Budowa mikroskopu o wysokiej rozdzielczości z konwencjonalnymi i holograficznymi możliwościami optycznego pułapkowania
22 kwietnia 2013
System opisany tutaj wykorzystuje tradycyjną pułapkę optyczną, jak również niezależną holograficzną linię pułapek optycznych, zdolną do tworzenia i manipulowania wieloma pułapkami. Pozwala to na tworzenie złożonych układów geometrycznych cząstek załamanych światła, a jednocześnie umożliwia jednoczesne szybkie pomiary aktywności enzymów biologicznych w wysokiej rozdzielczości.
W tej procedurze konwencjonalna i holograficzna linia pułapki optycznej jest montowana i wyrównywana Aby to osiągnąć, najpierw zmierz lokalizacje komponentów optycznych, a następnie bezpiecznie zamontuj komponenty we właściwych miejscach. Następnie wyrównaj optykę, aby umożliwić zalewkowanie. Ostatnim krokiem jest zablokowanie wiązki TED przed lustrem holograficznym
.Ostatecznie gotowy system pozwala na jednoczesne holograficzne i zwykłe pułapkowanie. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak zwykłe pułapkowanie, jest to, że umożliwia ona jednoczesne pozycjonowanie wielu obiektów załamanych w trzech wymiarach i szybkie pomiary manipulacji obiektami. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ projektowanie, układ i wyrównanie mogą być trudne.
Punktem wyjścia tego filmu jest ławka optyczna z mikroskopem umieszczonym w celu stworzenia pułapki optycznej o długości 980 nanometrów. Zacznij od jednej z łatwo dostępnych diod laserowych o tej długości fali. Użyj lasera przechylnego świni z polaryzacją, zachowując światłowód jednomodowy o znanej średnicy pola modowego.
Włókno powinno być wystarczająco długie, aby działało jako filtr modów i powinno być zakończone złączem kanału światłowodowego ze złączem FCPC lub F-C-A-P-C. Ze światłowodem jednomodowym należy obchodzić się ostrożnie, należy unikać skręcania. Zabezpiecz diodę laserową i mocowanie, które pozwala na kontrolę mocy i temperatury.
Uchwyt powinien być bezpośrednio przymocowany do ławki optycznej, aby zmaksymalizować pasywne odprowadzanie ciepła. Następnie zamontuj złącze światłowodowe do układu optycznego zbierającego wiązkę. Upewnij się, że wybrany port światłowodowy odpowiada średnicy pola modowego diody.
Włókno pigtailowe przymocuj adapter zbierający do stołu optycznego w wystarczającej odległości od mikroskopu, aby umożliwić prowadzenie wiązki, rozszerzanie i umieszczanie innych komponentów. Kolory prętów mogą być używane do ustalania odstępów między soczewkami w celu uzyskania solidnego, powtarzalnego pozycjonowania. Wyreguluj port światłowodowy, aby zapewnić stałe marnotrawstwo wiązki na odległościach porównywalnych z całkowitą ścieżką wiązki do mikroskopu.
Na drodze wiązki laserowej DDE znajduje się pięć luster. Począwszy od lasera dde, istnieją dwa lustra, które kierują jego sygnał wyjściowy do obudowy mikroskopu. Wiązka musi również przejść przez zwierciadło dichroiczne, które umożliwia niezmniejszoną transmisję wiązki diody laserowej pod kątem 45 stopni do kąta padania.
Wreszcie dwa dodatkowe zwierciadła diiczne krótkiego przepustu, które przepuszczają światło widzialne, ale odbijają się w bliskiej podczerwieni i powyżej. Poprowadź wiązkę do i z mikroskopu. Przestrzeń nieskończoności znajduje się w obudowie mikroskopu, aby wyregulować lustra, zdjąć obiektyw mikroskopu.
Użyj luster i karty podglądu na podczerwień, aby skierować wiązkę przez otwór w stage montażu obiektywu. Jeśli wiązka jest poza środkiem, wyreguluj lusterka, aby ustalić wyrównanie tak, aby belka znajdowała się na środku. Podczas montażu soczewek system klatek może skutkować sztywnym montażem.
Suwmiarki mogą być używane do wstępnego pomiaru odległości między soczewkami wzdłuż prętów klatki przed instalacją. Tymczasowo zamontuj czerwony wskaźnik laserowy z niestandardowym adapterem w miejscu obiektywu, tak aby jego wiązka znajdowała się wzdłuż osi optycznej mikroskopu. Użyj widocznej wiązki wskaźnika laserowego, aby umieścić i z grubsza wyrównać ekspander wiązki 980 nanometrów.
Ta konfiguracja wykorzystuje obiektywy o ogniskowej 60 milimetrów i 125 milimetrów w układzie keary, aby w przybliżeniu podwoić wiązkę w talii. Następnie zainstaluj soczewki sterujące 980 nanometrów, używając wiązki wskaźnika jako przewodnika tutaj. Każdy obiektyw ma mocowanie o ogniskowej 60 milimetrów, pierwszy obiektyw na ścieżce wiązki na precyzyjnym stoliku X, Y, Z z zakresem ruchu co najmniej pół cala, aby umożliwić sterowanie wiązką.
Drugą soczewkę można teraz ustawić tak, aby tworzyła układ jeden do jednego z pierwszą soczewką. Soczewka ta musi być ustawiona w taki sposób, aby była optycznie sprzężona z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu. Aby przygotować holograficzną pułapkę, zamontuj laser o długości 1064 nanometrów na podwyższonej platformie mniej więcej na wysokości wiązki 980 nanometrów.
Umieść płytkę półfalową i polaryzator zaraz po wyjściu lasera. Aby umożliwić ręczną regulację mocy lasera. Zainstaluj ekspander wiązki dla tego lasera, aby odpady wiązki były rozszerzane tak, aby pasowały do rozmiaru przekątnej lustra holograficznego.
Jeśli jest ograniczona przestrzenią, użyj tutaj obiektywów o małych ogniskowych, 16 milimetrów i 175 milimetrów. Teraz użyj wiązki wskaźnika laserowego, aby ustawić przestrzenny modulator światła lub SLM, który jest częścią używanego komercyjnego pakietu holograficznego. W tym eksperymencie przestrzenny modulator światła musi być ustawiony tak, aby był optycznie sprzężony z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu.
Umieść go tak, aby wiązka wskaźnika laserowego miała minimalny możliwy kąt padania, ale tak, aby jej odbicie bezpiecznie usunęło cały sprzęt na stole optycznym. Umieść kolejne lustro przed ekspanderem wiązki laserowej o długości 1064 nanometrów, aby skierować jego światło na przestrzenny modulator światła. Upewnij się, że światło wskaźnika laserowego uderza w środek otworu ekspandera wiązki.
Na koniec zainstaluj parę soczewek teleskopu między przestrzennym modulatorem światła a zwierciadłem dichroicznym. Obiektywy te mają ogniskowe 125 milimetrów i 200 milimetrów. Usuń wskaźnik laserowy, pozostaw niestandardowe mocowanie adaptera, aby służyło jako otwór do wyrównywania kursu.
Rozpocznij sprawdzanie wyrównania, używając tylko wiązki 980 nanometrów. Użyj przeglądarki kart podczerwieni, aby wyrównać wiązkę 980 nm tak, aby przebiegała wzdłuż środkowej osi przysłony w niestandardowym adapterze. Następnie użyj karty podczerwieni, aby upewnić się, że wiązka o długości 1064 nanometrów uderza w te same miejsca, co wiązka o długości 980 nanometrów wzdłuż ich wspólnej ścieżki wiązki.
Gdy to zrobisz, wymień niestandardowy adapter montażowy wskaźnika laserowego na obiektyw olejowy lub wodny o dużej aperturze numerycznej. Następnie wyrównaj pułapkę 980 nanometrów, przesuwając wiązkę laserową, aż na kamerze pojawi się promieniście symetryczny wzór interferencyjny przy wyłączonym lustrze holograficznym. Wyrównaj pułapkę 1064 nanometrów, używając przestrzennego modulatora światła i pierwszego lustra dichroicznego, aby przejść przez wiązkę UN DEFRATED 1064 nanometrów.
W tym przykładzie wyrównany obraz dla obu zalewek wskazuje na dobre wyrównanie w celu efektywnego zalewkowania, ale można go jeszcze bardziej udoskonalić. Istnieją również drobne aberracje związane z okrągłą wiązką 1064, uderzającą w kwadratowe lustro SLM, których nie można łatwo wyeliminować poprzez dopracowanie wyrównania soczewki. W celu zablokowania pułapki wytwarzanej przez niedostatecznie zadziałającą wiązkę z przestrzennego modulatora światła, należy wstawić mały nieprzezroczysty obiekt na ścieżce niedostatecznie zadziałanego światła w miejscu sprzężonym z płaszczyzną próbki dla tego systemu.
Nieprzezroczysta mikrosfera o średnicy od 100 do 300 mikronów, która jest metalowa, jest przyklejona do przezroczystej okrągłej szklanej pokrywy na podczerwień lub okna. Blok umieszcza się we wspólnym punkcie ogniskowym soczewek, który jest optycznie sprzężony z płaszczyzną próbki. Jeśli optyczne wiązki pułapkowe są wstrzykiwane do przestrzeni nieskończoności mikroskopu, blokadę wiązki można ustawić tak, aby blokować światło nieścigane lub można ją przesunąć, aby przepuścić całe światło.
Zmontowany zestaw pozwala operatorowi na uwięzienie wielu obiektów refrakcyjnych w czasie rzeczywistym i umieszczenie ich we wszystkich trzech wymiarach w polu widzenia. Tutaj holograficzne możliwości instrumentu są pokazane poprzez uwięzienie mikrosfer, zawieszonych w wodzie dejonizowanej, czerwone i zielone kółka pokazują pozycje pułapki, a zielone wskazują pułapkę wybraną do zmiany położenia w tym klipie, odtwarzanie jest przyspieszane po uwięzieniu obiektu. Jego pułapka jest ręcznie przestawiana.
Ostateczna aranżacja składa się z 11 koralików przedstawiających logo Uniwersytetu Utah, na którym przeprowadzono ten eksperyment. System pozwala również na jednoczesne stosowanie zarówno pułapek holograficznych, jak i konwencjonalnych. W tym przypadku dwa rzędy pułapek holograficznych są definiowane i kontrolowane przez operatora.
Między dwoma wierszami zdefiniowana jest dodatkowa konwencjonalna pułapka. Mikrosfery zawieszone w wodzie dejonizowanej są wiązane przez pułapki. Środkowy koralik jest przesuwany do maksymalnego przemieszczenia przestrzennego 4,1 mikrometra, a następnie cofany do pierwotnego położenia w tych samych okolicznościach.
Ale gdy środkowy koralik porusza się z prędkością 82 mikrometrów na sekundę, tworzona jest ta sekwencja ramek. Zwróć uwagę na rozmycie ruchu na drugim i trzecim obrazie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ułożyć i wyrównać system podwójnej pułapki optycznej z niezależną pułapką holograficzną i normalną w tej samej konfiguracji.
Nie zapominaj, że praca z laserami o dużej mocy może być niezwykle niebezpieczna i podejmij środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich okularów ochronnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje system, który integruje konwencjonalne i holograficzne techniki uwięzienia optycznego, umożliwiając manipulację wieloma pułapkami. Ten innowacyjny podejście ułatwia tworzenie złożonych geometrycznych układów cząstek załamujących światło, jednocześnie umożliwiając szybkie, wysokorozdzielcze pomiary aktywności enzymów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Uwięzienie optyczne
- Biofizyka
- Pomiar aktywności enzymów
Tło
- Tradycyjne metody uwięzienia optycznego są ograniczone w ich zdolności do manipulacji wieloma obiektami jednocześnie.
- Holograficzne uwięzienie optyczne oferuje zwiększoną elastyczność w pozycjonowaniu i manipulacji cząstkami.
- Łączenie tych technik może poprawić dokładność i szybkość pomiarów.
- Nowi użytkownicy mogą napotkać wyzwania w projektowaniu i ustawieniu komponentów optycznych.
Cel badania
- Rozwój systemu, który umożliwia jednoczesne konwencjonalne i holograficzne uwięzienie optyczne.
- Umożliwienie manipulacji wieloma obiektami załamującymi światło w trzech wymiarach.
- Ułatwienie szybkich pomiarów aktywności enzymów biologicznych.
Zastosowane metody
- Montaż i ustawienie komponentów uwięzienia optycznego.
- Pomiar położeń dla komponentów optycznych.
- Bezpieczne zamontowanie komponentów w określonych pozycjach.
- Ustawienie optyki, aby umożliwić efektywne uwięzienie.
Główne wyniki
- System z powodzeniem integruje techniki konwencjonalnego i holograficznego uwięzienia.
- Umożliwia jednoczesne pozycjonowanie wielu obiektów załamujących światło.
- Osiągnięto wysokiej prędkości pomiary aktywności enzymów.
- Użytkownicy zgłaszali wyzwania w początkowej konfiguracji, ale rozpoznali zalety systemu.
Konkluzje
- Opracowany system zwiększa możliwości technik uwięzienia optycznego.
- Daje znaczące zalety dla badaczy zajmujących się procesami biologicznymi.
- Dla nowych użytkowników dalsze szkolenie może być konieczne, aby opanować konfigurację.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Optical trapping systems enable precise manipulation of refractive objects for high-resolution force and motion measurements at nanometer and piconewton scales. Integrating conventional and holographic trapping allows simultaneous multi-object positioning and real-time 3D control, supporting mechanistic studies of molecular interactions and cellular mechanics. This capability enhances predictive confidence in target validation by enabling quantitative assessment of binding forces and conformational changes under physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of molecular binding forces and complex formation dynamics.
- Operational Value: Provides functional target validation by measuring piconewton-scale forces generated by molecular motors or enzyme activity in real time.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative force-displacement data that correlates with target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling controlled manipulation of dielectric beads or cellular organelles as force sensors.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through precise positioning and simultaneous readout of trap position relative to object motion.
- Scalability: Supports screening readiness via holographic pattern generation for parallel trapping of multiple objects in the field of view.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by enabling measurement of nanoscale mechanical properties in primary cells or tissue-derived models under near-physiological conditions.
- Mechanistic De-risking: Connects discovery observations to preclinical validation through force-production readouts that inform target modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying how perturbations affect mechanical output in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The system fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative biophysical readouts that inform target prioritization and mechanism elucidation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct measurement of intermolecular forces and conformational changes in protein complexes.
- Screening: Delivers assay readiness through high-speed, high-resolution position tracking of trapped objects, facilitating reliable compound evaluation via force-based readouts.
- Analytics: Generates nanometer-scale displacement and piconewton-force measurements that allow teams to compare conditions and assess target modulation efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling mechanical phenotyping in disease-relevant cellular systems, supporting biomarker alignment for mechanotransduction pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multi-parametric analysis across projects, reducing redundant setup and enabling cross-team standardization of force measurement protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct, label-free measurement of mechanical outputs that reduce ambiguity in target mechanism interpretation.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability via holographic trapping patterns and simultaneous multi-object control, improving throughput in force measurement campaigns.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early de-risking of targets through quantitative force data, reducing late-stage failure due to unanticipated mechanical liabilities.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by delivering objective, quantitative data on target engagement strength and conformational dynamics across candidate molecules.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and beam path optimization for dual-wavelength trapping systems.
- Depends on stable optical bench infrastructure, precision translation stages, and infrared-compatible components for 980 nm and 1064 nm laser integration.
- Necessitates cross-team standardization of trapping protocols, calibration procedures, and data analysis pipelines for force and displacement readouts.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-based assays to primary cells or tissue explants due to varying refractive indices and sample viability constraints.
- Limited by alignment complexity and potential aberrations from mismatched beam profiles, particularly when holographic patterns interact with spatial light modulator geometry.
