Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych
5 listopada 2013
Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego
obwodowego.Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja interakcji komórek śródbłonka komórek macierzystych in vivo. Osiąga się to poprzez wprowadzenie cewnika do tętnicy udowej do uspokojonego zwierzęcia w celu uzyskania dostępu dotętniczego. W drugim etapie mięsień chrominantyczny jest chirurgicznie przygotowywany do przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej.
Następnie badana populacja komórek macierzystych jest wstrzykiwana przez cewnik do tętnicy udowej. Ostatecznie można zobrazować i określić ilościowo interakcje między adoptyjnie przeniesionymi komórkami macierzystymi a śródbłonkiem mikrokrążenia mięśni głównych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak to, w jaki sposób regulowana jest migracja terapeutycznie stosowanych komórek macierzystych w żywym organizmie?
Przed rozpoczęciem mikrochirurgii D powietrze, cewnik połączony z jednomililitrową strzykawką z 0,9% chlorkiem sodu. Następnie delikatnie ogol przednią część prawej moszny, a także prawe udo i pachwinę znieczulonej męskiej myszy o grubości od 20 do 25 miligramów. Zbierz wszystkie luźne włosy za pomocą zwilżonego bawełnianego wacika, a następnie umieść mysz brzuszną stroną do góry na pleksi, wykonanej na zamówienie scenie do oglądania składającej się z płyty podstawy i drugiej płytki na krawędzi rozpieszczonej płyty podstawy w celu uniesienia obu tylnych nóg i moszny.
Po przymocowaniu łap elastyczną serwetą umieść stolik na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni Celsjusza. Następnie, używając powiększenia od 10 do 16 razy, użyj mikroskopu preparacyjnego i nożyczek, aby wykonać wstępne nacięcie w prawym udzie, tuż przed naczyniami udowymi od kolana do pachwiny. Zidentyfikuj tętnicę udową i podążaj za nią proksymalnie, mobilizując tętnicę z otaczającej tkanki miękkiej.
Następnie za pomocą termokauteryzacji zidentyfikuj i przetnij dużą gałąź tętniczą prowadzącą do lewego jądra. Umieść szew z sześcioma ochraniaczami prolenu powierzchownie na lewym jądrze. Następnie zidentyfikuj i termicznie kauteryzuj dużą gałąź tętniczą biegnącą przyśrodkowo przy udzie.
Następnie, stosując delikatną trakcję, podwiąż tętnicę udową w dystalnej części prawego uda, a następnie umieść szew wokół bliższej tętnicy udowej jak najbliżej środka zwierzęcia. Teraz umieść luźny węzeł wokół tętnicy udowej, ale nie wiąż go. Następnie zastosuj delikatną trakcję do szwu, aby stworzyć załamanie tętnicy.
Po ustaleniu załamania użyj mikronożyczek, aby dokładnie określić rozmiar tętnicy, zwracając szczególną uwagę, aby nie uszkodzić żyły udowej. Następnie należy wprowadzić wcześniej przygotowany mikrocewnik do nacięcia. Ostrożnie poluzuj załamanie, aby ułatwić przejście cewnika.
Przepływ krwi tętniczej powinien być natychmiast widoczny w cewniku. Powoli przesuń cewnik o kilka milimetrów poza poprzednie zagięcie. Następnie zwiąż przygotowaną ligaturę w celu zamocowania cewnika.
Teraz delikatnie przepłucz cewnik chlorkiem sodu, a następnie odessaj roztwór, aby potwierdzić prawidłowe położenie cewnika. Użyj kawałka taśmy, aby dodatkowo przymocować cewnik do etapu operacji. Po odpowiednim zamocowaniu cewnika i odsunięciu go na bok, przeciąć skórę i powięź powyżej brzusznej części prawej moszny.
Uważając, aby nie dotykać leżącej pod spodem tkanki żadnymi narzędziami. Przedłuż nacięcie aż do fałdu pachwinowego i delikatnie do dystalnego końca moszny. Następnie ostrożnie oddziel leżące pod spodem tkanki miękkie i łączne nad workiem cremaster, nie dotykając samej tkanki.
Następnie umieść szew podtrzymujący sześć oh prolene na dystalnym końcu cremastera, aby lekko wyprostować mięsień. Następnie delikatnie pociągnij mięsień do przodu i do przodu, aby wyciąć pozostałą tkankę miękką pod workiem mięśniowym. Po całkowitym oddzieleniu się od tkanki łącznej użyj nożyczek, aby otworzyć worek główny C na krawędzi czaszki i przedłużyć nacięcie od tego otworu w dół do dystalnego końca mięśnia.
Po termicznym kauteryzacji małego naczynia łączącego jądro na cremasterze, za pomocą nożyczek przeciąć pozostałe połączenia między mięśniem a jądrem. Otwarty cremaster będzie teraz leżał płasko na scenie. Teraz umieść cztery szwy z prolenu na krawędziach tkanki i przymocuj je elastyczną serwetką.
Aby od tego momentu rozprowadzić tkankę mięśniową cremaster, użyj jednomililitrowej strzykawki do ciągłego nawilżania tkanki PBS. Po 15 minutach odpoczynku preparatu wstrzyknąć od 0,05 do 0,1 mililitra 1% dekstryny rodynowej przez lewą tętnicę udową w celu kontrastowego wzmocnienia mikronaczyń krwionośnych. Teraz przesuń mysz i scenę pod urządzeniem sprzężonym z ładunkiem.
Mikroskop fluorescencyjny podłączony do kamery wideo, zmodyfikowany do oświetlenia epi, ze szczególnym naciskiem, aby nie zwichnąć cewnika do tętnicy udowej. Po dostosowaniu celu zanurzenia w wodzie w celu wystarczającej wizualizacji mikrokrążenia chma, stochastycznie zdefiniowano sześć postkapilarnych ES w celu późniejszej analizy mocnego przylegania komórek macierzystych. Następnie załaduj jednomililitrową strzykawkę z 200 mikrolitrami wcześniej oznaczonych fluorescencyjnych komórek macierzystych szpiku kostnego dawcy.
Delikatnie postukaj w strzykawkę, aby resusować, zawiesić zawiesinę komórek, a następnie podać komórki przez cewnik udowy w 40 mikrolitrowych zastrzykach, co daje łącznie pięć kolejnych wstrzyknięć. Rejestruj zwijanie się komórek macierzystych natychmiast po wstrzyknięciu komórki. Zdefiniowanie rolowania jako zmniejszenie prędkości komórek wzdłuż wyściółki śródbłonka o ponad 50% w połączeniu z typowymi ruchami komórkowymi drążka i uwalniania.
Po zakończeniu mikroskopii intrażyciowej ostrożnie usuń mięsień cremaster i przechowuj go do późniejszej analizy. Ogólnie rzecz biorąc, interakcja bezpośrednio wstrzykniętych komórek macierzystych lub progenitorowych ze śródbłonkiem naczyniowym w mikrokrążeniu mięśniowym cremaster jest rzadkim zdarzeniem i występuje wyłącznie w naczyniach włosowatych z powodu znakowania fluorescencyjnego. Toczące się komórki, oznaczone czarnym grotem strzałki, oraz mocno przylegające komórki macierzyste, oznaczone białymi strzałkami, można wyraźnie odróżnić od krążących endogennych leukocytów w es.
Warunki mikrokrążenia reprezentowane przez prędkość przepływu krwi i szybkość ścinania ścian zwykle nie różnią się istotnie między odpowiednimi grupami eksperymentalnymi z różnym leczeniem chemokinami. Miejscowe leczenie tkanki mięśniowej kera głównego różnymi chemokinami lub mediatorami odpowiedzi zapalnej. Na przykład czynnik pierwszy alfa pochodzący z komórek zrębu lub czynnik martwicy nowotworu alfa jest w stanie naśladować określone warunki mikrośrodowiskowe.
Takie warunki nasilają interakcje komórek macierzystych śródbłonka w różnym stopniu, w zależności od zastosowanej konkretnej chemokiny lub mediatora oraz wstrzykniętej populacji komórek macierzystych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować interakcje komórek macierzystych i komórek in vivo za pomocą mikroskopii przyżyciowej mikrokrążenia mięśniowego CreER.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wykorzystuje mikroskopię intravitalną do analizy interakcji między komórkami macierzystymi a komórkami śródbłonka w mikrokrążeniu mięśnia opuszkowego M. u myszy. Metoda ta zapewnia zestandaryzowany model in vivo do badania migracji obwodowych komórek macierzystych szpiku kostnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Medycyna regeneracyjna
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Zrozumienie migracji komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla terapii regeneracyjnych.
- Mikroskopia intravitalna umożliwia wizualizację oddziaływań komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Mikrokrążenie w mięśniu kremastor myszy stanowi skuteczny model dla tych badań.
- Poprzednie badania podkreśliły znaczenie oddziaływań endotelialnych w zachowaniu komórek macierzystych.
Cel badania
- Wizualizacja oddziaływań między komórkami macierzystymi a komórkami śródbłonka in vivo.
- Ilościowe określenie migracji komórek macierzystych wewnątrz żywego organizmu.
- Odpowiedź na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.
Zastosowane metody
- Kaniulacja tętnicy udowej u uspokojonej myszy w celu uzyskania dostępu do tętnicy.
- Przygotowanie chirurgiczne mięśnia chroma do intravitalnej mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wstrzyknięcie populacji komórek macierzystych poprzez cewnik tętnicy udowej.
- Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań komórek macierzystych z śródbłonkiem.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja oddziaływań między komórkami macierzystymi a śródbłonkiem w czasie rzeczywistym.
- Uzyskanie ilościowych danych na temat wzorców migracji komórek macierzystych.
- Wgląd w mechanizmy regulacyjne migracji komórek macierzystych.
- Potencjalne implikacje dla usprawnienia terapii regeneracyjnych.
Wnioski
- Technika mikroskopii wewnątrzorganizmowej jest skuteczna w badaniu dynamiki komórek macierzystych.
- Model ten może zwiększyć zrozumienie zachowania komórek macierzystych in vivo.
- Wyniki mogą wpłynąć na przyszłe strategie medycyny regeneracyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia wewnątrzżyciowa mikrokrążenia mięśnia opuszkowego myszy umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację oddziaływań komórek macierzystych z nabłonkiem naczyniowym in vivo, wypełniając tym samym istotną lukę w zrozumieniu migracji obwodowych komórek macierzystych w terapiach regeneracyjnych. Podejście to dostarcza wglądu w mechanizmy procesów rekrutacji i adhezji pośredniczonych przez chemokiny, co wspiera walidację celów i modelowanie predykcyjne we wczesnej fazie odkryć. Poprzez ustanowienie odtwarzalnego modelu in vivo, metoda ta zwiększa pewność przewidywań dotyczących zachowania komórek macierzystych i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań w rozwoju przedklinicznym.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących mechanizmów rekrutacji komórek macierzystych oraz wyjaśnienie szlaków sygnałowych w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez kwantyfikację zdarzeń adhezji toczącej oraz trwałej jako funkcjonalnych odczytów interakcji śródbłonkowych.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe dane na temat wzorców migracji komórek macierzystych, które służą do selekcji projektów w portfolio oraz mechanistycznego ograniczania ryzyka w przypadku kandydatów do terapii regeneracyjnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów pracy poprzez ustanowienie zestandaryzowanych warunków dla analizy interakcji między komórkami macierzystymi a śródbłonkiem.
- Powtarzalność: Zapewnienie standaryzacji analizy poprzez kontrolowaną superfuzję chemokin oraz spójne odczyty z mikrokrążenia.
- Skalowalność: Wskazanie potencjału ponownego wykorzystania platformy do oceny wielu populacji komórek macierzystych lub modulatorów mikrośrodowiskowych w identycznych warunkach obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Omówienie ciągłości procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez modelowanie migracji obwodowych komórek macierzystych w kontekście naprawy tkanek i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Opis tego, w jaki sposób obserwowane interakcje pod wpływem specyficznych chemokin (np. SDF-1α, TNF-α) wspierają spójność biomarkerów i pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Koncentracja na wartości predykcyjnej poprzez powiązanie warunków wstępnych mikrośrodowiska z efektywnością rekrutacji komórek macierzystych, co dostarcza informacji dla strategii biomarkerów translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z continuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne – zapewniając ilościowy odczyt zachowania komórek macierzystych w żywym systemie w czasie rzeczywistym.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda wspiera testowanie hipotez dotyczących regulacji migracji komórek macierzystych oraz wyjaśnianie szlaków poprzez dynamikę interakcji z endotelium.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu dzięki standaryzowanemu przygotowaniu mięśnia kremaster oraz ilościowej wizualizacji toczących się i przylegających komórek macierzystych.
- Analityka: Wskazuje na pomiary, takie jak redukcja prędkości komórek (>50%) oraz ruchy typu przyleganie-odrywanie, jako zdefiniowane wyniki służące do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając ocenę efektów zapośredniczonych przez chemokiny w rekrutacji komórek macierzystych, co jest istotne dla tkankowo swoistego homingu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnie wykorzystywalną możliwość przesiewania produktów komórek macierzystych lub czynników modulujących w wielu projektach, ze względu na jej przystosowalność do różnych chemokin i typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększenie pewności prognostycznej w zakresie mechanizmów migracji komórek macierzystych, walidacja celów w szlakach interakcji śródbłonka, ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w procesach regeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: standaryzacja przygotowania chirurgicznego i protokołów obrazowania, powtarzalność warunków mikrokrażeniowych, skalowalność w testowaniu wielu zmiennych.
- Wartość strategiczna: lepsze decyzje typu go/no-go w oparciu o ilościowe dane dotyczące interakcji, efektywność kapitałowa dzięki wczesnej redukcji ryzyka, zmniejszenie ryzyka biologicznego na późnych etapach rozwoju terapii komórkowych.
- Wpływ na portfolio: priorytetyzacja kandydatów na komórki macierzyste z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o efektywność zaangażowania śródbłonka w zdefiniowanych warunkach mikrośrodowiskowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Do pomyślnego przeprowadzenia cewnikowania i przygotowania tkanek wymagana jest biegłość w mikrochirurgii, mikroskopii intravitalnej oraz fluorescencyjnym znakowaniu komórek.
- Wymagana aparatura obejmuje mikroskop fluorescencyjny z oświetleniem epifluorescencyjnym, obiektywem imersyjnym wodnym oraz stołem z kontrolą temperatury w celu utrzymania warunków fizjologicznych.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga spójnej definicji kryteriów toczenia (redukcja prędkości >50%) oraz trwałej adhezji we wszystkich ośrodkach i przez wszystkich operatorów.
- Kwestie adaptacyjne obejmują optymalizację stężeń superfuzji chemokin oraz objętości iniekcji dla różnych populacji komórek macierzystych i systemów modelowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują rzadkość występowania oddziaływań między komórkami macierzystymi a śródbłonkiem w mikrokrążeniu oraz zależność od znakowania fluorescencyjnego w celu wyraźnego odróżnienia ich od endogennych leukocytów.
