Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest opracowanie modelu hodowli neuronów ludzkich, identyfikacja markerów neuronalnych oraz wyizolowanie czystej populacji neuronów do analizy ekspresji genów. Osiąga się to poprzez wstępną ekspansję ludzkich komórek progenitorowych układu nerwowego w celu zapewnienia ciągłej podaży tych komórek. W drugim kroku komórki progenitorowe układu nerwowego są hodowane w obecności suplementów różnicujących i neurotroficznych czynników wzrostu w naczyniach pokrytych czynnikami adhezyjnymi.

Następnie przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych, aby określić los zróżnicowanych neuroprogenitorowych komórek macierzystych. Na koniec wykonuje się mikrodysekcję laserową neuronów hodowanych na szkiełkach z membraną PEN, aby ułatwić analizę ekspresji genów specyficznych dla neuronów. Uzyskane wyniki wykazują, że zróżnicowane neuroprogenitorowe komórki macierzyste mają charakter głównie neuronalny.

Na podstawie barwienia immunofluorescencyjnego i wychwytu neuronów. Dzięki laserowej mikrodysekcji przechwytywanej (LCM) ludzkie neuroblastyczne komórki progenitorowe mogą być namnażane i różnicowane w kultury bogate w neurony. W badaniach in vitro, ze względu na obecność komórek glejowych w tych kulturach, można zastosować laserową mikrodysekcję przechwytywaną w celu wyizolowania czystej populacji neuronów.

Procedur tych zaprezentuje Ron Bouchard, starszy specjalista ds. badań w naszej centralnej pracowni mikroskopii. Aby rozpocząć tę procedurę, od revive zamrożony zapas ludzkich neuroprogenitorów wyizolowanych z płodowego mózgu poprzez ich szybkie ogrzanie do 37 °C, a następnie dodanie ich do kolby T 75 zawierającej 15 ml podgrzanego podłoża podstawowego dla neuronów, uzupełnionego o 10 ng/ml EGF i FGF. Po hodowaniu komórek przez trzy dni przenieść neurosfery do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w celu uzyskania osadu, wirując przy 1000 RPM przez pięć minut. Po wirowaniu odlać supernatant, pozostawiając około 100 µl podłoża, a następnie przenieść osad komórkowy do probówki typu Eppendorf.

Osad komórkowy o objętości 100 µL jest wystarczający do rozdzielenia na dwie kolby T 75. W przypadku mniejszej objętości należy zmniejszyć liczbę kolb, ponieważ neuroblastyczne komórki progenitorowe nie będą proliferować. Jeśli rozdzielenie jest rzadkie, należy dokładnie rozbić neurosfery do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, pipetując materiał w górę i w dół 50 razy, dociskając końcówkę 200 µL do dna probówki.

Wizualnie sprawdź postęp pod mikroskopem, aby upewnić się, że neurosfery uległy dysocjacji. Następnie podziel zawiesinę komórkową na równe części i przenieś ją do dwóch kolb T 75. Jedną przeznacz do dalszej ekspansji, a drugą do różnicowania.

Następnie inkubuj kolby. Wymień pożywkę komórek progenitorowych neuronów w kolbie przeznaczonej do ekspansji poprzez wirowanie. Następnie odlej starą pożywkę i dodaj nową pożywkę.

Wymieniaj pożywkę co cztery lub pięć dni, aż neurosfery osiągną pierwotny rozmiar od 300 do 500 mikronów. Aby rozpocząć różnicowanie komórek progenitorowych neuronów w kulturę bogatą w neurony, umieść pojedynczą szkiełko podstawowe w każdej studzience płytki 24-dołkowej i pokryj je, dodając 500 µL roztworu poli-L-lizyny o stężeniu 100 µg/mL do każdej z nich. Inkubuj płytki przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać roztwór poli-L-lizyny.

Opłucz płytkę zdejstylowaną sterylną wodą i ponownie odessa zawartość. Następnie pokryj dołki płytki 500 µL lamininy mysiej w stężeniu 5 µg/mL i inkubuj przez 30 minut. Po inkubacji przemyj dołki PBS, ponownie odessa zawartość i pozostaw je do wyschnięcia w dygestorium do hodowli tkankowych. Cztery dni po pasażowaniu komórek przenieś małe neurosfery z kolby przeznaczonej do różnicowania do pokrytej lamininą płytki 24-dołkowej.

Należy dodać około 500 neurosfer na dołek. Po sześciu godzinach inkubacji, gdy neurosfery przylgną do dna naczynia, należy usunąć medium proliferacyjne i dodać medium różnicujące. Medium to składa się z neurobasal medium, suplementu B 27, NGF, BDNF, CDF oraz kwasu retinowego. Następnie płytkę należy przenieść z powrotem do inkubatora. Po dwutygodniowej hodowli komórek progenitorowych neuronów w medium do różnicowania neuronów otrzymuje się kulturę bogatą w neurony.

Przepłucz neurony raz w PBS, a następnie utrwal je w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut. Po utrwaleniu przepłucz komórki trzykrotnie w PBS. Następnie przygotuj komórki do immunobarwienia, inkubując je w buforze permeabilizującym w temperaturze pokojowej przez 60 minut.

Następnie do dołków należy dodać przeciwciała poliklonalne i monoklonalne w 3% BSA w PBS. Po dodaniu innej pary przeciwciał do każdego dołka, inkubować je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wytrząsarce. Następnego dnia rano wypłukać szkiełka przykrywowe trzykrotnie za pomocą PBS, a następnie inkubować je z przeciwciałami wtórnymi anty-rabbit P SI 3 oraz anty-US fitzy w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez 90 minut po zakończeniu inkubacji.

Przemyj szkiełka nakrywki trzykrotnie w PBS. Następnie nanieś 10 µL medium montażowego na szkiełko przedmiotowe. Wyjmij szkiełko nakrywkę z naczynia hodowlanego i połóż ją stroną górną do dołu na medium montażowym.

Delikatnie usuń nadmiar medium montażowego i zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci. Aby przygotować komórki do mikrosekcji, najpierw zróżnicuj neuroprogenitory w celu uzyskania hodowli bogatej w neurony na membranie PEN. Użyj szkiełek powlekanych poli-L-lizyną i lamininą.

Wszystkie kolejne etapy należy przeprowadzić w warunkach wolnych od RNA. Następnie należy zabarwić hodowle przy użyciu barwnika histo gene, aby zwizualizować komórki; barwnik histo gene barwi jądra na kolor fioletowy, a cytoplazmę na jasnoróżowy, co ułatwia rozróżnienie neuronów i komórek glejowych na podstawie ich charakterystycznej morfologii. Należy umieścić preparat w 75% etanolu i dejonizowanej wodzie sterylnej na 30 sekund.

Następnie należy położyć preparas na chusteczce Kim wipe. Dodać 200 µL histo gene i odczekać 20 sekund. Następnie preparas należy kolejno zanurzać na 30 sekund w wodzie sterylnej dejonizowanej, 75% etanolu, 95% etanolu oraz 100% etanolu.

Następnie umieść preparat w ksylenie na pięć minut, a potem osusz go na chusteczce Kim wipe przez pięć minut. Następnie nałóż slajd z membraną PEN na zwykły slajd i umieść je w systemie do laserowej mikrodysekcji Veritas (laser capture micro dissection system lub LCM), korzystając z oprogramowania. Wykonaj obraz mapy drogowej, aby zlokalizować obszary czystych populacji neuronalnych pozbawionych astrocytów.

Oznacz te neurony za pomocą narzędzi do rysowania. Następnie przeprowadź laserową mikrodysekcję tych obszarów, wykorzystując komputerową precyzję i automatyzację w procesie dwuetapowym. W pierwszym kroku emitowane jest promieniowanie IR w wielu punktach przy mocy lasera ustawionej na 70 milliwatts i impulsie trwającym 2 500 microseconds, aby przytwierdzić membranę do nasadki.

Następnie zaznaczony obszar wycina się za pomocą narzędzia tnącego UV przy niskim ustawieniu napięcia wynoszącym 10 millivolts. Połączenie tych procesów pozwala na selektywne przeniesienie zaznaczonych obszarów na makroskopowe nakładki LCM. Po zebraniu minimum 100 neuronów, należy przy użyciu mikroskopu usunąć membranę z nakładki i umieścić ją w probówce.

Wyizoluj całkowite RNA z próbek LCM, używając zestawu do izolacji RNA P OPU, i potraktuj DNaza. Następnie przeprowadź amplifikację wyizolowanego RNA za pomocą zestawu do amplifikacji RNA ribo amp, postępując zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Na koniec przeprowadź analizę real-time R-T-P-C-R z użyciem sond TAC MAN w celu wykrycia ludzkiego ciężkiego łańcucha neurofilamentów.

Kulturę bogatą w neurony uzyskuje się poprzez różnicowanie czterodniowych neurosfer na powierzchniach pokrytych poli-L-lizyną i lamininą, w połączeniu ze specyficznymi czynnikami wzrostu indukującymi różnicowanie. Po dwóch tygodniach, w obszarach o niskiej gęstości, otrzymuje się kulturę bogatą w neurony, taką jak przedstawiona tutaj. Komórki mogą różnicować się w astrocyty, podobne do tych widocznych tutaj.

Różnicowanie astrocytów można również ukierunkować, stosując czynnik wzrostu CNTF zamiast czynników wykorzystywanych do różnicowania neuronów. Różnicowanie neuronów można zidentyfikować za pomocą przeciwciał przeciwko specyficznym markerom neuronalnym, takim jak new N i synapsyna, acetylocholinoesteraza i synaptofizyna, a także BDNF i GAAP 43. Pozytywne barwienie stanowi dowód na to, że zróżnicowane komórki wykazują cechy neuronów pierwotnych. Ponadto astrocyty można zidentyfikować poprzez pozytywne barwienie immunocytochemiczne na stat trzy i GAP.

Laserowa mikrodysekcja przechwytująca neuronów jest przeprowadzana na komórkach, które zostały zróżnicowane na szkiełkach z membraną PEN pokrytą poli-L-lizyną i lamininą; przedstawione tutaj są neurony barwione barwnikiem histologicznym. Aby zwizualizować komórki, można następnie obrysować interesujące nas komórki za pomocą lasera, który topi membranę PEN, powodując jej przyklejenie do nakładki przechwytującej umieszczonej powyżej. W końcowym etapie liczne komórki mogą zostać obrysowane i przechwycone na tę samą nakładkę w celu analizy DNA lub RNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji neuronów za pomocą mikrosekcji laserowej (LCM).