Name: Budowa mikroskopu o wysokiej rozdzielczości z konwencjonalnymi i holograficznymi możliwościami optycznego pułapkowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj budowę mikroskopu z konwencjonalnym i holograficznym pułapkowaniem optycznym do manipulacji wieloma cząstkami. System umożliwia szybkie pomiary aktywności enzymów biologicznych w trzech wymiarach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez Uniwersytet Utah. Chcielibyśmy podziękować dr J. Xu (UC Merced) i dr B.J.N Reddy (UC Irvine) za przydatne dyskusje.

1. Instalacja pojedynczej pułapki optycznej o długości fali 980 nm
<ol>
	<li>Pułapkowanie optyczne o długości fali 980 nm jest często optymalne dla eksperymentów biofizycznych, a niedrogie diody laserowe są łatwo dostępne o mocy wyjściowej do 300 mW. Zaleca się, aby laser diodowy był pokryty pigtailem światłowodem jednomodowym zachowującym polaryzację o znanej średnicy pola modowego. Włókno musi być wystarczająco długie, aby działało jako filtr modów i jest zwykle zakończone złączem FC/PC lub FC/APC. Spośród nich FC/APC jest preferowany, aby zminimalizować odbicie wsteczne światła i niestabilność potencjalnego sprzężenia zwrotnego.</li>
	<li>Zamocuj diodę laserową 980 nm w uchwycie, który pozwala na kontrolę mocy i temperatury. Najlepiej jest przymocować uchwyt bezpośrednio do stołu optycznego, aby zmaksymalizować pasywne odprowadzanie ciepła, a tym samym zminimalizować niebezpieczeństwo awarii diody z powodu nieprawidłowego działania regulatora temperatury.</li>
	<li>Zamontuj złącze światłowodowe PC/APC do optyki kolimacyjnej wiązki. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że skolimowana wiązka ma minimalną rozbieżność, więc regulowane porty światłowodowe są najbardziej przydatne. Upewnij się, że wybrany port światłowodowy jest zgodny ze średnicą pola modowego światłowodu warkocza diody. Jeśli wiązka ma być rastrowana za pomocą deflektorów akustyczno-optycznych (AOD) lub deflektorów elektrooptycznych (EOD), to talia skolimowanej wiązki laserowej musi być również nieco mniejsza niż rozmiar apertury deflektora.</li>
	<li>Przymocuj adapter kolimacyjny do stołu optycznego w wystarczającej odległości od mikroskopu, aby umożliwić prowadzenie wiązki, rozszerzanie i umieszczanie innych pożądanych elementów. Wyreguluj port światłowodowy, aby zapewnić stałą talię wiązki na odległościach porównywalnych z ogólną ścieżką wiązki do mikroskopu.</li>
	<li>Zainstaluj lusterka wskazane na rysunku 1. Zdejmij obiektyw z mikroskopu i użyj luster, aby skierować wiązkę przez otwór w etapie montażu obiektywu. Jeśli jest to preferowane, umieszczenie zwierciadeł dichroicznych DM1 i DM3 można pominąć na później. DM2 i DM3 są krótkoprzepustowe i przepuszczają światło widzialne, odbijając światło w bliskiej podczerwieni i powyżej.</li>
	<li>Pomocne jest tymczasowe zamontowanie czerwonego wskaźnika laserowego w miejscu obiektywu, ustawionego na osi optycznej mikroskopu. Niestandardowy adapter mechaniczny jest niezbędny, aby zapewnić centrowanie wskaźnika laserowego. Widzialna wiązka ze wskaźnika laserowego może być następnie skierowana z powrotem do środka otworu portu światłowodowego, a następnie może być wykorzystana do zainstalowania soczewek (patrz poniżej).</li>
	<li>Zainstaluj ekspander wiązki 980 nm (L8 i L9) w odpowiedniej odległości od portu światłowodowego, aby umożliwić w przyszłości wstawienie elementów sterujących (AOD lub EOD) w razie potrzeby 1. Rozszerzona wiązka musi nieznacznie przepełnić tylną aperturę ogniskową obiektywu. (W tym przypadku obiektywy o ogniskowych 125 mm i 60 mm są w układzie keplerowskim, aby w przybliżeniu podwoić wiązkę w talii). Użyj widzialnej wiązki wskaźnika laserowego (patrz rozdział 1.6), aby zapewnić prawidłowe umieszczenie soczewki i zgrubne wyrównanie.</li>
	<li>Zamontuj soczewki sterujące 980 nm (L2 i L3) w układzie teleskopu, jak pokazano (tutaj oba mają ogniskową 60 mm) 1. L3 jest zamontowany w płaszczyźnie sprzężonej z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu. Zamontuj L3 na precyzyjnym stoliku pozycjonującym XYZ, aby umożliwić sterowanie wiązką. Pomocne jest, aby stolik XYZ był wyposażony w cyfrowe wskaźniki mikrometrów, co pozwala na powtarzalne pozycjonowanie i zmianę położenia pułapki. Zakres ruchu 0,5 cala jest zwykle wystarczający, jednak pomocny może być dłuższy skok w celu pozycjonowania L3 wzdłuż osi optycznej. Użyj widzialnej wiązki wskaźnika laserowego (patrz rozdział 1.6), aby zapewnić prawidłowe umieszczenie soczewki i zgrubne wyrównanie.</li>
</ol>
2. Instalacja detektora laserowego
<ol>
	<li>Zamontuj zwierciadło dichroiczne DM3 nad skraplaczem, jak pokazano na rysunku 1. Zazwyczaj wymagany jest niestandardowy montaż. Przymocuj poczwórną fotodiodę (QPD) lub detektor czuły na położenie (PSD) 8 z boku zespołu kondensatora i upewnij się, że wiązka laserowa 980 nm odbita przez DM3 uderza w nią mniej więcej pośrodku. W przypadku korzystania z QPD należy upewnić się, że jest on zamontowany na małym stoliku XY, aby umożliwić precyzyjne wyśrodkowanie czujnika na wiązce laserowej.</li>
	<li>Zainstaluj L1 (zwykle obiektyw 30 mm) między DM3 a czujnikiem. Ustaw L1 tak, aby skupić wiązkę na jednym miejscu na czujniku.</li>
	<li>Zainstaluj filtr wycinający tuż przed L1, aby zablokować wiązkę 1,064 nm, a także wszelkie rozproszone odbicia światła widzialnego od oświetlacza mikroskopu i oświetlenia otoczenia.</li>
</ol>
3. Instalacja holograficznej pułapki o długości fali 1,064 nm
<ol>
	<li>Holograficzna część konfiguracji jest zbudowana wokół dostępnego na rynku pakietu sprzętowo-programowego Lusterka holograficzne użyte w tym pakiecie są przystosowane do maksymalnej mocy padającej 5 lub 10 W/cm2. Jednomodowe wiązki TEM00 w tym zakresie mocy można łatwo pozyskać z lasera DPSS o długości fali 1,064 nm.</li>
	<li>Zamontuj laser o długości fali 1,064 nm na podwyższonej platformie, aby mniej więcej odpowiadał wysokości ścieżki wiązki dla linii 980 (patrz rozdział 1).</li>
	<li>Jeśli nie można sterować bezpośrednio, moc lasera można regulować ręcznie, instalując płytkę półfalową (HWP) i polaryzator (PBS) zaraz za aperturą wyjścia lasera. Pomocne jest zamontowanie polaryzatora w stoliku obrotowym, aby móc dopasować się do wymagań lustra holograficznego dla polaryzacji wiązki.</li>
	<li>Zainstaluj ekspander wiązki 1,064 nm (L6 i L7). Talia wiązki laserowej musi być rozszerzona, aby dopasować się do rozmiaru przekątnej lustra holograficznego. W przypadku dużych współczynników rozszerzalności (powyżej 10X) utrzymanie małego rozmiaru ekspandera może być problemem. Dlatego pożądane może być stosowanie obiektywów o niezwykle małej ogniskowej (tutaj: 16 mm i 175 mm).</li>
	<li>Zamontuj pozostałe lusterka zgodnie z opisem, aby skierować wiązkę 1,064 nm przez obiektyw.
	<ol>
		<li>Zamocuj dichroiczny DM1 (kąt padania 45°) w uchwycie kinematycznym i umieść zespół na ścieżce wiązki 980 nm tak, aby pozwalał na niezmniejszoną transmisję tej wiązki.</li>
		<li>Aktywuj światło wskaźnika laserowego. Lustro DM1 powinno odbijać wystarczającą ilość światła widzialnego, aby prawidłowo ustawić przestrzenny modulator światła (SLM) na drodze tej wiązki. SLM musi być również ustawiony pod kątem, aby przychodzące i wychodzące wiązki laserowe były jak najbardziej zbliżone do normalnego padania. Jednak kąt padania musi być wystarczająco duży, aby zapewnić, że wiązka laserowa nie zostanie przycięta przez mocowania soczewek i inne elementy optyczne. Kąt 5° powinien być łatwo osiągalny i wystarczająco mały. Na koniec odległość od DM1 do SLM musi być dokładnie zmierzona, aby włożenie soczewek L4 i L5 (patrz 3.6 poniżej) mogło sprzęgnąć płaszczyznę lustra SLM i tylną płaszczyznę ogniskową obiektywu.</li>
		<li>Zainstaluj lustro, aby skierować światło z ekspandera wiązki 1,064 nm do SLM. Upewnij się, że światło wskaźnika laserowego pada na otwór ekspandera wiązki pośrodku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj soczewki L4 i L5 (tutaj: obiektywy odpowiednio 125 mm i 200 mm). Ta para teleskopów sprzęga płaszczyznę zwierciadła SLM z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu, a także zmniejsza talię wiązki, aby tylko nieznacznie przepełnić tylną aperturę obiektywu. Wybraliśmy obiektywy o długich ogniskowych, aby odsunąć SLM od DM1. To nie tylko zwalnia miejsce dla drugiej linii laserowej, ale także ułatwia wyrównanie.</li>
	<li>Usuń wskaźnik laserowy. Pozostaw adapter montażowy tak, aby służył jako otwór do zgrubnego wyrównywania.</li>
</ol>
4. Uwagi dotyczące instalacji i wyrównania systemu
<ol>
	<li>Soczewki L3 i SLM muszą być ustawione w taki sposób, aby były optycznie sprzężone z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu. Wspólny punkt ogniskowy L4 i L5 jest optycznie sprzężony z płaszczyzną próbki, jeśli optyczne wiązki pułapkowe są wstrzykiwane w przestrzeń nieskończoności mikroskopu.</li>
	<li>Przeglądarka kart IR Ustaw wiązkę 980 nm tak, aby przebiegała wzdłuż środkowej osi przysłony w adapterze wskaźnika laserowego.</li>
	<li>Użyj karty IR, aby upewnić się, że wiązka 1,064 nm trafia w to samo miejsce, co wiązka 980 nm na DM1, L2 i L3 oraz że wiązka 1,064 nm biegnie wzdłuż środkowej osi apertury w adapterze wskaźnika laserowego.</li>
	<li>Zastąp adapter mocujący wskaźnik laserowy obiektywem. Typowy jest obiektyw olejowy lub wodny o dużej aperturze numerycznej.</li>
	<li>Ustaw pułapkę 980 nm zgodnie z opisem w 9, "chodząc" po wiązce laserowej, aż na kamerze pojawi się promieniście symetryczny wzór interferencyjny</li>.
	<li>Przy wyłączonym zwierciadle holograficznym (tj. działającym jako lustro pasywne) użyj SLM i DM1, aby "chodzić" po niedyfrakcyjnej wiązce 1,064 nm, aby wyrównać pułapkę 1,064 nm.</li>
	<li>SLM wytwarza znaczną niedyfrakcyjną wiązkę, co skutkuje silną, nieruchomą pułapką laserową w polu widzenia. Jest to przydatne do wyrównywania, ale może być niepożądane w przypadku eksperymentów. Aby zablokować tę pułapkę, można umieścić mały nieprzezroczysty obiekt na ścieżce niedyfrakcyjnego światła w miejscu sprzężonym z płaszczyzną próbki (np. wspólny punkt ogniskowy L4 i L5). Rozmiar tego centralnego blokera plamek musi być nieco większy niż średnica dysku Airy'ego dla skupionego światła (bloker o średnicy 100-300 μm dla opisywanego systemu).</li>
	<li>djust 1,064 nm polaryzacja wiązki za pomocą polaryzatora w celu dopasowania orientacji SLM. Obróć płytkę półfalową, aby ustawić moc wyjściową wiązki zgodnie z potrzebami.</li>
	<li>W razie potrzeby włóż elementy sterujące wiązką AOD lub EOD do linii laserowej 980 nm. Upewnij się, że te elementy są prawidłowo sprzężone z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu i ponownie wyrównaj pułapkę. Pomocne jest zamontowanie elementów sterujących na stoliku goniometrycznym.</li>
</ol>

<ol><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+optical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Biological applications of optical forces.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23, 247-285 (1994).</li>
<li>Ashkin, A., Schutze, K., Dziedzic, J. M., Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+generation+of+organelle+transport+measured+in+vivo+by+an+infrared+laser+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force generation of organelle transport measured in vivo by an infrared laser trap.</a> Nature. 348, 346-348 (1990).</li>
<li>Shubeita, G. T., Tran, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Polin, M., Ladavac, K., Lee, S. H., Roichman, Y., Grier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+holographic+optical+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Optimized holographic optical traps.</a> Opt Express. 13, 5831-5845 (2005).</li>
<li>Sun, B., Roichman, Y., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+holographic+optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Theory of holographic optical trapping.</a> Opt. Express. 16, 15765-15776 (2008).</li>
<li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li>
<li>Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revolution+in+optical+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revolution in optical manipulation.</a> Nature. 424, 810-816 (2003).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+tweezers+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Introduction.+Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser tweezers in cell biology.</a> Introduction. Methods Cell Biol. 55, xi-xii (1998).</li>
<li>Spudich, J. A., Rice, S. E., Rock, R. S., Purcell, T. J., Warrick, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+traps+to+study+properties+of+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optical traps to study properties of molecular motors.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1305-1318 (2011).</li>
<li>Visscher, K., Gross, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+multiple-beam+optical+traps+with+nanometer-resolution+position+sensing.+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of%22%5BJournal%5D)">Construction of multiple-beam optical traps with nanometer-resolution position sensing. Selected Topics in Quantum Electronics.</a> IEEE Journal of. 2, 1066-1076 (1996).</li>
<li>Valentine, M. T., Guydosh, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+steering+of+an+optical+trap+by+electro-optic+deflection%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Precision steering of an optical trap by electro-optic deflection.</a> Opt Lett. 33, 599-601 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Skonstruowaliśmy przyrząd, który łączy w sobie dwie pułapki optyczne różnych typów (rysunek 1), aby zapewnić oddzielne urządzenia do manipulacji obiektami i pomiarów. "Konwencjonalna" pułapka optyczna zbudowana jest wokół lasera diodowego o długości fali 980 nm. Wiązka ta jest rozszerzana, sterowana, a następnie wstrzykiwana do naszego odwróconego mikroskopu (wiązka "jasnoczerwona" na rysunku 1). Holograficzna pułapka optyczna jest zbudowana wokół lasera DPSS o długości fali 1 064 nm. Wi...

Optyczne pułapkowanie jest jedną z kluczowych technik w biofizyce 6. Kluczowym postępem w dziedzinie pułapek optycznych było opracowanie pułapek holograficznych, które pozwalają na tworzenie trójwymiarowych wzorów pułapek zamiast konwencjonalnych pułapek punktowych 7. Takie pułapki holograficzne mają tę zaletę, że są wszechstronne w pozycjonowaniu obiektów refrakcyjnych. Jednak konwencjonalne pułapki można łatwo ustawić tak, aby były bardziej symetryczne niż dostępne na rynku zestawy holograficzne. Pozwalają również na szybkie, precyzyjne śledzenie uwięzionych obiektów. W tym miejscu opisano system (rysunek 1), który łączy w sobie dwa podejścia do odłowu w jednym instrumencie i pozwala użytkownikowi na wykorzystanie korzyści płynących z obu, jeśli jest to właściwe.
Ogólne rozważania dotyczące konstruowania pułapek optycznych (opartych na pojedynczych lub wielokrotnych wiązkach laserowych) są szczegółowo omówione gdzie indziej 8-10. W tym miejscu przedstawiamy kwestie specyficzne dla naszej konfiguracji i podajemy szczegóły naszej procedury wyrównywania. Na przykład systemy z dwiema optycznymi wiązkami pułapkowania zostały opisane wcześniej (np. odnośnik 11), zazwyczaj wykorzystujące jedną wiązkę laserową do uwięzienia obiektu załamanego światła, a drugą (wiązka celowo o niskiej mocy) do odsprzęgniętego odczytu położenia uwięzionego obiektu. W tym przypadku jednak obie wiązki laserowe muszą mieć dużą moc (300 mW lub wyższą), ponieważ obie mają być używane do pułapkowania. W przypadku pomiarów systemów biologicznych lasery używane do pułapkowania powinny optymalnie mieścić się w określonym oknie długości fali NIR, aby zminimalizować degradację białek wywołaną światłem 1. W tym przypadku zdecydowaliśmy się na zastosowanie laserów diodowych 980 nm i DPSS 1 064 nm ze względu na ich niski koszt, wysoką dostępność i łatwość obsługi.
Zdecydowaliśmy się również na użycie przestrzennego modulatora światła (SLM) do tworzenia i manipulowania wieloma pułapkami jednocześnie w czasie rzeczywistym 4,5. Urządzenia te są dostępne na rynku, jednak ich integracja z kompletną konfiguracją stanowi wyjątkowe wyzwanie. W niniejszym dokumencie opisujemy praktyczne podejście, które rozwiązuje te potencjalne trudności i zapewnia bardzo wszechstronne narzędzie. Podajemy wyraźny przykład dla konkretnej opisanej konfiguracji, który może być wykorzystany jako przewodnik dla zmodyfikowanych projektów.

<table><tbody><tr><td>Stół optyczny</td><td>Newport corporation</td><td>ST-UT2-56-8</td><td>Irvine, CA</td></tr><tr><td>Mikroskop, odwrócony, Eclipse Ti</td><td>Nikon USA</td><td>MEA53220</td><td>Melville, NY</td></tr><tr><td>Plan apo 100X obiektyw olejowy (1.4 NA)</td><td>Nikon USA</td><td>MRD01901</td><td>Melville, NY</td></tr><tr><td>Kondensator oleju Obiektyw 1.4 NA</td><td>Nikon USA</td><td>MEL41410</td><td>Melville, NY</td></tr><tr><td>Aparat EMCCD</td><td>Technologia Andor USA</td><td>Ixon DU897</td><td>South Windsor, CT</td></tr><tr><td>1/3" CCD IEEE1394</td><td>kamera NET USA Inc</td><td>Foculus FO124SC</td><td>Highland IN</td></tr><tr><td>Laser, TEM00, SLM, długość fali 1,064 nm</td><td>Klastech Laser Technologies</td><td>Senza-1064-1000</td><td>Dortmund; Niemcy</td></tr><tr><td>dioda laserowa, TEM00, SLM, 980 nm</td><td>Axcel Photonics</td><td>BF-979-0300-P5A</td><td>Marlborough,</td></tr><tr><td>mocowanie diody laserowej</td> MA <td>ILX Lightwave</td><td>LDX-3545, LDT-5525 i LDM-4984</td><td>Bozeman,</td></tr><tr><td>regulowane porty światłowodowe</td> MT <td>Thorlabs</td><td>PAF-X-11-B</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>system holograficzny</td><td>Arryx</td><td>HOTKIT-ADV-1064</td><td>Chicago, IL</td></tr><tr><td>holograficzny lustro</td><td>Boulder Układy nieliniowe</td><td>to jest część HOTKIT-ADV-1064</td><td>Lafayette, CO</td></tr><tr><td>Polaryzator kalcytowy</td><td>Thorlabs</td><td>GL10-B</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>płyta półfalowa</td><td>Thorlabs</td><td>WPH05M-1064</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>Uchwyt obrotowy polaryzatora</td><td>Thorlabs</td><td>PRM1</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>półfalowy montaż obrotowy płyty</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>Migawka</td><td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>lustra dichroiczne (DM2 & DM3); 45 stopni Celsjusza; AOI</td><td>Chroma Technology</td><td>t750spxrxt</td><td>Bellows Falls,</td></tr><tr><td>zwierciadło dichroiczne VT (DM1); 45 &deg; AOI</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP1000R</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>niestandardowy adapter mechaniczny</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A11 i AD12F z powiększonym otworem wewnętrznym</td><td>Newton, filtr</td></tr><tr><td>wycinający</td> NJ <td>Semrock</td><td>FF01-850/310-25</td><td>Rochester, NY</td></tr><tr><td>Deflektor akustyczno-optyczny (2-osiowy)</td><td>intraAction</td><td>DTD-584CA28</td><td>Bellwood,</td></tr><tr><td>IL stolik goniometryczny</td><td>New Focus</td><td>9081</td><td>Santa Clara, CA</td></tr><tr><td>Soczewki sterujące 60 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1134-B</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>16 mm asferyczna soczewka ekspanderowa</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-016-C</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>175 mm soczewka ekspanderowa</td><td>Thorlabs</td><td>LA1229-C</td><td>Newton, NJ</td></tr><tr><td>Bloker plamek (kula ze stali kabronowej)</td> <td>Bal-Tec</td><td>o średnicy 0,0100"</td><td>Los Angeles, CA</td></tr><tr><td>Mikrosfery ( Karboksyl-polistyren)</td><td>Spherotech</td><td>CP-45-10</td><td>Lake Forest, IL</td></tr></tbody></table>

budowa mikroskopu o wysokiej rozdzielczości z konwencjonalnymi i holograficznymi możliwościami optycznego pułapkowania

Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

Systemy mikroskopowe o wysokiej rozdzielczości z pułapkami optycznymi pozwalają na precyzyjne manipulowanie różnymi obiektami refrakcyjnymi, takimi jak koraliki dielektryczne 1 lub organelle komórkowe 2,3, a także na odczyt ich położenia względem środka pułapki w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Opisywany tutaj system posiada jedną z takich "tradycyjnych" pułapek działających na długości fali 980 nm. Dodatkowo zapewnia drugi optyczny system pułapkowania, który wykorzystuje dostępny na rynku pakiet holograficzny do jednoczesnego tworzenia i manipulowania złożonymi wzorcami pułapek w polu widzenia mikroskopu 4,5 przy długości fali 1,064 nm. Połączenie tych dwóch systemów pozwala na jednoczesną manipulację wieloma obiektami refrakcyjnymi przy jednoczesnym prowadzeniu szybkich i rozdzielczych pomiarów ruchu i produkcji siły w skali nanometrowej i pikonewtońskiej.

Zmontowany układ pozwala operatorowi na przechwytywanie wielu obiektów refrakcyjnych w czasie rzeczywistym i pozycjonowanie ich w trzech wymiarach w polu widzenia. Ilustrujemy możliwości holograficzne instrumentu poprzez przechwycenie 11 mikrosfer (Rysunek 2). Pułapka więżąca każdy obiekt jest ręcznie repozycjonowana po przechwyceniu w taki sposób, aby końcowy układ odwzorowywał logo University of Utah, gdzie przeprowadzono ten eksperyment. Połączoną funkcję pułapki holograficznej i konwencjonalnej przed...

System opisany tutaj wykorzystuje tradycyjną pułapkę optyczną, jak również niezależną holograficzną linię pułapek optycznych, zdolną do tworzenia i manipulowania wieloma pułapkami. Pozwala to na tworzenie złożonych układów geometrycznych cząstek załamanych światła, a jednocześnie umożliwia jednoczesne szybkie pomiary aktywności enzymów biologicznych w wysokiej rozdzielczości.

Budowa mikroskopu o wysokiej rozdzielczości z konwencjonalnymi i holograficznymi możliwościami optycznego pułapkowania

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

W tej procedurze montowany i konfigurowany jest tradycyjny oraz holograficzny układ pułapkowania optycznego. Aby to osiągnąć, należy w pierwszej kolejności wyznaczyć położenie komponentów optycznych, a następnie stabilnie zamontować elementy w odpowiednich miejscach. W kolejnym kroku należy ustawić optykę w sposób umożliwiający pułapkowanie. Ostatnim etapem jest zablokowanie wiązki TED przed lustrem holograficznym.W rezultacie gotowy system umożliwia jednoczesne pułapkowanie holograficzne i zwykłe. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak samo pułapkowanie zwykłe, jest możliwość jednoczesnego pozycjonowania wielu obiektów refrakcyjnych w trzech wymiarach oraz szybkie pomiary manipulacji obiektami. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ projektowanie, rozmieszczenie elementów i ich kalibracja mogą być wymagające.Punktem wyjścia w tym filmie jest ława optyczna z zamontowanym mikroskopem w celu stworzenia pułapki optycznej przy długości fali 980 nanometrów. Należy rozpocząć od użycia jednej z łatwo dostępnych diod laserowych o tej długości fali. Należy wykorzystać laser z regulacją kąta nachylenia (pig tilt), polaryzatorem oraz światłowodem jednomodowym o znanym średnicy pola mody.Włókno powinno być wystarczająco długie, aby pełnić funkcję filtra modowego, i powinno być zakończone złączem kanałowym z konektorem FCPC lub F-C-A-P-C. Z jednomodowym włóknem optycznym należy obchodzić się ostrożnie, unikając jego skręcania. Należy unieruchomić diodę laserową oraz uchwyt umożliwiający kontrolę mocy i temperatury.Uchwyt należy przymocować bezpośrednio do stołu optycznego, aby zmaksymalizować pasywne odprowadzanie ciepła. Następnie należy zamontować złącze światłowodowe do optyki kolimującej wiązkę. Należy upewnić się, że wybrany port światłowodowy jest zgodny z średnicą pola modowego diody.Za pomocą światłowodu typu pigtail przymocuj adapter kolimacyjny do stołu optycznego w odpowiedniej odległości od mikroskopu, aby zapewnić miejsce na prowadzenie wiązki oraz rozmieszczenie pozostałych komponentów. Kolory prętów mogą służyć do ustalenia odstępów między soczewkami w celu zapewnienia stabilnego i powtarzalnego pozycjonowania. Wyreguluj port światłowodowy, aby zapewnić stałą pas wiązki na dystansach porównywalnych z całkowitą drogą wiązki do mikroskopu.Na drodze wiązki lasera DDE znajduje się pięć luster. Począwszy od lasera dde, zastosowano dwa lustra w celu skierowania wiązki wyjściowej do obudowy mikroskopu. Wiązka musi również przejść przez lustro dichroiczne, które umożliwia niezakłóconą transmisję wiązki diody laserowej pod kątem 45 stopni względem kąta padania.Na koniec zastosowano dwa dodatkowe lustra dichroiczne z filtrem krótkoprzepustowym, które przepuszczają światło widzialne, ale odbijają bliską podczerwień i zakresy powyżej. Poprowadź wiązkę do wnętrza mikroskopu i na zewnątrz. Przestrzeń nieskończoności jeden znajduje się w obudowie mikroskopu, aby umożliwić regulację luster; należy usunąć obiektyw mikroskopu.Użyć luster oraz karty do obserwacji podczerwieni, aby skierować wiązkę przez otwór w elemencie montażowym obiektywu. Jeśli wiązka jest przesunięta względem centrum, należy wyregulować lustra, aby skorygować osiowość, tak aby wiązka znajdowała się w centrum. Podczas montażu soczewek zastosowanie systemu klatkowego pozwala na uzyskanie sztywnego zespołu.Do wstępnego pomiaru odległości między soczewkami wzdłuż prętów klatki przed ich montażem można użyć suwmiarki. Tymczasowo zamontuj czerwony wskaźnik laserowy za pomocą specjalnego adaptera w miejscu obiektywu, tak aby wiązka znajdowała się wzdłuż osi optycznej mikroskopu. Wykorzystaj widoczną wiązkę wskaźnika laserowego, aby umieścić i wstępnie wyrównać ekspander wiązki 980 nanometer.Układ ten wykorzystuje soczewki o ogniskowych 60 mm i 125 mm w konfiguracji Keary’ego, aby w przybliżeniu dwukrotnie zwiększyć pas waist wiązki. Następnie należy zainstalować soczewki sterujące dla długości fali 980 nm, wykorzystując wiązkę wskaźnikową jako prowadnicę. Każda soczewka posiada uchwyt dla ogniskowej 60 mm; pierwsza soczewka na drodze wiązki znajduje się na precyzyjnej scenie X, Y, Z o zakresie ruchu co najmniej pół cala, co umożliwia sterowanie wiązką.Drugą soczewkę można teraz ustawić tak, aby stworzyć układ Keery w stosunku jeden do jednego z pierwszą soczewką. Soczewka ta musi zostać ustawiona w taki sposób, aby była sprzężona optycznie z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu. Aby przygotować pułapkę holograficzną, zamontuj laser 1064 nanometer na podwyższonej platformie, mniej więcej na wysokości wiązki 980 nanometer.Umieść płytkę półfalową i polaryzator bezpośrednio za wyjściem lasera, aby umożliwić ręczną regulację mocy lasera. Zainstaluj rozszerzacz wiązki dla tego lasera w taki sposób, aby pas wiązki został rozszerzony do rozmiaru odpowiadającego przekątnej lustra holograficznego.W przypadku ograniczonej przestrzeni należy zastosować soczewki o krótkich ogniskowych, odpowiednio 16 mm i 175 mm. Następnie przy użyciu wiązki wskaźnika laserowego należy ustawić modulator światła przestrzennego (SLM), który jest elementem wykorzystywanego komercyjnego zestawu holograficznego. W tym doświadczeniu modulator światła przestrzennego musi zostać ustawiony tak, aby był sprzężony optycznie z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu.Ustaw go tak, aby wiązka wskaźnika laserowego miała jak najmniejszy kąt padania, ale jednocześnie tak, aby jej odbicie bezpiecznie omijało cały sprzęt znajdujący się na stole optycznym. Umieść kolejne lustro przed rozszerzaczem wiązki lasera 1064 nanometr, aby skierować światło do przestrzennego modulatora światła. Upewnij się, że światło wskaźnika laserowego trafia w środek otworu rozszerzacza wiązki.Na koniec zainstaluj układ soczewek teleskopowych pomiędzy przestrzennym modulatorem światła a lustrem dichroicznym. Soczewki te mają ogniskowe 125 mm i 200 mm. Usuń wskaźnik laserowy, pozostawiając niestandardowy uchwyt adaptera, który będzie służył jako otwór do wstępnego wyrównania.Rozpocznij sprawdzanie osiowości, korzystając wyłącznie z wiązki 980 nanometrów. Użyj karty do detekcji podczerwieni, aby ustawić wiązkę 980 nanometrów tak, aby biegła wzdłuż osi środkowej otworu w niestandardowym adapterze. Następnie użyj karty do detekcji podczerwieni, aby upewnić się, że wiązka 1064 nanometrów trafia w te same punkty co wiązka 980 nanometrów wzdłuż ich wspólnej ścieżki.Po wykonaniu tej czynności należy zastąpić niestandardowy adapter montażowy wskaźnika laserowego obiektywem olejowym lub wodnym o wysokiej aperturze numerycznej. Następnie należy wyrównać pułapkę 980 nanometrów, przesuwając wiązkę lasera, aż na kamerze, przy wyłączonym lustrze holograficznym, pojawi się radialnie symetryczny wzór interferencyjny. Pułapkę 1064 nanometrów należy wyrównać, używając przestrzennego modulatora światła oraz pierwszego lustra dichroicznego do ustawienia NIEDYFRAKCJONEJ wiązki 1064 nanometrów.W tym przykładzie obraz wyrównany dla obu pułapek wskazuje na prawidłowe ustawienie zapewniające wydajne chwytanie, które jednak można jeszcze bardziej dopracować. Występują również niewielkie aberracje związane z okrągłą wiązką 1064 nm padającą na kwadratowe lustro SLM, których nie da się łatwo wyeliminować poprzez korektę ustawienia soczewek. Aby zablokować pułapkę wytwarzaną przez nieaktywną wiązkę z przestrzennego modulatora światła, należy umieścić mały nieprzezroczysty obiekt na drodze nieaktywnego światła w punkcie sprzężonym z płaszczyzną próbki dla tego układu.Nieprzezroczysta metalowa mikrosfera o średnicy od 100 do 300 mikronów zostaje przyklejona do okrągłego szkiełka nakrywkowego lub okna wykonanego z materiału przezroczystego dla podczerwieni. Blok ten jest umieszczany w wspólnej ogniskowej soczewek, która jest sprzężona optycznie z płaszczyzną próbki. Jeśli wiązki pułapki optycznej są wprowadzane do przestrzeni nieskończonej mikroskopu, bloker wiązki może zostać ustawiony tak, aby blokować nieśledzone światło, lub przesunięty, aby umożliwić przejście całego światła.Złożony układ pozwala operatorowi na chwytanie wielu obiektów refrakcyjnych w czasie rzeczywistym i pozycjonowanie ich w trzech wymiarach w polu widzenia. Tutaj możliwości holograficzne instrumentu są zaprezentowane poprzez chwytanie mikrosfer zawieszonych w wodzie dejonizowanej; czerwone i zielone okręgi wskazują pozycje pułapek, przy czym kolor zielony oznacza pułapkę wybraną do zmiany położenia w tym klipie. Odtwarzanie zostaje przyspieszone po schwytaniu obiektu. Położenie jego pułapki jest zmieniane ręcznie.Ostateczny układ składa się z 11 kuleczek tworzących logo University of Utah, gdzie przeprowadzono ten eksperyment. System umożliwia również jednoczesne wykorzystanie pułapek holograficznych i konwencjonalnych. W tym przypadku operator zdefiniował i kontroluje dwa rzędy pułapek holograficznych.Pomiędzy dwoma rzędami zdefiniowano dodatkową pułapkę konwencjonalną. Mikrosfery zawieszone w wodzie dejonizowanej są wiązane przez pułapki. Środkowa kulka zostaje przesunięta o maksymalną wartość przestrzenną 4.1 micrometers, a następnie przy tych samych warunkach przywrócona do pierwotnego położenia.Jednak przy przesunięciu centralnej kulki z prędkością 82 µm/s powstaje następująca sekwencja klatek. Należy zwrócić uwagę na rozmycie ruchu na drugim i trzecim obrazie. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak rozplanować i wyrównać podwójny system pułapek optycznych z niezależną pułapką holograficzną i zwykłą pułapką w jednej konfiguracji.Należy pamiętać, że praca z laserami o wysokiej mocy może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich okularów ochronnych.

construction-high-resolution-microscope-with-conventional-holographic

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Budowa mikroskopu wysokiej rozdzielczości z konwencjonalnymi i holograficznymi możliwościami uwięzienia optycznego

Opisano metodę indywidualnego wyboru, manipulowania i obrazowania żywych patogenów przy użyciu pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem dyskowym (spinning disk). Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad organizmami i pozwala na umieszczenie ich w bezpośrednim sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na rejestrację dynamicznych interakcji międzykomórkowych przy minimalnym zaburzeniu stanu komórek.

Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Prezentujemy kompaktowy cyfrowy system holograficzny (CDHM) do inspekcji i charakteryzacji urządzeń MEMS. Zademonstrowano konstrukcję bez soczewek wykorzystującą rozbieżną falę wejściową zapewniającą naturalne powiększenie geometryczne. Prezentowane są zarówno badania statyczne, jak i dynamiczne.

Kompaktowy cyfrowy mikroskop holograficzny bez soczewek do kontroli i charakteryzacji MEMS

Użycie hipersoczewki zostało uznane za nowatorską technikę obrazowania w superrozdzielczości ze względu na jej zalety w obrazowaniu w czasie rzeczywistym i jej prostą implementację za pomocą konwencjonalnej optyki. W tym miejscu przedstawiamy protokół opisujący wytwarzanie i obrazowanie zastosowań hipersoczewki sferycznej.

Demonstracja mikroskopu zintegrowanego z hipersoczewkami i obrazowania superrozdzielczego

Prezentujemy zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym oraz jej implementację do badania mechaniki komórkowej bez koralików w zarodku Drosophila.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Plazmoniczne nanopręty złota mogą być uwięzione w cieczach i obracane z częstotliwością kHz za pomocą pęsety optycznej o polaryzacji kołowej. Wprowadzenie narzędzi do analizy dynamiki Browna i spektroskopii rozpraszania światła prowadzi do powstania potężnego systemu do badań i zastosowań w wielu dziedzinach nauki.

Budowa i działanie napędzanego światłem układu silnika obrotowego Gold Nanorod

Szczegółowa instrukcja jest opisana, jak zbudować mikroskop HIST (o dużym nachyleniu) i jego zastosowanie do obrazowania pojedynczych molekuł.

Przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Opracowaliśmy dwufotonowy mikroskop holograficzny, który może wizualizować, oceniać i manipulować aktywnością neuronalną przy użyciu wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej, w celu wyjaśnienia patogenezy zaburzeń neuropsychiatrycznych, które są związane z nieprawidłową aktywnością neuronalną.

Ocena i manipulacja aktywnością neuronalną za pomocą dwufotonowej mikroskopii holograficznej

Niniejszy artykuł opisuje metodę eksperymentalną osiągania długotrwałego, stabilnego uwięzienia i precyzyjnego pozycjonowania dużych metalicznych cząstek w powietrzu za pomocą dynamicznej, łódkowatej pułapki fotoforetycznej. System ten umożliwia kontrolowane manipulowanie, które nadaje się do badań interakcji plazmonowych.

Optyczne uwięzienie dużych metalicznych cząstek w powietrzu za pomocą pułapki 'łódka' z bezpośrednio rysowanymi ściankami bocznymi

Poznaj budowę mikroskopu z konwencjonalnym i holograficznym pułapkowaniem optycznym do manipulacji wieloma cząstkami. System umożliwia szybkie pomiary aktywności enzymów biologicznych w trzech wymiarach.

Budowa mikroskopu o wysokiej rozdzielczości z konwencjonalnymi i holograficznymi możliwościami optycznego pułapkowania

Przeglądaj więcej filmów