Name: Protokoły oceny interakcji o częstotliwości radiowej z nanocząstkami złota i systemami biologicznymi w nieinwazyjnej terapii nowotworów w hipertermii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-28T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj ocenę właściwości grzewczych nanocząstek złota w polu elektromagnetycznym RF 13,56 MHz in vitro i in vivo. Ta metoda umożliwia badanie potencjału terapeutycznego w hipertermii nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez NIH (U54CA143837), NIH M.D. Anderson Cancer Center Support Grants (CA016672), V Foundation (SAC) oraz nieograniczony grant badawczy od Kanzius Research Foundation (SAC, Erie, PA). Dziękujemy Kristine Ash z Oddziału Chirurgii Onkologicznej M.D. Anderson Cancer Center za pomoc administracyjną.

Pełny przegląd eksperymentu jest przedstawiony na rysunku 1.
Dalsze szczegóły są przedstawione w krokach 1-3 poniżej.
1. Ocena ogrzewania RF koloidów NP: AuNPs jako przykład
<ol>
	<li>Ogólnie rzecz biorąc, dla każdej badanej próbki NP należy najpierw kilkakrotnie przepłukać próbkę przez filtr wirówkowy wodą dejonizowaną (DI) w celu usunięcia jonów tła i zanieczyszczeń. Wszystkie jony i zanieczyszczenia zostaną usunięte z zawiesiny AuNP, gdy wypłukiwana ciecz ma podobną szybkość nagrzewania RF (HR) jak woda DI. Ten proces oczyszczania pozwala również na uzyskanie wyższych stężeń nanocząsteczek. Warto zauważyć, że chociaż w tym przykładzie użyto AuNP, podstawowe zasady można zastosować do innych materiałów NP.</li>
	<li>Na przykład należy oczyścić butelkę o pojemności 500 ml dostępnych w handlu AuNP o średnicy 5 nm, a następnie poddać je działaniu pola RF o natężeniu pola elektrycznego 13,56 MHz o natężeniu pola elektrycznego 90 kV/m.
	<ol>
		<li>Pobrać ~125 ml z podstawowego roztworu AuNP i podzielić na sześć probówek filtracyjnych wirówki o masie 50 kDa. Wirować przy 3 000 obr./min. przez 2 min 5 sek. Usuń przefiltrowany bufor i napełnij filtry większą ilością roztworu podstawowego. Powtarzać, aż wszystkie 500 ml zostanie przefiltrowane.</li>
		<li>Zastąp przefiltrowany bufor podobną objętością wody DI i powtórz około 8 razy (lub do momentu, gdy przefiltrowany bufor RF HRs będzie równoważny wodzie DI). Uwaga, analiza UV-Vis może być również wykorzystywana do monitorowania pików absorpcji zanieczyszczeń. Po całkowitym usunięciu zanieczyszczeń buforowych należy odpipetować około 0,5 ml wody DI do każdego filtra i ponownie zawiesić AuNPs przez wielokrotne pipetowanie. Powinno to całkowicie usunąć AuNPs z filtra i umożliwić pełne zawieszenie. Połączyć wszystkie sześć zawiesin w jednej tubce Eppendorf o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Po oczyszczeniu i zagęszczeniu AuNP należy przeanalizować próbkę przy użyciu ICP-OES i/lub ICP-MS, UV-vis i potencjału Zeta, aby uzyskać dane dotyczące odpowiednio stężenia i stabilności NP. Analiza SEM i/lub TEM może być również wykorzystana do uzyskania danych morfologicznych. Szczegółowe przygotowanie próbek do tych technik można znaleźć w literaturze4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z systemu Kanzius RF opisanego w poprzednich badaniach8 lub pochodnych tego systemu, umieść cylindryczną kuwetę kwarcową o pojemności 1,3 ml tak, aby pole elektryczne RF w powietrzu (bez obecnej próbki) wynosiło ~90 kV/m wewnątrz kuwety. Dla standardowej próbki soli fizjologicznej (0,9 % NaCl) pole elektryczne zostałoby zredukowane do ~1,1 kV/m. Są to przybliżone warunki stosowane w celu umożliwienia porównań między różnymi systemami.
	<ol>
		<li>Odpipetować 1,3 ml próbki oczyszczonego koloidu AuNP o stężeniu 1 000 mg/l do kuwety kwarcowej i wprowadzić ją do pola RF. Można to zrobić za pomocą specjalnie zbudowanego teflonowego uchwytu na próbki. Wystaw próbkę na działanie pola RF przez okres 120 sekund lub do momentu, gdy próbka osiągnie temperaturę 70 °C, aby zapobiec wyładowaniom elektrycznym lub szybkiemu wrzeniu. Przechwytuj dane termowizyjne (a także obszary kontrolne) za pomocą kamery na podczerwień i powiązanego oprogramowania. Powtórz tę procedurę trzy razy.</li>
		<li>Przefiltrować próbkę przez kolejny filtr wirówkowy o sile 50 kDa w celu ekstrakcji AuNPs z buforu wodnego DI. Ponownie wystaw bufor na działanie pola RF, ponownie trzy razy. Różnica w HR między koloidem AuNP a buforem wodnym DI w tle określa HR ze względu na same AuNPs. Spodziewaj się uzyskania HR na poziomie ~0,3 °C/s i 0,05 °C/s, aby uzyskać HR zależne od AuNP na poziomie ~ 0,25 °C/s. Zawiesić pozostałe AuNP z filtra w 1,3 ml wody do eksperymentów in vitro/vivo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hipertermia indukowana RF wspomagana nanocząstkami: badania in vitro
<ol>
	<li>Te badania in vitro można zastosować do dowolnego typu komórek rakowych, które tworzą monowarstwy 2D. W tym eksperymencie wykorzystaj ludzkie komórki Hep3B pochodzące z raka wątrobowokomórkowego.
	<ol>
		<li>Płytka ~ 50 000 komórek w trzech przednich dołkach 12-dołkowej płytki z 1 ml pożywki wzrostowej. Powtórz to 6 razy (użyć trzech płytek do badań NP i trzech płytek jako kontroli). Inkubować w temperaturze 37,5 °C przez 24 godziny przed wprowadzeniem nanocząsteczek. Najpierw wysterylizować nanocząsteczki za pomocą komory bezpieczeństwa biologicznego naświetlonej promieniami UV przez 5 minut.</li>
		<li>Do każdej studzienki wprowadzić 0,1 ml roztworu AuNP o stężeniu 1000 mg/l i pozostawić na kolejne 24 godziny. Dodać 0,1 ml wody do każdej studzienki z trzech płytek komory kontrolnej i również pozostawić na 24 godziny.</li>
		<li>Po upływie 24 godzin odessać pożywkę komórkową i przemyć PBS, aby usunąć wszelkie powierzchniowo związane AuNPs. Wymień nośnik komórkowy. Ogniwa są teraz gotowe do ekspozycji na fale radiowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść każdy pakiet 12-dołkowych komórek w polu RF. Poczekaj, aż ogniwa ostygną do 31 °C. Włącz generator RF i wystaw na 3,5 minuty. Ostateczna temperatura nośnika komórkowego wyniesie ~37 °C. Wyłącz pole RF. Usuń komórki i umieść je w inkubatorze na 24 godziny przed analizą.
	<ol>
		<li>Usuń komórki z inkubatora i odessaj pożywkę komórkową. Dodać 1,6 ml pożywki komórkowej do każdej studzienki, a także 0,4 ml odczynnika MTT. Inkubować komórki przez 4 godziny. Odessać pożywkę i zastąpić 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Umieść płytki komórkowe na kołysce stołowej i pozostaw na 10 minut, aby DMSO mogło rozpuścić odczynniki MTT. Na koniec należy odpipetować 100 μl każdego dołka do płytki 96-dołkowej i optycznie odczytać dołek przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika płytek, takiego jak czytnik płytek SPECTROstar Nano.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hipertermia indukowana RF wspomagana nanocząstkami: badania in vivo
<ol>
	<li>Te badania in vivo można zastosować do każdego rodzaju nowotworu, który tworzy guzy lite w ortotopowym lub ektopowym modelu mysim. W tym eksperymencie wykorzystano komórki raka wątroby Hep3B w ektopowym modelu myszy BALB-C Nade.</li>
	<li>Uwaga: wszystkie eksperymenty in vivo są przeprowadzane zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Ponadto, demonstrowany protokół został przeprowadzony pod kierunkiem i zgodą University of Texas M.D. Anderson Cancer Centers Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
	<ol>
		<li>Hodować odpowiednią liczbę komórek (~100 k) w kolbie do hodowli tkankowej z odpowiednią pożywką wzrostową. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5 % CO2 przez cały czas hodowli komórkowej.</li>
		<li>Potraktować komórki trypsyną (w celu odłączenia od kolby) i wytworzyć roztwór 2 milionów komórek na każde 25 μl. Dodać równą ilość Matrigelu (na lodzie) i dokładnie wymieszać, aby przygotować ostateczny roztwór do wstrzykiwań. Wstrzyknij ten roztwór w żądane miejsce na grzbiecie myszy i odczekaj odpowiednią ilość czasu, aż guzy urosną do pożądanych rozmiarów (2-4 tygodnie w przypadku większości komórek). Przed ekspozycją na fale radiowe myszy BALB-C Nude powinny mieć lite guzy ektopowe o średnicy 0,5-1 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Przygotuj myszy do użycia (w tym przypadku myszy BALB-C Nado), znieczulając je roztworem ketaminy i ksylazyny przez wstrzyknięcie IP. Podczas gdy myszy zasypiają, trzymaj je w komorze o kontrolowanej temperaturze 37 °C. W sumie potrzebnych będzie 20 myszy, wszystkie z guzami podobnej wielkości. Dziesięć myszy zostanie użytych w połączeniu z AuNP i bez nich (te ostatnie to tylko zastrzyki PBS), podczas gdy pozostałe 10 myszy zostanie podzielonych na kontrole narażone na RF i nienarażone na RF: obie grupy bez zastrzyków AuNP.</li>
		<li>Po odpowiednim znieczuleniu wstrzyknąć AuNPs bezpośrednio do guza za pomocą strzykawki o pojemności 1 cm3 z igłą 27 G. Roztwór AuNP powinien mieć stężenie Au 200 mg/l w 0,1 ml PBS. Po wstrzyknięciu należy użyć wacika chirurgicznego, aby wchłonąć krew i przetrzeć miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
		<li>Następnie zamontuj mysz, która ma być leczona, na głowicy odbiorczej generatora RF. Mysz musi być ustawiona tak, aby guz znajdował się najbliżej głowy transmisyjnej. Osłoń obszary, które nie mają być leczone, a także wrażliwe obszary, takie jak oczy, uszy i palce u stóp, taśmą miedzianą. Upewnij się, że taśma miedziana prawidłowo styka się z płaszczyzną uziemienia, aby nie doszło do gromadzenia się ładunku. Ponadto obszar ekspozycji musi mieć odstęp co najmniej 1 cm większy niż rozmiar pożądanego miejsca zabiegowego.</li>
		<li>Ustaw kamerę termowizyjną na podczerwień tak, aby guz i obszar leczenia były widoczne. Włącz RF na 5 minut. Zapisz wynikową krzywą temperatury. Jeśli terapia osiągnie temperaturę wyższą niż 42 °C, należy natychmiast przerwać leczenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Po ekspozycji na fale radiowe odzyskaj myszy ze znieczulenia w ciepłej komorze, aż odzyskają przytomność.</li>
		<li>Powtórz eksperyment z tymi samymi myszami 48 godzin później (kroki 3.3.1 - 3.4.1).</li>
		<li>Po eksperymencie poddać myszy eutanazji zgodnie z instytucjonalnymi protokołami i procedurami. Zapisz wagę guza. Do analizy histologicznej unieruchomić guzy za pomocą formaliny i zanurzyć je w parafinie. Skrawki guza są zwykle barwione hematoksyliną i eozyną oraz dla celów istotnych dla oceny skuteczności terapeutycznej, np. Ki-67, rozszczepiona kaspaza-3 itp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gannon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotube-enhanced+thermal+destruction+of+cancer+cells+in+a+noninvasive+radiofrequency+field%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field.</a> Cancer. 110, 2654(2007).</li>
<li>Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+radiofrequency+field-induced+hyperthermic+cytotoxicity+in+human+cancer+cells+using+cetuximab-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Ther.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive radiofrequency field-induced hyperthermic cytotoxicity in human cancer cells using cetuximab-targeted gold nanoparticles.</a> J. Exp. Ther. Oncol. 7, 313(2008).</li>
<li>Gannon, C. J., Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+gold+nanoparticles+enhance+non-invasive+radiofrequency+thermal+destruction+of+human+gastrointestinal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Intracellular gold nanoparticles enhance non-invasive radiofrequency thermal destruction of human gastrointestinal cancer cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 6, 2(2008).</li>
<li>Raoof, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+antibody-conjugated+gold+nanoparticles+in+the+endolysosomal+nanoenvironment%3A+implications+for+noninvasive+radiofrequency-based+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endolysosomal nanoenvironment: implications for noninvasive radiofrequency-based cancer therapy.</a> Nanomedicine. 8, 1096(2012).</li>
<li>Glazer, E. S., Massey, K. L., Zhu, C., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+carcinoma+cells+are+susceptible+to+noninvasive+radio+frequency+fields+after+treatment+with+targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Pancreatic carcinoma cells are susceptible to noninvasive radio frequency fields after treatment with targeted gold nanoparticles.</a> Surgery. 148, 319(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiofrequency+field-induced+thermal+cytotoxicity+in+cancer+cells+treated+with+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiofrequency field-induced thermal cytotoxicity in cancer cells treated with fluorescent nanoparticles.</a> Cancer. 116, 3285(2010).</li>
<li>Glazer, E. S., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+radiofrequency+ablation+of+malignancies+mediated+by+quantum+dots%2C+gold+nanoparticles+and+carbon+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Delivery%22%5BJournal%5D)">Non-invasive radiofrequency ablation of malignancies mediated by quantum dots, gold nanoparticles and carbon nanotubes.</a> Therapeutic Delivery. 2, 1325(2011).</li>
<li>Corr, S. J., Raoof, M., Mackeyev, Y., Phounsavath, S., Cheney, M. A., Cisneros, B. T., Shur, M., Gozin, M., McNally, P. J., Wilson, L. J., Curley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate-Capped+Gold+Nanoparticle+Electrophoretic+Heat+Production+in+Response+to+a+Time-Varying+Radiofrequency+Electric-Field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Citrate-Capped Gold Nanoparticle Electrophoretic Heat Production in Response to a Time-Varying Radiofrequency Electric-Field.</a> J. Phys. Chem. C. 116, 24380(2012).</li>
<li>Kruse, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Radio-Frequency+Coupling+Network+for+Heating+of+Citrate-Coated+Gold+Nanoparticles+for+Cancer+Therapy%3A+Design+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A Radio-Frequency Coupling Network for Heating of Citrate-Coated Gold Nanoparticles for Cancer Therapy: Design and Analysis.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, 10(2011).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negligible+absorption+of+radiofrequency+radiation+by+colloidal+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Negligible absorption of radiofrequency radiation by colloidal gold nanoparticles.</a> J. Colloid Interf. Sci. 358, 47(2011).</li>
<li>Liu, X., Chen, H. J., Chen, X., Parini, C., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+heating+of+gold+nanoparticle+dispersions+for+non-invasive+thermal+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Low frequency heating of gold nanoparticle dispersions for non-invasive thermal therapies.</a> Nanoscale. , (2012).</li>
<li>Sassaroli, E., Li, K. C. P., O'Neill, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radio+frequency+absorption+in+gold+nanoparticle+suspensions%3A+a+phenomenological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+D+App.+Phys%22%5BJournal%5D)">Radio frequency absorption in gold nanoparticle suspensions: a phenomenological study.</a> J. Phys. D App. Phys. 45, 075303(2012).</li>
<li>Worle-Knirsch, J. M., Pulskamp, K., Krug, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oops+they+did+it+again%21+Carbon+nanotubes+hoax+scientists+in+viability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays.</a> Nano Lett. 6, 1261(2006).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Protokoły te pozwalają eksperymentatorowi w pełni przeanalizować stopień, w jakim nanomateriały (w tym przypadku AuNPs) mogą zwiększać hipertermię wywołaną przez RF w leczeniu raka. Pierwszy protokół dotyczy w szczególności analizy produkcji ciepła z wysoko skoncentrowanych i oczyszczonych próbek AuNP. Chociaż inne grupy zgłaszały produkcję ciepła głównie z, w których zawieszone są AuNP, a nie z samych AuNP9-11, ich systemy RF wykorzystywały niższe stężenia AuNP o średnicach >10 nm, a także niższe moce robocze...

Absorpcja energii RF przez tkankę biologiczną (ze względu na ich naturalną przenikalność elektryczną) powoduje wzrost temperatury tkanek w funkcji czasu, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórki przez hipertermię. Przypuszcza się, że hipertermia nowotworowa może być zoptymalizowana poprzez zastosowanie ukierunkowanych nanomateriałów, które internalizują się w komórce rakowej i działają jak przetworniki termiczne RF, pozostawiając sąsiednie zdrowe, normalne komórki nienaruszone. Kilka doniesień wykazało już, że różne NP mogą działać jako skuteczne źródła ciepła RF, które pomagają w martwicy raka1-4.
Pod tym względem, nanocząsteczki złota (AuNPs)3-5, nanorurki węglowe1 i kropki kwantowe6, 7 wykazały ekscytujące cechy, gdy były używane zarówno w eksperymentach RF in vitro, jak i in vivo. Chociaż dokładna natura mechanizmu nagrzewania tych nanocząsteczek pod wpływem pola RF jest nadal przedmiotem dyskusji, seria fundamentalnych eksperymentów z wykorzystaniem AuNP położyła ogromne znaczenie zarówno na wielkość NP, jak i stany agregacji. Wykazano, że tylko AuNP o średnicach <10 nm nagrzewają się pod wpływem pola RF8. Ponadto ten mechanizm grzewczy jest znacznie osłabiony, gdy AuNP są agregowane. Ten warunek agregacji został również zweryfikowany w modelach in vitro, w których położono nacisk na optymalizację stabilności koloidalnej AuNP w wewnątrzkomórkowych przedziałach endolizomalnych w celu zapewnienia skutecznej terapii RF4. Jednak techniki i zasady eksperymentalne stosowane do zbierania i oceny tych danych mogą być problematyczne, zwłaszcza w przypadku walidacji profili cieplnych RF z koloidów NP.
Kilka raportów wykazało, że głównym źródłem produkcji ciepła RF może być ogrzewanie dżulem zawiesiny jonowej tła, w której zawieszone są nanocząsteczki, a nie sameNP-y 9-12. Chociaż nasz niedawny artykuł8 potwierdził wykorzystanie oddziaływań RF do generowania ciepła z AuNP o średnicach mniejszych niż 10 nm, naszym celem jest bardziej szczegółowe opisanie tych protokołów w tym artykule.
Pokazujemy również protokoły i techniki potrzebne do oceny skuteczności AuNPs jako hipertermicznych czynników termicznych zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo dla modeli raka wątroby. Chociaż skupiamy się przede wszystkim na prostych koloidach AuNP zwieńczonych cytrynianem, te same techniki można zastosować do innych hybryd AuNP, takich jak kompleksy sprzężone z przeciwciałami i chemioterapią. Miejmy nadzieję, że stosując się do tych zasad, eksperymentatorzy powinni być w stanie szybko ocenić potencjał dowolnego nanomateriału jako skutecznego czynnika hipertermicznego indukowanego przez fale radiowe.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>500 ml nanocząsteczek złota (5 nm)</td><td>Ted Pella, INC</td><td>15702-5</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4/-15 (50 kDa)</td><td>Milipory</td><td>UFC805024/UFC910096</td><td>(objętości 4 ml i 15 ml)</td></tr><tr><td>MEM X1 Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Cellgro</td><td>10-101-CV</td> <td>(w razie potrzeby dodaj dodatkowe składniki odżywcze)</td></tr><tr><td>Bydło płodowe Serum</td><td>Sigma</td><td>F4135-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Taśma miedziana</td><td>Ted Pella</td><td>16072</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Kanzius RF System (13.56 MHZ)</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera na podczerwień</td><td>FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)</td><td>Skontaktuj się z FLIR</td><td></td></tr><tr><td>1.3 ml Kuweta kwarcowa</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflonowy uchwyt na próbkę ze stolikiem obrotowym</td><td>ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPECTROstar Nano Czytnik mikropłytek</td><td>BGM Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr UV-Vis</td><td>Applied Nanofluorescence, Houston, TX)</td><td>NS1 NanoSpectralyzer</td><td></td></tr><tr><td>ICP-&#8211; S</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 4300 DV</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>Zen 3600 Zetasizer</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoły oceny interakcji o częstotliwości radiowej z nanocząstkami złota i systemami biologicznymi w nieinwazyjnej terapii nowotworów w hipertermii

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

Terapie przeciwnowotworowe, które są mniej toksyczne i inwazyjne niż ich obecne odpowiedniki, są wysoce pożądane. Wykorzystanie pól elektrycznych RF, które wnikają głęboko w organizm, powodując minimalną toksyczność, jest obecnie badane jako realny sposób nieinwazyjnej terapii raka. Przewiduje się, że interakcje energii RF z uwewnętrznionymi nanocząstkami (NP) mogą uwalniać ciepło, które może następnie spowodować przegrzanie (hipertermię) komórki, ostatecznie kończąc się martwicą komórki.
W przypadku systemów niebiologicznych przedstawiamy szczegółowe protokoły dotyczące ilościowego oznaczania ciepła uwalnianego przez wysoko skoncentrowane koloidy NP. W przypadku systemów biologicznych, w przypadku eksperymentów in vitro, opisujemy techniki i warunki, których należy przestrzegać, aby skutecznie wystawić komórki rakowe na działanie energii RF bez artefaktów ogrzewania mediów masowych znacznie zasłaniających dane. Na koniec podajemy szczegółową metodologię dla mysich modeli in vivo z ektopowymi guzami raka wątroby.

1. Ocena nagrzewania koloidów NP za pomocą RF: AuNPs jako przykład.
Po wykonaniu kroków opisanych w sekcjach 1.1 – 1.2.3 należy otrzymać silnie skoncentrowany, stabilny i oczyszczony roztwór AuNP o średnicach 5 nm i 10 nm. Z 500 ml zakupionego roztworu wyjściowego należy uzyskać co najmniej 4 ml roztworu o stężeniu 1 000 mg/L. Różnica w HR pomiędzy AuNP a tłem w postaci buforu z wody DI przy tym stężeniu powinna wynosić odpowiednio ~0,25 °C/sec dla AuNP 5 nm oraz 0,1 °C/sec dla AuNP 10 nm, co prz...

Opisujemy protokoły używane do badania oddziaływań pól elektrycznych o częstotliwości radiowej (RF) 13,56 MHz z koloidami nanocząstek złota zarówno w systemach niebiologicznych, jak i biologicznych (in vitro/vivo). Interakcje te są badane pod kątem zastosowań w terapii nowotworów.

Protokoły oceny interakcji o częstotliwości radiowej z nanocząstkami złota i systemami biologicznymi w nieinwazyjnej terapii nowotworów w hipertermii

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena właściwości grzewczych nanocząsteczek złota w polu elektrycznym o częstotliwości radiowej 13,56 megahertz, in vitro oraz in vivo. Jest to realizowane poprzez wstępną ocenę szybkości nagrzewania stężonych nanocząsteczek złota oraz ich buforu w kuwecie kwarcowej. Drugim krokiem procedury jest przeprowadzenie badań toksyczności nanocząsteczek złota in vitro z zastosowaniem hodowlanych komórek nowotworowych.Trzecim krokiem jest przeprowadzenie badań in vivo nanocząsteczek złota w mysim modelu raka ektopowego. Ostatecznie, wyniki mogą wykazać, czy badana nanocząsteczka może być skutecznym czynnikiem do zastosowania w hipertermii indukowanej przez RF, na podstawie analizy nanocząsteczek w zawiesinie, in vitro oraz in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nieinwazyjnej hipertermii radioczęstotliwościowej wspomaganej nanocząsteczkami, takie jak: czy dochodzi do nagrzewania wywołanego przez same cząsteczki i czy można je wykorzystać w celach terapeutycznych?Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na niewielką liczbę dobrze opracowanych protokołów dla tego typu eksperymentów. Procedurę zademonstrują Cisneros, asystent badawczy, Stuart Core, naukowiec na stopniu postdoctoral oraz Leila Green, również naukowiec na stopniu postdoctoral. Jako przykład, należy rozpocząć od komercyjnie dostępnej butelki 500 mililitrów nanocząsteczek złota o średnicy pięciu nanometrów.Pobrać około 125 mililitrów roztworu zapasu nanocząsteczek złota i rozdzielić go pomiędzy sześć probówek z filtrem do wirowania 50 kilodalton, a następnie wirować nanocząsteczki przy 3000 RPM przez dwie minuty i pięć sekund. Usunąć nadsącz, będący przefiltrowanym buforem, i ponownie napełnić każdy filtr kolejną porcją roztworu zapasu.Kontynuuj wirowanie, usuwanie buforu i ponowne napełnianie probówek, aż do przefiltrowania całego roztworu nanocząsteczek. Po ostatnim dodaniu zastąp przefiltrowany bufor podobną objętością wody dejonizowanej i powtórz ten proces około osiem razy po załadowaniu próbki przefiltrowanego buforu do urządzenia RF. Używając oprogramowania kamery na podczerwień, utwórz ramki nad QVE, aby zarejestrować profil nagrzewania. Po ośmiu przemyciach dane dotyczące nagrzewania filtratu nanocząsteczek złota o rozmiarze 5 nm zbliżają się do danych dla wody dejonizowanej.Analiza UV-vis może być również wykorzystana do monitorowania piku absorpcji zanieczyszczeń. Przedstawiono tutaj czyste widmo. Po całkowitym usunięciu zanieczyszczeń z buforu zawieszamy nanocząstki w 0,5 milliliters wody dejonizowanej w probówkach z filtrem, usuwając nanocząstki z filtra.Następnie połącz wszystkie sześć zawiesin w jednej probówce o pojemności 15 ml. Teraz przeanalizuj próbkę za pomocą spektroskopii UV-VIS oraz pomiaru potencjału zeta w celu uzyskania danych o stabilności. Użyj ICP-OES i/lub spektrometrii mas ICP w celu oznaczenia stężenia nanocząstek.Analiza SEM i lub TEM może być również wykorzystana do uzyskania danych morfologicznych przy użyciu systemu RF Kansas lub pochodnych obciążenia, strzykawki kwarcowej o pojemności 1,3 ml, przy ustawieniu pola elektrycznego RF na około 90 kV/m w powietrzu, w którym znajduje się strzykawka kwarcowa. Dla standardowej próbki soli fizjologicznej z 0,9% chlorkiem sodu pole elektryczne zostałoby zredukowane do około 1,1 kV/m. Są to przybliżone warunki zastosowane w celu umożliwienia porównania różnych systemów RF.Następnie do czystej kuwety kwarcowej należy wlać 1,3 ml oczyszczonej zawiesiny nanocząsteczek złota o stężeniu 1000 mg/L. Próbkę należy poddać działaniu pola RF przez 120 s lub do momentu osiągnięcia przez próbkę temperatury 70 °C. Zbyt długa ekspozycja może doprowadzić do powstania łuku elektrycznego lub gwałtownego wrzenia.Należy zarejestrować dane obrazowania termicznego oraz obszary kontrolne, używając kamery IR i odpowiedniego oprogramowania. Powtórz tę procedurę trzykrotnie na tej samej próbce. Następnie przefiltruj próbkę przez kolejny filtr wirówkowy o wielkości odcięcia 50 kilodalton, aby wyekstrahować nanocząsteczki złota z buforu wodnego.Następnie ponownie wystaw sam bufor na działanie pola RF. Ponownie, trzykrotna różnica w wartości hrs między koloidem nanocząstek złota a filtratem określa HR wynikający z samych nanocząstek złota. Na koniec zawieszamy pozostałe na filtrze nanocząstki złota w 1,3 milliliters wody w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów.Niniejsze badania in vitro można zastosować do każdego typu komórek nowotworowych tworzących monowarstwy 2D. W tym przykładzie zostaną wykorzystane ludzkie komórki Hep three B pochodzące z raka hepatokomórkowego, z wysiewem około 50 000 komórek w trzech studzienkach płytki 12-dołkowej w 1 ml pożywki wzrostowej.Dodać pożywkę i kontynuować hodowlę komórek, aż wypełnione zostaną trzy płytki do badań nad nanocząsteczkami oraz trzy płytki jako kontrole. Inkubować płytki w temperaturze 37,5 °C przez 24 godziny. Następnego dnia do każdego dołka trzech płytek z nanocząsteczkami wprowadzić 0,1 ml roztworu nanocząsteczek złota o stężeniu 1000 mg/l, pomijając płytki kontrolne.Do każdego dołka dodaj 0,1 ml wody, a następnie inkubuj wszystkie płytki przez kolejne 24 godziny. Po upływie tych 24 godzin odessaj pożywkę komórkową i przemyj komórki roztworem PBS, aby usunąć wszelkie nanocząsteczki złota związane z powierzchnią. Następnie wymień pożywkę komórkową.Komórki są teraz gotowe do ekspozycji na promieniowanie RF. Umieść każdą 12-dołkową płytkę z komórkami w polu RF i odczekaj, aż komórki ochłodzą się do 31 °C. Po lekkim schłodzeniu poddaj komórki 3,5-minutowej ekspozycji na promieniowanie RF.Końcowa temperatura pożywki komórkowej wyniesie około 37 °C. Przenieś komórki do inkubatora i odczekaj 24 godziny przed ich analizą. Gdy komórki będą gotowe, odessaj pożywkę i zastąp ją dwoma mililitrami 25% odczynnika MTT w pożywce.Następnie inkubować komórki przez kolejne cztery godziny. Potem zastąpić medium z MTT dwiema mililitrami DMSO. Umieścić płytki z komórkami na kołysce laboratoryjnej na 10 minut, aby DMSO rozpuściło odczynniki MTT.Na koniec pipetuj próbki o objętości 100 µL z każdej studzienki do płytki 96-dołkowej i odczytaj optycznie płytkę przy długości fali 570 nm. Te badania in vivo można zastosować do każdego rodzaju nowotworu tworzącego guzy lite w ortotopowym lub ektopowym modelu odzwierciedlającym. W tym przykładzie użyto komórek raka wątroby Hep three B oraz myszy nago BPC.Zacznij od około 100 000 komórek, poddaj je trypsynizacji, schłodź na lodzie i przygotuj zawiesinę o stężeniu 2 milionów komórek na 25 µL. Do zawiesiny komórek dodaj taką samą ilość schłodzonego do temperatury lodowej Matrigelu i wymieszaj dokładnie poprzez wielokrotne zasysanie i wypuszczanie pipetą. Następnie wstrzyknij wymieszaną zawiesinę w wybrane miejsce na grzbiecie każdego zwierzęcia.Po kilku tygodniach guzy osiągną średnicę od 0,5 do 1 cm; w tym momencie należy rozpocząć leczenie RF i zpodać myszom roztwór ketaminy i ksylazyny w drodze wstrzyknięcia doszpikowego (IP), dbając o ich ogrzanie. Następnie wstrzyknij nanocząsteczki złota bezpośrednio do połowy guzów, używając strzykawki o pojemności 1 cc z igłą o rozmiarze 27 lub 30 G. Użyj gazika chirurgicznego do wchłonięcia krwi i przemyj miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem.W ramach kontroli w pozostałą połowę guzów wstrzyknij sam PBS. Następnie poddaj zabiegowi połowę myszy w każdej grupie. Przymocuj mysz do głowicy odbiorczej generatora RF i osłoń obszary niepodlegające leczeniu taśmą miedzianą, w tym oczy, uszy oraz palce.Najważniejszą częścią tego eksperymentu jest prawidłowe uziemienie myszy. Bez właściwego uziemienia nagromadzenie ładunków na zwierzętach może spowodować oparzenia termiczne lub elektrodermalne. Można temu łatwo zapobiec.Umieść guz w odległości od głowicy transmisyjnej o co najmniej jeden centymetr większej niż szerokość planowanego miejsca leczenia. Następnie ustaw kamerę termowizyjną IR tak, aby guz i obszar leczenia były widoczne. Włącz RF na pięć minut i zarejestruj powstałą krzywą temperatury.Jeśli temperatura powierzchni skóry wzrośnie powyżej 42 °C, należy natychmiast przerwać zabieg po ekspozycji na RF. Pozostawić myszy do regeneracji w ciepłej komorze do momentu odzyskania przez nie przytomności. Zabiegi powtarzać dwa razy w tygodniu przez trzy tygodnie.Następnie uśmierć myszy 48 godzin po ostatniej ekspozycji na RF i poddaj guzy obróbce. Nagrzewanie nanocząsteczek złota oczyszczonych za pomocą RF określono na podstawie różnicy w hrs między nimi a tłem w postaci zbuforowanego roztworu wody dejonizowanej. Wyniki były zgodne z oczekiwaniami dla nanocząsteczek o rozmiarach pięciu nanometrów oraz 10 nanometrów.Oczyszczone nanocząsteczki złota zostały zintegrowane z komórkami Hep three B pochodzącymi z ludzkiego raka hepatokomórkowego. Gdy takie komórki zostaną poddane działaniu pola RF, zazwyczaj wykazują mniejszą żywotność niż komórki poddane działaniu RF bez zinternalizowanych nanocząsteczek. Rysunek 3 przedstawia zidealizowany scenariusz, w którym użyte nanocząsteczki złota same w sobie mają ograniczoną toksyczność, ale wykazują doskonałe cytotoksyczne właściwości inicjowane przez RF; w celu uzyskania kompleksowego przeglądu dotychczasowych wyników in vitro z wykorzystaniem różnych rodzajów nanomateriałów należy zapoznać się z literaturą.Do generowania guzów na grzbietach myszy nago babsi wykorzystano komórki raka wątroby Hep three B. Do guzów tych wstrzyknięto nanocząsteczki złota zawieszone w PBS, a następnie zastosowano ekspozycję na RF. Analiza po zakończeniu leczenia wykazała, że terapia zahamowała wzrost guza i zmniejszyła jego masę.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat oceny nanocząstek pod kątem zastosowania w RF-indukowanej hipotermii poprzez określenie ich właściwości odpowiedzi na RF w roztworze in vitro oraz in vivo. Należy pamiętać, że praca z wysokomocnymi polami elektrycznymi RF może być niezwykle niebezpieczna. Nigdy nie należy dotykać ani wprowadzać rąk do aktywnego pola elektrycznego.Przeprowadź pomiary pola elektrycznego i w razie potrzeby zastosuj odpowiednie ekranowanie, takie jak klatka Faradaya. Generalnie zawsze należy minimalizować ekspozycję na długotrwałe działanie pól elektrycznych o wysokim natężeniu.

protocols-for-assessing-radiofrequency-interactions-with-gold

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Protokoły oceny oddziaływań częstotliwości radiowych z nanocząstkami złota i układami biologicznymi w nieinwazyjnej terapii hipertermią nowotworów

Niniejszy artykuł opisuje protokół hipertermii całego ciała u myszy, który może stymulować stany przypominające gorączkę przez okres od 12 do 24 hr.

Protokół długotrwałej hipertermii całego ciała u myszy

Opisujemy syntezę i właściwości wielofunkcyjnych nanocząstek Fe2O3-Au wytwarzanych metodą mokrej chemii i badamy ich właściwości fototermiczne za pomocą promieniowania laserowego. Kompozytowe nanocząstkiFe2O3-Au zachowują właściwości obu materiałów, tworząc wielofunkcyjną strukturę o doskonałych właściwościach magnetycznych i plazmonicznych.

Wielofunkcyjne hybrydowe nanocząstki Fe2O3-Au do wydajnego ogrzewania plazmonicznego

Prezentowany tutaj jest protokół wytwarzania mikropęcherzyków z nanocząsteczkami tlenku żelaza (NSM) poprzez samoorganizację, synergię reakcji magnetycznej, akustycznej i optycznej w jednej nanoterapeutycznej platformie do hipertermii magnetycznej i fototermicznej terapii przeciwnowotworowej.

Mikropęcherzyki reagujące na magnesy, akustycznie i optycznie do hipertermii magnetycznej i potototermicznej skojarzonej terapii nowotworów

Ten protokół przedstawia techniki i metodologię niezbędne do dokładnego dostarczania hipertermii magnetycznych nanocząstek przy użyciu zaawansowanego systemu dostarczania i monitorowania.

Dostarczanie hipertermii nanocząstek magnetycznych in vitro i in vivo za pomocą specjalnie zaprojektowanego systemu dostarczania

Ta praca przedstawia protokół umożliwiający osiągnięcie dynamicznego, nieinwazyjnego monitorowania transferu ciepła z napromieniowanych laserowo nanocząstek złota do tBLM. System łączy spektroskopię impedancji do pomiaru zmian przewodności w czasie rzeczywistym w tBLM z poziomo skupioną wiązką laserową, która napędza oświetlenie nanocząstek złota, w celu produkcji ciepła.

Dwuwarstwowe membrany lipidowe na uwięzi do monitorowania wymiany ciepła między nanocząstkami złota a błonami lipidowymi

Prezentowany tutaj jest protokół do użycia kontrolowanej hipertermii, generowanej przez ultradźwięki o wysokiej intensywności sterowane rezonansem magnetycznym, do wywołania uwalniania leku z liposomów wrażliwych na temperaturę w modelu myszy mięsaka prążkowanokomórkowego.

Hipertermia ultradźwiękowa o wysokiej intensywności sterowana rezonansem magnetycznym: wykonalna metoda leczenia w modelu mysiego mięsaka prążkowanokomórkowego

Artykuł opisuje protokół do symulacji przejściowych profili temperatury i sprzężonej czasoprzestrzennej zmienności ciśnienia płynu śródmiąższowego po ogrzewaniu dostarczanym przez dipolarny system hipertermii o częstotliwości radiowej. Protokół może być wykorzystany do oceny odpowiedzi parametrów biofizycznych charakteryzujących mikrośrodowisko guza na techniki hipertermii interwencyjnej.

Podejście do modelowania obliczeniowego w celu zbadania wpływu hipertermii na mikrośrodowisko guza

Ten artykuł przedstawia protokół przygotowania fantomów tkanki nowotworowej, które replikują właściwości optyczne dla plazmonicznej terapii fototermicznej. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie fantomowe, oceny fototermiczne i walidację opracowanego modelu numerycznego opartego na pomiarach temperatury fototermicznej w celu oceny parametrów terapeutycznych, oferując etyczną, opłacalną alternatywę dla badań in vivo do wstępnych testów.

Plazmoniczna terapia raka fototermicznego: Fantomy naśladujące tkankę nowotworową osadzone w nanocząstkach do wizualizacji fototermicznego rozkładu temperatury

W protokole tym przedstawiono techniki i metodologię niezbędne do celowanej terapii hipertermicznej w modelach guzów litych. Podejście to wykorzystuje fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni przez wstrzykiwane domięśniowo złote nanopręty w celu wywołania miejscowego ogrzewania w mikrośrodowisku guza.

Indukowanie ukierunkowanej łagodnej hipertermii w mysich modelach nowotworów poprzez fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni za pomocą wewnątrznowotworowych nanoprętów złota

W niniejszym filmie zaprezentowano procedury charakterystyki ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) oraz immunohistochemii (IHC). Przekroje trzustki z obszarów głowy, trzonu i ogona poddaje się barwieniu H&amp;E oraz IHC w celu określenia składu endokrynnego wysepek (insulina, glukagon i polipeptyd trzustkowy), replikacji komórek (Ki67) oraz nacieków zapalnych (H&amp;E, CD3). Obszar haczykowaty jest lokalizowany za pomocą IHC w kierunku...

Protokoły barwienia dla ludzkich wysepek trzustkowych

Poznaj ocenę właściwości grzewczych nanocząstek złota w polu elektromagnetycznym RF 13,56 MHz in vitro i in vivo. Ta metoda umożliwia badanie potencjału terapeutycznego w hipertermii nowotworowej.

Protokoły oceny interakcji o częstotliwości radiowej z nanocząstkami złota i systemami biologicznymi w nieinwazyjnej terapii nowotworów w hipertermii (Wideo) | JoVE Journal

Protokoły oceny interakcji o częstotliwości radiowej z nanocząstkami złota i systemami biologicznymi w nieinwazyjnej terapii nowotworów w hipertermii

Przeglądaj więcej filmów