Name: Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metodę indukcji przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) in vitro z wykorzystaniem różnych linii komórkowych. Technika umożliwia analizę morfologii i ekspresji markerów przez immunocytochemię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Julii Hatler i Martinowi Ramsdenowi (R & D Systems) za pomocną dyskusję i recenzję manuskryptu.

1. Indukcja EMT
<ol>
	<li>Podgrzać pożywkę do temperatury 37 °C w łaźni wodnej. Użyte pożywki hodowlane są takie same, jak pożywki używane do standardowej hodowli komórek będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład linia komórkowa ludzkiego raka płuc A549 jest hodowana w F12 Kaighna uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 2 mM glutaminą.</li>
	<li>Zbierz interesujące Cię komórki za pomocą roztworu dysocjacyjnego (np. TrypLE Express).</li>
	<li>Zawiesić komórki we wstępnie ogrzanej pożywce hodowlanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek o sile 400 x g przez 5 min.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant, wlewając go do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy we wstępnie ogrzanej pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego. Pobrać próbkę zawiesiny komórek i rozcieńczyć w 0,4% roztworze błękitu trypanowego. Umieścić 10 μl rozcieńczonej próbki na hemocytometrze i policzyć żywe komórki (komórki, które nie zmieniają koloru na niebieski). Użyj liczby komórek, aby określić gęstość komórek w roztworze.</li>
	<li>Płytki na płytkach lub kolbach poddanych działaniu hodowli tkankowej w proporcjach 0,9-1,0 x 104 komórki na cm2. Na przykład, 0,5 x 106 komórek posianych na płytce 100 mm w pożywce hodowlanej zawierającej 1X Suplement Pożywki indukującej EMT (6 ml pożywki na płytkę 100 mm).</li>
	<li>Hodowla komórek posianych w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 . Codziennie monitoruj morfologię komórek.</li>
	<li>Trzy dni po posiewie usuń pożywkę i zastąp ją świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką hodowlaną zawierającą 1X Suplement Pożywki indukującej EMT. Kontynuować hodowlę w inkubatorze o temperaturze 37 °C/ 5% CO2 .</li>
	<li>Pięć dni po posiewie komórki są gotowe do analizy. Morfologia komórek jest wizualizowana za pomocą mikroskopii w świetle odwróconym.</li>
</ol>
2. Analiza ekspresji białek za pomocą immunocytochemii
<ol>
	<li>Przygotować sterylne szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm na płytkę 24-dołkową, umieszczając szkiełka nakrywkowe na płytce Petriego zawierającej 95% etanolu. Delikatnie usuń szkiełka nakrywkowe z etanolu za pomocą igły i zakrzywionych kleszczy i sterylizuj płomieniem. Umieść sterylne szkiełko nakrywkowe w jednym dołku na płytce 24-dołkowej. Powtórz z pozostałymi szkiełkami nakrywkowymi.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek w sposób opisany w ppkt 1.1 - 1.7.</li>
	<li>Płytka 1,6 x 104 komórki / studzienka w 0,5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej zawierającej 1X Suplement pożywki indukującej EMT.</li>
	<li>Hoduj i odżywiaj komórki zgodnie z opisem w sekcjach 1.9 - 1.11.</li>
	<li>Pięć dni po posiewie usuń pożywkę i utrwal komórki za pomocą 300 μl / studzienka 4% paraformaldehydu w 1X buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i spłukać komórki 2x za pomocą 1X PBS, 500 μl/studzienkę.</li>
	<li>Inkubować komórki w 400 μl/studzienkę buforu blokującego (1X PBS zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 10% normalnej surowicy osła i 0,3% Triton X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować w przeciwciałie pierwszorzędowym w zalecanym przez producenta stężeniu w 400 μl/basenik buforu blokującego przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku stosowania przeciwciała pierwszorzędowego bezpośrednio sprzężonego z fluorochromem, próbki należy inkubować w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki trzy razy w 500 μl/basenik 1X PBS zawierający 0,1% BSA przez 5 minut każdego płukania. W przypadku stosowania przeciwciała pierwszorzędowego bezpośrednio sprzężonego z fluorochromem należy przejść bezpośrednio do kroku 2.12.</li>
	<li>Inkubować komórki w przeciwciałie drugorzędowym w zalecanym przez producenta stężeniu w 400 μl/basenik 1X PBS zawierającego 1% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki trzy razy w 500 μl/basenik 1X PBS zawierający 0,1% BSA przez 5 minut każdego płukania.</li>
	<li>W razie potrzeby przeciwbarwić jądra roztworem DAPI.</li>
	<li>Opłucz komórki w wodzie dejonizowanej i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku ekranem do dołu za pomocą mediów montażowych.</li>
</ol>

<ol><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li>
<li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li>
<li>Onder, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).</li>
<li>Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin%2F%CE%B2-catenin+complex+and+the+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).</li>
<li>Scheel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+and+autocrine+signals+induce+and+maintain+mesenchymal+and+stem+cell+states+in+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast.</a> Cell. 145, 926-940 (2011).</li>
<li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Research. 19, 156-172 (2009).</li>
<li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B21+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMT%29.+Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition.</a> EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).</li>
<li>Miettinen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells%3A+involvement+of+type+I+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TGF-β induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).</li>
<li>Pelton, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+genes+encoding+TGFs+%CE%B21%2C+%CE%B22%2C+and+%CE%B23+during+murine+palate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of genes encoding TGFs β1, β2, and β3 during murine palate formation.</a> Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).</li>
<li>Taube, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li>
<li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li>
<li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states%3A+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li>
<li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+by+transforming+growth+factor-%CE%B21+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction by transforming growth factor-β1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li>
<li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li>
<li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-%CE%B21-induced+EMT+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Activation of the Erk pathway is required for TGF-β1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li>
<li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription%3A+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li>
<li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li>
<li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
</ol>

R & D Systems, Inc. jest spółką publiczną nastawioną na zysk. Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez R&D Systems, Inc.

Poprzednie metody indukcji EMT na ogół wykorzystywały stymulację TGF-β lub modyfikację genetyczną. Chociaż wykazano, że sam TGF-β indukuje EMT w niektórych typach komórek, obecnie wykazano, że TGF-β jest niezbędny dla EMT, ale nie jest wystarczający we wszystkich typach komórek6,14. Stosowanie modyfikacji genetycznej do indukcji EMT jest czasochłonne i pracochłonne. Opisana tutaj metoda wykorzystuje kombinację czynników, w tym anty-ludzkiej E-kadheryny, anty-ludzkiego sFRP-1, anty-ludzkiego Dkk-1, rekombinowanego ludzkiego Wnt-5a i rekombinowanego ludzkiego TGF-a1, aby niezawodnie indukować EMT. Ta kombinacja czynników ma na celu zablokowanie adhezji opartej na E-kadherynie, co jest krytycznym krokiem dla indukcji EMT4, i wzmocnienie sygnalizacji Wnt poprzez dodanie białka Wnt-5a, a także zastosowanie przeciwciał blokujących inhibitory Wnt, sFRP-1 i Dkk-1. Wykazano, że sygnalizacja Wnt i TGF-β działa w pętli autokrynnej w celu wywołania i utrzymania stanu komórki mezenchymalnej6. Ta metoda indukcji pozwala uniknąć manipulacji genetycznych i jest bardziej skuteczna niż stosowanie samego TGF-β. Co ważne, jesteśmy w stanie zaobserwować indukcję EMT w typach komórek, w tym komórkach MCF7 i PANC-1, które, jak wykazano wcześniej, nie reagują wyłącznie na stymulację TGF-β (Figura 5)14.
Komórki traktowane suplementem pożywki indukującej EMT wykazują mniej zwartą i zwiększoną morfologię wrzecionowatą (ryc. 1). Dodatkowo obserwuje się spadek powierzchniowej ekspresji E-kadheryny równolegle ze wzrostem ekspresji fibronektyny, które są cechami charakterystycznymi EMT (ryc. 2 i 3). Dodatkowe markery mezenchymalne, takie jak wimentyna i ślimak, są również regulowane w górę w komórkach indukowanych EMT w porównaniu z nieindukowanymi kontrolami (ryc. 4). Zwiększona zdolność migracji i inwazji to główne cechy funkcjonalne komórek mezenchymalnych. W testach migracji i inwazji in vitro komórki traktowane suplementem pożywki indukującej EMT wykazały znacznie zwiększoną zdolność do migracji i inwazji (ryc. 6).
Ta prosta metoda indukcji EMT jest przydatna do badania sygnalizacji EMT, jak wykazano przy użyciu danych dotyczących ekspresji matrycy przeciwciał pokazanych na rysunku 7. Można porównać różne typy komórek przed i po indukcji EMT, aby uzyskać wspólne sygnatury ekspresji związane z EMT, takie jak wzrost fosforylowanych CREB i ERK1 / 2 obserwowany zarówno w komórkach indukowanych przez MCF7, jak i A549 EMT. Fosforylacja S133 CREB stymuluje wiązanie DNA i wykazano, że działa poniżej indukowanego przez TGF-a1 EMT15. Wykazano również, że fosforylacja ERK1/2 działa poniżej EMT16 indukowanego przez TGF-β1. Można również wyjaśnić różnice w szlakach sygnałowych między typami komórek, co widać przy wzroście fosforylacji GSK-3β w komórkach A549 w porównaniu z fosforylacją p70S6K w MCF7. Fosforylacja GSK-3β przy serynie 9 zmniejsza jej funkcję, a wykazano, że GSK-3β hamuje czynnik transkrypcyjny pro-EMT, Ślimak17. Natomiast p70S6K indukuje aktywność ślimaka, a jego fosforylacja jest związana z aktywacją tego białka18.
Ogólnie rzecz biorąc, prosta i niezawodna indukcja EMT, szczególnie w komórkach, w których wcześniej wykazano, że nie reagują wyłącznie na TGF-β, jest przydatna do zrozumienia biologii EMT, identyfikacji wspólnych sygnatur ekspresji do wykorzystania jako markery prognostyczne oraz opracowania i oceny nowych metod leczenia raka i choroby zwłóknieniowej.

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) to proces, w którym spolaryzowana komórka nabłonkowa przechodzi różnorodne zmiany, w wyniku których powstaje wysoce ruchliwa, podobna do fibroblastów komórka mezenchymalna. Proces ten zachodzi częściowo poprzez zmiany ekspresji genów i degradację połączeń adherens, co skutkuje zwiększoną zdolnością do migracji i inwazji. Fizjologicznie EMT odgrywa ważną rolę podczas rozwoju embrionalnego i gojenia się ran. Utrata właściwej kontroli nad EMT może prowadzić do zwłóknienia i przerzutów raka1,2. 
	Redukcja E-kadheryny na powierzchni komórek nabłonkowych jest krytycznym krokiem w rozwoju komórki przez EMT3,4. E-kadheryna jest białkiem transbłonowym z pojedynczym przejściem, które bezpośrednio oddziałuje z białkami kadheryny na sąsiednich komórkach. Oprócz swojej roli w adhezji komórek, E-kadheryna wpływa na sygnalizację komórkową poprzez interakcje między cytoplazmatycznym ogonem E-kadheryny a różnymi białkami regulatorowymi, zwłaszcza β-kateniną. β-katenina odgrywa rolę w stabilizacji połączeń przylegających. Podczas kanonicznej sygnalizacji Wnt β-katenina jest uwalniana z E-kadheryny i przemieszczana do jądra, gdzie działa jako dalszy czynnik transkrypcyjny w szlaku Wnt3,4,5. Wykazano, że w jądrze β-katenina zwiększa transkrypcję kilku czynników związanych z EMT, w tym Twist, Slug, Fibronectin i różnych metaloproteaz macierzy3,6.
	Oprócz Wnts, wykazano, że sygnalizacja TGF-β odgrywa znaczącą rolę w indukcji EMT zarówno podczas normalnego rozwoju, jak i w stanach chorobowych7,8,9. TGF-β bierze udział w EMT, który występuje podczas tworzenia podniebienia i w rozwijającym się sercu10. Jest również zaangażowany w zwłóknienie i progresję raka do przerzutów7.
	Opisana tutaj procedura zapewnia konsekwentną indukcję EMT w różnych typach komórek bez potrzeby manipulacji genetycznej. W tej procedurze wykorzystuje się koktajl przeciwciał blokujących E-kadherynę, sFRP-1 i Dkk-1 oraz rekombinowanych białek Wnt-5a i TGF-β1. Ten koktajl został zaprojektowany w celu blokowania adhezji opartej na E-kadherynie, jednocześnie wzmacniając sygnalizację Wnt i TGF-β. Zdolność do solidnej indukcji EMT ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii tego procesu i sposobu manipulowania nim w celach terapeutycznych. Obecne powszechne markery EMT, E-kadheryna (obniżona w EMT) i wimentyna (w górę w EMT), mogą ulegać jednoczesnej ekspresji w nowotworach, a zatem nie zapewniają najlepszych markerów diagnostycznych potencjalnych komórek przerzutowych12. Co ważne, analiza różnych typów komórek, które zostały poddane EMT, jest przydatna do opracowania wspólnych sygnatur ekspresji genów, które można wykorzystać do celów diagnostycznych w raku i zwłóknieniu11. Ponadto ostatnie badania wykazały, że EMT może odgrywać rolę w tworzeniu rakowych komórek macierzystych, co sugeruje, że komórki, które przeszły EMT, mogą być przydatne do badań przesiewowych leków w celu identyfikacji związków, które mogą celować w te komórki.

<table><tbody><tr>Interesujące <td></td><td></td><td>nas komórki nabłonkowe</td><td>Przetestowaliśmy: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7 i PANC1</td></tr><tr><td>Suplement pożywki indukującej EMT</td><td>R& D Systems</td><td>CCM017</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TGF-&#946; 1</td><td>R& Systemy D</td><td>240-B</td><td>Stosowane przy 10 ng / ml</td></tr><tr><td>przeciwciało sprzężone anty-E-Kadheryna NL557</td><td>R& D Systems</td><td>NL648R</td><td>Stosowany w rozcieńczeniu 1:10 do immunocytochemii</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin </td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1838</td><td>używane przy 0,1 &mu; g/ml dla western blot</td></tr><tr><td>anty-fibronektyny</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1918</td><td>używane przy 10 &mu; g/ml dla immunocytochemii; Używany przy 0,5 &mu; g/ml do western blot</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>R& D Systems</td><td>AF5718</td><td>Używany przy 0,2 &mu; g / ml dla western blotting</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse NL493 Przeciwciało wtórne</td><td>R& D Systems</td><td>NL009</td><td>Stosowany w rozcieńczeniu 1:200 do immunocytochemii</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne Donkey Anti-Goat HRP</td><td>R& D Systems</td><td>HAF109</td><td>Używany w 1:2000 do western blotting</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Anti Drugorzędowe przeciwciało</td> R<td>& D Systems</td><td>HAF007</td><td>Używany w 1:2000 do western blotting</td></tr><tr><td>EMT 3-kolorowy zestaw immunocytochemiczny</td><td>R& D Systems</td><td>SC026</td><td>Używany zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje. Ten zestaw zawiera bezpośrednio sprzężone przeciwciała przeciwko E-kadherynie, wimentynie i ślimakowi.</td></tr><tr><td>96 Well: Test inwazji komórek BME</td><td>R& D Systems</td><td>3455-096-K</td><td>Ten zestaw był używany zgodnie z zaleceniami producenta.</td></tr><tr><td>Zestaw macierzy Proteome Profiler Human Phospho-MAPK R</td><td>& D Systems</td><td>ARY002B</td><td>Ten zestaw był używany zgodnie z zaleceniami producenta19.</td></tr><tr><td>Nośniki montażowe</td><td>R& D Systems</td><td>CTS011</td><td></td></tr><tr><td>0,4% Trypan Blue Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15350-061</td><td></td></tr><tr><td>1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>95% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>789-704</td><td>Rozcieńczyć w 1X PBS, aby uzyskać 10% roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Rozcieńczyć w 1X PBS do 4% stężenia roboczego.</td></tr><tr><td>Roztwór DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Przygotować roztwór podstawowy w temperaturze 14,3 mM, rozpuszczając się w wodzie. Roztwór roboczy to rozcieńczenie roztworu podstawowego w stosunku 1:5000 w 1X PBS.</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione o cienkim spiczastym</td> profilu <td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>12 mm szkiełka nakrywkowe</td><td>Carolina Biological</td><td>633009</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko</td><td></td><td></td> w proszku <td>Stosowany w stężeniu 5% w TBST do blokowania w western blotting</td></tr><tr><td>TBST [25mM Tris, pH 7,4, 0,15M NaCl, 0,1% Tween 20]</td><td></td><td></td><td>Do blokowania i mycia western blotting</td></tr><tr><td>Membrana</td><td></td><td></td> <td>PVDFDo western blotting </td></tr><tr><td>4-20% żel</td><td></td><td></td> SDS <td>Do podłoża</td></tr><tr><td></td><td></td><td>ECL</td> do <td>western blotting</td></tr><tr><td>Probówki</td><td></td><td></td><td></td>stożkowe 15 ml</tr><tr><td>Płytki/kolby, płytki 24-dołkowe poddane</td><td></td><td></td><td></td>działaniu</tr><tr><td>kultur tkankowych, poddane działaniu</td><td></td><td></td><td></td>kultur tkankowych</tr><tr><td>Pipety / końcówki</td><td></td> <td>do pipet</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Aid / pipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>37 &deg; C/5%CO2 Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td></td>światła<td>odwróconego</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td> fluorescencyjny</tr></tbody></table>

indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) jest niezbędne dla prawidłowej morfogenezy podczas rozwoju. Nieprawidłowa regulacja tego procesu została uznana za kluczowe zdarzenie w zwłóknieniu i progresji raka do stanu przerzutowego. Zrozumienie procesów leżących u podstaw EMT jest niezbędne do wczesnej diagnozy i klinicznej kontroli tych stanów chorobowych. Niezawodna indukcja EMT in vitro jest użytecznym narzędziem do odkrywania leków, a także do identyfikacji typowych sygnatur ekspresji genów do celów diagnostycznych. Tutaj demonstrujemy prostą metodę indukcji EMT w różnych typach komórek. Uwzględniono również metody analizy komórek przed i po indukcji EMT za pomocą immunocytochemii. Dodatkowo wykazujemy skuteczność tej metody poprzez analizę macierzy opartą na przeciwciałach i testy migracji/inwazji.

Opisane tutaj warunki hodowli indukujące EMT stanowią niezawodną metodę indukcji przejścia epitelialno-mezenchymalnego w wielu typach komórek. Rysunki 1 i 2 przedstawiają morfologię oraz poziomy ekspresji markerów dla 4 różnych ludzkich linii komórkowych: komórek glejaka T98G, komórek gruczolaka przewodowego jelita grubego HT29, komórek raka płuca A549 oraz komórek nabłonkowych gruczołu piersiowego MCF10A. Komórki traktowane suplementem do pożywki indukującej EMT zmieniły klasyczną morfologię nabłonkową (Rysunki 1A - 1D) na mezenchymalną morfologię wrzecionowatą (Rysunki 1E - 1H). Komórki po indukcji EMT wydawały się mniej gęsto upakowane w zwartych koloniach w porównaniu z komórkami nieindukowanymi. Próbki nieindukowanych komórek MCF10A zawierały ściśle upakowane skupiska otoczone przez bardziej rozproszone komórki. Skupiska te były pozytywne pod kątem E-cadherin (Rysunek 2D) i zanikły po zastosowaniu suplementu do pożywki indukującej EMT (Rysunek 2H).
	EMT oceniono również poprzez analizę downregulation markerów nabłonkowych i upregulation markerów mezenchymalnych. Downregulation ekspresji E-kadheryny jest zazwyczaj obserwowana po indukcji EMT w różnych typach komórek3,4. Rysunek 2 pokazuje ekspresję powierzchniową E-kadheryny w większości nieleczonych komórek (Rysunki 2A - 2D; czerwony) w porównaniu do jej braku po indukcji EMT (Rysunki 2E - 2H; czerwony). W jednej linii komórkowej, T98G, stwierdzono niezwykle niski podstawowy poziom E-kadheryny przed indukcją EMT, co uniemożliwiło jej analizę. Upregulation markera mezenchymalnego, fibronektyny, była również widoczna po indukcji przy użyciu suplementu do medium indukującego EMT (Rysunki 2A - 2D versus Rysunki 2E - 2H; zielony).
	Poziomy ekspresji E-kadheryny i fibronektyny obserwowane w immunocytochemii zostały dodatkowo potwierdzone za pomocą western blotu lizatów całkowitych komórek (Rysunek 3). Western blot potwierdził obniżenie poziomu E-kadheryny oraz zwiększenie ekspresji fibronektyny zaobserwowane w immunocytochemii. Prążki zostały poddane kwantyfikacji metodą densytometrii i znormalizowane względem GAPDH w celu określenia względnej zmiany krotności po indukcji EMT. Poziomy E-kadheryny uległy zmniejszeniu odpowiednio 6,4 i 3,4 krotnie w komórkach A549 i MCF10A. Poziomy fibronektyny wzrosły odpowiednio 4,6, 4,1 i 2,3 krotnie w komórkach T98G, A549 i MCF10A. Chociaż western blot nie wykazuje istotnego zmniejszenia poziomu białka E-kadheryny w komórkach HT29 po indukcji EMT, wyniki immunocytochemii wykazują spadek ekspresji powierzchniowej E-kadheryny (Rysunek 2B w porównaniu do 2F), czego nie można rozróżnić w western blocie lizatów całkowitych komórek. 
	Aby dalej ocenić status EMT, przeanalizowano dodatkowe znane markery EMT przed i po indukcji EMT. Zgodnie z poprzednimi wynikami, poziom E-kadheryny był obniżony we wszystkich badanych liniach komórkowych, co wskazywało na indukcję EMT. Ponadto markery mezenchymalne, Vimentina i Snail, wykazywały zwiększoną ekspresję w komórkach A549, T98G i MCF10A po zastosowaniu suplementu medium indukującego EMT (Rysunek 4). Linia komórkowa HT29 nie wykazała ekspresji tych markerów mezenchymalnych ani z indukcją EMT, ani bez niej (dane nie zostały przedstawione), co może wskazywać, że komórki te wykorzystują alternatywne szlaki indukcji EMT.
	Choć TGF-β jest wystarczający do indukowania EMT w określonych kontekstach komórkowych7,8,9, inne typy komórek nie reagują wyłącznie na dodanie TGF-β14. Doniesiono, że ludzkie komórki raka piersi MCF7 oraz ludzkie komórki raka trzustki PANC-1 nie reagują na samo sygnałowanie TGF-β14. Aby ustalić, czy obie linie mogą przejść EMT in vitro, komórki hodowano w obecności suplementu do pożywki indukującej EMT (EMT Inducing Media Supplement). Komórki stymulowano samym rekombinowanym TGF-β1 w stężeniu zawartym w suplemencie do pożywki indukującej EMT. Komórki te zachowały swoją morfologię nabłonkową, tworząc gęsto upakowane kolonie komórek (dane nie pokazano), a poziom E-kadheryny na powierzchni był zbliżony do poziomu w komórkach kontrolnych (Rycina 5C i 5D w porównaniu z Rysunami 5A i 5B). W przeciwieństwie do nich, komórki stymulowane suplementem do pożywki indukującej EMT wykazały drastyczny spadek poziomu E-kadheryny na powierzchni (Ryciny 5E i 5F). Komórki te uzyskały również bardziej mezenchymalną morfologię, stając się mniej kompaktowe i bardziej wrzecionowate (dane nie pokazano). Wyniki te dowodzą, że opisana tutaj metoda indukcji EMT jest w stanie promować zmiany morfologiczne i ekspresję markerów EMT w komórkach typowo opornych na EMT indukowane przez TGF-β.
	Oprócz zmian w ekspresji markerów, kolejną cechą charakterystyczną komórek mezenchymalnych jest ich zdolność do migracji i inwazji. Migrację i inwazję komórek hodowanych z dodatkiem lub bez dodatku suplementu mediów indukujących EMT analizowano za pomocą testu inwazji komórkowej BME w płytkach 96-dołkowych zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, komórki wysiano na płytki 96-dołkowe (50 000 komórek/dołek) zawierające wkłady filtracyjne z porami o średnicy 8,0 μm. Po 48 h oceniono migrację poprzez barwienie calceiną AM komórek, które przedostały się przez filtr. Każdą próbkę badano dwukrotnie w trzech powtórzeniach, uzyskując podobne wyniki. Reprezentatywne wyniki z jednego eksperymentu przedstawiono na Ryc. 6A. Po indukcji EMT zaobserwowano statystycznie istotny wzrost (P-value&lt;0,003) migracji komórek zarówno w przypadku linii A549, jak i PANC-1. Aby ocenić zdolność tych komórek do inwazji (i.e. migracji przez macierz zewnątrzkomórkową), przeprowadzono ten sam test przy użyciu filtra powleczonego ekstraktem błony podstawnej. Komórki po indukcji EMT wykazały statystycznie istotny (P-value&lt;0,001) wzrost zdolności inwazyjnych w porównaniu z komórkami nieleczonymi, co przedstawiono na Ryc. 6B.
	Skuteczna indukcja EMT jest przydatna do analizy zmian w ekspresji genów oraz sygnalizacji zachodzącej w tych komórkach. Analiza macierzy oparta na przeciwciałach z wykorzystaniem lizatów z komórek traktowanych i nietraktowanych jest jedną z metod analizy poziomów ekspresji różnorodnych cząsteczek w pojedynczej próbce. Jako przykład przeanalizowaliśmy poziomy fosforylacji członków rodziny MAPK w lizatach z nieindukowanych oraz indukowanych do EMT komórek MCF7 i A549, używając zestawu Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit. Macierz była przeprowadzana dwukrotnie w niezależnych próbach indukcji EMT, dając podobne wyniki. Rysunek 7 przedstawia reprezentatywne dane z jednej macierzy. Oba typy komórek wykazały zwiększoną fosforylację CREB (S133), ERK1 (T202/Y204) oraz ERK2 (T185/Y187) w komórkach z indukowanym EMT w porównaniu do kontroli. Zaobserwowano również różnice w zdarzeniach sygnalizacyjnych pomiędzy dwoma typami komórek. Komórki A549 wykazały wzrost fosforylacji GSK-3 β (S9), natomiast komórki MCF7 wykazały zwiększoną fosforylację p70S6K (T421/S424). 
	<img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="Hodowle komórkowe w warunkach EMT i poza EMT; obraz mikroskopowy; przejście nabłonkowo-mezenchymalne." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Indukcja morfologii mezenchymalnej po stymulacji suplementem do pożywki indukującej EMT. (A - D) Morfologia nabłonkowa w czterech wskazanych typach komórek po 5 dniach hodowli w standardowej pożywce hodowlanej bez suplementu do pożywki indukującej EMT. (E - H) Morfologia mezenchymalna w czterech wskazanych typach komórek hodowanych z suplementem do pożywki indukującej EMT przez 5 dni.
	<img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="Schematy EMT hodowli komórkowych T98G, HT29, A549, MCF10A z mikroskopii fluorescencyjnej." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Obniżenie ekspresji markera nabłonkowego oraz zwiększenie ekspresji markera mezenchymalnego w komórkach poddanych indukcji EMT. Komórki barwiono immunofluorescencyjnie w celu wykrycia ekspresji markera nabłonkowego, E-kadheryny (czerwony), oraz markera mezenchymalnego, fibronektyny (zielony). (A - D) Komórki kontrolne hodowane przez 5 dni bez dodatku indukującego EMT do pożywki. (E - H) Komórki hodowane przez 5 dni z dodatkiem indukującym EMT do pożywki. Wszystkie komórki zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski).
	<img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="Western blot dla markerów EMT: fibronektyny, E-kadheryny i GAPDH w liniach komórkowych; analiza białek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Potwierdzenie ekspresji markerów nabłonkowych i mezenchymalnych za pomocą analizy western blot. Western blot całkowitych lizatów czterech wskazanych typów komórek, traktowanych (EMT) lub nietraktowanych (-) suplementem pożywki indukującej EMT przez 5 dni. Prążki dla E-kadheryny, fibronektyny oraz kontroli ładunku GAPDH są wskazane po lewej stronie. Marker wielkości jest wskazany po prawej stronie. 
	<img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="Mikroskopia komórek A549, T98G, MCF10A; proces EMT; markery fluorescencyjne, porównanie morfologii komórek." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Podwyższenie poziomu markerów mezenchymalnych, Vimentiny i Snail w komórkach indukowanych do przejścia EMT. Komórki barwiono wielokolorową immunofluorescencją w celu wykrycia ekspresji markera nabłonkowego, E-kadheryny (szary), oraz markerów mezenchymalnych: Vimentiny (zielony) i Snail (czerwony). (A - C) Komórki kontrolne hodowane bez suplementu pożywki indukującej EMT przez 5 dni. (D - F) Komórki hodowane z suplementem pożywki indukującej EMT przez 5 dni.
	<img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna EMT w komórkach PANC1 i MCF7; traktowanie TGF-β1 w porównaniu z kontrolą." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
 Rysunek 5. Indukcja EMT w komórkach niewrażliwych na TGF-β1. (A i B) Komórki hodowane w samym medium przez 5 dni. (C i D) Komórki hodowane w medium zawierającym 10 ng/ml TGF-β1 przez 5 dni. (E i F) Komórki hodowane w medium z suplementem indukującym EMT przez 5 dni. Wszystkie komórki przebarwiono pod kątem ekspresji E-kadheryny (czerwony) i przeciwbarwiono DAPI (niebieski).
	<img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="Schemat wpływu EMT na migrację i inwazję komórek, analiza A549 PANC-1, zwiększona inwazja." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
 Rysunek 6. Komórki indukowane przez EMT wykazują zwiększoną zdolność do migracji i inwazji. A. Średnia liczba komórek, które migrowały przez filtr z porami 8 μm po 48 hr inkubacji. B. Średnia liczba komórek, które były zdolne do inwazji przez filtr z porami 8 μm pokryty ekstraktem błony podstawnej po 48 hr inkubacji. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe z 3 studni.
	<img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="Analiza fosforylacji białek, schematy z wykresami słupkowymi, pokazujące wpływ procesu EMT na szlaki sygnalizacyjne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
 Rycina 7. Analiza ekspresji metodą macierzy przeciwciał po indukcji EMT. Lizaty z komórek A549 (A i C) oraz MCF7 (B i D) hodowanych z dodatkiem lub bez dodatku suplementu medium indukującego EMT zostały wykorzystane do analizy macierzowej z użyciem zestawu Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit. Plamki zaznaczone w A i B zostały następnie ilościowo określone za pomocą densytometrii. Porównania lizatów nieindukowanych i indukowanych do EMT przedstawiono na odpowiadających im wykresach słupkowych poniżej (C i D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.

Opisana jest prosta metoda indukcji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT) w różnych typach komórek. Uwzględniono metody analizy komórek w stanach EMT za pomocą immunocytochemii.

Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie prostej i powtarzalnej metody indukcji przejścia epitelialno-mezenchymalnego (EMT) in vitro. Osiąga się to poprzez początkowe wysianie wybranego typu komórek nabłonkowych w obecności suplementu do pożywki indukującej EMT. Drugim krokiem procedury jest wymiana pożywki na świeżą pożywkę zawierającą suplement do pożywki indukującej EMT trzy dni po początkowym wysianiu.Ostatnim krokiem jest zebranie komórek pięć dni po początkowym wysiewie w celu przeprowadzenia dalszej charakterystyki, takiej jak barwienie immunocytochemiczne. Ostatecznie wyniki mogą wykazać nabycie przez komórki cech mezenchymalnych za pomocą mikroskopii świetlnej, immunocytochemii, analizy western blot lub innej wybranej procedury analitycznej. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stymulacja TGF beta lub modyfikacja genetyczna, są szybkość i łatwość wykonania (w przeciwieństwie do modyfikacji genetycznej) oraz możliwość indukcji EMT w różnych typach komórek, z których niektóre mogą nie reagować wyłącznie na stymulację TGF beta.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię i diagnostykę przerzutów nowotworowych. Technika ta umożliwia badaczom opracowanie wspólnych sygnatur ekspresji komórek przerzutowych, które mogłyby zostać wykorzystane w diagnostyce. Dostarcza ona również komórek do wykorzystania w badaniach przesiewowych leków.W pierwszej kolejności należy ogrzać pożywkę hodowlaną dla wybranych komórek do 37°C w łaźni wodnej. Następnie zebrać komórki, używając roztworu dysocjującego, np. Triple E Express. Potem zawiesić komórki w uprzednio ogrzanej pożywce hodowlanej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórkową z prędkością 400 ×g przez pięć minut.Ostrożnie usuń supernatant, wylewając go do pojemnika na odpady, a następnie resuspender pellet komórkowy w podgrzanym wcześniej medium hodowlanym. Następnie przeprowadź liczenie żywych komórek, rozcieńczając próbkę zawiesiny komórkowej w 0,4% roztworze błękitu trypanu. Nanieś 10 µL rozcieńczonej próbki na hemocytometr i policz żywe komórki.Żywe komórki. Nie zmieniają koloru na niebieski po obliczeniu gęstości komórek na płytce roztworu. Od 9 do 10 000 komórek na centymetr kwadratowy w podgrzanej pożywce hodowlanej zawierającej jednokrotny suplement medium indukującego XEMT; zastosowano płytki lub kolby do hodowli komórkowej z odpowiednią obróbką powierzchniową.Komórki wysiane inkubuje się w temperaturze 37°C przy 5% dwutlenku węgla, monitorując codziennie ich morfologię za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego. Po trzech dniach medium należy wymienić na świeże, uprzednio ogrzane medium hodowlane zawierające jednokrotny suplement medium indukującego XEMT. Pięć dni po wysianiu komórki są gotowe do analizy.Wizualizuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem świetlnym; komórki można teraz utrwalić lub zebrać do dalszych badań. Przygotuj sterylne szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm do płytki 24-dołkowej, umieszczając nakrywki w szalce Petri zawierającej 95% etanol. Ostrożnie wyjmij szkiełka nakrywkowe z etanolu za pomocą pęsety zakrzywionej.Każde szkiełko nakrywkowe wysterylizuj w płomieniu i przenieś do jednego dołka płytki 24-dołkowej; manipulowanie szkiełkami nakrywkowymi wymaga ostrożności i wprawy. Następnie dodaj 0,5 ml podgrzanej pożywki hodowlanej zawierającej jednokrotne stężenie pożywki indukującej XEMT. Uzupełnij suplementy do komórek i wysiej 16 000 komórek na dołek.Następnie hoduj i karm komórki zgodnie z wcześniejszym opisem. Pięć dni po wysianiu komórek usuń pożywkę i utrwal je za pomocą 300 µL 4% paraformaldehydu w 1x PBS na studzienkę; pozostaw do utrwalenia na 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń utrwalacz i dwukrotnie przemyj komórki 500 µL 1x PBS na studzienkę.Następnie inkubuj utrwalone komórki w 400 µL buforu blokującego na każdą studzienkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po przeprowadzeniu blokowania przygotuj przeciwciało pierwszorzędowe w zalecanym przez producenta stężeniu w 400 µL buforu blokującego na każdą studzienkę. Następnie usuń roztwór blokujący ze studzienek i dodaj mieszaninę przeciwciał do komórek.Inkubować komórki przez trzy godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Jeśli przeciwciało pierwszorzędowe jest bezpośrednio sprzężone z fluorochromem, inkubację należy przeprowadzić w ciemności. Następnie usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć studzienki trzykrotnie, używając 500 µL na studzienkę 1x PBS zawierającego 0,1% BSA; każde przemywanie powinno trwać pięć minut, a w razie potrzeby komórki należy osłonić przed światłem.W razie potrzeby inkubuj komórki z przeciwciałem wtórnym w stężeniu zalecanym przez producenta. Rozcieńcz przeciwciało w 400 µL na dołek buforu XPBS zawierającego 1% BSA. Pozostaw do inkubacji przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem.Przemyj komórki trzykrotnie w ten sam sposób, w jaki usunięto przeciwciało pierwszorzędowe po etapach płukania. W razie potrzeby zastosuj barwienie kontrastowe DPI dla komórek. Na koniec opłucz komórki wodą dejonizowaną i zamocuj szkiełka nakrywki stroną skierowaną w dół na preparatach, używając medium montażowego.Ponownie, należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z szkiełkami nakrywkowymi. Warunki hodowli indukujące EMT stanowią niezawodną metodę indukcji EMT w różnych typach komórek. Zostało to przetestowane na czterech różnych ludzkich liniach komórkowych.Komórki traktowane suplementem do pożywki indukującej EMT zmieniły klasyczną morfologię nabłonkową na mezenchymalną morfologię wrzecionowatą. Podwójne barwienie na ekspresję e-kadheryny i fibronektyny wykazało obniżenie poziomu markera nabłonkowego e-kadheryny (kolor czerwony) oraz wzrost poziomu markera mezenchymalnego fibronektyny (kolor zielony). Nieindukowane próbki CF 10 A zawierały gęsto upakowane skupiska otoczone przez komórki o luźniejszym upakowaniu. Skupiska te były dodatnie pod kątem e-kadheryny, co zaznaczono kolorem czerwonym.Klastry zniknęły po zastosowaniu suplementu do pożywki indukującej EMT. Zbiegło się to ze wzrostem ekspresji fibronektyny zaznaczonej kolorem zielonym. T 98.Stwierdzono, że poziom podstawowy terriny w G był niezwykle niski przed indukcją EMT, co uniemożliwiło jego analizę. Jednakże, przy użyciu tego markera wykazano, że poziomy fibronektyny znacząco wzrosły po indukcji EMT w tych komórkach. Poziomy ekspresji E-kadheryny i fibronektyny potwierdzono następnie za pomocą western blottingu lizatów komórkowych.Choć analiza western blot nie wykazuje istotnego spadku całkowitego poziomu białka EAD herrin w komórkach HT 29, w badaniu immunochemicznym zaobserwowano redukcję jego ekspresji powierzchniowej. Aby dalej ocenić status EMT, przeanalizowano markery mezenchymalne charakterystyczne dla EMT: menton (kolor zielony) oraz snail (kolor czerwony) przed i po indukcji EMT, co było zgodne z poprzednimi wynikami. Poziom Eki herein (kolor szary) był obniżony we wszystkich badanych liniach komórkowych, co wskazuje na indukcję EMT. Dodatkowo odnotowano nadekspresję snail (kolor czerwony) oraz menton (kolor zielony) w komórkach 5 49 T 98 G i MCF 10 A. W przypadku komórek CCF seven (ludzki rak piersi) oraz komórek PanIN (ludzki rak trzustki) zgłoszono, że nie wchodzą one w proces EMT wyłącznie pod wpływem sygnałowania TGF beta.Doniesienia te potwierdzono przy użyciu samego rekombinowanego TGF beta one. W stężeniu zawartym w dodatku do medium indukującego EMT komórki zachowały swoją morfologię nabłonkową, a poziomy powierzchniowej E-kadheryny były zbliżone do komórek kontrolnych. W przeciwieństwie do nich, komórki stymulowane dodatkiem do medium indukującego EMT wykazały drastyczny spadek poziomu powierzchniowej E-kadheryny.Komórki te uzyskały również bardziej mezenchymalną morfologię. Inną cechą charakterystyczną komórek mezenchymalnych jest ich zdolność do migracji i inwazji. Zostało to przeanalizowane przy użyciu testu inwazji komórkowej BME w płytce 96-dołkowej.Zgodnie z instrukcjami producenta, odnotowano znaczny wzrost migracji komórek zarówno w przypadku 5 49, jak i komórek pan one. Po indukcji EMT przeprowadzono ten sam test z użyciem filtra pokrytego ekstraktem z błony podstawnej w celu zbadania inwazji. Komórki poddane indukcji EMT wykazały istotny wzrost zdolności do inwazji w porównaniu z komórkami nieleczonymi.Silna indukcja EMT jest przydatna do analizy zmian w ekspresji genów oraz sygnalizacji zachodzącej w tych komórkach. Do analizy poziomów fosforylacji członków rodziny kinaz MAP wykorzystano komercyjny macierz przeciwciał z zastosowaniem lizatów z komórek MCF 7 oraz 5 49. Oba typy komórek wykazały zwiększoną fosforylację ERK1 i ERK2 w komórkach z indukowanym EMT w porównaniu z grupami kontrolnymi.Komórki A 5 49 wykazały również wzrost fosforylacji GSK trzy beta. Komórki Mc siedem wykazały zwiększoną fosforylację P 70 S sześć K, poza zwiększoną fosforylacją kreb or one oraz DIRK dwa. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wyniki mogą się różnić w zależności od rodzaju komórek; nie wszystkie komórki reagują w ten sam sposób.Wykorzystujemy te same szlaki sygnałowe w procesie indukcji EMT, co prowadzi do różnic w ekspresji markerów pomiędzy typami komórek. Ponadto wiele markerów EMT nie wykazuje ścisłych stanów włączony/wyłączony i może występować w poziomach podstawowych w komórkach nabłonkowych. Takie markery mogą wykazywać zmianę lokalizacji po przejściu w fenotyp mezenchymalny w następstwie tej procedury.Inne metody, takie jak przesiewanie leków, mogą zostać wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące tego, jakie związki są w stanie modulować przejście epitelialno-mezenchymalne. Związki te mogłyby być bardzo przydatne w leczeniu nowotworów i włóknienia.

induction-and-analysis-of-epithelial-to-mesenchymal-transition

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego w mezenchymalne

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Prezentujemy tutaj metodę hodowli komórkowej do indukowania przemian mezenchymalno-nabłonkowych (MET) w komórkach mięsaka opartą na połączonej ektopowej ekspresji członków rodziny mikroRNA-200 i ziarnistej głowy 2 (GRHL2). Metoda ta jest odpowiednia do lepszego zrozumienia biologicznego wpływu plastyczności fenotypowej na agresywność raka i leczenie.

Indukcja przejść mezenchymalno-nabłonkowych w komórkach mięsaka

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.

Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów

Opisujemy systematyczny proces badania sygnalizacji TGF-β i EMT indukowanego przez TGF-β, badając ekspresję białek i genów zaangażowanych w ten szlak sygnałowy. Metody obejmują Western blotting, test reporterowy lucyferazy, qPCR i barwienie immunofluorescencyjne.

Badanie sygnalizacji TGF-β i indukowanego przez TGF-β przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego w raku piersi i prawidłowych komórkach

Opisujemy metody badania EndMT indukowanego przez TGF-β2 w komórkach śródbłonka, obserwując zmiany morfologii komórek i badając zmiany markerów związanych z ekspresją EndMT za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Opisano edycję genu CRISPR/Cas9 i wykorzystano ją do wyczerpania genu kodującego ślimaka w celu zbadania jego roli w EndMT indukowanym przez TGF-β2.

Przejście śródbłonka do mezenchymalnego za pośrednictwem TGF-β (EndMT) i ocena funkcjonalna efektorów EndMT przy użyciu edycji genów CRISPR/Cas9

Światło / ciemność testu transformacji jest jednym z najczęściej stosowanych testów do pomiaru lęku zachowań w myszy. Poniżej prezentujemy film, który pokazuje szczegółowe procedury, w jaki sposób przeprowadzenia testu.

Światło / ciemność test przejścia dla Myszy

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

Poznaj metodę indukcji przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) in vitro z wykorzystaniem różnych linii komórkowych. Technika umożliwia analizę morfologii i ekspresji markerów przez immunocytochemię.

Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego

Przeglądaj więcej filmów