Protokoły oceny interakcji o częstotliwości radiowej z nanocząstkami złota i systemami biologicznymi w nieinwazyjnej terapii nowotworów w hipertermii

Ogólnym celem tej procedury jest ocena właściwości grzewczych nanocząstek złota w polu elektrycznym o częstotliwości radiowej 13,56 megaherca, in vitro i in vivo. W tym celu należy najpierw ocenić szybkość ogrzewania skoncentrowanych nanocząstek złota i ich bufora w kwarcowym weterynarzu. Drugim etapem procedury jest przeprowadzenie badań toksyczności in vitro nanocząstek złota z hodowanymi komórkami nowotworowymi.

Trzecim krokiem jest przeprowadzenie badań in vivo nanocząstek złota w ektopowym modelu raka myszy. Ostatecznie wyniki mogą pokazać, czy badana nanocząstka może być skutecznym środkiem do stosowania w hipertermii za pośrednictwem RF poprzez analizę nanocząstek w zawiesinie, in vitro i in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nieinwazyjnej hipotermii o częstotliwości radiowej za pośrednictwem nanocząstek, takie jak to, czy ogrzewanie jest spowodowane samymi cząstkami i czy można je wykorzystać do celów terapeutycznych?

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ nie ma wielu dobrze ugruntowanych protokołów wykonywania tego typu eksperymentów. Procedurę zademonstrują Cisneros, asystent naukowy, Stuart Core, naukowiec ze stopniem doktora i Leila Green, inny naukowiec ze stopniem doktora. Na przykład zacznij od dostępnej na rynku butelki o pojemności 500 mililitrów z nanocząstkami złota o średnicy pięciu nanometrów.

Weź około 125 mililitrów podstawowego roztworu nanocząstek złota i podziel go między sześć 50 kilodaltonowych probówek filtracyjnych wirówek, odwiruj nanocząstki z prędkością 3000 obr./min przez dwie minuty i pięć sekund. Usunąć supernatant będący przefiltrowanym buforem i ponownie napełnić każdy filtr. Z większą ilością roztworu podstawowego.

Kontynuować centrowanie i usuwanie buforu oraz ponowne ładowanie probówek, aż cały roztwór nanocząstek zostanie przefiltrowany. Po ostatnim dodaniu zastąp przefiltrowany bufor podobną objętością wody dejonizowanej i powtórz proces jeszcze około osiem razy po załadowaniu przefiltrowanej próbki buforu do maszyny RF. Korzystając z oprogramowania kamery na podczerwień, utwórz pola nad QVE, aby uchwycić profil grzewczy Po ośmiu praniach dane dotyczące ogrzewania filtratu z nanocząstek złota o długości pięciu nanometrów zbliżają się do danych wody dejonizowanej.

Analiza UV/vis może być również wykorzystywana do monitorowania absorpcji zanieczyszczeń. Szczyty. Pokazane tutaj jest czyste spektrum. Po całkowitym usunięciu zanieczyszczeń buforowych zawieszamy nanocząstki w 0,5 mililitra dejonizowanej wody w rurkach filtrujących, które usuwają nanocząstki z filtra.

Następnie połącz wszystkie sześć zawiesin w jedną 15-mililitrową rurkę. Teraz przeanalizuj próbkę za pomocą UV VIS i potencjału zeta, aby uzyskać dane dotyczące stabilności. Użyj I-C-P-O-E-S i/lub ICP mass spec, aby określić stężenie nanocząstek.

Analiza SEM i/lub TEM może być również wykorzystana do uzyskania danych morfologicznych za pomocą systemu RF Kansas lub pochodnych obciążenia, strzykawki kwarcowej o pojemności 1,3 mililitra i ustawienia pola elektrycznego RF na około 90 kilowoltów na metr w powietrzu, w którym znajdowałby się Q vete. W przypadku standardowej próbki soli fizjologicznej z 0,9% chlorkiem sodu pole elektryczne zostałoby zredukowane do około 1,1 kilowolta na metr. Są to przybliżone warunki używane do umożliwienia porównań między różnymi systemami RF.

Teraz załaduj czysty kwarc vete 1,3 mililitra oczyszczonej zawiesiny nanocząstek złota o stężeniu 1000 miligramów na litr. Wystaw próbkę na działanie pola RF przez okres 120 sekund lub do momentu, gdy próbka osiągnie 70 stopni Celsjusza. Nadmierna ekspozycja może prowadzić do wyładowań łukowych lub szybkiego wrzenia.

Przechwytuj dane termowizyjne, a także obszary kontrolne za pomocą kamery na podczerwień i powiązanego oprogramowania. Powtórzyć tę procedurę trzy razy na tej samej próbce. Teraz przefiltruj próbkę przez kolejny filtr wirówkowy o mocy 50 kilodaltonów, aby wyekstrahować nanocząstki złota z bufora wodnego.

Następnie ponownie wystaw sam bufor na działanie pola RF. Ponownie, trzykrotna różnica w godzinach między koloidem nanocząstki złota a filtratem określa HR ze względu na same nanocząstki złota. Na koniec zawieszamy pozostałe nanocząstki złota z filtra w 1,3 mililitra wody do dalszych eksperymentów.

Te badania in vitro można zastosować do dowolnego typu komórek rakowych, które tworzą monowarstwy 2D. W tym przykładzie ludzkie komórki B pochodzące z raka wątrobowokomórkowego Hep 3 zostaną użyte na około 50 000 komórek. W trzech dołkach 12-dołkowej płytki z jednym mililitrem wzrostu.

Media kontynuują ładowanie komórek, dopóki trzy płytki nie zostaną wypełnione do badań nanocząstek, a trzy płytki zostaną wypełnione jako kontrole. Inkubować płytki w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia wprowadź 0,1 mililitra 1000 miligramów na litr roztworu nanocząstek złota do każdej studzienki z trzech płytek nanocząstek do płytek kontrolnych.

Po 0,1 mililitra wody do każdego dobrze inkubuj wszystkie płytki przez kolejne 24 godziny. Po kolejnych 24 godzinach odessać pożywkę komórkową i umyć komórki PBS, aby usunąć wszelkie nanocząstki złota związane z powierzchnią. Następnie wymień nośnik ogniwa.

Ogniwa są teraz gotowe do ekspozycji na fale radiowe. Umieść każdy pakiet 12 dołków w polu RF i poczekaj, aż komórki ostygną do 31 stopni Celsjusza. Po lekkim schłodzeniu wystaw ogniwa na 3,5 minuty fal radiowych.

Ostateczna temperatura podłoża komórkowego wyniesie około 37 stopni Celsjusza. Przenieś komórki do inkubatora i odczekaj 24 godziny przed ich analizą. Gdy komórki są gotowe, odessać pożywkę i zastąpić ją dwoma mililitrami odczynnika 25% MTT w pożywce.

Następnie pozwól komórkom inkubować przez kolejne cztery godziny. Następnie zastąp pożywkę MTT dwoma mililitrami DMSO. Umieść płytki komórkowe na kołysce stołowej na 10 minut, aby DMSO mogło rozpuścić odczynniki MTT.

Na koniec odpipetuj 100 mikrolitrów próbek z każdej studzienki na płytkę 96-dołkową i odczytaj optycznie płytkę przy 570 nanometrach. Te badania in vivo można zastosować do każdego rodzaju nowotworu, który tworzy guzy lite w ortotopowym lub ektopowym modelu lustrzanym. W tym przykładzie komórki raka wątroby Hep 3 B są używane z nagimi myszami BPC.

Zacznij od około 100 000 komórek, trypsyna zamrozi komórki i wyprodukuj roztwór 2 milionów komórek na 25 mikrolitrów. Dodać równą ilość lodowatego żelu matri do zawiesiny komórek i dokładnie wymieszać przez wielokrotne zasysanie w pipecie. Teraz wstrzyknąć zmieszaną zawiesinę w żądane miejsce na grzbiecie każdego zwierzęcia.

Po kilku tygodniach guzy będą w tym czasie okrągłe od pół do jednego centymetra, rozpocznij leczenie RF i znieczul myszy roztworem ketaminy i ksylazyny przez wstrzyknięcie IP i utrzymuj je w cieple. Następnie wstrzyknij nanocząsteczki złota bezpośrednio do połowy guzów za pomocą strzykawki o pojemności jednej cm3 z igłą o rozmiarze 27 lub 30. Użyj wacika chirurgicznego, aby wchłonąć krew i przetrzyj miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem.

Jako kontrolę, wstrzyknąć tylko PBS do drugiej połowy guzów. Teraz potraktuj połowę myszy w każdej grupie. Zamontuj mysz na głowicy odbiorczej generatora RF i osłoń nieleczone obszary taśmą miedzianą, w tym oczy, uszy i palce u stóp.

Najważniejszą częścią tego eksperymentu jest odpowiednie uziemienie myszy. Bez odpowiedniego uziemienia nagromadzenie ładunku na zwierzętach może spowodować obrażenia termiczne lub elektrodermalne. Można temu łatwo zapobiec.

Umieść guz z głowicą transmisyjną o co najmniej jeden centymetr więcej niż szerokość żądanego miejsca leczenia. Teraz ustaw kamerę termowizyjną na podczerwień tak, aby guz i obszar leczenia były widoczne. Włącz RF na pięć minut i zapisz wynikową krzywą temperatury.

Jeśli temperatura powierzchni skóry wzrośnie powyżej 42 stopni Celsjusza, należy przerwać zabieg natychmiast po ekspozycji na fale radiowe. Pozwól myszom dojść do siebie w ciepłej komorze, aż odzyskają przytomność. Zabiegi powtarzaj dwa razy w tygodniu przez trzy tygodnie.

Następnie poddaj myszy eutanazji 48 godzin po ostatniej ekspozycji na fale radiowe i przetwórz guzy. Ogrzewanie RF oczyszczonych nanocząstek złota określono na podstawie różnicy godzin między nimi a roztworem buforowym wody dejonizowanej w tle. Wyniki były zgodne z oczekiwaniami zarówno dla nanocząstek o nacząsteczkach 5 nanometrów, jak i 10 nanometrów.

Oczyszczone nanocząstki złota zintegrowane z ludzkimi komórkami B raka wątrobowokomórkowego pochodzącymi z Hep 3. Kiedy takie komórki są wystawione na działanie pola RF, zwykle stają się mniej żywotne niż te wystawione na działanie RF bez zinternalizowanych nanocząstek. Rysunek trzeci przedstawia wyidealizowany scenariusz, w którym użyte nanocząstki złota same w sobie mają ograniczoną toksyczność, ale doskonałe właściwości cytotoksyczne inicjowane przez RF Zapoznaj się z literaturą w celu kompleksowego przeglądu dotychczasowych wyników in vitro przy użyciu różnych rodzajów nanomateriałów.

Komórki raka wątroby Hep 3 B. Wątroby wykorzystano do wytworzenia guzów na grzbietach nagich myszy babsi. Guzom tym wstrzyknięto zawieszone nanocząstki złota PBS, a następnie poddano ich ekspozycji na fale radiowe. Leczenie po analizie Thomasa wykazało, że leczenie kontrolowało wzrost guza i zmniejszało masę guza.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać nanocząstki do stosowania w hipotermii za pośrednictwem RF, określając ich właściwości reagujące na RF i rozwiązanie in vitro i in vivo. Nie zapominaj, że praca z polami elektrycznymi RF o dużej mocy może być niezwykle niebezpieczna. Nigdy nie dotykaj ani nie sięgaj w obrębie aktywnego pola elektrycznego.

Wykonaj pomiary pola elektrycznego i, jeśli to konieczne, użyj odpowiedniego ekranowania, takiego jak klatka Faradaya. Ogólnie rzecz biorąc, zawsze minimalizuj narażenie na utrzymujące się pola elektryczne o wysokim natężeniu.