Cyfrowa mikroskopia holograficzna (DIHM) obiektów o słabym rozproszeniu
8 lutego 2014
Trójwymiarowe lokalizacje słabo rozpraszających obiektów mogą być jednoznacznie zidentyfikowane za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej (DIHM), która obejmuje niewielką modyfikację standardowego mikroskopu. Nasze oprogramowanie wykorzystuje prostą heurystykę obrazowania sprzężoną z propagacją wsteczną Rayleigha-Sommerfelda, aby uzyskać trójwymiarowe położenie i geometrię mikroskopijnego obiektu fazowego.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zrekonstruowanie pozycji 3D w geometrii łańcucha pływających komórek bakteryjnych. Osiąga się to poprzez wczesną hodowlę komórek bakteryjnych do odpowiedniego stężenia, aby zapewnić odpowiednią próbkę do obrazowania. W drugim kroku ustawia się i wyrównuje źródło światła LED, co pozwala na uzyskanie obrazów holograficznych.
Następnie wykorzystywane jest oprogramowanie do rekonstrukcji w celu uzyskania współrzędnych 3D łańcucha komórek bakteryjnych. Wyniki wskazują na możliwość rekonstrukcji pozycji 3D i konfiguracji komórek bakteryjnych na podstawie obrazowania holograficznego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest to, że obrazowanie wolumetryczne bez etykiet jest możliwe przy dużej liczbie klatek na sekundę.
Aby rozpocząć inokulację, 10 mililitrów pożywki KTY kryształkami lodu z zamrożonego wywaru szczepu Streptococcus V 4 0 5 1 1 97 inkubuje kulturę starterową w wytrząsarce obrotowej przez noc w temperaturze 35 stopni Celsjusza i 150 obr./min. Gdy dorośnie, zaszczep 10 mililitrów świeżej pożywki KTY z 500 mikrolitrami z nasyconej kultury starterowej. Inkubować przez 3,5 godziny w temperaturze 35 stopni Celsjusza i 150 obr./min, aż komórki osiągną gęstość optyczną o długości fali 600 nanometrów od 0,8 do 1,0.
Odpowiada to około pięć razy 10 do ósmych komórek na mililitr. Następnie rozcieńczyć komórki w ilości od jednego do 400 w świeżych pożywkach, aby uzyskać końcowe stężenie około 1 miliona komórek na mililitr. Następnie napełnij strzykawkę wazeliną i wykonaj pierścień smaru o wysokości jednego milimetra na szkiełku mikroskopowym.
Następnie umieść kroplę roztworu próbki na środku. Delikatnie umieść szklankę nakrywkową na próbce i lekko dociśnij szkło, aby uszczelnić krawędzie, upewniając się, że płyn styka się zarówno ze szkiełkiem, jak i szkłem nakrywkowym. Powstała komora na próbki powinna mieć głębokość od 100 do 200 mikrometrów.
Obróć soczewkę zanurzeniową z olejkiem 60 x na miejsce i dodaj kroplę oleju. Następnie umieść komorę na próbkę na stoliku mikroskopu ze szkłem nakrywkowym skierowanym w dół. Upewnij się, że między szkiełkiem nakrywkowym a soczewką nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
Ustaw ostrość na dolnej powierzchni komory próbki, a następnie ustaw ostrość skraplacza. Następnie wyłącz standardowe oświetlenie i umieść głowicę LED za otworem kondensora mikroskopu. Upewnij się, że kondensator jest ustawiony na tryb jasnego pola i ustaw zasilacz LED na maksymalną moc.
Następnie zamknij przysłonę kondensora do maksimum i popchnij diodę LED w jej mocowaniu, aż oświetlenie zostanie wyśrodkowane na aperturze obiektywu. Włącz komputer, a następnie przekieruj ścieżkę światła do portu kamery mikroskopu. Dostosuj liczbę klatek na sekundę do 30 klatek na sekundę, a rozmiar obrazu do pięciu 12 na pięć 12 pikseli w oprogramowaniu do akwizycji obrazów.
Sprawdź histogram intensywności obrazu, aby upewnić się, że żadna część obrazu nie jest nasycona lub niedoświetlona. Czas naświetlania klatki powinien być jak najkrótszy przy zachowaniu dobrego kontrastu. Jeśli komórki zbierają się w pobliżu interfejsu, ponownie ustaw ostrość mikroskopu, aby komórki bakteryjne były lekko rozogniskowane.
Komórki powinny leżeć około 10 do 30 mikronów od płaszczyzny ogniskowej, aby zapewnić optymalną rekonstrukcję. Po ponownym ustawieniu ostrości uzyskaj serię klatek wideo i zapisz jako nieskompresowany plik VI. Następnie uruchom oprogramowanie DIHM dostępne do bezpłatnego pobrania, aby przekonwertować klatkę wideo na numerycznie zogniskowany stos obrazów.
Przykładowe ramy są dostarczane z oprogramowaniem do rozpoczęcia rekonstrukcji. Wprowadź interesującą Cię ramkę i jej tło jako osobne pliki graficzne do pól. Obraz tła wiernie reprezentuje tło wideo w przypadku braku hologramu i zostanie wykorzystany do stłumienia wszelkich stałych dźwięków, które mogą zakłócać lokalizację i analizę holograficzną.
Następnie wprowadź parametry stosu wyjściowego w polach ustawień globalnych. Najpierw wprowadź położenie osiowe pierwszej klatki w początkowym ustawieniu ostrości. Następnie wprowadź liczbę plasterków w zrekonstruowanym stosie w liczbie kroków, a na koniec wprowadź rzeczywistą odległość między każdym plasterkiem w stosie w rozmiarze kroku.
Ustaw rozmiar kroku tak, aby był taki sam jak boczne odstępy między pikselami, aby zrekonstruować obiekty o prawidłowych proporcjach przy użyciu przykładowych danych. Wartość ta powinna wynosić 0,233 mikrometra. Następnie wprowadź oświetlenie kamery, długość fali i średni współczynnik załamania światła oraz boczną częstotliwość próbkowania.
W polu pikseli na mikron boczną częstotliwość próbkowania kamery można znaleźć, dzieląc powiększenie obiektywu przez rozmiar piksela czujnika aparatu. Korzystając z przykładowych danych, liczba wynosiłaby 60 x podzielona przez 14 mikrometrów, co równa się 4,29 piksela na mikron. Następnie, jeśli środek obiektu jest ciemny na hologramie, naciśnij przycisk odwrócenia gradientu Z.
Spowoduje to zastosowanie filtra, który wyodrębnia obiekty znajdujące się poniżej płaszczyzny ogniskowej w oryginalnej próbce. Następnie włącz filtr pasmowo-przepustowy, który jest odpowiedzialny za tłumienie udziału zaszumionych pikseli w obrazie. Jest on stosowany do każdego wycinka obrazu natychmiast po wygenerowaniu.
Następnie sprawdź stan włączenia przełącznika wyjścia pośredniego i upewnij się, że są włączone. Gdy te przełączniki są włączone, spowoduje to utworzenie dwóch filmów. Pierwszym wyjściem jest stos refokusa z nazwą pliku kończącą się na stos a V. Drugi stos to rzeczywista operacja gradientu z nazwą pliku kończącą się gradientem a VI.Idealnie, ten drugi stos będzie zawierał interesujący obiekt podświetlony jako jasny obiekt na ciemnym tle.
Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij uruchom w oknie głównym, aby wykonać polecenia. Wybrana ramka pojawi się w głównym polu oprogramowania. Następnie użyj narzędzia lupy znajdującego się na pasku narzędzi po lewej stronie obrazu, aby powiększyć lub pomniejszyć.
Użyj narzędzia prostokąta, aby wybrać obszar zainteresowania lub ROI i uchwyć jak najwięcej prążków hologramów wewnątrz prostokąta, aby zoptymalizować rekonstrukcję. Na koniec naciśnij przycisk procesu, aby wygenerować dwa oddzielne stosy obrazów. Sprawdź wynikowe stosy za pomocą obrazu J dostępnego na tej stronie internetowej.
Jeśli interesujący obiekt jest wyraźnie widoczny w stosie obrazów gradientu, przejdź do sekcji renderowania, aby wyodrębnić współrzędne obiektu. Aby rozpocząć renderowanie, naciśnij przycisk wyodrębniania obiektów, aby włączyć funkcję lokalizacji współrzędnych X, Y, Z. Następnie wprowadź ścieżkę i rozszerzenie dla wyjściowego pliku współrzędnych, wybierz styl promienia POV w polu wyjściowy styl współrzędnych.
Powoduje to, że program zapisuje plik obiektu, który można wizualizować za pomocą bezpłatnego pakietu oprogramowania do śledzenia promieni POV, który można pobrać z tej witryny, ponownie przetwarza obrazy w celu wyodrębnienia współrzędnych obiektów. Program poda serię współrzędnych X, Y, Z w wybranym ROI zapisanym w nazwie pliku w polu przewodów wyjściowych. Ekstrakcja współrzędnych obiektów trwa znacznie dłużej niż generowanie stosów.
Upewnij się, że przykładowy plik promienia POV dostarczony z kodem rekonstrukcji znajduje się w tym samym folderze, co plik współrzędnych wyjściowych. Edytuj przykładowy plik pov z kropką i zastąp nazwę pliku cudzysłowem w wierszu. Dołącz mój plik NC z nazwą pliku danych wygenerowanego przez kod rekonstrukcji.
Następnie dostosuj pozycję kamery, oświetlenie, teksturę i opcje renderowania w promieniu POV. Po zakończeniu kliknij przycisk Uruchom, aby renderować obraz bitmapowy. Jest to obraz łańcucha bakterii paciorkowca, który był chwilowo zorientowany.
Zakończ na płaszczyźnie ogniskowej. Obiekty w tej konfiguracji są trudne do zrekonstruowania i zazwyczaj dają plamę blisko płaszczyzny ogniskowej. Pokazany tutaj jest prawidłowo wyrenderowany obraz reprezentatywny dla większości klatek z tej serii, w których łańcuch nie jest zorientowany bezpośrednio wzdłuż osi optycznej.
Kształt i położenie obiektu są wiernie odwzorowane w renderingu, jak widać na panelu po prawej stronie. Po opanowaniu tej techniki można to zrobić w ciągu kilku minut.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie demonstruje zastosowanie cyfrowej holografii w układzie inline (DIHM) do rekonstrukcji trójwymiarowych pozycji i geometrii pływających komórek bakteryjnych. Technika ta umożliwia bezznacznikowe obrazowanie wolumetryczne przy wysokiej częstotliwości klatek, co stanowi znaczącą przewagę nad metodami tradycyjnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Cyfrowa holograficzna mikroskopia w linii (DIHM) jest zmodyfikowaną techniką mikroskopową.
- Umożliwia ona unikalną identyfikację słabo rozpraszających obiektów w trzech wymiarach.
- Obrazowanie holograficzne pozwala na rejestrację procesów dynamicznych w czasie rzeczywistym.
- Istniejące metody, takie jak mikroskopia konfokalna, często wymagają znakowania, co może zmieniać zachowanie próbek biologicznych.
Cel badania
- Odtworzenie trójwymiarowej pozycji i geometrii pływających komórek bakteryjnych.
- Wykazanie skuteczności metody DIHM w rejestrowaniu dynamiki żywych komórek.
- Porównanie zalet DIHM w stosunku do tradycyjnych metod obrazowania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie kultur komórek bakteryjnych o odpowiednich stężeniach.
- Ustawienie źródła światła LED w celu optymalizacji obrazowania holograficznego.
- Wykorzystanie oprogramowania do rekonstrukcji w celu uzyskania współrzędnych 3D.
- Analiza otrzymanych obrazów holograficznych w celu oceny konfiguracji komórek.
Główne wyniki
- Pozycje 3D komórek bakteryjnych zostały pomyślnie zrekonstruowane.
- Technika ta wykazała możliwość obrazowania z wysoką częstotliwością klatek bez konieczności stosowania znaczników.
- Wyniki wskazały na wyraźną przewagę nad mikroskopią konfokalną pod względem szybkości obrazowania oraz integralności próbki.
- Obrazowanie holograficzne okazało się skuteczne w badaniu dynamicznych procesów biologicznych.
Wnioski
- DIHM jest potężnym narzędziem do badania dynamiki żywych komórek bakteryjnych.
- Metoda ta pozwala na szczegółowe obrazowanie 3D bez modyfikowania próbki.
- Technika ta może zostać zastosowana w różnych obszarach badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Cyfrowa holografia w układzie inline (DIHM) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie wolumetryczne słabo rozpraszających próbek biologicznych przy wysokiej częstotliwości klatek, co rozwiązuje kluczowy problem w obrazowaniu żywych komórek, gdzie tradycyjne metody wymagają znakowania lub nie oferują rozdzielczości przestrzennej 3D. Możliwość ta wspiera procesy wczesnego odkrywania leków, zapewniając ilościowe, bezmodelowe pomiary pozycji i geometrii komórek w warunkach natywnych, co redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów i przesiewaniu fenotypowym. Kompatybilność tej techniki ze standardowym sprzętem do obrazowania oraz skalowalność objętości próbek sprawiają, że stanowi ona uniwersalną platformę do ograniczania ryzyka weryfikacji hipotez terapeutycznych w biologii odkrywczej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia jednoznaczną, bezmodelową pomiar lokalizacji i kształtu obiektów w próbkach mikroskopowych, wspierając weryfikację hipotez terapeutycznych bez konieczności stosowania zewnętrznych znaczników.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje standardowe kamery CMOS/CCD oraz oświetlenie LED lub laserowe, co pozwala na integrację z istniejącymi procedurami mikroskopowymi bez potrzeby użycia specjalistycznych odczynników.
- Wartość prognostyczna: Dostarcza ilościowych współrzędnych 3D struktur komórkowych, co ułatwia walidację celów funkcjonalnych i minimalizację ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią obserwację natywnej dynamiki.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Rejestruje wzory interferencyjne zawierające informacje o głębokości niezbędne do rekonstrukcji 3D, co umożliwia bezetykietową ocenę odpowiedzi komórkowych w złożonych mikrośrodowiskach.
- Wartość operacyjna: Określa dostępną objętość próbki na podstawie rozmiaru sensora kamery i koherencji oświetlenia, wspierając standaryzację między platformami dla objętości do 5 mm³ przy użyciu oświetlenia laserowego.
- Wartość predykcyjna: Wykorzystuje wsteczną propagację Rayleigha-Sommerfelda oraz heurystyki anomalii fazy Gouy'a do generowania powtarzalnych, ilościowych wyników w celu oceny gotowości i skalowalności testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając obserwację dynamicznych procesów biologicznych w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Pozwala na obrazowanie z wysoką częstotliwością klatek bez modyfikacji próbki, co pozwala zachować naturalne zachowanie obiektów podczas długofalowego śledzenia w modelach przedklinicznych.
- Wartość predykcyjna: Zmniejsza ryzyko mechanistyczne poprzez redukcję niejednoznaczności w zakresie geometrii i rozmieszczenia komórek, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
DIHM wpisuje się w kontinuum odkryć naukowych – od testowania hipotez we wczesnej biologii po identyfikację związków wiodących i walidację przedkliniczną, szczególnie w przypadkach, gdy do porównania warunków eksperymentalnych wymagane jest obrazowanie wolumetryczne, dynamiczne i bez zastosowania znaczników.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez zapewnienie wolnej od modelu lokalizacji 3D słabo rozpraszających obiektów, takich jak komórki bakteryjne lub struktury podkomórkowe.
- Screening: Umożliwia przygotowanie testów dzięki ilościowym, refokusowanym stosom obrazów, które pozwalają na porównanie konfiguracji komórkowych w różnych warunkach.
- Analityka: Generuje wyjściowe współrzędne X, Y, Z poprzez ekstrakcję cech, co umożliwia analizę statystyczną rozkładów przestrzennych i wzorców ruchu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez zachowanie integralności próbek podczas podłużnego obrazowania procesów dynamicznych.
- Zastosowania systemowe: Funkcjonuje jako wielokrotnie wykorzystywalna możliwość obrazowania, a nie technika jednorazowa, wykorzystując bezpłatne oprogramowanie do rekonstrukcji i standardowy sprzęt.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna dzięki bezznacznikowej i bezmodelowej rekonstrukcji 3D geometrii oraz pozycji obiektu.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność poprzez numeryczną refokusację oraz tłumienie szumu o stałym wzorcu za pomocą odejmowania tła.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki redukcji ryzyka biologicznego na późnych etapach poprzez wczesną, wysokowierną obserwację natywnych dynamik komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko dzięki ilościowym danym przestrzennym, które informują o pewności wyboru celu i lidera.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy w zakresie holograficznej akwizycji obrazu i rekonstrukcji numerycznej z wykorzystaniem wstecznej propagacji Rayleigha-Sommerfelda.
- Wymaga instrumentarium umożliwiającego oświetlenie falą płaską oraz rejestrację obrazu za pomocą matrycy CMOS/CCD przy określonych częstotliwościach klatek i rozdzielczościach.
- Wymaga standaryzacji koherencji oświetlenia, wielkości kroku oraz częstotliwości próbkowania bocznego pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalnej rekonstrukcji 3D.
- Wymaga dostosowania parametrów stosu wyjściowego (początkowa ogniskowa, liczba kroków, wielkość kroku) do skali eksperymentu i powiększenia.
- Ograniczenie praktyczne: optymalna rekonstrukcja wymaga, aby obiekty znajdowały się w odległości 10–30 mikronów od płaszczyzny ogniskowej, co wymusza precyzyjne przygotowanie próbki i ustawienie ostrości.
