Name: Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę przygotowania wycinków hipokampa myszy do stabilnego zapisu długotrwałego wzmocnienia synaptycznego przez ponad 8 godzin. Protokół zapewnia 95% powtarzalność w badaniach elektrofizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bernardowi Foucartowi za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Belgijski Fundusz Badań Naukowych (F.R.S.-FNRS) oraz przez Fundusz Badań Medycznych Królowej Elżbiety. Agnès Villers jest pracownikiem naukowym w Belgijskim Funduszu Badań Naukowych.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystywania zwierząt w badaniach oraz za zgodą lokalnej komisji etyki.
1. Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego
Te same media są używane do preparowania, krojenia i perfuzji plastrów (1 ml/min) podczas okresu spoczynku i zapisów elektrofizjologicznych. Pożywka ta składa się ze 124 mM NaCl, 4,4 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2, 1,3 mMMgSO4 i 10 mM D-glukozy.
<ol>
	<li>Zważyć poszczególne składniki dla 2 l ACSF, z wyjątkiem MgSO4, który jest już w roztworze (1 M). Stosowanie roztworu wzorcowego pozwala mieć pewność co do dokładnego stężeniaMg2+, ponieważMgSO4 w proszku jest wysoce higroskopijny. Stosunek Ca2 + Mg2 + ma duży wpływ na indukcję i utrzymanie LTP 14 i dlatego zawsze należy przestrzegać ich proporcji.</li>
	<li>Umieścić wszystkie składniki z wyjątkiem CaCl2 w szklanym cylindrze z podziałką i doprowadzić do 2 l destylowanymH2O.</li>
	<li>Energicznie wymieszać. Gdy wszystko się rozpuści, dodaj karbogen przez bełkotkę akwariową i rurkę dołączoną do zbiornika (95% O2, 5% CO2 ). Odczekaj kilka minut i dodaj chlorek wapnia, gdy pH zostanie ustalone na poziomie 7,4 przez działanie buforu wodorowęglanowego.</li>
	<li>Przechowywać 600 ml w prostokątnym szklanym naczyniu w lodówce i schłodzić do 4 °C lodem wokół naczynia. Pożywka ta zostanie wykorzystana do rozwarstwienia hipokampa.</li>
	<li>Przefiltrować pozostałe 1 400 ml i przechowywać w kolbie Erlenmeyera.</li>
</ol>
2. Przygotowanie stanowiska elektrofizjologicznego i komory zapisu wycinków mózgu
Obwód perfuzyjny składa się z 2 pomp perystaltycznych, z których jedna pompuje świeży płyn ze zbiornika rezerwowego, a druga pompuje zużyty płyn z komory zapisu do pojemnika. Świeży płyn jest dodawany do domowego systemu perfuzyjnego, gdzie jest ponownie natleniany i podgrzewany przed dotarciem grawitacyjnie do komory rejestrującej interfejs (rysunek 1A). Komora zapisu interfejsu została zaprojektowana przez FST (Fine Science Tools, Vancouver, Kanada, rysunek 1B). Plastry tkanek są umieszczane na tkanym filtrze siatkowym przymocowanym do zdejmowanego pierścienia studziennego i mogą być stale utrzymywane w warunkach interfejsu poprzez regulację wysokości igły studni ssącej. Domowa rurka z tworzywa sztucznego zablokowana na końcu i perforowana bocznie (0,5 mm) jest przymocowana do igły ssącej w celu zwiększenia stabilności poziomu w komorze. Głowica nagrywająca jest zamontowana nad łaźnią wodną zawierającą kamień dyspersyjny gazu, który pomaga utrzymać wilgotne środowisko poprzez przepuszczanie wilgotnego powietrza przez otwory odchylające w głowicy nagrywającej (w celu zmniejszenia tworzenia się kropel wody). Temperatura kąpieli i medium jest kontrolowana poprzez ciągłą zmianę poziomu prądu stałego przez element grzejny osadzony w gumie silikonowej w łaźni wodnej. Termistory w łaźni wodnej i studniach rejestrujących pozwalają na ustawienie temperatury w komorze i precyzyjne monitorowanie w tych miejscach.
System ogrzewania komory jest uzupełniany przez globalny system grzewczy kontrolujący temperaturę całego stanowiska. Oprogramowanie opracowane przez naukowców z Uniwersytetu w Edynburgu (<a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a>) monitoruje i wyrównuje temperaturę natlenionego powietrza, wycinka mózgu, elektrod i pozostałego sprzętu, zapewniając stabilne środowisko dla długotrwałych zapisów (ryc. 1C). Temperatura stosowana do plastrów hipokampa myszy wynosi 28 °C.
<ol>
	<li>Przepłukać cały obwód perfuzyjny destylowanymH2Oprzez co najmniej 20 minut i uruchomić systemy grzewcze.</li>
	<li>Uruchom bulgotanie karbogenu w obwodzie. Karbogen dociera do domowych rurek perfusingowych przez świece filtracyjne oraz do łaźni wodnej pod komorą nagraniową. Natężenie przepływu w łaźni wodnej jest kontrolowane przez przepływomierz. Jeśli szybkość przepływu jest zbyt niska, tkanka może stać się niedotleniona. I odwrotnie, jeśli natężenie przepływu jest zbyt wysokie, gaz może nie być wystarczająco podgrzany i nawilżony, co prowadzi do wysuszenia tkanki. Wysokie natężenie przepływu gazu może również zwiększyć ryzyko rozpryskiwania się wody na tkankę z kąpieli wodnej poniżej, prowadząc do wstrząsu osmotycznego. Można temu zapobiec, dodając kawałki siatki nylonowej (100 μm) na wylocie z otworów odchylających.</li>
	<li>Opróżnij obwód i napełnij przefiltrowanym ACSF.</li>
	<li>Umieść pierścień, który będzie podtrzymywał plasterek w komorze do przechowywania. Tkany filtr siatkowy z otworami siatkowymi o wielkości od 500 do 750 μm jest rozciągany i mocowany do pierścienia za pomocą dwuskładnikowego kleju epoksydowego z żywicy. Filtr siatkowy wykonany jest w 87% z poliamidu i 13% elastanu (majtki 15 den). Klej należy nakładać ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się reliefów na powierzchni pierścienia.</li>
	<li>Ostrożnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z obwodu.</li>
	<li>Wyreguluj poziom ACSF w komorze nagrywającej za pomocą igły ssącej. Prędkość obrotowa pomp perystaltycznych jest dostosowana do 1 ml/min dla pompy wlotowej i do 5 ml/min dla pompy wylotowej.</li>
</ol>
System perfuzyjny jest umieszczony na sztywnym, odpornym na wibracje stole i otoczony klatką Faradaya.
3. Przygotowanie obszaru sekcji
Narzędzia chirurgiczne: skalpel z ostrzem #11, małe standardowe nożyczki do preparacji, nożyczki sprężynowe, zakrzywione kleszcze, dwie szpatułki Heidemanna i łyżka.
Materiał dodatkowy: gilotyna, podkładka, rozdrabniacz do tkanek McIlwaina z żyletką, bibuła filtracyjna, szklana pipeta Pasteura z gumowym smoczkiem, 2 plastikowe pipety Pasteura, w tym jedna z szerokim otworem, szalka Petriego, metalowy cylinder o średnicy 7 mm (Rysunek 2A).
<ol>
	<li>W naczyniu preparacyjnym wypełnionym zimnym ACSF (przygotowanym w kroku 1) zanurz schłodzoną szklaną pokrywkę z naczynia do barwienia, owiniętą w bibułę filtracyjną. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza i natlenić ACSF przez bełkotkę akwariową (Rysunek 2A).</li>
	<li>Rozłóż instrumenty w kolejności użycia. Dodać trzy warstwy bibuły filtracyjnej na płytkę rozdrabniacza tkanek i nową żyletkę oczyszczoną wodą destylowaną i eterem (Rysunek 2B). Żyletka musi być ustawiona poziomo, gdy dotyka papieru. Siła ostrza jest regulowana do połowy wartości maksymalnej, a prędkość do około jednej trzeciej wartości maksymalnej.</li>
	<li>Uważnie sprawdź, czy wszystko jest gotowe (instrumenty, temperatura...), ponieważ później nie będziesz miał czasu.</li>
	<li>Poproś kogoś, aby spryskał sekcję pipetą Pasteura wypełnioną zimnym ACSF.</li>
	<li>Znieczulić mysz Nembutalem IP (100 mg/kg) przed dekapitacją. Można również zastosować znieczulenie halotanowe. Porównaliśmy obie metody i uzyskaliśmy te same wyniki. Dekapitacja musi być wykonana w znieczuleniu, ale można również zastosować zwichnięcie szyjki macicy. Jednak zwichnięcie szyjki macicy wymaga bardzo dobrej praktyki, aby uniknąć cierpienia zwierząt.</li>
	<li>Wypreparuj na podkładce tak szybko, jak to możliwe, pod zimnym ciągłym prysznicem ACSF.</li>
</ol>
4. Usunięcie mózgu
<ol>
	<li>Trzymając głowę nieruchomo palcem wskazującym i kciukiem jednej ręki na pysku, wykonaj nacięcie nożyczkami preparacyjnymi wzdłuż środka czubka głowy, zaczynając od krawędzi cięcia gilotynowego i biegnąc rostralnie do kości czołowej.</li>
	<li>Przetnij mięsień skórny po każdej stronie głowy, aby całkowicie odsłonić płytki czaszki i usunąć mięśnie po ogonowej stronie głowy.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych przetnij mięsień skroniowy z każdej strony, wzdłuż płytki skroniowej, a następnie przetnij przednie płytki pośrodku, poprzecznie. Następnie wykonaj małe nacięcie na kości potylicznej, między dwiema płytkami.</li>
	<li>Z każdej strony przeciąć u podstawy ogonowej płytek potylicznych.</li>
	<li>Przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego nożyczkami sprężynowymi.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń połówki czaszki, odsuwając je od siebie.</li>
	<li>Za pomocą skalpela przeciąć poprzecznie tuż za opuszką węchową i tuż przed móżdżkiem, a następnie zanurzyć wyekstrahowany mózg w naczyniu sekcyjnym z zimnym ACSF.</li>
</ol>
5. Rozwarstwienie hipokampa
<ol>
	<li>Gdy mózg zostanie zanurzony w naczyniu preparacyjnym, odetnij dwie półkule od siebie za pomocą skalpela włożonego pośrodku.</li>
	<li>Fragment hipokampa wykonuje się za pomocą szpatułek pod kontrolą wzrokową za pomocą dwuokularowego mikroskopu operacyjnego (X25, ryc. 2A). Na jednej półkuli ostrożnie rozłóż struktury, aby zobaczyć komorę boczną. Usuń pień mózgu i międzymózgowie. Odbywa się to poprzez nałożenie szpatułek na korę czołową z jednej strony i na międzymózgowie z drugiej strony. Uważaj, aby nie dotykać hipokampa szpatułkami i nie rozciągać go podczas cięcia tkanek.</li>
	<li>Odetnij sklepienie, a następnie delikatnie wypchnij hipokamp z kory (odtocz), wkładając szpatułkę do komory.</li>
	<li>Po ekstrakcji hipokampa usuń nadmiar tkanki kory i pozostałe naczynia krwionośne.</li>
</ol>
6. Krojenie plastrów
<ol>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety Pasteura z szeroką końcówką przenieś hipokamp w łyżce powierzchnią pęcherzyka do góry (strona wypukła).</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu za pomocą standardowej plastikowej pipety Pasteura.</li>
	<li>Przechyl łyżkę pionowo w górę, prawie dotykając bibuły filtracyjnej rozdrabniacza (Rysunek 2B) i upuść hipokamp z łyżki, szybko dotykając bibuły filtracyjnej, a następnie cofnij łyżkę.</li>
	<li>Ustaw hipokamp i pokrój go poprzecznie do 400 μm za pomocą rozdrabniacza (patrz rysunek 2C, aby zapoznać się z orientacją hipokampa względem żyletki). Działaj tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Usuń bibułę filtracyjną z pokrojonym hipokampem i owiń ją wokół metalowego cylindra, aby trochę rozprowadzić plastry. Następnie uwolnij plastry za pomocą sprayu ACSF za pomocą standardowej plastikowej pipety Pasteura i zbierz je na szalce Petriego wypełnionej zimnym ACSF.</li>
</ol>
7. Inkubacja plasterków w interfejsie
<ol>
	<li>Za pomocą standardowej plastikowej pipety Pasteura należy wybrać plastry i szybko umieścić je w komorze rejestracyjnej. Plastry pozyskują się po urazie preparacyjnym bezpośrednio w komorze rejestracyjnej, na granicy faz w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Plasterek najprawdopodobniej zatonie. Obniż poziom płynu, aby osiągnąć poziom plastru, a następnie podnieś go, aby unosił się na wodzie.</li>
	<li>Obróć plasterek we właściwej pozycji, jednocześnie obniżając poziom. Plastry są zawsze zorientowane w ten sam sposób, aby ułatwić ustawienie elektrod (2 elektrod stymulujących i jednej rejestrującej) w obszarze CA1.</li>
	<li>Zatrzymaj się, gdy płyn znajdzie się w interfejsie. "Menisk" pożywki wokół wycinka wskazuje na wystarczający poziom pożywki. Filtr siatkowy musi być nasycony mediami, ale nie może być całkowicie zanurzony.</li>
	<li>Utrzymuj komorę przykrytą bibułą filtracyjną umieszczoną na perforowanej pokrywie.</li>
	<li>Odstaw plasterek na co najmniej 1,5 godziny w temperaturze 28 °C.</li>
</ol>
8. Rejestracja odpowiedzi synaptycznych
<ol>
	<li>Elektroda rejestrująca: szklane kapilary są ciągnięte w celu uzyskania rezystancji końcówki 2-5 MΩ po napełnieniu ACSF. Wokół końcówki elektrody umieszcza się mały kawałek bibuły filtracyjnej, a na końcu nakłada się wosk kostny, aby zmniejszyć kondensację. Elektrody stymulujące: platynowo-irydowe bipolarne elektrody klastrowe o średnicy 12,5 μm kupowane są w FHC (USA). Przy odpowiedniej pielęgnacji każda elektroda może być użyta co najmniej 30 razy (rysunek 1B).</li>
	<li>Umieść elektrody w warstwie promieniowej obszaru CA1, wszystkie elektrody ustawione w jednej linii (rysunek 3A). Elektrody są opuszczane na głębokość od 75 do 150 μm pod powierzchnię plastra za pomocą mikromanipulatorów Narishige. Dwie elektrody stymulujące są umieszczone w celu stymulacji dwóch odrębnych wiązek zabezpieczeń Schaffera. Gdy elektrody są opuszczane na plasterek, bibuły filtracyjne są ostrożnie umieszczane dookoła, aby zamknąć komorę.</li>
	<li>Stymulacja dwufazowa (czas trwania impulsu 0,08 ms na półfalę) jest wykonywana przy stałym napięciu za pomocą stymulatora trawy podłączonego do jednostek izolacyjnych SIU-V. Maksymalna odpowiedź jest sprawdzana poprzez zwiększenie intensywności bodźca z 2 V do maksimum 12 V. Pola EPSP są wzmacniane 1000 razy za pomocą wzmacniacza WPI ISO-80 i filtrowane przy 10 Hz i 10 kHz. Sygnał jest następnie przesyłany do komputera za pośrednictwem przetwornika A/D National Instrument. Stymulacja, akwizycja i analiza danych odbywa się za pomocą programu WinLTP (<a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a>). Pola EPSP są rejestrowane przy 40% maksymalnej amplitudy uzyskanej na krzywej wejścia-wyjścia. Dla każdego wycinka nachylenia fEPSP są normalizowane względem średniego nachylenia w ciągu 30 minut poprzedzających indukcję LTP.</li>
	<li>LTP jest wyzwalane przez zastosowanie pojedynczego ciągu stymulacji (100 Hz) o sile testu na jednej ścieżce, podczas gdy druga ścieżka służy jako kontrola.</li>
</ol>
9. Czyszczenie konfiguracji
<ol>
	<li>Przepłukać cały obwód 3% roztworem nadtlenku wodoru (H2O2) przez co najmniej 10 minut, a następnie odcedzić. Obwód zostanie dokładnie przepłukany wodą destylowaną przed rozpoczęciem jakiegokolwiek eksperymentu. StosowanieH2O2nie jest absolutnie wymagane, ponieważ inne laboratoria używają tylko wody destylowanej do czyszczenia, ale zauważyliśmy osadzanie się ciemnych pozostałości w systemie rurek przy użyciu samej wody.</li>
	<li>Wlej wodę do łaźni wodnej pod komorą nagrywania.</li>
	<li>Kąpać końcówki elektrod stymulujących w alkoholu przez 5 min.</li>
</ol>

<ol><li>Bliss, T. V., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anaesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J. Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).</li>
<li>Douglas, R. M., Goddard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+of+the+perforant+path-granule+cell+synapse+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation of the perforant path-granule cell synapse in the rat hippocampus.</a> Brain Res. 86, 205-215 (1975).</li>
<li>Squire, L., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSquire%2C+L+%22Memory%3A+From+mind+to+molecules%22">Memory: From mind to molecules</a>. , WH Freeman & Company. New York, New York, USA. (1999).</li>
<li>Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+a+critical+period+of+transcription+for+induction+of+a+late+phase+of+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP.</a> Science. 265 (5175), 1104-1107 (1994).</li>
<li>Frey, U., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and long-term potentiation.</a> Nature. 385 (6616), 533-536 (1038).</li>
<li>Bortolotto, Z. A., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+protein+kinase+C+in+a+form+of+metaplasticity+that+regulates+the+induction+of+long-term+potentiation+at+CA1+synapses+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for protein kinase C in a form of metaplasticity that regulates the induction of long-term potentiation at CA1 synapses of the adult rat hippocampus.</a> Eur. J. Neurosci. 12 (11), 4055-4062 (2000).</li>
<li>Migues, P. V., Hardt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKMzeta+maintains+memories+by+regulating+GluR2-dependent+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKMzeta maintains memories by regulating GluR2-dependent AMPA receptor trafficking.</a> Nat. Neurosci. 13 (5), 630-634 (2010).</li>
<li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. -C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54 (3), 447-460 (2007).</li>
<li>Vickers, C. A., Dickson, K. S., Wyllie, D. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+maintenance+of+late-phase+long-term+potentiation+in+isolated+dendrites+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Induction and maintenance of late-phase long-term potentiation in isolated dendrites of rat hippocampal CA1 pyramidal neurones.</a> J. Physiol. 568 (3), 803-813 (2005).</li>
<li>Fonseca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+actin+dynamics+are+required+for+the+maintenance+of+long-term+plasticity+and+for+synaptic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent actin dynamics are required for the maintenance of long-term plasticity and for synaptic capture.</a> Eur. J. Neurosci. 35 (2), 195-206 (2012).</li>
<li>Redondo, R. L., Okuno, H., Spooner, P. A., Frenguelli, B. G., Bito, H., Morris, R. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+capture%3A+differential+role+of+distinct+calcium%2Fcalmodulin+kinases+in+protein+synthesis-dependent+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation.</a> J. Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).</li>
<li>Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis-dependent+long-term+functional+plasticity%3A+methods+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 15 (5), 607-613 (2005).</li>
<li>Connor, S. A., Wang, Y. T., Nguyen, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+beta-adrenergic+receptors+facilitates+heterosynaptic+translation-dependent+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of beta-adrenergic receptors facilitates heterosynaptic translation-dependent long-term potentiation.</a> J. Physiol. 589 (17), 4321-4340 (2011).</li>
<li>Villers, A., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+LTP+requires+neither+repeated+trains+for+its+induction+nor+protein+synthesis+for+its+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting LTP requires neither repeated trains for its induction nor protein synthesis for its development.</a> PLoS One. 7 (7), e40823(2012).</li>
<li>Capron, B., Sindic, C., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+characteristics+of+LTP+induced+in+hippocampal+slices+are+dependent+on+slice-recovery+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">The characteristics of LTP induced in hippocampal slices are dependent on slice-recovery conditions.</a> Learn. Mem. 13 (3), 271-277 (2006).</li>
<li>Villers, A., Godaux, E., Ris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+phase+of+L-LTP+elicited+in+isolated+CA1+dendrites+cannot+be+transferred+by+synaptic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Late phase of L-LTP elicited in isolated CA1 dendrites cannot be transferred by synaptic capture.</a> Neuroreport. 21, 210-215 (2010).</li>
<li>Nguyen, P. V., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+theta-burst+stimulation+induces+a+transcription-dependent+late+phase+of+LTP+requiring+cAMP+in+area+CA1+of+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Brief theta-burst stimulation induces a transcription-dependent late phase of LTP requiring cAMP in area CA1 of the mouse hippocampus.</a> Learn. Mem. 4 (2), 230-243 (1997).</li>
<li>Dewachter, I., Ris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+plasticity+and+Tau+phosphorylation+by+wild-type+and+mutant+presenilin1%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic plasticity and Tau phosphorylation by wild-type and mutant presenilin1.</a> Neurobiol. Aging. 29 (5), 639-652 (2008).</li>
<li>Dewachter, I., Filipkowski, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+NMDA-receptor+function+and+down-stream+signaling+in+APP%5BV717I%5D+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Deregulation of NMDA-receptor function and down-stream signaling in APP[V717I] transgenic mice.</a> Neurobiol. Aging. 30 (2), 241-256 (2009).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Hippocampal+Slices+from+Rats+and+Transgenic+Mice+for+the+Study+of+Synaptic+Alterations+during+Aging+and+Amyloid+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), e2330(2011).</li>
<li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J. Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).</li>
<li>Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warmer+preparation+of+hippocampal+slices+prevents+synapse+proliferation+that+might+obscure+LTP-related+structural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity.</a> Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).</li>
<li>Alger, B. E., Dhanjal, S. S., Dingledine, R., Garthwaite, J., Henderson, G., King, G. L., et al. Appendix: Brain slice methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlger%2C+BE+%22Brain+Slices%22">Brain Slices</a>. Dingledine, R. , Plenum. New York. 381-437 (1984).</li>
<li>Watson, P. L., Weiner, J. L., Carlen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+variations+in+hippocampal+slice+preparation+protocol+on+the+electrophysiological+stability%2C+epileptogenicity+and+graded+hypoxia+responses+of+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of variations in hippocampal slice preparation protocol on the electrophysiological stability, epileptogenicity and graded hypoxia responses of CA1 neurons.</a> Brain Res. 775, 134-143 (1997).</li>
<li>Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisomycin%2C+an+inhibitor+of+protein+synthesis%2C+blocks+late+phases+of+LTP+phenomena+in+the+hippocampal+CA1+region+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Anisomycin, an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro.</a> Brain Res. 452 (1-2), 57-65 (1988).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialogue+between+genes+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Fonseca, R., Nägerl, U. V., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+determines+the+protein+synthesis+dependence+of+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity determines the protein synthesis dependence of long-term potentiation.</a> Nat. Neurosci. 9 (4), 478-480 (2006).</li>
<li>Rudy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+baby+in+the+bathwater%3F+Maybe%3A+some+methodological+issues+for+the+de+novo+protein+synthesis+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Is there a baby in the bathwater? Maybe: some methodological issues for the de novo protein synthesis hypothesis.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 89 (3), 219-224 (2008).</li>
<li>Sharma, A. V., Nargang, F. E., Dickson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosilence%3A+Profound+Suppression+of+Neural+Activity+following+Intracerebral+Administration+of+the+Protein+Synthesis+Inhibitor+Anisomycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurosilence: Profound Suppression of Neural Activity following Intracerebral Administration of the Protein Synthesis Inhibitor Anisomycin.</a> J. Neurosci. 32 (7), 2377-2387 (2012).</li>
<li>Volianskis, A., Jensen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+sustained+types+of+long-term+potentiation+in+the+CA1+area+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transient and sustained types of long-term potentiation in the CA1 area of the rat hippocampus.</a> J. Physiol. 550 (2), 459-492 (2003).</li>
<li>Ris, L., Villers, A., Godaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+capture-mediated+long-lasting+long-term+potentiation+is+strongly+dependent+on+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Synaptic capture-mediated long-lasting long-term potentiation is strongly dependent on mRNA translation.</a> Neuroreport. 20 (17), 1572-1576 (2009).</li>
<li>Abbas, A. -K., Dozmorov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+LTP+without+triggered+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Persistent LTP without triggered protein synthesis.</a> Neurosci. Res. 63 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Ho, O. H., Delgado, J. Y., O'Dell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+proteins+involved+in+activity-dependent+forms+of+synaptic+plasticity+is+altered+in+hippocampal+slices+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of proteins involved in activity-dependent forms of synaptic plasticity is altered in hippocampal slices maintained in vitro.</a> J. Neurochem. 91, 1344-1357 (2004).</li>
<li>Whittingham, T. S., Lust, W. D., Christakis, D. A., Passonneau, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stability+of+hippocampal+slice+preparations+during+prolonged+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Metabolic stability of hippocampal slice preparations during prolonged incubation.</a> J. Neurochem. 43, 689-696 (1984).</li>
<li>Dunlop, D. S., van Elden, W., Lajtha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+protein+synthesis+in+incubated+slices+of+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for protein synthesis in incubated slices of rat brain.</a> Brain Res. 99, 303-318 (1975).</li>
<li>Taubenfeld, S. M., Stevens, K. A., Pollonini, G., Ruggiero, J., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+molecular+changes+following+hippocampal+slice+preparation%3A+loss+of+AMPA+receptor+subunits+and+uncoupled+mRNA%2Fprotein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Profound molecular changes following hippocampal slice preparation: loss of AMPA receptor subunits and uncoupled mRNA/protein expression.</a> J. Neurochem. 81 (6), 1348-1360 (2002).</li>
<li>Gruart, A., Munoz, M. D., Delgado-Garcia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+CA3-CA1+synapse+in+the+acquisition+of+associative+learning+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice.</a> J. Neurosci. 26 (4), 1077-1087 (2006).</li>
<li>Whitlock, J. R., Heynen, A. J., Shuler, M. G., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+induces+long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Learning induces long-term potentiation in the hippocampus.</a> Science. 313, 1093-1097 (2006).</li>
<li>Grant, S. G. N., Silva, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+learning%5BTitle%5D)+AND+%22TINS%22%5BJournal%5D)">Targeting learning.</a> TINS. 17 (2), 71-75 (1994).</li>
<li>Izquierdo, I., Medina, J. H., Vianna, M. R. M., Izquierdo, L. A., Barros, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+mechanisms+for+short-+and+long-term+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Separate mechanisms for short- and long-term memory.</a> Behav. Brain Res. 103, 1-11 (1999).</li>
<li>Morice, E., Andreae, L. C., Cooke, S. F., Vanes, L., Fisher, E. M. C., Tybulewicz, V. L. J., Bliss, T. V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+long-term+memory+and+synaptic+plasticity+despite+short-term+impairments+in+the+Tc1+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Preservation of long-term memory and synaptic plasticity despite short-term impairments in the Tc1 mouse model of Down syndrome.</a> Learn Mem. 15 (7), 492-500 (2008).</li>
<li>Dunlop, D. S., van Elden, W., Plucinska, I., Lajtha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+Slice+Protein+Degradation+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Brain Slice Protein Degradation and Development.</a> J. Neurochem. 36, 258-265 (1981).</li>
<li>Izquierdo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+the+mechanisms+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and the mechanisms of memory.</a> Drug Dev. Res. 30, 1-17 (1993).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opracowaliśmy w naszym laboratorium protokół będący wynikiem połączenia metod opracowanych i stosowanych przez inne laboratoria posiadające duże doświadczenie w zapisach LTP 11,17. Protokół ten jest dostosowany do hipokampa dorosłej myszy i może być stosowany u zwierząt w każdym wieku i o dowolnym genotypie. Umożliwia również analizę LTP u myszy transgenicznych, u których rozwijają się choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera 18,19.
Wykorzystanie tego pro...

Obecnie nie ma zbyt wiele wiedzy na temat tego, jak złożone wspomnienia są przechowywane i przywoływane na poziomie obwodu neuronalnego. Jednak jednocząca hipoteza przechowywania pamięci jest dostępna i szeroko akceptowana: wspomnienia są przechowywane jako zmiany w sile połączeń synaptycznych między neuronami w ośrodkowym układzie nerwowym. Same badania nad plastycznością synaptyczną w dużej mierze skorzystały z dwóch przełomowych odkryć. (1) W eksperymentalnym eksperymencie Bliss i Lomo 1, używając nienaruszonego znieczulonego królika, odkryli, że dostarczenie krótkiej stymulacji o wysokiej częstotliwości (1 sekunda, 100 Hz) do ścieżki perforacji hipokampa spowodowało długotrwały (kilka godzin) wzrost powiązanych połączeń synaptycznych. To fascynujące zjawisko zostało nazwane "Długoterminowym Wzmocnieniem" lub LTP przez Douglasa i Goddarda w 1975 roku. (2) Później odkryto, że podobne zjawisko może być wywołane w wycinkach mózgu (0,4 mm) sztucznie utrzymywanych przy życiu in vitro. Najszerzej badany LTP obserwowano in vitro poprzez dostarczenie jednego lub kilku tężców do wiązki aksonów (tzw. pobocznych Schaffera) przy jednoczesnym rejestrowaniu powstałego w ten sposób pobudzającego potencjału synaptycznego pola wywołanego w neuronach piramidowych tzw. regionu CA1. Mechanizmy indukcji LTP zostały w dużej mierze ujawnione. Zasadniczo, napływ Ca2 + przez receptory NMDA aktywuje enzymy z dwiema konsekwencjami: fosforylacją receptorów AMPA (co zwiększa ich wydajność) i włączeniem dodatkowych receptorów AMPA do błony postsynaptycznej 3. W przeciwieństwie do tego, mechanizmy fazy podtrzymującej LTP są w dużej mierze nieznane, zwłaszcza dlatego, że eksperymentalnie znacznie trudniej jest utrzymać plasterek w dobrym stanie przez wiele godzin niż przez 30 do 60 minut.
Wiele badań poświęcono zrozumieniu mechanizmów LTP i na przestrzeni lat 4-11 opracowano interesujące teorie. Jednak do tej pory dokładne mechanizmy molekularne leżące u podstaw stabilnego wzrostu siły synaptycznej nie zostały wyjaśnione. Może to częściowo wynikać z trudności w odtworzeniu poprzednich wyników w różnych laboratoriach przy użyciu różnych technik przygotowania i konserwacji wycinków hipokampa. W swoim artykule metodologicznym Sajikumar i wsp. 12 podkreśliło znaczenie warunków doświadczalnych dla przygotowania wycinków hipokampa szczura i rejestrowania stabilnego LTP. W tym filmie przedstawiamy wszystkie kroki optymalizacyjne opracowane w naszym laboratorium na przestrzeni lat, aby móc rejestrować bardzo stabilny LTP w mysich wycinkach hipokampa.
Ta optymalizacja została wykonana z protokołów opracowanych i z powodzeniem stosowanych przez inne laboratoria, które badają mechanizmy LTP u myszy 13 i szczurów 11. Pozwala doświadczonym badaczom na wywołanie i zarejestrowanie bardzo długotrwałego LTP u dorosłych myszy z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Fizjologiczne podstawy indukowanego LTP zostały dokładnie sprawdzone i wykazane 14. W tym artykule metodologicznym pokazujemy, że wszelkie modyfikacje warunków eksperymentalnych, takie jak temperatura lub natlenienie, mogą mieć głęboki wpływ na utrzymanie LTP, podczas gdy procedura preparacji może głęboko modyfikować pobudliwość plastrów. Trzeba również podkreślić, że precyzyjna kontrola wszystkich tych parametrów wymaga kilkumiesięcznego szkolenia dla początkujących studentów.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 </td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 1M</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>63126</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide (Belgia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>WPI, Inc. (Wielka Brytania)</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody stymulujące</td><td>FHC (USA)</td><td>CE2B30</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>FST (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna 84 g/m2</td><td>Sartorius</td><td>FT-3-105-110</td><td></td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Lycra</td><td>15 den</td><td></td></tr><tr><td>Klej</td><td>UHU</td><td>plus endfest300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrument</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>WPI, Inc. (UK)</td><td>ISO-80</td><td></td></tr><tr><td>Interfejs komory rejestracyjnej</td><td>FST (Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompy perystaltyczne</td><td>Gilson (USA)</td><td>Regulator temperatury Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Uniwersytet w Edynburgu</td><td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Rozdrabniacz tkanek</td><td>Mcllwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stymulatory</td><td>Grass (USA)</td><td>S88X + SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>Analiza programu</td><td>WinLTP</td><td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Narishige</td><td>MM-3 i MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Przetwornik analogowo-cyfrowy Leica Microsystem</td><td></td><td></td></tr> National <tr><td></td><td>Instruments</td><td>NIPCI-6229 Seria</td><td></td> M</tr></tbody></table>

ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Długoterminowe wzmocnienie (LTP) to rodzaj plastyczności synaptycznej charakteryzujący się wzrostem siły synaptycznej i uważany za zaangażowany w kodowanie pamięci. LTP wywołany w regionie CA1 ostrych wycinków hipokampa został szeroko przebadany. Jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw fazy utrzymania tego zjawiska są nadal słabo poznane. Może to częściowo wynikać z różnych warunków eksperymentalnych stosowanych przez różne laboratoria. Rzeczywiście, faza utrzymania LTP jest silnie zależna od parametrów zewnętrznych, takich jak natlenienie, temperatura i wilgotność. Jest to również zależne od parametrów wewnętrznych, takich jak orientacja płaszczyzny krojenia i żywotność plastra po rozbiorze.
Optymalizacja wszystkich tych parametrów umożliwia indukcję bardzo powtarzalnego i bardzo stabilnego długoterminowego wzmocnienia. Metodologia ta daje możliwość dalszego badania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w stabilny wzrost siły synaptycznej w wycinkach hipokampa. Podkreślono również znaczenie warunków eksperymentalnych w badaniach in vitro zjawisk neurofizjologicznych.

Niniejszą metodologię wykorzystano do analizy właściwości długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (LTP) indukowanego w ostrych skrawkach hipokampa dorosłych myszy C57Bl/6J (JANVIER SAS, Francja) 14. Co zaskakujące, udoskonalenie warunków eksperymentalnych doprowadziło do nowego spojrzenia na LTP. Wykazaliśmy, że długotrwały wzrost siły synaptycznej nie wymaga syntezy nowych białek.
W niniejszej pracy wykazujemy, że indukcja LTP zależy od żywotności i pobudliwości skrawków. Gdy prepa...

Ten artykuł przedstawia kompletną metodologię przygotowania i konserwacji in vitro ostrych wycinków hipokampa od dorosłych myszy. Protokół ten pozwala na rejestrowanie bardzo stabilnego, długotrwałego wzmocnienia (LTP) przez ponad 8 godzin ze wskaźnikiem sukcesu 95%.

Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie rejestracji bardzo stabilnego i reprodukowalnego długotrwałego wzmocnienia synaptycznego (LTP) w ostrych skrawkach hipokampa. Osiąga się to poprzez najpierw wyjęcie mózgu myszy i wypreparowanie hipokampa w zimnym A CSF pod mikroskopem. Drugim krokiem jest wykonanie poprzecznych skrawków hipokampa za pomocą choppera do tkanek.Następnie skrawek umieszcza się w komorze rejestrującej na styku faz, która będzie perfundowana natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Ostatnim krokiem jest umieszczenie elektrod i rejestracja aktywności synaptycznej w obszarze CA1 hipokampa. W końcowej fazie stosuje się protokół stymulacji o wysokiej częstotliwości, aby wykazać indukcję bardzo stabilnego długotrwałego wzmocnienia synaptycznego.Zastosowanie tej metody może dostarczyć wglądu w mechanizmy leżące u podstaw plastyczności synaptycznej. Można ją również zastosować w innych systemach, takich jak modele zwierzęce chorób neurodegeneracyjnych lub schorzeń układu nerwowego, a także w przypadku chorób immunologicznych. Co do zasady, osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ wszystkie manipulacje wymagają dużej wprawy i znacznej praktyki.Rozpocznij tę procedurę od płukania obwodu perfuzyjnego wodą destylowaną przez co najmniej 20 minut. Następnie włącz systemy grzewcze. Uruchom napowietrzanie obwodu mieszaniną carbogen.Karbogen jest dostarczany do łaźni wodnej pod komorą rejestracyjną poprzez dyfuzory powietrza. Następnie, za pomocą przepływomierza, należy kontrolować szybkość przepływu w łaźni wodnej. Potem należy opróżnić układ i napełnić go filtrowanym A CSF, stukując go, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie należy umieścić pierścień, który będzie podtrzymywał skrawek w komorze mocującej.Ostrożnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z układu. Następnie wyreguluj poziom A CSF w komorze rejestracyjnej za pomocą śruby igły ssącej; prędkość pompy wlotowej należy ustawić na 1 ml/min, a pompy wylotowej na 5 ml/min. Przed przystąpieniem do sekcji przygotuj wszystkie instrumenty chirurgiczne.Aby usunąć mózg uśpistej myszy, należy przytrzymać jej głowę palcem wskazującym i kciukiem, a następnie wykonać nacięcie nożyczkami preparacyjnymi wzdłuż środka górnej części głowy, zaczynając od krawędzi gilotyny i przecinając tkankę aż do kości czołowej. Następnie należy przeciąć mięśnie skórne po obu stronach głowy, aby w pełni odsłonić płytki czaszki.Następnie usuń mięśnie z boku głowy od strony karku. Po tym przetnij mięsień skroniowy z każdej strony wzdłuż płytki skroniowej. Następnie przetnij płytki czołowe w poprzek, w ich środkowej części.Następnie wykonaj niewielkie nacięcie na kości potylicznej pomiędzy obiema płytkami. Przetnij podstawę płytek potylicznych po każdej stronie. Następnie, używając nożyczek sprężynowych, przetnij wzdłuż szwu strzałkowego.Na koniec usunąć czaszkę, rozsuwając obie połowy za pomocą pęsety. Następnie skalpelem wykonać cięcia poprzeczne tuż przed móżdżkiem i tuż za opuszkiem węchowym, a następnie przenieść wyizolowany mózg do naczynia sekcyjnego z zimnym A CSF. Po umieszczeniu mózgu w naczyniu sekcyjnym, rozdzielić obie półkule za pomocą skalpela włożonego pośrodku pod binokularowym mikroskopem chirurgicznym, a następnie ostrożnie rozsunąć strukturę jednej półkuli, aby odsłonić komorę boczną.Usuń pień mózgu i głowę, umieszczając jedną szpatułkę na korze czołowej, a drugą na głowie. Należy uważać, aby nie dotknąć szpatułką hipokampa i nie rozciągać go podczas sekcjonowania tkanki. Następnie przetnij forging.Następnie delikatnie wypchnij hipokamp z kory, wprowadzając szpatułkę do komory. Po wyjęciu hipokampa usuń nadmiar tkanki korowej i pozostałe naczynia krwionośne za pomocą plastikowej pipety pastoralnej z szerokim wlotem. Przenieś hipokamp łyżeczką, powierzchnią alvi skierowaną do góry, na platformę krojarki (choppera).Usuń nadmiar płynu z łyżeczki za pomocą standardowej plastikowej pipety Pasteura. Następnie przechyl łyżeczkę pionowo w górę, tak aby niemal dotykała papieru filtracyjnego na rozdrabniaczu. Przenieś hipokamp, szybko dotykając papieru filtracyjnego.Następnie wyjmij łyżeczkę. Potem ustaw hipokamp i potnij go. Przetnij go w poprzek na plastry o grubości 400 mikronów za pomocą choppera.Przeprowadź procedurę tak szybko, jak to możliwe. Następnie wyjmij papier filtracyjny z plastrami hipokampa i owiń go wokół metalowego cylindra, aby nieco rozsunąć plastry. Następnie uwolnij plastry, rozpylając A CSF za pomocą standardowej plastikowej pipety pastoralnej, i zbierz je do szalki Petriego wypełnionej zimnym roztworem.Do płynu CSF. Przenieś wybrany skrawek do komory rejestracyjnej za pomocą standardnej plastikowej pipety pasterskiej. Pozostaw skrawek w komorze interfejsu rejestracyjnego w temperaturze 28°C, aby odzyskał sprawność po urazie powstałym podczas dysekcji.Jeśli plasterek opadnie poniżej poziomu A CSF, należy ponownie podnieść poziom A CSF, aby plasterek wypłynął. Następnie należy zorientować plasterek w pozycji, która ułatwi rozmieszczenie elektrod w regionie CA1. Zaprzestań obniżania poziomu A CSF, gdy osiągnie on powierzchnię styku.Menisk medium wokół skrawka świadczy o odpowiednim poziomie A CSF. Siatka musi być nasycona medium, ale nie może być całkowicie zanurzona. Następnie należy pozostawić komorę przykrytą papierami filtrującymi umieszczonymi na perforowanej pokrywie.Przed rejestracją należy pozostawić skrawek do odpoczynku przez co najmniej 1 godzinę i 30 minut w temperaturze 28°C. Poniższy schemat przedstawia dwa niezależne wejścia synaptyczne, S1 i S2, prowadzące do tej samej populacji neuronów. Ścieżka S1 została wykorzystana do indukcji LTP, natomiast ścieżka S2 służyła jako kontrola.Są to przykładowe zapisy fEPSP zarejestrowane tuż przed indukcją LTP, oznaczone czerwonymi liniami, oraz jedną godzinę po indukcji LTP, oznaczone niebieskimi liniami. Tutaj przedstawiono fEPSP z całkowicie zdrowego skrawka, a tutaj fEPSP ze skrawka wykazującego wysoki poziom pobudliwości, co zdarza się, gdy skrawki nie są w pełni zdrowe. Obserwowane są odpowiedzi polisynaptyczne, a potencjacja nachylenia fEPSP jest zredukowana.Poniżej przedstawiono porównanie przebiegów czasowych nachylenia F-E-P-S-P po LTP wywołanym pojedynczą serią stymulacji o wysokiej częstotliwości, zarejestrowanych w 2005, 2010 i 2011 roku w naszym laboratorium. Pierwsze eksperymenty, zarejestrowane w 2005 roku, są oznaczone wypełnionymi okręgami. Kolejne pomiary, oznaczone wypełnionymi kwadratami, przeprowadzono z wykorzystaniem ulepszonej procedury sekcji.Obecne wyniki wynikają z optymalizacji natlenienia interfejsu i kontroli temperatury, wraz ze standaryzacją elektrod, co zaznaczono pustymi kółkami. Przedstawiamy tutaj, że zwiększenie szybkości przepływu tlenu w kąpieli wodnej pod komorą rejestracyjną z 0,15 do 0,25 litrów na minutę, co wskazuje krzywa niebieska, powoduje spadek nachylenia F-E-P-S-P o 20% przy jednoczesnym zwiększeniu temperatury z 28 do 29 stopni Celsjusza. Jak wskazano, krzywa zielona powoduje wzrost nachylenia F-E-P-S-P o ponad 50%.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że każdy krok jest kluczowy, a błędy w protokole mogą prowadzić do odmiennych wyników. Po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli dobrą wiedzę na temat tego, jak uzyskać bardzo stabilne długotrwałe wzmocnienie synaptyczne. Rejestracja w ostrych skrawkach hipokampa.

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Poprawiona Preparacja i Zachowanie Krowich Plamek Hipokampu dla Bardzo Stabilnego i Możliwego do Odtworzenia Rejestrowania Długotrwałej Potencjacji

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

Prezentowany protokół opisuje transport i przygotowanie wyciętej ludzkiej tkanki hipokampa, której ostatecznym celem jest wykorzystanie ważnych wycinków mózgu jako narzędzia do oceny przedklinicznej potencjalnych substancji przeciwpadaczkowych.

Przygotowanie ostrych wycinków ludzkiego hipokampa do zapisów elektrofizjologicznych

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Poznaj metodę przygotowania wycinków hipokampa myszy do stabilnego zapisu długotrwałego wzmocnienia synaptycznego przez ponad 8 godzin. Protokół zapewnia 95% powtarzalność w badaniach elektrofizjologicznych.

Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Przeglądaj więcej filmów