Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie modelu hodowli neuronów ludzkich, identyfikacja markerów neuronalnych i wyizolowanie czystej populacji neuronów do analizy ekspresji genów. Osiąga się to poprzez najpierw ekspansję ludzkich neuro komórek progenitorowych w celu wytworzenia ciągłego dopływu komórek progenitorowych. W drugim etapie komórki progenitorowe układu nerwowego są hodowane w obecności suplementów różnicujących i neurotroficznych czynników wzrostu w naczyniach pokrytych czynnikami przyłączenia.

Następnie przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych w celu określenia losu zróżnicowanych komórek progenitorowych neuro. Na koniec przeprowadza się mikrodysekcję laserową neuronów hodowanych na szkiełkach z błoną PEN, aby ułatwić analizę ekspresji genów specyficznych dla neuronów. Uzyskano wyniki, które pokazują, że zróżnicowane neuro komórki progenitorowe mają głównie charakter neuronalny.

Na podstawie barwienia immunofluorescencyjnego i wychwytywania neuronów. Dzięki mikrodysekcji wychwytywania laserowego ludzkie neuro komórki progenitorowe mogą być rozszerzane i różnicowane w kultury bogate w neurony. W przypadku badań in vitro, ponieważ kultury te zawierają pewne komórki galowe, możemy użyć mikropreparacji laserowej, aby wyizolować czystą populację neuronów.

Procedury te zademonstruje Ron Bouchard, starszy pracownik naukowy w naszym głównym ośrodku mikroskopowym. Aby rozpocząć tę procedurę, ożyw zamrożony zapas ludzkich neuro komórek progenitorowych wyizolowanych z mózgu płodu, szybko podgrzewając je do 37 stopni Celsjusza, a następnie dodając je do T 75 zawierającego 15 mililitrów wstępnie ciepłej pożywki neuropodstawowej, uzupełnionej 10 nanogramami na mililitr, EG, F i FGF. Po hodowli komórek przez trzy dni, przenieś neurosfery do 15-mililitrowej probówki i zagnieżdżaj je przez wirowanie z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut po odwirowaniu, wyrzuć supernatant, pozostawiając około 100 mikrolitrów pożywki i przenieś osad komórkowy do probówki einor.

Granulka komórek o pojemności 100 mikrolitrów wystarczy, aby podzielić się na dwie kolby T 75. Jeśli mniej, zmniejsz liczbę kolb, ponieważ neuroprogenitorowe komórki nie mogą się namnażać. Jeśli rozłupiesz cienko, dokładnie rozbij neurosfery na zawiesinę jednokomórkową, pipetując w górę iw dół 50 razy, trzymając końcówkę o pojemności 200 mikrolitrów przy dnie probówki.

Wizualnie sprawdź postęp za pomocą mikroskopu, aby upewnić się, że neurosfery są rozłączone. Następnie równo podzielić zawiesinę komórek i dodać ją do dwóch kolb T 75. Jeden dla ciągłej ekspansji, a drugi dla zróżnicowania.

Następnie inkubować kolby. Zmienić pożywkę komórek progenitorowych układu nerwowego w kolbie przeznaczonej do ekspansji przez odwirowanie. Następnie wyrzuć stare podłoże i dodaj nowe.

Zmieniaj pożywkę co cztery do pięciu dni, aż neurosfery osiągną swój pierwotny rozmiar od 300 do 500 mikronów. Aby rozpocząć różnicowanie komórek neuro progenitorów w kulturę bogatą w neurony, umieść pojedynczą szkiełko nakrywkowe w każdym dołku 24-dołkowej płytki i pokryj, dodając do każdej 500 mikrolitrów 100 mikrogramów na mililitr poli L lizyny. Dobrze inkubować naczynia przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odessać roztwór poliolilizyny.

Przepłukać płytkę dejonizowaną sterylną wodą i ponownie odssać. Następnie pokryj studzienki płytki 500 mikrolitrami po pięć mikrogramów na mililitr, mysią lamininą i inkubuj przez 30 minut po inkubacji, ponownie umyj studzienki aspiratem PBS i ustaw je do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych. Cztery dni po podziale komórek przenieś małe neurosfery z kolby oznaczonej do różnicowania do powlekanej płytki 24-dołkowej.

Dodaj gęstość około 500 neurosfer na dołek po inkubacji przez sześć godzin, gdy neurosfery przyczepią się do naczynia, usuń pożywkę proliferacyjną i dodaj różnicowanie. Pożywka składająca się z neuro baseal pożywki B 27, suplementu N-G-F-B-D-N-F-D-B-C i kwasu retinowego. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze po hodowli komórek progenitorowych neuro w pożywce różnicującej neurony przez dwa tygodnie, uzyskuje się kulturę bogatą w neurony.

Opłucz neurony raz w PBS, a następnie utrwal je w 4% aldehydzie paraform przez 30 minut. Po utrwaleniu przepłucz komórki trzykrotnie PBS. Następnie przygotuj komórki do barwienia immunologicznego, inkubując je z przepuszczalnym buforem w temperaturze pokojowej przez 60 minut.

Następnie dodaj przeciwciała poliklonalne i monoklonalne w 3% BSA w PBS do studzienek. Dodając do każdego z nich inną parę przeciwciał, dobrze inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w shakerze następnego ranka. Umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie PBS, a następnie inkubować je z przeciwciałami anty króliczymi P SI trzy i anty-US fitzy drugorzędowymi w temperaturze pokojowej w ciemności przez 90 minut po inkubacji.

Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie za pomocą PBS. Następnie umieść 10 mikrolitrów podłoża montażowego na szkiełku podstawowym. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z naczynia hodowlanego i połóż je do góry nogami na podłożu montażowym.

Delikatnie zetrzyj nadmiar medium montażowego i uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci. Aby przygotować komórki do mikrodysekcji, najpierw zróżnicuj komórki progenitorowe neuro w kulturę bogatą w neurony na błonie PEN. Szkiełka pokryte poli L lizyną i lamininą.

Wykonaj wszystkie kolejne kroki w warunkach wolnych od RNA. Następnie wybarwić kultury za pomocą barwienia genu histo w celu wizualizacji komórek gen histo barwi jądra na fioletowo, a cytoplazmę na jasnoróżowo, co ułatwia różnicowanie neuronów i komórek glejowych według ich odrębnej morfologii. Umieść szkiełko w 75% etanolu i dejonizowanej sterylnej wodzie na 30 sekund.

Następnie umieść szkiełko na chusteczce Kim. Dodaj 200 mikrolitrów genu histo i odczekaj 20 sekund. Następnie umieść szkiełko sekwencyjnie na 30 sekund w dejonizowanej sterylnej wodzie, 75% etanolu, 95% etanolu i 100% etanolu.

Następnie umieść w ksylenie na pięć minut i susz na chusteczce Kim przez pięć minut. Następnie umieść membranę PEN Slide na zwykłym szkiełku i umieść je w systemie mikropreparacji laserowej Veritas lub LCM za pomocą oprogramowania. Zrób obraz mapy drogowej, aby znaleźć obszary czystych populacji neuronów pozbawionych astrocytów.

Zaznacz te neurony za pomocą narzędzi do rysowania. Następnie wykonaj laserowe przechwytywanie tych obszarów przy użyciu sterowanej komputerowo precyzji i automatyzacji w dwuetapowym procesie. Po pierwsze, podczerwień jest wystrzeliwana w wiele punktów z ustawieniem mocy lasera na 70 miliwatów i impulsem 2 500 mikrosekund w celu przymocowania membrany do nasadki.

Następnie zaznaczony obszar jest wycinany za pomocą narzędzia tnącego UV przy niskim poziomie 10 miliwoltów. Kombinacja tych procesów selektywnie przechwytuje zaznaczone obszary na makr LCM przechwytywania. Gdy co najmniej 100 neuronów zostanie przechwyconych, użyj mikroskopu, aby usunąć błonę z czapeczki i umieścić ją na probówce.

Wyizoluj całkowite RNA z próbek LCM za pomocą zestawu do izolacji P OPU RNA i potraktuj DNA. Następnie amplifikuj wyizolowany RNA za pomocą zestawu do amplifikacji RNA ribo, postępując zgodnie z instrukcjami z zestawu. Na koniec przeprowadź analizę R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym za pomocą sond TAC MAN w celu wykrycia ciężkiego łańcucha ludzkiego neurofilamentu.

Kulturę bogatą w neurony uzyskuje się poprzez różnicowanie czterodniowych neurosfer przy użyciu powierzchni pokrytych poli-lizyną i laminatem w połączeniu z czynnikami wzrostu specyficznymi dla różnicowania. Po dwóch tygodniach uzyskuje się pokazaną tutaj kulturę bogatą w neurony w obszarach o niskiej gęstości. Komórki mogą różnicować się w astrocyty, takie jak te widoczne tutaj.

Różnicowaniem astrocytów można również kierować za pomocą czynnika wzrostu CNTF zamiast tych używanych do różnicowania neuronów. Różnicowanie neuronów można zidentyfikować za pomocą przeciwciał przeciwko specyficznym markerom neuronalnym, nowemu N i synapsyny, acetylocholinoesterazie i synaptofizynie oraz BDNF i GAAP 43 Barwienie dodatnie jest dowodem na to, że zróżnicowane komórki mają cechy neuronów pierwotnych. Dodatkowo astrocyty można zidentyfikować poprzez dodatnie barwienie immunologiczne stat three i GAP.

Mikrodysekcja neuronów wychwytywana laserowo jest wykonywana na komórkach, które zostały zróżnicowane na błonie PEN pokrytej poli-lizyną i lamininą Pokazane tutaj slajdy to neurony zabarwione barwnikiem histo. Aby zobrazować komórki, interesujące komórki można następnie obrysować za pomocą lasera, który topi membranę PEN, powodując jej przyklejenie się do umieszczonej nad nią nasadki wychwytującej. W końcu wiele komórek można obrysować i uchwycić na tej samej czapce w celu analizy DNA lub RNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować neurony za pomocą mikrodysekcji laserowej.