Name: Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Poznaj mikroskopię przyżytowzą mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia wizualizację interakcji komórek macierzystych z endotelem w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cały protokół po izolacji komórek trwa około 2 godzin.
1. Przygotowanie mikrochirurgiczne
<ol>
	<li>Przeprowadzić izolację komórek macierzystych ze szpiku kostnego dawcy i znakowanie fluorescencyjne izolowanej subpopulacji zgodnie ze znormalizowanymi protokołami9,12 Pozwól komórkom odpocząć w czasie wykonywania operacji na zwierzęciu. Do znakowania fluorescencyjnego polecamy CFDA (ester sukcynimidylowy dioctanu karboksyfluoresceiny).</li>
	<li>Znieczulić samca myszy o wadze 20-25 g ketaminą (75 mg/kg) i ksylazyną (2,5 mg/kg). Przez cały czas trwania zabiegów chirurgicznych i protokołów eksperymentalnych znieczulenie powinno być utrzymywane przez suplementy (10% początkowego wstrzyknięcia, i.p.) w razie potrzeby (zwykle co 30-60 minut).</li>
	<li>Delikatnie ogol przednią część prawej moszny, a także prawe udo i pachwiny. Zbierz wszystkie wypadające włosy za pomocą zwilżonego bawełnianego wacika. Umieść mysz brzuszną stroną do góry na scenie z pleksiglasu i przymocuj stopy za pomocą elastycznej zasłony. Stolik jest wykonany na zamówienie, składa się z płyty podstawy i drugiej płyty na ogonowej krawędzi płyty podstawy do uniesienia obu nóg i moszny. Umieść stolik na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Po utrwaleniu na stoliku umieść zwierzę pod mikroskopem operacyjnym i wykonaj następujące czynności operacyjne przy użyciu 10- do 16-krotnego powiększenia.</li>
	<li>Wykonaj początkowe nacięcie za pomocą nożyczek do skóry na prawym udzie, tuż przed naczyniami udowymi od kolana do pachwiny.</li>
	<li>Zidentyfikuj tętnicę udową i podążaj za nią proksymalnie, mobilizując tętnicę z otaczających tkanek miękkich. Zidentyfikuj i odetnij dużą gałąź do lewego jądra za pomocą termokoagulacji. Następnie założyć szew podtrzymujący powierzchownie na lewym jądrze. Delikatna trakcja ułatwi dalszą proksymalną mobilizację tętnicy udowej.</li>
	<li>Po zakończeniu mobilizacji proksymalnej zidentyfikuj i odetnij dużą gałąź biegnącą przyśrodkowo przy udzie za pomocą termokoagulacji. Następnie podwiązać tętnicę udową w dystalnej części prawego uda. Delikatna przyczepność na ligaturze pomoże w dalszym przygotowaniu.</li>
	<li>Zwróć teraz ponownie uwagę na bliższą tętnicę udową i umieść szew wokół tętnicy tak proksymalnie, jak to możliwe. Przygotuj węzeł, ale jeszcze go nie wiąż. Zastosuj delikatną trakcję do szwu i stwórz załamanie tętnicy.</li>
	<li>Po ustaleniu załamania ostrożnie naciąć tętnicę za pomocą mikronożyczek. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić żyły udowej.</li>
	<li>Wprowadzić przygotowany mikrocewnik (średnica wewnętrzna 0,28 mm) przez nacięcie. Przed włożeniem cewnika należy odwietrzyć (0,9% chlorku sodu, NaCl) i podłączyć do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Po pomyślnym wprowadzeniu cewnika ostrożnie poluzuj załamanie, aby ułatwić przejście cewnika. Przepływ krwi tętniczej powinien być natychmiast widoczny w cewniku. Delikatnie przesuń cewnik o kilka milimetrów poza poprzednie zagięcie. Następnie zwiąż przygotowaną ligaturę w celu zamocowania cewnika.</li>
	<li>Delikatnie przepłucz cewnik (0,9% NaCl) i odessać, aby potwierdzić prawidłowe położenie. Użyj kawałka taśmy, aby dodatkowo przymocować cewnik do etapu operacji.</li>
	<li>Po odpowiednim ustabilizowaniu należy odłożyć cewnik na bok na kolejne etapy przygotowania mięśnia cremaster. Stosuj regularne płukanie i aspirację cewnika co 5-10 minut, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów.</li>
	<li>Zwróć teraz uwagę na prawą mosznę i wykonaj nacięcie, przecinając skórę i powięź powyżej brzusznej części prawej moszny. Uważaj, aby nie dotykać leżącej pod spodem tkanki żadnymi narzędziami.</li>
	<li>Przedłuż nacięcie aż do fałdu pachwinowego i doogonowo do dystalnego końca moszny.</li>
	<li>Ostrożnie oddziel leżącą pod spodem tkankę miękką i łączną nad workiem cremaster, nie dotykając jej. Zidentyfikuj dystalny koniec cremastera i umieść tutaj szew podtrzymujący, aby nieznacznie rozciągnąć mięsień. Wytnij teraz pozostałą tkankę miękką pod workiem mięśniowym, delikatnie pociągając mięsień doogonowo i do przodu.</li>
	<li>Po całkowitym oddzieleniu od tkanki łącznej otwórz worek cremaster w jednym punkcie na krawędzi czaszki za pomocą nożyczek. Przedłuż nacięcie od tego otworu w dół do dystalnego końca mięśnia.</li>
	<li>Uszczelnij małe naczynie łączące jądro i cremaster za pomocą termokoagulacji, a następnie przetnij pozostałe połączenia między mięśniem a jądrem za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Odłóż jądro na bok, poza pole mikroskopii.</li>
	<li>Otwarty cremaster leży teraz płasko na scenie. Umieść cztery szwy 6-0 Prolene Stay na krawędziach tkanki i przymocuj je elastyczną serwetą, aby rozprowadzić tkankę mięśniową cremaster. Od tej pory należy stale nawilżać tkankę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (ryc. 1).</li>
	<li>Odstaw teraz preparat na odpoczynek przez 15 minut. Następnie wstrzyknąć 0,05-0,1 ml 1% rodaminy-dekstranu przez lewą tętnicę udową w celu kontrastowego wzmocnienia mikrokrążenia. Jeśli planowane jest zastosowanie jakichkolwiek chemokin lub środków zapalnych, należy teraz miejscowo zwilżyć mięsień odpowiednim odczynnikiem za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. W przypadku eksperymentu kontrolnego kontynuuj nawilżanie PBS.</li>
</ol>
2. Mikroskopia przyżyciowa
<ol>
	<li>Trzymaj mysz nieruchomo na stoliku operacyjnym i poruszaj się pod mikroskopem fluorescencyjnym zmodyfikowanym do epi-oświetlenia i podłączonym do kamery wideo CCD (urządzenie sprzężone z ładunkiem). Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zwichnąć cewnika do tętnicy udowej.</li>
	<li>Przeprowadzaj eksperymenty z użyciem obiektywu do zanurzenia w wodzie.</li>
	<li>Po dostosowaniu obiektywu w celu odpowiedniej wizualizacji mikrokrążenia cremaster, a przed wstrzyknięciem komórek, stochastycznie zdefiniuj sześć żyłek zakapilarowych w celu późniejszej analizy mocnego przylegania komórek macierzystych.</li>
	<li>Podawać znakowane fluorescencyjnie komórki macierzyste, rozpuszczone w 200 μl PBS, w dawce 0,4 x 106 komórek na wstrzyknięcie, w sumie pięć kolejnych wstrzyknięć z wykorzystaniem cewnika do tętnicy udowej i strzykawki o pojemności 1 ml. Ostrożnie wstrząsnąć próbką komórek przed pierwszym wstrzyknięciem.</li>
	<li>Rejestruj zwijanie się komórek macierzystych natychmiast po wstrzyknięciu komórki, definiując w ten sposób "toczenie" jako ponad 50% zmniejszenie prędkości komórek wzdłuż wyściółki śródbłonka w połączeniu z typowymi ruchami komórkowymi typu "przyklej i uwolnij". Wykonaj liczenie toczących się komórek macierzystych i wszystkich komórek macierzystych przechodzących przez określoną odległość komorową w ciągu 1 minuty obserwacji po każdym wstrzyknięciu. Ilość zwijających się komórek macierzystych jest wyrażona jako procent wszystkich przechodzących komórek. Nie należy liczyć komórek wykazujących losowe, krótkie zjawiska wiązania jako komórek toczących się.</li>
	<li>Po ostatnim wstrzyknięciu komórki należy określić liczbę mocno przylegających komórek macierzystych przez liczenie i wyrazić ilość w stosunku do obliczonej powierzchni śródbłonka sześciu wstępnie zdefiniowanych żyłek (średnica x długość x π ) jako przylegające komórki/mm2 . Mocna adhezja jest brana pod uwagę, gdy przez 30 sekund nie jest wykrywany żaden ruch komórek.</li>
	<li>Po zakończeniu mikroskopii przyżyciowej ostrożnie usuń mięsień cremaster i przechowuj go w korespondencji do późniejszej analizy (immunohistochemia lub biologia molekularna). Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy. Analiza zapisów z mikroskopii przyżyciowej w celu ilościowego określenia rolowania komórek macierzystych i twardej adhezji śródbłonka, a także hemodynamiki mikronaczyniowej, takiej jak prędkość krwinek czerwonych (mm/s), długość naczynia (μm), średnica naczynia (μm), wskaźnik udziału ścian (sec-1); powinny być wykonywane w trybie offline przez badacza nieznanego z odpowiedniego eksperymentalnego leczenia tkankowego przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li>
<li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+stem+cells+find+their+way+home%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">How do stem cells find their way home?</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li>
<li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Endosc%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874(2011).</li>
<li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha%2FCXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit%2B+bone+marrow+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB-1+induces+c-kit%2B+cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li>
<li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe%3F+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li>
<li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133%28%2B%29+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li>
</ol>

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach, przeprowadzone na potrzeby tego manuskryptu, zostały zatwierdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.
	Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna pozwala na bezpośrednią wizualizację i analizę ilościową oddziaływań komórka-śródbłonek. Model mięśni cremaster jest szczególnie przydatny, ponieważ ekspozycja mikrochirurgiczna i techniki wizualizacji przyżyciowej zostały dobrze ugruntowane podczas badań nad interakcjami leukocyty-śródbłonek, a różne składniki chemiczne mogą być selektywnie stosowane do tkanki docelowej za pomocą prostej techniki superfuzji. Ze względu na brak artefaktów ruchowych i silne zakłócenia obrazu, ten k...

Celem niniejszego artykułu jest opisanie techniki mikroskopii przyżyciowej (IVM) zastosowanej na mysim mikrokrążeniu cremaster do bezpośredniej obserwacji i analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.
Obecna koncepcja regeneracji tkanek i narządów opartych na komórkach macierzystych polega na kierowaniu komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego do uszkodzonej tkanki1. Kluczowym krokiem do udanej migracji komórek macierzystych jest interakcja komórek macierzystych z miejscowym śródbłonkiem w uszkodzonym narządzie, a następnie migracja przezśródbłonkowa i ostatecznie wszczepienie narządu2. Analiza przyżyciowa tych interakcji komórka macierzysta - komórki śródbłonka stanowi idealny parametr do ilościowego określenia odpowiedzi regeneracyjnej opartej na komórkach macierzystych w różnych warunkach patofizjologicznych in vivo. Co więcej, wydaje się możliwe, że w przyszłości analiza śródżyciowa zdolności migracyjnych określonych populacji komórek macierzystych w standaryzowanych środowiskach mikrokrążenia może zostać zastosowana przed przejściem tych populacji do dalszych badań klinicznych.
Mikroskopia przyżyciowe została początkowo opracowana do obserwacji i ilościowego oznaczania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka in vivo w dziedzinie badań nad stanami zapalnymi3. Pierwsze udane zapisy badań mikroskopowych przyżyciowych zostały odnotowane przez Cohnheima już w XIX wieku, badając języki i krezki żab pod mikroskopem świetlnym4. Od czasu pierwszego zastosowania IVM przeszedł ogromny rozwój techniczny i obecnie pewne niezbędne komponenty stanowią warunki wstępne do wykonywania ilościowego IVM: (i) preparaty tkankowe, które umożliwiają dostęp optyczny, (ii) sondy molekularne, które mogą być wykryte przez mikroskop, (iii) mikroskop podłączony do systemu detekcji oraz (iv) komputerowe systemy analizy, które mogą wyodrębnić interesujące parametry z zestawu danych obrazu4.
Do badań IVM wprowadzono różnorodne preparaty tkankowe, w tym krezki i wątrobę myszy i szczura5, grzbietowe komory fałdów skórnych myszy 6 i chomika, ucho królika i woreczek policzkowy chomika, by wymienić tylko kilka.
Jednak w dalszej części skupimy się na mięśniu cremaster myszy, stanowiącym idealną tkankę do obserwacji przyżyciowych, ponieważ przygotowanie i wizualizacja są możliwe dzięki dobrze ustandaryzowanej procedurze chirurgicznej i generalnie nie występują problemy z artefaktami ruchu. Otwarte przygotowanie mięśni cremaster zostało przeprowadzone po raz pierwszy w latach siedemdziesiątych XX wieku przez Baeza i współpracowników 7. Pierwotnie opisany dla szczurów, został z powodzeniem zaadoptowany również u myszy8. Po tym, jak poprzednie badania koncentrowały się głównie na interakcjach leukocytów ze ścianą naczynia, nasza własna grupa wprowadziła niedawno preparat mięśniowy cremaster myszy jako cenne narzędzie do bezpośredniej wizualizacji i analizy ilościowej interakcji komórka macierzysta-śródbłonek w określonym mikrośrodowisku9. Za pomocą tego modelu badano różne subpopulacje komórek macierzystych, w tym mysie komórki macierzyste szpiku kostnego c-kit + i mezenchymalne komórki macierzyste, a także ludzkie komórki macierzyste szpiku kostnego CD 133 + 10-12. Po wyizolowaniu komórek ze szpiku kostnego dawcy i znakowaniu fluorescencyjnym w celu wizualizacji, komórki macierzyste są selektywnie wprowadzane do mikrokrążenia cremaster za pomocą iniekcji tętniczej przez tętnicę udową, unikając w ten sposób uwięzienia komórek w odległych narządach. Co więcej, model mięśniowy cremaster jest szczególnie użyteczny, ponieważ różne chemokiny potencjalnie pośredniczące w lokalnej migracji komórek macierzystych w odpowiednich ustawieniach, mogą być miejscowo stosowane do tkanki docelowej za pomocą prostej techniki superfuzji.

<table><tbody><tr><td>Dioctan karboksy-fluoresceiny sukcynimidyloester (CFDA)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 6 G (1%)</td><td>Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy</td><td>83697</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Ketanest)</td><td>Pfizer, Berlin, Niemcy</td><td>niedostępne</td><td></td></tr><tr><td>Xylacin (Rompun)</td><td>Bayer, Leverkusen, Niemcy</td><td>niedostępne</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate - buforowana sól fizjologiczna (PBS)</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Niemcy</td><td>P04-36500</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

W erze wewnątrznaczyniowych protokołów aplikacji komórek w kontekście regeneracyjnej terapii komórkowej, mechanizmy leżące u podstaw migracji komórek macierzystych do tkanek nieszpikowych nie zostały całkowicie wyjaśnione. Opisano tutaj technikę mikroskopii przyżyciowej zastosowaną do mysiego mikrokrążenia cremaster do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego in vivo. Mikroskopia przyżyciowa M. cremaster została wcześniej wprowadzona w dziedzinie badań zapalnych do bezpośredniej obserwacji interakcji leukocytów ze śródbłonkiem naczyniowym. Ponieważ wystarczająca migracja obwodowych komórek macierzystych i progenitorowych obejmuje podobne początkowe etapy zwijania się i mocnego przylegania do wyściółki śródbłonka, możliwe jest zastosowanie modelu M. cremaster do obserwacji i kwantyfikacji interakcji komórek macierzystych podawanych donaczyniowo ze śródbłonkiem. Ponieważ różne składniki chemiczne mogą być selektywnie nakładane na tkankę docelową za pomocą prostych technik superfuzji, możliwe jest ustalenie niezbędnych warunków mikrośrodowiskowych, aby początkowa rekrutacja komórek macierzystych mogła zajść w żywym organizmie poza szpikiem kostnym.

Zasadniczo interakcja bezpośrednio wstrzykniętych komórek macierzystych lub progenitorowych z śródbłonkiem naczyniowym w mikrokrążeniu mięśnia kremastra jest zdarzeniem rzadkim i występuje wyłącznie w żyłkach postkapilarnych (średnica: 30-80 μm). Dzięki znakowaniu fluorescencyjnemu toczące się i silnie przylegające komórki macierzyste mogą być wyraźnie ilościowo określone w odróżnieniu od krążących endogennych leukocytów w obserwowanych żyłkach (Rysunek 2).
Warunki mikrokrażow...

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja oddziaływań między komórkami macierzystymi a komórkami śródbłonka in vivo. Jest to realizowane poprzez wprowadzenie cewnika do tętnicy udowej u znieczulonego zwierzęcia w celu uzyskania dostępu do tętnicy. W drugim kroku mięsień chromatyczny jest przygotowany chirurgicznie do intravitalnej mikroskopii fluorescencyjnej.Następnie pożądaną populację komórek macierzystych wstrzykuje się za pomocą cewnika tętnicy udowej. W efekcie możliwe jest zwizualizowanie i ilościowe określenie oddziaływań między adoptywnie przeniesionymi komórkami macierzystymi a śródbłonkiem mikrokrążenia głównych mięśni. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak: w jaki sposób regulowana jest migracja terapeutycznie zastosowanych komórek macierzystych wewnątrz żywego organizmu?Przed rozpoczęciem mikrosurgerycznym przygotować cewnik połączony z strzykawką o pojemności 1 ml z 0.9% chlorkiem sodu. Następnie delikatnie ogolić przednią część prawego mosznika, a także prawe udo i pachwinę znieczulonej samca myszy o masie od 20 do 25 mg. Zebrać wszystkie luźne włosy za pomocą zwilżonego patyczka bawełnianego, a następnie umieścić mysz w pozycji brzusznej na pleksiglasowej, specjalnie wykonanej platformie obserwacyjnej, składającej się z płyty podstawowej i drugiej płyty przy krawędzi płyty podstawowej, służącej do uniesienia obu tylnych kończyn oraz mosznika.Po unieruchomieniu łap za pomocą elastycznej tkaniny, umieść stół operacyjny na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C. Następnie, przy powiększeniu od 10- do 16-krotnym, używając mikroskopu stereoskopowego i nożyczek, wykonaj początkowe nacięcie w prawym udzie, tuż przed naczyniami udowymi, od kolana do pachwiny. Zidentyfikuj tętnicę udową i podążaj nią proksymalnie, uwalniając tętnicę z otaczających ją tkanek miękkich.Następnie, używając kauteryzacji termicznej, zidentyfikuj i przetnij dużą gałąź tętniczą prowadzącą do lewego jądra. Załóż powierzchniowy szew stabilizujący z nici Prolene 6-0 na lewym jądrze. Następnie zidentyfikuj i wypal termicznie dużą gałąź tętniczą biegnącą przyśrodkowo w obrębie uda.Następnie, stosując delikatną trakcję, podwiąż tętnicę udową w dystalnej części prawego uda, a następnie załóż szew wokół proksymalnej części tętnicy udowej tak blisko centrum ciała zwierzęcia, jak to możliwe. Teraz zrób luźny węzeł wokół tętnicy udowej, ale go nie zaciśnij. Następnie delikatnie pociągnij za szew, aby doprowadzić do załamania tętnicy.Po wykonaniu zagięcia użyj mikronożyczek, aby ostrożnie przyciąć tętnicę, zwracając szczególną uwagę, by nie uszkodzić żyły udowej. Następnie wprowadź wcześniej przygotowany mikrokateter do nacięcia. Ostrożnie rozluźnij zagięcie, aby ułatwić przejście katetera.Przepływ krwi tętniczej powinien być natychmiast widoczny w cewniku. Powoli posuń cewnik o kilka milimetrów poza miejsce poprzedniego zagięcia. Następnie zawiąż przygotowaną ligaturę, aby unieruchomić cewnik.Teraz delikatnie przepłucz cewnik chlorkiem sodu, a następnie odessać roztwór, aby potwierdzić prawidłowe umiejscowienie cewnika. Użyj kawałka taśmy, aby dodatkowo przymocować cewnik do stołu operacyjnego. Po odpowiednim unieruchomieniu i odsunięciu cewnika, przetnij skórę i powięź nad brzuszną stroną prawego mosznicy.Należy uważać, aby nie dotknąć instrumentami tkanki podległej. Rozszerzyć nacięcie aż do fałdy pachwinowej i ostrożnie do dystalnego końca moszny. Następnie należy starannie oddzielić leżące poniżej tkanki miękkie i łączną powyżej worka mięśnia dźwigacza jądra, nie dotykając samej tkanki.Następnie na dystalnym końcu mięśnia kremastera umieść szew stabilizujący wykonany nicią Prolene 6-0, aby lekko rozciągnąć mięsień. Dalej, delikatnie odciągnij mięsień w kierunku kaudalnym i przednim, aby wyciąć pozostałą tkankę miękką znajdującą się pod workiem mięśniowym. Po całkowitym oddzieleniu od tkanki łącznej, za pomocą nożyczek otwórz worek mięśnia kremastera na krawędzi kranialnej i przedłuż nacięcie od tego otworu w dół, aż do dystalnego końca mięśnia.Po termicznej koagulacji małego naczynia łączącego jądro z mięśniem opuszkowym, należy za pomocą nożyczek przeciąć pozostałe połączenia między mięśniem a jądrem. Otwarty mięsień opuszkowy będzie teraz leżał płasko na stole operacyjnym. Następnie należy założyć cztery szwy stabilizujące z Prolene 6-0 na krawędziach tkanki i przymocować je do elastycznego obrusa.Aby od tego momentu rozszerzać tkankę mięśnia podnoszącego jądro, należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml, aby stale nawilżać tkankę roztworem PBS. Po 15 minutach odpoczynku preparatu, wstrzyknij od 0,05 do 0,1 ml 1% rodine dextrin przez lewą tętnicę udową w celu wzmocnienia kontrastu mikrokrążenia. Następnie przesuń mysz wraz z podstawką pod urządzenie CCD.Mikroskop fluorescencyjny z podłączoną kamerą wideo, zmodyfikowany do oświetlenia epifluorescencyjnego, przy zachowaniu szczególnej ostrożności, aby nie przesunąć cewnika tętnicy udowej. Po ustawieniu obiektywu imersyjnego w celu zapewnienia wystarczającej wizualizacji mikrokrążenia chma, stochastycznie określono sześć postkapilarnych ES do późniejszej analizy stabilnego przylegania komórek macierzystych. Następnie do strzykawki o pojemności 1 mL nabrano 200 µL uprzednio znakowanych fluorescencyjnie donorskich komórek macierzystych szpiku kostnego.Delikatnie ostukaj strzykawkę, aby zresuspender zawiesinę komórkową, a następnie podaj komórki przez cewnik udowy w pięciu kolejnych iniekcjach po 40 µL każda. Zarejestruj toczenie się komórek macierzystych bezpośrednio po iniekcji. Toczenie zdefiniowano jako spadek prędkości komórki wzdłuż wyściółki śródbłonka o ponad 50%, połączony z typowymi ruchami przylegania i odrywania się komórek.Po zakończeniu mikroskopii intravitalnej ostrożnie usuń mięsień kremaster i przechowuj go do późniejszej analizy. Generalnie oddziaływanie bezpośrednio wstrzykniętych komórek macierzystych lub progenitorowych z śródbłonkiem naczyniowym w mikrokrążeniu mięśnia kremaster jest zdarzeniem rzadkim i dzięki znakowaniu fluorescencyjnemu występuje wyłącznie w naczyniach pokapilarnych. Komórki toczące się, wskazane czarną grotą strzałki, oraz silnie przylegające komórki macierzyste, wskazane białymi strzałkami, można wyraźnie odróżnić od krążących endogennych leukocytów w naczyniach.Warunki mikrokrążenia, reprezentowane przez prędkość przepływu krwi oraz szybkość ścinania przyścianną, zazwyczaj nie różnią się znacząco pomiędzy poszczególnymi grupami eksperymentalnymi poddanymi różnym terapiom chemokinowym. Lokalna terapia tkanki mięśnia Ker master za pomocą różnych chemokin lub mediatorów odpowiedzi zapalnej. Przykładowo, czynnik pochodzenia komórek zrębowych 1 alfa lub czynnik martwicy nowotworu alfa są w stanie naśladować specyficzne warunki mikrośrodowiska.Takie warunki nasilają oddziaływania między komórkami macierzystymi a komórkami śródbłonka w różnym stopniu, w zależności od zastosowanej konkretnej chemokiny lub mediatora oraz wstrzykniętej populacji komórek macierzystych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wizualizacji oddziaływań między komórkami macierzystymi a komórkami śródbłonka in vivo za pomocą mikroskopii wewnątrzorganizmowej mikrokrążenia mięśniowego myszy CreER.

intravital-microscopy-microcirculation-mouse-cremaster-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie mikrokrążenia in vivo w mięśniu stępkowym myszy w celu analizy migracji komórek macierzystych obwodowych

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Opisano przygotowanie tkanki do wizualizacji i manipulacji eksperymentalnej żywego mikrokrążenia. U znieczulonych samców myszy przygotowano cienki, silnie unaczyniony mięsień kremaster do mikroskopii przyżyciowej w celu badania sieci mikronaczyniowych, w tym tętniczek, kapilar i żyłek. Metoda ta może być łatwo dostosowana do szczurów i chomików.

Przygotowanie mięśnia kremastra myszy do obrazowania intravitalnego mikrokrążenia

Mikrojontoforeza polega na przemieszczaniu jonów z mikropipety w odpowiedzi na różnicę potencjałów elektrycznych między wnętrzem a zewnętrzem mikropipety. Dzięki temu cząsteczki biologicznie czynne są dostarczane proporcjonalnie do natężenia prądu elektrycznego. Przedstawiamy mikrojontoforezę acetylocholiny w połączeniu z mikromanipulacją w celu zbadania rozszerzenia naczyń zależnego od śródbłonka w mikrokrążeniu.

Mikrojontoforeza i mikromanipulacja w obrazowaniu fluorescencyjnym mikrokrążenia in vivo

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Cyfrowa intravitalna mikroskopia epifluorescencyjna żyłek posutniczych w mikrokrążeniu mięśnia dźwigacza jest wygodną metodą pozwalającą na uzyskanie wglądu w interakcje leukocytowo-śródbłonkowe in vivo w przypadku uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI) prążkowanej tkanki mięśniowej. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół bezpiecznego wykonania tej techniki oraz omawiamy jej zastosowania i ograniczenia.

Obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (IRI) mięśnia kremaster szczura

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Monocyty są ważnymi mediatorami arteriogenezy w kontekście choroby tętnic obwodowych. Wykorzystując macierz przypominającą błonę podstawną i mikroskopię przyżyciową, protokół ten bada naprowadzanie monocytów i angiogenezę związaną z nowotworem po wstrzyknięciu monocytów w mysim modelu podwiązania tętnicy udowej.

Mikroskopia przyżyciowa naprowadzania monocytów i angiogenezy związanej z nowotworem w mysim modelu choroby tętnic obwodowych

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Poznaj mikroskopię przyżytowzą mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych. Ta metoda umożliwia wizualizację interakcji komórek macierzystych z endotelem w czasie rzeczywistym.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów