikroskopowy przepływających komórek za pomocą kamery telefonu komórkowego w trybie wideo. Powinniśmy również podkreślić, że przenośna pompa strzykawkowa zasilana bateryjnie, a nawet siła grawitacji może być wykorzystana do napędzania przepływu przez kanał mikroprzepływowy.</li>
</ol>

<ol><li>Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSklar%2C+LA+%22Flow+Cytometry+for+BioTechnology%22">Flow Cytometry for BioTechnology</a>. , Oxford University Press Inc. (2005).</li>
<li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNunez%2C+R+%22Flow+cytometry+for+research+scientists%3A+principle+and+applications%22">Flow cytometry for research scientists: principle and applications</a>. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).</li>
<li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMertz%2C+J+%22Introduction+to+optical+microscopy%22">Introduction to optical microscopy</a>. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).</li>
<li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+deeper+than+microscopy%3A+the+optical+imaging+frontier+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.</a> Nature Methods. 7, 603-614 (2010).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Toward fluorescence nanoscopy.</a> Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM.</a> Nature Methods. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+near-field+microscopy+of+DNA+at+sub-10+nm+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution.</a> Physical Review Letters. 97, 260801(2006).</li>
<li>Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+standing+wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%3A+superresolution+imaging+of+single+molecular+and+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens.</a> Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).</li>
<li>Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+without+lenses%3A+achievements+and+remaining+challenges+of+wide-field+on-chip+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy.</a> Nature Methods. 9, 889-895 (2012).</li>
<li>Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+and+compact+wide-field+fluorescent+imaging+on+a+cell-phone%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optofluidic+fluorescent+imaging+cytometry+on+a+cell+phone%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone.</a> Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).</li>
<li>Suzuki, S., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+Visualand+Graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Computer Visualand Graphics.</a> Image Processing. 30, 32-46 (1985).</li>
<li>Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+enabled+detection+of+Escherichia+coli+using+a+cell-phone%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone.</a> Analyst. 137, 2541-2544 (2012).</li>
<li>Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Rapid-Diagnostic-Test+Reader+Platform+on+a+Cellphone%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone.</a> Lab on a Chip. 12 (15), (2012).</li>
<li>Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+signal+recovery+from+incomplete+and+inaccurate+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Communication+of+Pure+and+Applied+Mathematics%22%5BJournal%5D)">Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements.</a> Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).</li>
</ol>

Dr. Ozcan jest założycielem start-upu, którego celem jest komercjalizacja narzędzi do obrazowania obliczeniowego i mikroskopii.

Przedstawiliśmy nasze ostatnie wyniki dotyczące szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej opartej na telefonach komórkowych i obrazowania optofluidycznego cytometrii przepływowej przy użyciu lekkich i kompaktowych nasadek opto-fluidycznych do aparatów w telefonach komórkowych. Korzystając z tej technologii, zobrazowaliśmy obiekty fluorescencyjne, w tym mikrocząsteczki i oznaczone białe krwinki w próbkach krwi pełnej. Dlatego ten kompaktowy i ekonomiczny zestaw narzędzi do obrazowania fluorescencyjnego oparty na telefoni...

Mikroskopia i cytometria przepływowa są szeroko stosowanymi technikami1-12 w badaniach biomedycznych i naukowych, a także w diagnostyce klinicznej do liczenia i charakteryzowania różnych typów komórek. Jednak konwencjonalne mikroskopy i przyrządy do cytometrii przepływowej są stosunkowo skomplikowane i drogie, co ogranicza ich zastosowanie głównie do renomowanych laboratoriów centralnych. Niedawno opracowaliśmy kompaktowe i lekkie urządzenie do obrazowania fluorescencyjnego, cytometryczne i mikroskopijne zintegrowane z telefonem komórkowym,13,14 które daje nadzieję na ekonomiczne przełożenie mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej i powiązanych technik mikroanalizy na środowiska o ograniczonych zasobach do różnych zastosowań telemedycznych mających wpływ na zdrowie na całym świecie.
W konfiguracji optofluidycznej cytometrii przepływowej (patrz np. Rysunek 1C i 1D), specjalnie zaprojektowany kanał mikroprzepływowy oparty na polidimetysiloksanach (PDMS) jest umieszczony przed modułem kamery telefonu komórkowego, gdzie diody elektroluminescencyjne (LED) są sprzężone z krawędziami kanału. Ten mikroprzepływowy chip, wraz z znajdującą się w nim próbką cieczy, tworzy opto-fluidyczny falowód planarny (składający się na przykład z PDMS-ciecz-PDMS) tak, że światło wzbudzenia jest kierowane w celu równomiernego pompowania próbek znakowanych fluorescencyjnie do wnętrza mikrokanału. Emisja fluorescencji z tych oznaczonych obiektów, np. komórek, jest dalej obrazowana przez dodatkową soczewkę umieszczoną zaraz za kamerą telefonu komórkowego i jest odwzorowywana na czujniku obrazu CMOS (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) telefonu komórkowego. Ponieważ emisja fluorescencyjna jest zbierana prostopadle do ścieżki światła wzbudzenia, niedrogi plastikowy filtr absorpcyjny jest wystarczający do usunięcia rozproszonego światła wzbudzenia i może zapewnić przyzwoite tło ciemnego pola wymagane do obrazowania fluorescencyjnego. Korzystając z podobnej konstrukcji opto-fluidycznej, możemy również obrazować obiekty fluorescencyjne w trybie statycznym (patrz rysunek 1A i 1B), w którym cząstki fluorescencyjne są umieszczone między dwoma szklanymi szkiełkami zamiast przepływać przez kanał mikroprzepływowy, a emisja fluorescencyjna z tych fluorescencyjnych cząstek jest przechwytywana przez czujnik obrazu CMOS w telefonie komórkowym w celu zliczenia i scharakteryzowania cząstek. W zależności od różnych wymagań aplikacji można wybrać cytometrię przepływową lub szerokokątną mikroskopię fluorescencyjną. Na przykład urządzenie do cytometrii przepływowej w telefonie komórkowym może być szczególnie przydatne do badań przesiewowych dużych objętości próbek cieczy (np. kilku ml) w celu wykrycia rzadkich komórek lub patogenów.
W tym manuskrypcie przeglądamy niektóre z naszych ostatnich wyników dotyczących integracji mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi do obrazowania cytometrii przepływowej w telefonie komórkowym przy użyciu kompaktowych i opłacalnych przystawek opto-fluidycznych. Te oparte na telefonach komórkowych platformy mikroanalizy, cytometrii obrazowej i czujników mogą zapewnić różne możliwości w zakresie telemedycyny i diagnostyki przyłóżkowej, szczególnie wpływając na naszą walkę z globalnymi wyzwaniami zdrowotnymi w regionach świata o ograniczonych zasobach.

<table><tbody><tr><td>Telefon komórkowy</td><td>Sony</td><td>Sony Ericsson Aino</td><td></td></tr><tr><td>Plano-wypukły obiektyw</td><td>Edmund Optics</td><td># NT45-302</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka asferyczna</td><td>Thorlab</td><td># C230TME-A</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Edmund Optics</td><td>#NT54-46</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska dioda LED</td><td>Digikey</td><td>#365-1201-ND</td><td></td></tr><tr><td>Bateria</td><td>Digikey</td><td>#P032-ND</td><td></td></tr><tr><td>Rurka polistyrenowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>#05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 ZESTAW ELASTOMERÓW SILIKONOWYCH</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Red fluorescencyjne koraliki (10 &mu; m)</td> <td>Life Technologies</td><td>#F8834</td><td></td></tr><tr><td>Zielone koraliki fluorescencyjne (10 &mu; m)</td> <td>Life Technologies</td><td>#F8836</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne oznakowanie kwasów nukleinowych SYTO16</td><td>Life Technologies</td> <td># S7578</td><td></td></tr></tbody></table>

szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna i obrazowanie fluorescencyjne cytometria przepływowa w telefonie komórkowym

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa są szeroko stosowanymi narzędziami w badaniach biomedycznych i diagnostyce klinicznej. Jednak urządzenia te są na ogół stosunkowo nieporęczne i kosztowne, co czyni je mniej skutecznymi w ustawieniach o ograniczonych zasobach. Aby potencjalnie rozwiązać te ograniczenia, niedawno zademonstrowaliśmy integrację szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi do obrazowania cytometrii przepływowej w telefonach komórkowych przy użyciu kompaktowych, lekkich i opłacalnych przystawek opto-fluidycznych. W naszej konstrukcji cytometrii przepływowej komórki znakowane fluorescencyjnie są przepłukiwane przez kanał mikroprzepływowy, który jest umieszczony nad istniejącą kamerą telefonu komórkowego. Zasilane bateryjnie diody elektroluminescencyjne (LED) są sprzężone doczołowo z boku tego mikroprzepływowego chipa, który skutecznie działa jak wielomodowy falowód płytowy, w którym światło wzbudzenia jest kierowane w celu równomiernego wzbudzenia celów fluorescencyjnych. Kamera telefonu komórkowego nagrywa film poklatkowy komórek fluorescencyjnych przepływających przez kanał mikroprzepływowy, w którym przetwarzane są cyfrowe klatki tego filmu w celu zliczenia liczby oznaczonych komórek w roztworze docelowym będącym przedmiotem zainteresowania. Korzystając z podobnej konstrukcji opto-fluidycznej, możemy również zobrazować te fluorescencyjnie znakowane komórki w trybie statycznym, np. umieszczając cząstki fluorescencyjne między dwoma szklanymi szkiełkami i przechwytując ich fluorescencyjne obrazy za pomocą kamery telefonu komórkowego, która może osiągnąć rozdzielczość przestrzenną np. ~ 10 μm przy bardzo dużym polu widzenia ~ 81 mm2. Ta oparta na telefonie komórkowym platforma do obrazowania fluorescencyjnego, cytometrii przepływowej i mikroskopii, może być przydatna szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów, np. do liczenia limfocytów T CD4 + w celu monitorowania pacjentów z HIV + lub do wykrywania pasożytów przenoszonych przez wodę w wodzie pitnej.

Dzięki naszemu optofluidycznemu schematowi pompowania/wzbudzania (Rysunki 1C i 1D), komórki znakowane fluorescencyjnie mogą być dostarczane w sposób ciągły do kanału mikrofluidycznego za pomocą pompy strzykawkowej, podczas gdy aparat w telefonie komórkowym rejestruje poklatunkowy fluorescencyjny film mikroskopowy płynących komórek. Filmy te mogą być następnie szybko analizowane za pomocą algorytmów detekcji konturów i śledzenia14,15, aby automatycznie określić bezwzględną licz...

Przeglądamy nasze ostatnie wyniki dotyczące integracji mikroskopii fluorescencyjnej i narzędzi do obrazowania cytometrii przepływowej w telefonie komórkowym przy użyciu kompaktowych i opłacalnych przystawek opto-fluidycznych. Te urządzenia do mikroanalizy oparte na telefonach komórkowych mogą być przydatne do analizy cytometrycznej, takiej jak wykonywanie różnych zadań związanych z liczeniem komórek, a także do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, np. próbek wody w warunkach ograniczonych zasobów.

Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna i obrazowanie fluorescencyjne Cytometria przepływowa w telefonie komórkowym

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przekształcenie aparatu w telefonie komórkowym w platformę do mikroskopii fluorescencyjnej lub fluorescencyjny cytometr obrazujący. Najpierw emisja fluorescencyjna jest zbierana przez dołączoną soczewkę umieszczoną pomiędzy modułem aparatu w telefonie a badaną próbką. Następnie prosty plastikowy filtr wewnątrz adaptera odrzuca rozproszone światło wzbudzenia, co tworzy ciemne tło dla obrazowania fluorescencyjnego, zmieniając telefon z aparatem w mikroskop fluorescencyjny lub cytometr obrazujący.W ostatnim kroku, przy użyciu kamery w trybie nocnym, wykonuje się zdjęcie lub nagranie wideo fluorescencyjnych cząsteczek, które są przedmiotem badania. W rezultacie fluorescencyjne kuleczki lub komórki mogą zostać zobrazowane i scharakteryzowane za pomocą aparatu w telefonie komórkowym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi rozwiązaniami, takimi jak konwencjonalny mikroskop fluorescencyjny, jest to, że mikroskop oparty na telefonie komórkowym jest kompaktowy, lekki i tani, a ponadto wykazuje potencjał do zastosowania w diagnostyce w punkcie opieki (point-of-care).W warunkach ograniczonych zasobów, gdzie konwencjonalne usługi opieki zdrowotnej są niedostępne, aby złożyć optofluidyczny fluorescencyjny mikroskop szerokopolowy, należy rozpocząć od umieszczenia soczewki plano-konweksyjnej w uchwycie soczewki wewnątrz przystawki optycznej. Następnie należy położyć plastikowy filtr na tacy filtrów i wsunąć go do przystawki. Na koniec należy włożyć tacę LED do przystawki.Umieść szkiełka przedmiotowe z próbkami w tacy na próbki, a następnie wsuń tacę do adaptera. Po skierowaniu diod LED w stronę uchwytu na próbkę, zamocuj złożony adapter do szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej opto-płynowej do telefonu komórkowego w taki sposób, aby dodatkowa soczewka stykała się bezpośrednio z obiektywem aparatu telefonu. Następnie za pomocą przełącznika w adapterze włącz diody LED i wykonaj obrazowanie wybranej próbki przy użyciu aparatu w telefonie.W trybie nocnym. Gdy istnieje potrzeba przesiewania dużych objętości próbek ciekłych w celu wykrycia rzadkich zdarzeń, można złożyć urządzenie do optofluidycznej cytometrii przepływowej. Należy rozpocząć od umieszczenia soczewki sferycznej A w uchwycie.Następnie przymocuj taśmą plastikowy filtr absorpcyjny przed obiektywem kamery i wsuń komorę mikrofluidyczną do adaptera. Teraz przypnij zmontowany adapter opto-fluidyczny do cytometrii obrazowania fluorescencyjnego do telefonu komórkowego w taki sposób, aby dodatkowa soczewka bezpośrednio stykała się z obiektywem kamery telefonu, a następnie za pomocą przełącznika na adapterze włącz diody LED. W dalszej kolejności podłącz kanał mikrofluidyczny do pompy strzykawkowej i podaj płynną próbkę do urządzenia mikrofluidycznego ze stałą prędkością przepływu.Następnie, korzystając z trybu wideo w aparacie telefonu komórkowego, nagraj film przedstawiający fluorescencyjne komórki przepływające przez kanał mikroprzepływowy, aby przygotować próbki fluorescencyjnych mikrocząsteczek. Najpierw zmieszaj 10 µL zielonych fluorescencyjnych kulek i 10 µL czerwonych fluorescencyjnych kulek z 40 µL wody dejonizowanej. Za pomocą mikropipety nanieś 10 µL mieszaniny kulek na szkiełko przedmiotowe.Następnie użyj kolejnego szkiełka przedmiotowego, aby utworzyć strukturę typu „kanapka”. Na koniec umieść strukturę w tacy na próbki adaptera do szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej i wsuń go do adaptera telefonu komórkowego. Aby przygotować próbkę fluorescencyjnie znakowanych leukocytów, przenieś najpierw 200 µL próbki krwi pełnej z probówki do pobierania krwi z EDTA do probówki polistyrenowej o objętości 1,5 ml.Następnie do 200 µl próbki krwi pełnej dodaj jeden mililitr buforu do lizy erytrocytów i dokładnie wymieszaj; po pięciu minutach odwiruj zlizowaną próbkę krwi. Następnie usuń supernatant, resuspenduj osad leukocytów w 200 µl PBS i po odwirukowaniu delikatnie wymieszaj komórki. Ponownie usuń supernatant i resuspenduj w PBS.Następnie do leukocytów dodaj 5 µL roztworu cyto 16 o stężeniu 1 mM i inkubuj próbkę w folii aluminiowej przez 30 minut. Po ponownym odwirowaniu próbki resuspenduj oznakowany osad białych krwinek w dodatkowej ilości PBS, a następnie przenieś od 5 do 10 µL zawiesiny komórkowej na szkiełko nakrywkowe. Na wierzchu próbki umieść drugie szkiełko nakrywkowe, a następnie włóż tak przygotowany preparat do tacy na próbki.Wykonaj obrazowanie próbki, korzystając z adaptera do mikroskopii fluorescencyjnej dla telefonu komórkowego. Alternatywnie, znakowane komórki mogą być dostarczane w sposób ciągły przez kanał mikrofluidyczny za pomocą przenośnej, zasilanej bateryjnie zautomatyzowanej pompy strzykawkowej. Następnie, używając aparatu w telefonie w trybie wideo, zarejestruj fluorescencyjny film mikroskopowy płynących komórek.Fluorescencyjne komórki lub cząstki można obrazować w trybie statycznym, dzięki czemu bez przepływu cieczy można obserwować bardzo duże pole widzenia próbki z rozdzielczością przestrzenną około 10 micrometers. Na przykład na tej ilustracji obrazowano zielone i czerwone fluorescencyjne kuleczki. Satysfakcjonująca jakość obrazu jest osiągana w polu widzenia o powierzchni około 81 millimeters squared w kierunku krawędzi centralnego pola widzenia.Jednakże występują tutaj obszary z aberracjami; przedstawione są zdjęcia leukocytów znakowanych fluorescencyjnie, wykonane telefonem komórkowym. Ten wstawiony obraz przedstawia cyfrowo powiększone zdjęcie leukocytów znakowanych fluorescencyjnie, wycięte z obrazu głównego. W tym wstawionym obrazie pokazano wyniki dekodowania kompresyjnego dla pierwszego wstawienia; zdekodowany obraz wykazuje podobny poziom przejrzystości co ta sama próbka komórek oglądana przez obiektyw 10 x w konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym o tym samym polu widzenia.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przekształcić telefon komórkowy w mikroskop kryminalistyczny lub cytometr obrazowy, co umożliwia charakterystykę obrazową oraz analizę zawartości kulek kryminalistycznych lub komórek.

wide-field-fluorescent-microscopy-fluorescent-imaging-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia fluorescencyjna szerokiego pola i cytometria przepływowa z fluorescencyjnym obrazem na telefonie komórkowym

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Zaprezentowano bezsoczewkową platformę do fluorescencyjnej mikroskopii na chipie, która umożliwia obrazowanie obiektów fluorescencyjnych w bardzo szerokim polu widzenia, np. &gt;0,6-8 cm2, z rozdzielczością &lt;4μm, przy użyciu algorytmu dekodującego opartego na próbkowaniu kompresyjnym. Taka kompaktowa modalność obrazowania fluorescencyjnego na chipie z szerokim polem widzenia może być cenna w cytometrii wysokoprzepustowej, badaniach rzadkich komórek oraz analizach mikromacierzy.

Bezosobnikowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Ten protokół opisuje implementację systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie do obrazowania pojedynczych komórek w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym oraz jego zastosowania w obrazowaniu cytometrii przepływowej.

Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM)

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Tutaj prezentowany jest protokół do optycznego wyodrębniania i katalogowania wrodzonych sygnatur fluorescencji komórkowej (tj. autofluorescencji komórkowej) z każdej pojedynczej żywej komórki rozmieszczonej w przestrzeni trójwymiarowej. Metoda ta jest odpowiednia do badania wrodzonej sygnatury fluorescencyjnej różnych układów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki, w tym komórek bakterii, grzybów, drożdży, roślin i zwierząt.

Rekonstrukcja wrodzonych sygnatur fluorescencyjnych pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Poznaj metodę przekształcania aparatu telefonu komórkowego w platformę mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii obrazowej. Technika ta umożliwia analizę cytometryczną w warunkach ograniczonych zasobów.

Szerokokątna mikroskopia fluorescencyjna i obrazowanie fluorescencyjne Cytometria przepływowa w telefonie komórkowym

Przeglądaj więcej filmów