Name: Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj technikę laserowego wychwytywania mikrodysekcji do izolacji czystych populacji neuronów z ludzkich komórek neuroprogenitorowych. Metoda umożliwia analizę ekspresji genów w zróżnicowanych hodowlach neuronowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Merit Review (NEUD-004-07F) od Veterans Administration (dla S.P.).

1. Ekspansja ludzkich NPC (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Ożyw zamrożony zapas ludzkich NPC z mózgu płodu (Lonza, Walkersville, MD, USA) i hoduj je w zawiesinie w kolbach T-75 jako neurosfery (Figura 1A) w pożywce neuropodstawowej zawierającej suplementy proliferacji, EGF (10 ng / ml) i FGF (10 ng / ml).</li>
	<li>Po 3 dniach w hodowli przenieś neurosfery do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj z prędkością 500 obr./min przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, pozostawiając ~100 μl pożywki nad osadem komórkowym i przenieść do probówki Eppendorfa. Osad komórkowy o pojemności 100 μl wystarczy do rozszczepienia na 2 kolby T-75. Jeśli mniej, zmniejsz liczbę kolb, ponieważ komórki neuroprogenitorowe nie proliferują się, jeśli są podzielone na cienkie kawałki.</li>
	<li>Rozcieraj granulat końcówką o pojemności 200 μl 50x, trzymając końcówkę o pojemności 200 μl przy dnie tuby. Podzielić zawiesinę komórkową równomiernie na dwie części i dodać je do 2 kolb T-75 (podział 1-2), jednej do dalszego rozprężania, a drugiej do różnicowania.</li>
	<li>Kontynuować hodowlę komórek neuroprogenitorowych w celu ekspansji (pierwsza kolba), zmieniając pożywkę co 4-5 dni, aż neurosfery osiągną swój pierwotny rozmiar 300-500 μm. Zmienić pożywkę przez odwirowanie (500 obr./min; 5 min), wyrzucić starą pożywkę i dodać nową pożywkę.</li>
</ol>
2. Zróżnicowanie ludzkich NPC w kulturę bogatą w neurony (Rysunek 2)
<ol>
	<li>W celu różnicowania komórek neuroprogenitorowych w kulturę bogatą w neurony, umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe w każdym dołku 24-dołkowej płytki i pokryj 100 μg/ml poli-L-lizyny, dodając 500 μl do każdej studzienki. Inkubuj naczynia przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór poli-L-lizyny i przepłukać płytkę jałową wodą.</li>
	<li>Następnie pokryj studzienki płytki 500 μl 5 μg/ml mysiej lamininy i inkubuj przez 30 minut. Po inkubacji umyć studzienki PBS.</li>
	<li>4 dni po podziale komórek (krok 1.4) przenieś małe neurosfery z kolby oznaczonej "Do różnicowania" do powlekanych szalek o gęstości ~ 500 neurosfer na dołek 24-dołkowej płytki.</li>
	<li>Po 6 godzinach, gdy neurosfery przyczepią się do naczynia, usuń pożywkę proliferacyjną i dodaj pożywkę różnicującą składającą się z podłoża neuropodstawnego, suplementu B27, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM) i kwasu retinowego (2 μM).</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne zróżnicowanych NPC (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Po dwóch tygodniach hodowli komórek neuroprogenitorowych w pożywce różnicowania neuronów uzyskuje się kulturę bogatą w neurony. Wypłucz neurony raz w PBS, a następnie utrwal je w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut. Po utrwaleniu przepłucz komórki trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Inkubować komórki z buforem permeabilacyjnym (5% BSA i 0,2% Triton X-100 w PBS) w temperaturze pokojowej przez 60 minut.</li>
	<li>Inkubować szalki O/N w temperaturze 4 °C w wytrząsarce z następującą kombinacją przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych w 3% BSA w PBS: NeuN (1:250) i synapsyna (1:250); acetylocholinoesterazy (1:500) i synaptofizyny (1:250); BDNF (1:500) i GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) i GFAP (1:1 000).</li>
	<li>Przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie PBS, a następnie inkubować je z drugorzędowymi przeciwciałami anty-króliczym-Cy3 i anty-mysimi przeciwciałami FITC w temperaturze pokojowej w ciemności przez 90 minut. Po inkubacji przemyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Umieścić 10 μl podłoża montażowego na szkiełku podstawowym, wyjąć szkiełko nakrywkowe z naczynia hodowlanego za pomocą kleszczy i położyć je do góry nogami na podłożu montażowym. Delikatnie zetrzyj nadmiar podłoża montażowego i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci.</li>
	<li>Zbadaj neurony wybarwione immunologicznie w mikroskopie fluorescencyjnym.</li>
</ol>
4. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Różnicować NPC w kulturę bogatą w neurony na szkiełkach błonowych PEN pokrytych poli-L-lizyną i lamininą myszy, postępując zgodnie z procedurami opisanymi na rysunku 2.</li>
	<li>Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w warunkach wolnych od RNAse.</li>
	<li>Wybarwić kultury za pomocą HistoGene Stain (Arcturus) w celu wizualizacji komórek.</li>
	<li>Znajdź obszary czystych populacji neuronów pozbawionych astrocytów, korzystając z obrazu mapy drogowej całego slajdu z systemem Veritas LCM. Zaznacz neurony za pomocą narzędzi do rysowania.</li>
	<li>Wykonuj laserowe przechwytywanie tych obszarów przy użyciu sterowanej komputerowo precyzji i automatyzacji w dwuetapowym procesie. Po pierwsze, IR (podczerwień) jest wystrzeliwana w wiele punktów z ustawieniem mocy lasera 70 mW i impulsem 2,500 μs, aby membrana została przymocowana do nasadki. Następnie zaznaczony obszar jest wycinany za pomocą narzędzia tnącego UV przy niskim poziomie 10 mV.</li>
	<li>Połączenie tych procesów selektywnie przechwytuje zaznaczone obszary z membrany PEN na nasadki makr CapSure LCM. Kiedy czapeczka jest podnoszona, błona z neuronami przylega do czapeczki.</li>
	<li>Wyizolować całkowite RNA z próbek LCM za pomocą zestawu do izolacji PicoPure RNA (Arcturus) i potraktować DNazą.</li>
	<li>Amplifikuj wyizolowane RNA za pomocą zestawu do amplifikacji RNA RiboAMP, postępując zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu.</li>
	<li>Wykonuj analizę RT-PCR w czasie rzeczywistym za pomocą sond TaqMan w celu wykrycia ludzkiego łańcucha ciężkiego neurofilamentu (hNFHc).</li>
</ol>
Skróty:
AD, choroba Alzheimera; BDNF, neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego; CREB, cykliczne białko wiążące element odpowiedzi AMP; DBC, cykliczny wzmacniacz dibutyrylu; EGF, naskórkowy czynnik wzrostu; FGF, czynnik wzrostu fibroblastów; GFAP, kwaśne białko fibrylarne glejowe; LCM, mikrodysekcja wychwytu laserowego; NGF, czynnik wzrostu nerwów; NPC, komórka neuroprogenitorowa; PEN, naftalan etylenu.

<ol><li>Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+identity+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial identity of neural stem cells.</a> Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).</li>
<li>Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: an overview.</a> Circ. Res. 92, 598-608 (2003).</li>
<li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review.</a> J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).</li>
<li>Breier, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+as+models+for+high-throughput+screens+of+developmental+neurotoxicity%3A+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).</li>
<li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+supplementation+of+differentiating+human+neural+progenitors+and+embryonic+stem+cells+leads+to+enhanced+neurogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro.</a> J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li>
<li>Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+gene+expression+with+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection.</a> J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).</li>
<li>Robles, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+gene+expression+profiling+in+spatial+discrimination+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning.</a> Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).</li>
<li>Su, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ethanol+versus+formalin+fixation+on+preservation+of+histology+and+RNA+in+laser+capture+microdissected+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues.</a> Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).</li>
<li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain%3A+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).</li>
<li>Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+CREB+expression+in+Alzheimer%27s+brain+and+in+Abeta-treated+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons.</a> Mol. Neurodegener. 6, 60(2011).</li>
<li>Dworkin, S., Mantamadiotis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CREB+signalling+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Ther.+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting CREB signalling in neurogenesis.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+perspectives+of+neural+stem+cell+differentiation%3A+from+neurotransmitters+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics.</a> Cytometry A. 75, 38-53 (2009).</li>
<li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li>
<li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li>
</ol>

Brak konfliktu interesów, który można by zadeklarować.

W tym badaniu opisujemy bogaty w neurony model hodowli komórek poprzez różnicowanie samoodnawiających się ludzkich komórek neuroprogenitorowych oraz metodę izolowania czystej populacji neuronów za pomocą mikrodysekcji wychwytywania laserowego. Użyliśmy kombinacji NGF, BDNF, DBC i kwasu retinowego do różnicowania neuronalnego NPC. DBC jest używany do aktywacji CREB, czynnika transkrypcyjnego, który wzmacnia neurogenezę 12. Kwas retinowy indukuje wyjście z cyklu komórkowego i zmniejsza populację glejową 13<...

Wiadomo, że neurogeneza trwająca całe życie występuje w strefie podkomorowej komór bocznych oraz w warstwie podziarnistej zakrętu zębatego mózgu dorosłego ssaka 1. Komórki neuroprogenitorowe (NPC), które pochodzą z tych regionów, są komórkami multipotencjalnymi, które mogą różnicować się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty 2. NPC wzbudziły zainteresowanie ze względu na ich potencjał do przeszczepiania pacjentom z różnymi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Parkinsona, stwardnieniem zanikowym bocznym, udarem mózgu i chorobą Alzheimera (AD) 3. Badania z udziałem NPC koncentrowały się na tym kącie przeszczepu, ale potencjał neuronów pochodzących z NPC jako modelu hodowli komórkowej w celu określenia mechanizmu neurodegeneracji nie został w pełni wykorzystany. Wcześniejsze badania na ogół wykorzystywały neurony postmitotyczne wyizolowane z tkanek mózgowych gryzoni, które muszą być izolowane w każdym eksperymencie, ponieważ nie odnawiają się samoczynnie. Chociaż ludzkie linie komórkowe nerwiaka zarodkowego, w tym komórki SH-SY5Y i SK-N-MC, mogą być rozszerzane, nie mają one cech neuronów pierwotnych. Z drugiej strony ludzcy NPC oferują obie zalety, ponieważ można je rozszerzać na wiele przejść i różnicować w celu wygenerowania populacji komórek o cechach neuronów pierwotnych 4,5. W obecnym badaniu opisujemy nowy protokół różnicowania w celu uzyskania spójnej, bogatej w neurony populacji z dostępnych na rynku NPC wyizolowanych z ludzkiego mózgu płodu. Ponieważ kultury te zawierają niewielki procent komórek glejowych, potrzebujemy dodatkowych metod, aby wyizolować czystą populację neuronów w celu charakterystyki molekularnej. Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LCM) jest nową techniką, dzięki której jednorodna populacja komórek z wycinka tkanki może być selektywnie wychwytywana w celu analizy ekspresji genów 6. Mózg jest niejednorodną tkanką składającą się z neuronów, gleju i innych typów komórek. LCM wykorzystano do określenia analiz ekspresji genów specyficznych dla neuronów 7-10. Wcześniej przeprowadziliśmy LCM neuronów hipokampa z odcinków mózgu myszy AD (Tg2576), aby wykazać zmniejszoną ekspresję cyklicznego białka wiążącego element odpowiedzi AMP (CREB) i BDNF, szczególnie w neuronach hipokampa 11. W niniejszym badaniu opisano procedury ekspansji ludzkich NPC, różnicowania neuronów, barwienia immunofluorescencyjnego markerów neuronalnych i LCM izolacji neuronów hodowanych na szkiełkach błonowych PEN.

<table><tbody><tr><td>Komórki neuroprogenitorowe (NPC) </td><td>Lonza</td><td>PT-2599</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A ludzkie podłoże</td> podstawowe <td>Technologia komórek macierzystych</td><td>5750</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Suplement proliferacyjny</td><td>Technologia komórek macierzystych</td><td>5753</td><td></td></tr><tr><td>Neurocult NS-A Suplement różnicujący</td><td>Technologia komórek macierzystych</td><td>5754</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x) </td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Technologia komórek macierzystych</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów </td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego </td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3897S</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu nerwów </td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Dibutyryl cykliczny AMP</td><td>Sigma</td><td>D-0627</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna </td><td>Sigma</td><td>P-5899</td><td></td></tr><tr><td>Mysia laminina </td><td>Sigma</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Przeciwciało Sigma</td><td>R-2625</td><td></td></tr><tr><td>STAT3</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9132</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GFAP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3670</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało GAP43</td><td>Laboratoria transdukcji</td><td>612262</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało BDNF</td><td>Millipore</td><td>AB1534SP</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało acetylocholinoesterazy </td><td>Santz cruz</td><td>Sc-11409</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało synaptofizyny</td><td>Abcam</td><td>ab18008-50</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało NeuN</td><td>Chemicon</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało synapsyny</td><td>Novus</td><td>NB300-104</td><td></td></tr><tr><td>Anty mysie FITC</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-095-146</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratoria</td><td></td><td></td>badawcze</tr><tr><td>Anti Rabbit Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboratoria</td><td></td><td></td>badawcze</tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Acros</td><td>21568-2500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehye </td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe (szkiełko nakrywkowe z dużym kołem)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-102</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe (Prolong Gold)</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Membrana długopisu</td><td>Zastosowane biosystemy</td><td>LCM0521</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia sekcji mrożonych Histogene LCM</td><td>Biosystemy zastosowane</td><td>KIT0401</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do amplifikacji RNA RiboAmp</td><td>Applied biosystems</td><td>KIT0201</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji Picopure RNA</td><td>Zastosowane biosystemy</td><td>KIT0202</td><td></td></tr><tr><td>CapsureMacro LCM Kapsułki</td><td>Applied biosystems</td><td>LCM0211</td><td></td></tr></tbody></table>

laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Komórki neuroprogenitorowe (NPC) wyizolowane z ludzkiego mózgu płodu zostały namnażone w warunkach proliferacyjnych w obecności naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i czynnika wzrostu fibroblastów (FGF), aby zapewnić obfite zaopatrzenie komórek. NPC różnicowano w obecności nowej kombinacji czynnika wzrostu nerwów (NGF), neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF), dibutyrylu cAMP (DBC) i kwasu retinowego na naczyniach pokrytych poli-L-lizyną i mysią lamininą w celu uzyskania kultur bogatych w neurony. NPC różnicowano również pod względem braku neurotrofin, DBC i kwasu retinowego oraz w obecności rzęskowego czynnika neurotroficznego (CNTF), aby uzyskać kultury bogate w astrocyty. Zróżnicowane NPC charakteryzowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego dla panelu markerów neuronalnych, w tym NeuN, synapsyny, acetylocholinoesterazy, synaptofizyny i GAP43. Kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP) i markery astrocytów STAT3 wykryto u 10-15% zróżnicowanych NPC. Aby ułatwić charakterystykę molekularną specyficzną dla typu komórki, przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego w celu wyizolowania neuronów hodowanych na szkiełkach membranowych z naftalanu etylenu (PEN). Metody opisane w tym badaniu dostarczają cennych narzędzi do pogłębienia naszej wiedzy na temat molekularnego mechanizmu neurodegeneracji.

Ekspansja NPC (Rysunek 1)
Podczas rozbijania neurosfer do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez tryturację, końcówka pipety musi dotykać dna probówki, aby podczas pipetowania zawiesiny w górę i w dół występował pewien opór. Liczba cykli tryturacji różni się w zależności od osoby i powinna zostać ustalona metodą prób i błędów poprzez badanie otrzymanej zawiesiny komórek pod mikroskopem. Kluczowe jest zapewnienie odpowiedniej gęstości zawiesiny komórek, ponieważ proliferac...

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest opracowanie modelu hodowli neuronów ludzkich, identyfikacja markerów neuronalnych oraz wyizolowanie czystej populacji neuronów do analizy ekspresji genów. Osiąga się to poprzez wstępną ekspansję ludzkich komórek progenitorowych układu nerwowego w celu zapewnienia ciągłej podaży tych komórek. W drugim kroku komórki progenitorowe układu nerwowego są hodowane w obecności suplementów różnicujących i neurotroficznych czynników wzrostu w naczyniach pokrytych czynnikami adhezyjnymi.Następnie przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych, aby określić los zróżnicowanych neuroprogenitorowych komórek macierzystych. Na koniec wykonuje się mikrodysekcję laserową neuronów hodowanych na szkiełkach z membraną PEN, aby ułatwić analizę ekspresji genów specyficznych dla neuronów. Uzyskane wyniki wykazują, że zróżnicowane neuroprogenitorowe komórki macierzyste mają charakter głównie neuronalny.Na podstawie barwienia immunofluorescencyjnego i wychwytu neuronów. Dzięki laserowej mikrodysekcji przechwytywanej (LCM) ludzkie neuroblastyczne komórki progenitorowe mogą być namnażane i różnicowane w kultury bogate w neurony. W badaniach in vitro, ze względu na obecność komórek glejowych w tych kulturach, można zastosować laserową mikrodysekcję przechwytywaną w celu wyizolowania czystej populacji neuronów.Procedur tych zaprezentuje Ron Bouchard, starszy specjalista ds. badań w naszej centralnej pracowni mikroskopii. Aby rozpocząć tę procedurę, od revive zamrożony zapas ludzkich neuroprogenitorów wyizolowanych z płodowego mózgu poprzez ich szybkie ogrzanie do 37 °C, a następnie dodanie ich do kolby T 75 zawierającej 15 ml podgrzanego podłoża podstawowego dla neuronów, uzupełnionego o 10 ng/ml EGF i FGF. Po hodowaniu komórek przez trzy dni przenieść neurosfery do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w celu uzyskania osadu, wirując przy 1000 RPM przez pięć minut. Po wirowaniu odlać supernatant, pozostawiając około 100 µl podłoża, a następnie przenieść osad komórkowy do probówki typu Eppendorf.Osad komórkowy o objętości 100 µL jest wystarczający do rozdzielenia na dwie kolby T 75. W przypadku mniejszej objętości należy zmniejszyć liczbę kolb, ponieważ neuroblastyczne komórki progenitorowe nie będą proliferować. Jeśli rozdzielenie jest rzadkie, należy dokładnie rozbić neurosfery do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, pipetując materiał w górę i w dół 50 razy, dociskając końcówkę 200 µL do dna probówki.Wizualnie sprawdź postęp pod mikroskopem, aby upewnić się, że neurosfery uległy dysocjacji. Następnie podziel zawiesinę komórkową na równe części i przenieś ją do dwóch kolb T 75. Jedną przeznacz do dalszej ekspansji, a drugą do różnicowania.Następnie inkubuj kolby. Wymień pożywkę komórek progenitorowych neuronów w kolbie przeznaczonej do ekspansji poprzez wirowanie. Następnie odlej starą pożywkę i dodaj nową pożywkę.Wymieniaj pożywkę co cztery lub pięć dni, aż neurosfery osiągną pierwotny rozmiar od 300 do 500 mikronów. Aby rozpocząć różnicowanie komórek progenitorowych neuronów w kulturę bogatą w neurony, umieść pojedynczą szkiełko podstawowe w każdej studzience płytki 24-dołkowej i pokryj je, dodając 500 µL roztworu poli-L-lizyny o stężeniu 100 µg/mL do każdej z nich. Inkubuj płytki przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać roztwór poli-L-lizyny.Opłucz płytkę zdejstylowaną sterylną wodą i ponownie odessa zawartość. Następnie pokryj dołki płytki 500 µL lamininy mysiej w stężeniu 5 µg/mL i inkubuj przez 30 minut. Po inkubacji przemyj dołki PBS, ponownie odessa zawartość i pozostaw je do wyschnięcia w dygestorium do hodowli tkankowych. Cztery dni po pasażowaniu komórek przenieś małe neurosfery z kolby przeznaczonej do różnicowania do pokrytej lamininą płytki 24-dołkowej.Należy dodać około 500 neurosfer na dołek. Po sześciu godzinach inkubacji, gdy neurosfery przylgną do dna naczynia, należy usunąć medium proliferacyjne i dodać medium różnicujące. Medium to składa się z neurobasal medium, suplementu B 27, NGF, BDNF, CDF oraz kwasu retinowego. Następnie płytkę należy przenieść z powrotem do inkubatora. Po dwutygodniowej hodowli komórek progenitorowych neuronów w medium do różnicowania neuronów otrzymuje się kulturę bogatą w neurony.Przepłucz neurony raz w PBS, a następnie utrwal je w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut. Po utrwaleniu przepłucz komórki trzykrotnie w PBS. Następnie przygotuj komórki do immunobarwienia, inkubując je w buforze permeabilizującym w temperaturze pokojowej przez 60 minut.Następnie do dołków należy dodać przeciwciała poliklonalne i monoklonalne w 3% BSA w PBS. Po dodaniu innej pary przeciwciał do każdego dołka, inkubować je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wytrząsarce. Następnego dnia rano wypłukać szkiełka przykrywowe trzykrotnie za pomocą PBS, a następnie inkubować je z przeciwciałami wtórnymi anty-rabbit P SI 3 oraz anty-US fitzy w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez 90 minut po zakończeniu inkubacji.Przemyj szkiełka nakrywki trzykrotnie w PBS. Następnie nanieś 10 µL medium montażowego na szkiełko przedmiotowe. Wyjmij szkiełko nakrywkę z naczynia hodowlanego i połóż ją stroną górną do dołu na medium montażowym.Delikatnie usuń nadmiar medium montażowego i zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci. Aby przygotować komórki do mikrosekcji, najpierw zróżnicuj neuroprogenitory w celu uzyskania hodowli bogatej w neurony na membranie PEN. Użyj szkiełek powlekanych poli-L-lizyną i lamininą.Wszystkie kolejne etapy należy przeprowadzić w warunkach wolnych od RNA. Następnie należy zabarwić hodowle przy użyciu barwnika histo gene, aby zwizualizować komórki; barwnik histo gene barwi jądra na kolor fioletowy, a cytoplazmę na jasnoróżowy, co ułatwia rozróżnienie neuronów i komórek glejowych na podstawie ich charakterystycznej morfologii. Należy umieścić preparat w 75% etanolu i dejonizowanej wodzie sterylnej na 30 sekund.Następnie należy położyć preparas na chusteczce Kim wipe. Dodać 200 µL histo gene i odczekać 20 sekund. Następnie preparas należy kolejno zanurzać na 30 sekund w wodzie sterylnej dejonizowanej, 75% etanolu, 95% etanolu oraz 100% etanolu.Następnie umieść preparat w ksylenie na pięć minut, a potem osusz go na chusteczce Kim wipe przez pięć minut. Następnie nałóż slajd z membraną PEN na zwykły slajd i umieść je w systemie do laserowej mikrodysekcji Veritas (laser capture micro dissection system lub LCM), korzystając z oprogramowania. Wykonaj obraz mapy drogowej, aby zlokalizować obszary czystych populacji neuronalnych pozbawionych astrocytów.Oznacz te neurony za pomocą narzędzi do rysowania. Następnie przeprowadź laserową mikrodysekcję tych obszarów, wykorzystując komputerową precyzję i automatyzację w procesie dwuetapowym. W pierwszym kroku emitowane jest promieniowanie IR w wielu punktach przy mocy lasera ustawionej na 70 milliwatts i impulsie trwającym 2 500 microseconds, aby przytwierdzić membranę do nasadki.Następnie zaznaczony obszar wycina się za pomocą narzędzia tnącego UV przy niskim ustawieniu napięcia wynoszącym 10 millivolts. Połączenie tych procesów pozwala na selektywne przeniesienie zaznaczonych obszarów na makroskopowe nakładki LCM. Po zebraniu minimum 100 neuronów, należy przy użyciu mikroskopu usunąć membranę z nakładki i umieścić ją w probówce.Wyizoluj całkowite RNA z próbek LCM, używając zestawu do izolacji RNA P OPU, i potraktuj DNaza. Następnie przeprowadź amplifikację wyizolowanego RNA za pomocą zestawu do amplifikacji RNA ribo amp, postępując zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Na koniec przeprowadź analizę real-time R-T-P-C-R z użyciem sond TAC MAN w celu wykrycia ludzkiego ciężkiego łańcucha neurofilamentów.Kulturę bogatą w neurony uzyskuje się poprzez różnicowanie czterodniowych neurosfer na powierzchniach pokrytych poli-L-lizyną i lamininą, w połączeniu ze specyficznymi czynnikami wzrostu indukującymi różnicowanie. Po dwóch tygodniach, w obszarach o niskiej gęstości, otrzymuje się kulturę bogatą w neurony, taką jak przedstawiona tutaj. Komórki mogą różnicować się w astrocyty, podobne do tych widocznych tutaj.Różnicowanie astrocytów można również ukierunkować, stosując czynnik wzrostu CNTF zamiast czynników wykorzystywanych do różnicowania neuronów. Różnicowanie neuronów można zidentyfikować za pomocą przeciwciał przeciwko specyficznym markerom neuronalnym, takim jak new N i synapsyna, acetylocholinoesteraza i synaptofizyna, a także BDNF i GAAP 43. Pozytywne barwienie stanowi dowód na to, że zróżnicowane komórki wykazują cechy neuronów pierwotnych. Ponadto astrocyty można zidentyfikować poprzez pozytywne barwienie immunocytochemiczne na stat trzy i GAP.Laserowa mikrodysekcja przechwytująca neuronów jest przeprowadzana na komórkach, które zostały zróżnicowane na szkiełkach z membraną PEN pokrytą poli-L-lizyną i lamininą; przedstawione tutaj są neurony barwione barwnikiem histologicznym. Aby zwizualizować komórki, można następnie obrysować interesujące nas komórki za pomocą lasera, który topi membranę PEN, powodując jej przyklejenie do nakładki przechwytującej umieszczonej powyżej. W końcowym etapie liczne komórki mogą zostać obrysowane i przechwycone na tę samą nakładkę w celu analizy DNA lub RNA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji neuronów za pomocą mikrosekcji laserowej (LCM).

laser-capture-microdissection-neurons-from-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Laserowa mikrosekcja komórek Neuronów z zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

W tym filmie opisano manipulację hodowanymi neuronami z wykorzystaniem pęsety laserowej in vitro.

Wykorzystanie pęsety laserowej do manipulowania izolowanymi neuronami in vitro

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji pojedynczych lub wielu neuronów dopaminergicznych (da) Drosophila z larw trzeciego stadium za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM) w klasie przechwytywania podczerwienią (IR). RNA uzyskane z wyizolowanych neuronów może być łatwo wykorzystane w dalszych zastosowaniach, w tym w analizach qRT-PCR lub mikromacierzach.

Mikrodysekcja laserowa neuronów obwodowych Drosophila

Źródło: Palma-Tortosa, S., et.al. Hodowle organotypowe dorosłej ludzkiej kory mózgowej jako model ex vivo do przeszczepiania i walidacji ludzkich komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje przeszczep neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych do wycinków ludzkiej tkanki korowej. Procedura polega na wyizolowaniu i ponownym zawieszeniu komórek progenitorowych w macierzy błony podstawnej, a następnie wstrzyknięciu ich do wycinka korowego...

Przeszczepianie progenitorów neuronalnych pochodzących z komórek macierzystych do ludzkich wycinków korowych

Ten film demonstruje metodę różnicowania ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych (NPC) w neurony. NPC są wprowadzane do ustalonej kokultury neuronów korowych astrocytów myszy i szczurów, promując różnicowanie NPC w neurony. Różnicowanie potwierdza się poprzez wizualizację komórek pod mikroskopem konfokalnym.

Technika kohodowli do różnicowania ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych w neurony

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

W tym badaniu opracowano i zweryfikowano nową platformę do badania wewnątrzneuronalnych sygnatur molekularnych odpowiedzi na leczenie w chorobie afektywnej dwubiegunowej (ChAD). Nabłonek węchowy od pacjentów z ChAD uzyskano za pomocą biopsji nosa. Następnie mikrodysekcję laserową połączono z Real Time RT PCR w celu zbadania sygnatury molekularnej odpowiedzi litu w ChAD.

Neurony węchowe uzyskane przez biopsję nosa w połączeniu z mikrodysekcją laserową: potencjalne podejście do badania odpowiedzi na leczenie w zaburzeniach psychicznych

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj technikę laserowego wychwytywania mikrodysekcji do izolacji czystych populacji neuronów z ludzkich komórek neuroprogenitorowych. Metoda umożliwia analizę ekspresji genów w zróżnicowanych hodowlach neuronowych.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Przeglądaj więcej filmów