Name: Przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy, umożliwiającą nieinwazyjne obrazowanie in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki. Technika ta pozwala na długoterminowe monitorowanie żywotności i integracji przeszczepu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Camillo Ricordiemu, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephanowi Speierowi i Danielowi Nyqvistowi za owocne dyskusje. Dziękujemy również Eleut Hernandez i Diego Espinosa-Heidmann za pomoc techniczną oraz Mike'owi Valdesowi i Margaret Formoso za pomoc w nagrywaniu wideo. Byron Maldonado nagrał, zmontował i wyprodukował ostateczną wersję teledysku. Wsparcia badawczego udzieliła Fundacja Instytutu Badań nad Diabetologią (<a href="http://www.DiabetesResearch.org" target="_blank">www.DiabetesResearch.org</a>), NIH/NIDDK/NIAID (F32DK083226 do M.H.A.; NIH RO3DK075487 do A.C.; U01DK089538 do P-O.B.). Dodatkowe wsparcie badawcze dla P-O. B został zapewniony dzięki funduszom Karolinska Institutet, Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych, Szwedzkiej Fundacji Diabetologicznej, Fundacji Rodziny Erling-Persson, Fundacji Rodziny Knutów i Alice Wallenberg, Skandia Insurance Company Ltd., VIBRANT (FP7-228933-2), Strategicznego Programu Badawczego w Diabecie w Karolinska Institutet, Fundacji Novo Nordisk oraz Fundacji Bertha von Kantzowa.

Poniższa procedura jest wykonywana pod stereoskopem w 2 krokach, pierwszy krok polega na załadowaniu wysp trzustkowych do kaniuli, a drugi krok to faktyczny przeszczep do ACE. Wszystkie procedury wykonywane na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania (IACUC) Uniwersytetu w Miami.
1. Ładowanie wysepek w kaniuli do przeszczepu
<ol>
 <li>Wyśrodkuj wysepki w naczyniu hodowlanym, obracając naczynie w zwężających się okręgach.</li>
 <li>Odłącz kaniulę od "zbiornika" i umieść kaniulę oraz rurkę łączącą na czystej powierzchni. Zbiornik może być wykonany z jednorazowej plastikowej końcówki do pipety o pojemności 300 μl bez filtra (rysunek 1a).</li>
 <li>Wypłucz pęcherzyki powietrza ze zbiornika, aby zapewnić ciągły strumień wysepek podczas zasysania do zbiornika. Płukanie zbiornika odbywa się poprzez przesunięcie do przodu zmotoryzowanej strzykawki bez użycia rąk za pomocą pedału nożnego (Rysunek 1b, c). Zapewni to również miejsce w strzykawce, aby umożliwić aspirację wysp trzustkowych do zbiornika (wstępnie załadowanego sterylnym roztworem, takim jak sól fizjologiczna, PBS lub pożywka hodowlana). </li>
 <li>Delikatnie zassać żądaną ilość wysepek do zbiornika. Wysepki będą miały tendencję do wirowania, gdy wejdą do zbiornika i pozostaną razem w kierunku dna. Zasysanie odbywa się poprzez napędzanie do tyłu zmotoryzowanego sterownika strzykawki za pomocą pedału nożnego. </li>
 <li>Podłącz ponownie kaniulę do zbiornika za pomocą rurki łączącej. </li>
 <li>Umieść końcówkę kaniuli z powrotem w naczyniu hodowlanym i wypłucz wysepki ze zbiornika do rurki, a następnie do kaniuli. Upewnij się, że wysepki pozostają razem podczas napełniania rurki/kaniuli, delikatnie "trzepiąc" (stukając) rurką (Rysunek 1d). Zatrzymaj się przed lub po wypłukaniu kaniuli przez kaniulę wszystkich pęcherzyków powietrza znajdujących się przed wysepkami. Jeśli nie masz pewności, zatrzymaj się, gdy wysepki wejdą z tyłu kaniuli, ponieważ pozostałe pęcherzyki powietrza przed wysepkami mogą pomóc w zapobieganiu refluksowi (przepływowi wstecznemu) wysp z ACE. Zniknie z dnia na dzień.
 </li>
 <li>Na tym etapie pacjent jest gotowy do wstrzyknięcia wysepek do ACE (patrz następne kroki). </li>
</ol>
2. Przeszczep wysp trzustkowych do przedniej komory oka
<ol>
 <li>Umieść znieczuloną mysz na ciepłej podkładce pod stereoskopem.</li>
 <li>Umieść pysk myszy w "masce" anestezjologicznej połączonej z aparatem do znieczulenia tlenem/izofluranem. Maska jest wykonana z jednorazowej plastikowej końcówki pipety o pojemności 1 ml (bez filtra) i podłączona do rurki anestezjologicznej przez wąski koniec (rysunek 2a,b).</li>
 <li>Delikatnie cofnij powieki oka, które ma być przeszczepione, za pomocą palca wskazującego i kciuka wolnej ręki i "wysuń" oko, aby uzyskać lepszą ekspozycję i łatwy dostęp (Rysunek 2c). Będzie to wymagało trochę praktyki, aby udoskonalić się bez utrudniania oddychania myszy przez nadmierny nacisk na szyję lub blokowanie przepływu krwi do głowy. </li>
 <li>Używając jednorazowej strzykawki insulinowej (29 - 31G) jako skalpela, ostrożnie wbij się tylko w końcówkę rogówki i wykonaj pojedyncze boczne nacięcie. Wykonaj nacięcie w połowie między wierzchołkiem rogówki a rąbkiem, aby zminimalizować refluks wysp trzustkowych podczas wstrzykiwania z ACE (ryc. 2d). </li>
 <li>Ostrożnie włóż kaniulę (wstępnie załadowaną wysepkami) przez nacięcie. </li>
 <li>Powoli wysuń wysepki z kaniuli i umieść je na górze tęczówki. Aby uniknąć refluksu wysp trzustkowych z powodu nadmiernego wzrostu ciśnienia w ACE, wyrzuć wysepki krótkimi pchnięciami w jak najmniejszej objętości w kwadrancie przeciwległym do nacięcia. Można to dodatkowo zapewnić poprzez zagęszczenie wysepek w wężyku podczas ładowania kaniuli (patrz krok 1.6).</li>
 <li>Powoli wysuń kaniulę z ACE. Jest to krytyczny krok, zwłaszcza jeśli wstrzyknięto dużą objętość wysp trzustkowych, ponieważ refluks wysp z powodu wzrostu ciśnienia wewnątrz ACE może być nieunikniony. Aby wyeliminować/zminimalizować refluks wysp trzustkowych, delikatnie obróć kaniulę wewnątrz ACE, aby uwolnić nadmierne ciśnienie przez nacięcie wokół kaniuli. Sprawdź, czy nie ma oznak refluksu podczas próby wycofania kaniuli i, jeśli to konieczne, poczekaj, aż ciśnienie spadnie, zanim całkowicie wyjmiesz kaniulę z ACE. </li>
 <li>Przepłukać przeszczepione oko sterylnym PBS lub solą fizjologiczną.</li>
 <li>Wstrzyknąć buprenorfinę w celu znieczulenia pooperacyjnego (0,05-0,1 mg/kg, podskórnie) przez pierwsze 48 godzin.</li>
 <li>Natychmiast po przeszczepie należy nałożyć maść z antybiotykiem okulistycznym erytromycyny na przeszczepione oko.</li>
 <li>Umieść zwierzę z powrotem w ogrzanej klatce, aby umożliwić powrót do zdrowia po znieczuleniu.</li>
</ol>

<ol><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).</li>
<li>Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+%3F-cell+function+and+survival+-+a+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol.+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective.</a> Acta Physiol. (Oxf). , (2011).</li>
<li>Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+photoacoustic+and+fluorescence+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy.</a> IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).</li>
<li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+deeper+than+microscopy%3A+the+optical+imaging+frontier+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.</a> Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).</li>
<li>Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+quantum+dots+for+deep+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging.</a> Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).</li>
<li>Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging%3A+a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev.+Nanomed+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging: a personal perspective.</a> Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).</li>
<li>Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+FTY720+treatment+on+postischemic+pancreatic+microhemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics.</a> Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).</li>
<li>Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+whole-body+fluorescence+imaging%3A+Review+of+instruments%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Photochem.+Photobiol.+B%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications.</a> J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).</li>
<li>Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+magnetic+resonance+imaging+of+pancreatic+islet+grafts+after+iron+nanoparticle+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling.</a> Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+deep+intravital+tissues+and+its+merits+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research.</a> J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).</li>
<li>Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transient+migration+behavior+of+natural+killer+cells+imaged+in+situ+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro.</a> Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoimaging%3A+studying+immune+system+dynamics+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99(2011).</li>
<li>Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelli%2C+S+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. , (2011).</li>
<li>Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFan%2C+Z+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 16 (6), 718-722 (2010).</li>
<li>Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+human+islet+vascularization+using+a+dorsal+window+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model.</a> Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).</li>
<li>Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+in+vivo+imaging+of+autoimmune+diabetes+development+in+the+pancreas+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy.</a> PLoS One. 5 (12), e15732(2010).</li>
<li>Martinic, M. M., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+pancreas+during+development+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes.</a> Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+2-Photon+Imaging+of+Blood+Flow+in+the+Neocortex+through+a+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window.</a> J. Vis. Exp. (12), e678(2008).</li>
<li>Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+molecular+imaging+and+analysis+in+mice+using+dorsal+window+chamber+models+applied+to+hypoxia%2C+vasculature+and+fluorescent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent.</a> 6 (9), 1355-1366 (2011).</li>
<li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).</li>
<li>Taylor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+capillary+endothelium+to+changes+in+intravascular+pressure%2C+as+seen+in+the+rabbit%27s+ear+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Exp.+Biol.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber.</a> Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).</li>
<li>Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+rodent+mammary+window+of+orthotopic+breast+cancer+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).</li>
<li>Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li>
<li>Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li>
<li>Falck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site+of+production+of+oestrogen+in+the+ovary+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Site of production of oestrogen in the ovary of the rat.</a> Nature. 184, Suppl 14. 1082(1959).</li>
<li>Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+cerebellar+and+cortical+tissue+transplanted+to+the+anterior+eye+chamber+of+athymic+rats%3A+electrophysiological+and+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).</li>
<li>Adeghate, E., Donath, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+findings+in+long-term+pancreatic+tissue+transplants+in+the+anterior+eye+chamber+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats.</a> Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).</li>
<li>Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+noninvasive+longitudinal+live+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).</li>
<li>Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primate+lentiviral+receptor+Bonzo%2FSTRL33+is+coordinately+regulated+with+CCR5+and+its+expression+pattern+is+conserved+between+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse.</a> J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).</li>
<li>Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+oxygenase-1+induction+in+islet+cells+results+in+protection+from+apoptosis+and+improved+in+vivo+function+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation.</a> Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).</li>
</ol>

P-O.B. jest jednym z założycieli firmy biotechnologicznej Biocrine, która zamierza wykorzystać przednią komorę oka jako komercyjną platformę serwisową. A.C. jest na patencie chroniącym tę technologię.

Mysie wyspy trzustkowe wyizolowano za pomocą trawienia kolagenazą, a następnie oczyszczono na gradientach gęstości, jak opisano wcześniej 33. Izolowane wyspy trzustkowe hodowano przez noc przed przeszczepem. Chociaż może to nie być wymagane, zaleca się, aby wyspy trzustkowe mogły się zregenerować po procedurze izolacji. Ma to kluczowe znaczenie w przypadku przeszczepu u biorców z cukrzycą, ponieważ zapewni przeszczep ocalałych/wytrzymałych wysp trzustkowych. 
Przeszczep wykonuje...

Postępy w mikroskopii przyżyciowej ujawniły zjawiska fizjologiczne, których nie przewidywały badania in vitro 1. Uwypukla to wyzwanie związane z przełożeniem wyników uzyskanych konwencjonalnymi metodami in vitro na żywe zwierzę. W ostatniej dekadzie wizualizacja tkanek u żywych zwierząt uległa znacznej poprawie dzięki postępowi technologicznemu w metodach obrazowania2, 3, 4, 5, 6. Spowodowało to zapotrzebowanie na metody obrazowania in vivo z możliwością zastosowania w eksperymentalnych modelach zwierzęcych, aby umożliwić nieinwazyjną wizualizację podłużną tkanek docelowych. 
Techniki obrazowania, takie jak rezonans magnetyczny i pozytonowa tomografia emisyjna lub bioluminescencja, umożliwiły nieinwazyjne obrazowanie narządów/tkanek głęboko w ciele7-8, 9. Techniki te nie są jednak w stanie osiągnąć rozdzielczości pojedynczej komórki ze względu na wysokie sygnały tła i niską rozdzielczość przestrzenną, pomimo zastosowania materiałów o wysokim kontraście lub luminescencji specyficznej dla tkanki4. Problem ten został rozwiązany wraz z pojawieniem się dwufotonowej fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej10. Mikroskopia dwufotonowa umożliwiła badania obrazowania przyżyciowego w celu wizualizacji i ilościowego określenia zdarzeń komórkowych z niespotykanymi dotąd szczegółami11, 12. Doprowadziło to do scharakteryzowania kluczowych procesów biologicznych w zdrowiu i chorobie13, 14, 15, 16. Podczas gdy pionierskie badania obrazowania przyżyciowego przede wszystkim "naśladowały" warunki in vivo w wyciętych tkankach (np. węzłach chłonnych), inne badania wykorzystywały inwazyjne podejścia do obrazowania odsłoniętych tkanek docelowych in situ17, 18, 19, 20, 21. W innych badaniach wykorzystano również "modele komór okiennych" w celu obejścia ograniczeń związanych z inwazyjnymi podejściami i ograniczoną rozdzielczością obrazowania in vivo22, 23, 24, 25. W modelu komory okiennej komora z przezroczystym oknem jest chirurgicznie wszczepiana w skórę w różnych miejscach (skóra grzbietowa lub uszna, poduszeczka tłuszczowa sutka, wątroba itp.) u zwierzęcia (np. myszy, szczura, królika). Chociaż takie podejście wyraźnie umożliwia obrazowanie in vivo w wysokiej rozdzielczości, wymaga inwazyjnej operacji w celu wszczepienia komory i może nie być w stanie pomieścić badań obrazowania podłużnego trwających kilka tygodni lub miesięcy22.
Niedawno wykazano, że połączenie mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości z minimalnie inwazyjną procedurą, a mianowicie przeszczepem do przedniej komory oka (ACE), zapewnia "naturalne okno ciała" jako potężną i wszechstronną platformę obrazowania in vivo 26, 27. Transplantacja do ACE była stosowana w ciągu ostatnich kilku dekad do badania biologicznych aspektów różnych tkanek 28, 29, 30; a jego niedawne połączenie z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości umożliwiło badanie fizjologii wysp trzustkowych z rozdzielczością pojedynczej komórki nieinwazyjnie i podłużnie26, 27. Podejście to zastosowano do badania odpowiedzi autoimmunologicznych podczas rozwoju cukrzycy typu 1 w modelach zwierzęcych (dane niepublikowane). Stosowano go również do badania rozwoju trzustki, a także w badaniach funkcji nerek poprzez przeszczepienie do zawiązków trzustki ACE lub poszczególnych kłębuszków nerkowych, odpowiednio, (dane niepublikowane). Niedawny raport, w którym zastosowano to podejście, dodatkowo wykazało jego zastosowanie do badania odpowiedzi immunologicznych po przeszczepie wysp trzustkowych31. Co ważne, badanie to wykazało, że przeszczep do przedniej komory oka zapewnia naturalne okno organizmu do wykonywania: (1) podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania przeszczepionych tkanek in vivo; (2) cytoznakowanie in vivo w celu oceny fenotypu komórkowego i żywotności in situ; (3) śledzenie w czasie rzeczywistym naciekających komórek odpornościowych w tkance docelowej; oraz (4) interwencja miejscowa poprzez aplikację miejscową lub wstrzyknięcie dogałkowe.
Tutaj pokazujemy, jak przeprowadzić przeszczep do przedniej komory oka za pomocą wysp trzustkowych.

<table><tbody><tr><td>IsoTHESIA (Isoflurane)</td><td>Buttler Animal Health Supply</td><td>11695-6775-2</td><td>99,9% Izofluran/ml</td></tr><tr><td>Ketaset (Ketamina HCL)</td><td>Fort dodge Zdrowie zwierząt</td><td>0856-2013-01</td><td>Alternatywne znieczulenie iniekcyjne</td></tr><tr><td>Beprenex (Buprenorfina HCL)</td><td>Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd.</td><td>12496-075-7-1</td><td>0,3 mg / ml</td></tr><tr><td>Erytromycyna Maść okulistyczna USP, 0,5%</td><td>Akron</td><td>17478-070-35</td><td>Stosowana profilaktycznie na przeszczepione oko </td></tr><tr><td>0,9% Chlorek sodu (sól fizjologiczna)</td> <td>Hospira Inc.</td><td>0409-7983-03</td><td>Do wstrzykiwań dożylnych. Sterylne</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>1X. Sterylne</td></tr><tr><td>podłoże CMRL 1066</td><td>Cellgro</td><td>98-304-CV</td><td>Uzupełnione, modyfikacja CIT. Preferowane podłoże dla wysepek </td></tr></tbody></table>

przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Obrazowanie przyżyciowe stało się nieodzownym narzędziem w badaniach biologicznych. W tym procesie opracowano wiele technik obrazowania w celu nieinwazyjnego badania różnych procesów biologicznych u zwierząt. Jednak głównym ograniczeniem technicznym w istniejących metodach obrazowania przyżyciowego jest brak możliwości połączenia nieinwazyjnego, podłużnego obrazowania z możliwościami rozdzielczości pojedynczej komórki. Pokazujemy tutaj, w jaki sposób przeszczep do przedniej komory oka pozwala ominąć tak znaczące ograniczenie, oferując wszechstronną platformę eksperymentalną, która umożliwia nieinwazyjne, podłużne obrazowanie z rozdzielczością komórkową in vivo. Demonstrujemy procedurę przeszczepu na myszy i przedstawiamy reprezentatywne wyniki przy użyciu modelu o znaczeniu klinicznym, a mianowicie przeszczepu wysp trzustkowych. Oprócz umożliwienia bezpośredniej wizualizacji w różnych tkankach przeszczepionych do przedniej komory oka, podejście to zapewnia platformę do badań przesiewowych leków poprzez przeprowadzanie długoterminowej obserwacji i monitorowania w tkankach docelowych. Ze względu na swoją wszechstronność, przeszczep tkanki/komórek do przedniej komory oka nie tylko przynosi korzyści terapiom transplantacyjnym, ale także rozszerza się na inne zastosowania in vivo do badania procesów fizjologicznych i patofizjologicznych, takich jak transdukcja sygnału i rozwój raka lub choroby autoimmunologicznej.

Istnieje kilka parametrów definiujących „poprawną” transplantację. Poprawna transplantacja to taka, która przebiega bez krwawienia podczas wykonywania nacięcia, co można zaobserwować na filmie. Krwawieniu zapobiega się lub minimalizuje je, wprowadzając do przedniej komory oka (ACE) jedynie czubek skalpela (igły) (Rysunek 3a). Pomoże to również zapobiec kontaktowi i przebiciu tęczówki. Zapewni to również niewielkie nacięcie, które zagoi się bardzo dobrze, nie powodując z czasem zmętnienia rogówki (<strong...

Nowe podejście łączące przeszczep wewnątrzgałkowy i mikroskopię konfokalną umożliwia podłużne, nieinwazyjne obrazowanie w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek w przeszczepionych tkankach in vivo. Pokazujemy, jak przeszczepić wyspy trzustkowe do przedniej komory oka myszy.

Przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Witajcie, nazywam się Doretta i pochodzę z Instytutu Badań nad Cukrzycą w University of Miami Miller School of Medicine. W tym filmie zaprezentuję, jak przeprowadzić transplantację wysepek trzustkowych do komory tylnej oka myszy. Procedura ta składa się z dwóch etapów.Krok pierwszy to załadowanie wyizolowanych wysepek trzustkowych do kaniuli, a krok drugi to właściwa procedura transplantacji. Szczegółowe informacje na temat instrumentarium i odczynników znajdują się w tekście towarzyszącym. Przedstawiamy tutaj zmotoryzowany sterownik strzykawki z zamontowaną strzykawką oraz przystawkami zbiornika i kaniuli, na których skupimy się w następnym filmie.Pracę rozpoczynamy od załadowania przekaźników (eyelets) do kaniuli. Wszystkie procedury są wykonywane pod stereoskopem. Należy zacząć od wycentrowania przekaźników poprzez obracanie naczynia kolistym ruchem.Po wycentrowaniu odłącz kaniulę od zbiornika i usuń pęcherzyki powietrza, przesuwając zmotoryzowany napęd strzykawki do przodu. Czynność tę wykonuje się, naciskając pedał sterujący ruchem do przodu. Po przygotowaniu rozpocznij aspirację oczek do zbiornika, przesuwając zmotoryzowany napęd strzykawki w kierunku wstecznym.Ponownie, wykonuje się to poprzez naciśnięcie tylnego pedału. Zauważcie, że oczka mają tendencję do gromadzenia się na dnie zbiornika. Następnie należy ponownie podłączyć kaniulę do zbiornika i usunąć z niego oczka.Następnie wprowadź rurkę do kaniuli, aby wypchnąć oczka z zbiornika i sprawić, by pozostały one ciasno upakowane w rurce. Opukuj zbiornik, przesuwając zmotoryzowany dozownik strzykawkowy do przodu. Zauważ, jak ciasno upakowane są oczka w rurce w momencie, gdy zaczynają one wnikać do tylnej części kaniuli.W tym momencie powinni Państwo być gotowi do przeszczepienia obrączków rogówki. Umieść mysz o rozmiarze NS na podkładce i odsłoń lub wypchnij oko przeznaczone do przeszczepienia, odciągając skórę głowy palcem wskazującym i kciukiem. Użyj nowej igły jako skalpela.Zbliż igłę do oka, kierując ściętym końcem w dół, aby zapobiec kontaktowi z tęczówką i jej uszkodzeniu. Wprowadź końcówkę igły w rogówkę i wykonaj nacięcie boczne. Następnie wprowadź przez nacięcie do komory wewnętrznej kaniulę z uprzednio załadowanymi oczkami, a następnie rozpocznij ponowne wprowadzanie oczek do komory, przesuwając zmotoryzowany napęd strzykawki do przodu.Nie należy niepokoić się pęcherzykami powietrza, które mogą zostać uwięzione w kaniuli, ponieważ rozproszą się one później. Będą one również pełnić funkcję naturalnej bariery, minimalizując lub zapobiegając cofaniu się powiek z komory. Powoli i ostrożnie wycofaj kaniulę z komory wewnętrznej.Następnie przemyj oko sterylnym PBS. Podaj preferowany środek przeciwbólowy, a na koniec nałóż okulistyczną maść z antybiotykiem. Transplantacja została zakończona.Przedstawiamy teraz reprezentatywne wyniki dotyczące wysepek trzustkowych przeszczepionych do komory przedniej oka. W badaniach obrazowych wzdłużnych poszczególnych wysepek w siódmym dniu po przeszczepieniu, wysepki są wyraźnie zzespolone na powierzchni tęczówki do 28. dnia.Przeszczepy (eyelets) znajdują się w tych samych miejscach, co widziano wcześniej 42 dni po transplantacji. Przeszczepy są wyraźnie widoczne w tych samych lokalizacjach. Należy również zwrócić uwagę, jak dobrze zagoiło się cięcie, co wyklucza jakąkolwiek możliwość zakłócenia obrazowania poszczególnych przeszczepów.

transplantation-into-anterior-chamber-eye-for-longitudinal-non

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przeszczepienie do komory przedniej oka dla długotrwałego, nieinwazyjnego in vivo Obrazowania z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Tutaj opisujemy platformę, która umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy. Przebieg pracy obejmuje zarówno generowanie sferoid z pierwotnych komórek wątroby, jak i przeszczep do oka myszy oraz obrazowanie in vivo w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

Wysokoczęstotliwościowe ultradźwięki Dopplera to nowatorska technologia służąca do oceny regionalnej funkcji mięśnia sercowego. Niniejsza praca przedstawia pierwsze dowody wykazujące przydatność tej wszechstronnej platformy obrazowania do wielokrotnego pomiaru odkształcenia mięśnia sercowego, dp/dt oraz niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji (IR) serca mysiego.

Wysokoczęstotliwościowa echokardiografia o wysokiej rozdzielczości: pierwsze dowody na nieinwazyjny, powtarzalny pomiar odkształcenia mięśnia sercowego, kurczliwości i niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji serca myszy

W niniejszym przedstawiamy model przeszczepu nerki u szczura do nieinwazyjnej oceny ostrego odrzucenia allograftu przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej z zastosowaniem 18F-fluorodeoksyglukozy.

Nieinwazyjne obrazowanie ostrego odrzucenia allograftu po przeszczepieniu nerki u szczura z wykorzystaniem 18F-FDG PET

Połączyliśmy pomiary utlenowania hemoglobiny mózgowej wykonane za pomocą spektroskopii bliskiej podczerwieni w dziedzinie częstotliwości z pomiarami wskaźnika przepływu krwi mózgowej za pomocą dyfuzyjnej spektroskopii korelacyjnej, aby oszacować wskaźnik metabolizmu tlenu. Przebadaliśmy przydatność tego pomiaru jako narzędzia do przesiewowej oceny przy łóżku pacjenta w celu ewaluacji stanu zdrowia i rozwoju mózgu noworodka.

Nieinwazyjny pomiar optyczny metabolizmu mózgowego i hemodynamiki u niemowląt

Poznaj metodę przeszczepu wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy, umożliwiającą nieinwazyjne obrazowanie in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki. Technika ta pozwala na długoterminowe monitorowanie żywotności i integracji przeszczepu.

Przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal

Przeszczep do przedniej komory oka w celu podłużnego, nieinwazyjnego obrazowania in vivo z rozdzielczością pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów