Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Ten artykuł przedstawia kompletną metodologię przygotowania i konserwacji in vitro ostrych wycinków hipokampa od dorosłych myszy. Protokół ten pozwala na rejestrowanie bardzo stabilnego, długotrwałego wzmocnienia (LTP) przez ponad 8 godzin ze wskaźnikiem sukcesu 95%.

Ogólnym celem tej procedury jest możliwość zarejestrowania bardzo stabilnego i powtarzalnego długoterminowego nasilenia w ostrych wycinkach hipokampa. Osiąga się to poprzez najpierw ekstrakcję mózgu myszy i wypreparowanie hipokampa w zimnym płynie mózgowo-rdzeniowym A pod mikroskopem. Drugim krokiem jest przecięcie poprzecznych plastrów hipokampa za pomocą rozdrabniacza do tkanek.

Następnie wycinek umieszcza się w komorze rejestrującej interfejs, która zostanie perfuzjonowana natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Ostatnim krokiem jest umieszczenie elektrod i zarejestrowanie aktywności synaptycznej w jednym regionie CA hipokampa. Ostatecznie stosuje się protokół stymulacji o wysokiej częstotliwości, aby wykazać indukcję bardzo stabilnego, długotrwałego wzmocnienia.

Dzięki tej metodzie można uzyskać wgląd w mechanizm leżący u podstaw plastyczności synaptycznej. Może być również stosowany do innych układów, takich jak modele zwierzęce układu neurodegeneracyjnego lub nerwowego, lub do chorób immunologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą walczyć, ponieważ wszystkie manipulacje wymagają dużych umiejętności i dużej praktyki.

Rozpocznij tę procedurę od przepłukania obwodu perfuzji wodą destylowaną przez co najmniej 20 minut. Następnie włącz systemy grzewcze. Uruchom bulgotanie karbogenu w obwodzie.

Karbogen jest dostarczany do łaźni wodnej pod komorą zapisu przez dyfuzory powietrza. Następnie kontroluj natężenie przepływu w łaźni wodnej za pomocą przepływomierza Następnie opróżnij obwód i napełnij go przefiltrowanym kranem A CSF, aby usunąć pęcherzyki. Następnie umieść pierścień, który będzie podtrzymywał plasterek w komorze trzymania.

Ostrożnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z obwodu. Następnie wyreguluj poziom A CSF w komorze rejestracyjnej za pomocą igły ssącej, prędkość pompy wlotowej jest regulowana na jeden mililitr na minutę, a pompa wylotowa jest regulowana na pięć mililitrów na minutę. Przed sekcją przygotuj wszystkie narzędzia chirurgiczne.

Aby usunąć mózg myszy złożonej w ofierze. Przytrzymaj jego głowę palcem wskazującym i kciukiem i wykonaj nacięcie nożyczkami preparacyjnymi wzdłuż środka czubka głowy, zaczynając od krawędzi gilotyny, przeciąć i biegnąć do kości czołowej. Następnie przetnij mięsień skórny po obu stronach głowy, aby w pełni odsłonić płytki czaszki.

Następnie usuń mięśnie po rozpieszczonej stronie głowy. Następnie przetnij mięsień skroniowy z każdej strony wzdłuż płytki skroniowej. Następnie przetnij przednie płyty pośrodku poprzecznie.

Teraz wykonaj małe nacięcie na kości potylicznej między dwiema płytkami. Wyciąć u podstawy rozdętej płytki potylicznej z każdej strony. Następnie nożyczkami sprężynowymi przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego.

Na koniec usuń czaszkę, odsuwając połówki od siebie za pomocą kleszczy. Teraz skalpelem przeciąć tuż przed móżdżkiem i tuż za opuszką węchową, a następnie poprzecznie przenieść wyekstrahowany mózg do naczynia preparacyjnego z zimnym płynem mózgowo-rdzeniowym A. Gdy mózg pojawi się w naczyniu preparacyjnym, odetnij dwie półkule od siebie za pomocą skalpela włożonego pośrodku pod dwuocznym mikroskopem chirurgicznym, ostrożnie rozłóż strukturę jednej półkuli, aby odsłonić boczną komorę.

Usuń pień mózgu i cefalon, umieszczając jedną szpatułkę na korze czołowej, a drugą szpatułkę na głowie. Uważaj, aby nie dotknąć hipokampa szpatułką i nie rozciągać go podczas cięcia tkanek. Następnie odetnij fornix.

Następnie delikatnie wypchnij hipokamp z kory, wkładając szpatułkę do komory. Po ekstrakcji hipokampa usuń nadmiar tkanki korowej i pozostałe naczynia krwionośne za pomocą plastikowej pipety do pastwiska z szeroką ustą. Przenieś hipokamp w łyżce powierzchnią alvi do góry na platformę helikoptera.

Usuń nadmiar płynu z łyżki za pomocą standardowej plastikowej pipety pastwiskowej. Następnie przechyl łyżkę pionowo do góry i prawie dotykając bibuły filtracyjnej na rozdrabniaczu. Upuść hipokamp, szybko dotykając bibuły filtracyjnej.

Następnie wyjmij łyżkę. Następnie zorientuj hipokamp i pokrój go w plasterki. Poprzecznie do 400 mikronów za pomocą rozdrabniacza.

Wykonaj procedurę tak szybko, jak to możliwe. Następnie usuń bibułę filtracyjną z plastrami hipokampa i owiń ją wokół metalowego cylindra, aby trochę rozprowadzić plastry. Następnie uwolnij plastry za pomocą sprayów CSF A za pomocą standardowej plastikowej pipety pasterskiej i zbierz je na szalce Petriego wypełnionej zimnym płynem.

Płyn CSF. Przenieś wybrany plasterek do komory rejestracyjnej za pomocą standardowej plastikowej pipety obok pipety. Pozwól, aby plasterek zregenerował się po urazie rozwarstwienia w komorze interfejsu nagrywania w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Jeśli plasterek opadnie, obniż poziom CSF A do poziomu wycinka, a następnie ponownie podnieś poziom CSF A, aby wycinek unosił się na wodzie. Następnie ustaw plasterek w pozycji, która ułatwi ustawienie elektrod w jednym regionie CA. Przestań obniżać poziom A CSF, gdy znajduje się na interfejsie.

Menisk pożywki wokół wycinka wskazuje na wystarczający poziom płynu mózgowo-rdzeniowego. Siatka musi być nasycona mediami, ale nie może być całkowicie zanurzona. Następnie utrzymuj komorę przykrytą bibułami filtracyjnymi na perforowanej pokrywie.

Pozostaw plasterek na co najmniej godzinę i 30 minut w temperaturze 28 stopni Celsjusza przed nagraniem. Oto szkic, który pokazuje dwa niezależne wejścia synaptyczne jako jedno i S dwa do tej samej populacji neuronów. S jeden szlak został wykorzystany do indukcji LTP, podczas gdy drugi szlak S działał jako kontrola.

Są to ślady próbki F-E-P-S-P zarejestrowane tuż przed indukcją LTP, jak wskazują czerwone ślady i jedna godzinę po indukcji LDP, oznaczone niebieskimi ścieżkami. Oto F EPSP z idealnie zdrowego plasterka, a oto F EPSP z plasterka prezentującego wysoki poziom pobudliwości, gdy plastry nie są idealnie zdrowe. Obserwuje się wielosynaptyczne odpowiedzi i zmniejsza się nasilenie nachylenia F-E-P-S-P.

Poniżej znajduje się porównanie przebiegów czasowych nachylenia F-E-P-S-P po LTP indukowanego pojedynczym ciągiem stymulacji wysokiej częstotliwości zarejestrowanym w latach 2005, 2010 i 2011 w naszym laboratorium. Pierwsze eksperymenty zostały zarejestrowane w 2005 roku, na co wskazują wypełnione okręgi. Kolejne nagrania oznaczone wypełnionymi kwadratami skorzystały z ulepszonej procedury preparacji.

Obecne wyniki wynikają z optymalizacji natleniania granicy faz i kontroli temperatury, wraz ze standaryzacją elektrod, na co wskazują otwarte okręgi. Pokazujemy tutaj, że zwiększenie natężenia przepływu tlenu w łaźni wodnej pod komorą rejestracyjną z 0,15 do 0,25 litra na minutę, jak wskazuje niebieska krzywa, powoduje zmniejszenie nachylenia F-E-P-S-P o 20%, zwiększając temperaturę z 28 do 29 stopni Celsjusza. Jak wskazano, zielona krzywa powoduje ponad 50% wzrost nachylenia F-E-P-S-P.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że każdy krok jest kluczowy, a błędy w protokole mogą prowadzić do różnych wyników. Po obejrzeniu tego filmu będziesz miał dobre zrozumienie, jak uzyskać bardzo stabilne długoterminowe wzmocnienie. Nagrywanie w ostrych wycinkach hipokampa.