Cyfrowa mikroskopia holograficzna (DIHM) obiektów o słabym rozproszeniu
February 8th, 2014
Trójwymiarowe lokalizacje słabo rozpraszających obiektów mogą być jednoznacznie zidentyfikowane za pomocą cyfrowej mikroskopii holograficznej (DIHM), która obejmuje niewielką modyfikację standardowego mikroskopu. Nasze oprogramowanie wykorzystuje prostą heurystykę obrazowania sprzężoną z propagacją wsteczną Rayleigha-Sommerfelda, aby uzyskać trójwymiarowe położenie i geometrię mikroskopijnego obiektu fazowego.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zrekonstruowanie pozycji 3D w geometrii łańcucha pływających komórek bakteryjnych. Osiąga się to poprzez wczesną hodowlę komórek bakteryjnych do odpowiedniego stężenia, aby zapewnić odpowiednią próbkę do obrazowania. W drugim kroku ustawia się i wyrównuje źródło światła LED, co pozwala na uzyskanie obrazów holograficznych.
Następnie wykorzystywane jest oprogramowanie do rekonstrukcji w celu uzyskania współrzędnych 3D łańcucha komórek bakteryjnych. Wyniki wskazują na możliwość rekonstrukcji pozycji 3D i konfiguracji komórek bakteryjnych na podstawie obrazowania holograficznego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna, jest to, że obrazowanie wolumetryczne bez etykiet jest możliwe przy dużej liczbie klatek na sekundę.
Aby rozpocząć inokulację, 10 mililitrów pożywki KTY kryształkami lodu z zamrożonego wywaru szczepu Streptococcus V 4 0 5 1 1 97 inkubuje kulturę starterową w wytrząsarce obrotowej przez noc w temperaturze 35 stopni Celsjusza i 150 obr./min. Gdy dorośnie, zaszczep 10 mililitrów świeżej pożywki KTY z 500 mikrolitrami z nasyconej kultury starterowej. Inkubować przez 3,5 godziny w temperaturze 35 stopni Celsjusza i 150 obr./min, aż komórki osiągną gęstość optyczną o długości fali 600 nanometrów od 0,8 do 1,0.
Odpowiada to około pięć razy 10 do ósmych komórek na mililitr. Następnie rozcieńczyć komórki w ilości od jednego do 400 w świeżych pożywkach, aby uzyskać końcowe stężenie około 1 miliona komórek na mililitr. Następnie napełnij strzykawkę wazeliną i wykonaj pierścień smaru o wysokości jednego milimetra na szkiełku mikroskopowym.
Następnie umieść kroplę roztworu próbki na środku. Delikatnie umieść szklankę nakrywkową na próbce i lekko dociśnij szkło, aby uszczelnić krawędzie, upewniając się, że płyn styka się zarówno ze szkiełkiem, jak i szkłem nakrywkowym. Powstała komora na próbki powinna mieć głębokość od 100 do 200 mikrometrów.
Obróć soczewkę zanurzeniową z olejkiem 60 x na miejsce i dodaj kroplę oleju. Następnie umieść komorę na próbkę na stoliku mikroskopu ze szkłem nakrywkowym skierowanym w dół. Upewnij się, że między szkiełkiem nakrywkowym a soczewką nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
Ustaw ostrość na dolnej powierzchni komory próbki, a następnie ustaw ostrość skraplacza. Następnie wyłącz standardowe oświetlenie i umieść głowicę LED za otworem kondensora mikroskopu. Upewnij się, że kondensator jest ustawiony na tryb jasnego pola i ustaw zasilacz LED na maksymalną moc.
Następnie zamknij przysłonę kondensora do maksimum i popchnij diodę LED w jej mocowaniu, aż oświetlenie zostanie wyśrodkowane na aperturze obiektywu. Włącz komputer, a następnie przekieruj ścieżkę światła do portu kamery mikroskopu. Dostosuj liczbę klatek na sekundę do 30 klatek na sekundę, a rozmiar obrazu do pięciu 12 na pięć 12 pikseli w oprogramowaniu do akwizycji obrazów.
Sprawdź histogram intensywności obrazu, aby upewnić się, że żadna część obrazu nie jest nasycona lub niedoświetlona. Czas naświetlania klatki powinien być jak najkrótszy przy zachowaniu dobrego kontrastu. Jeśli komórki zbierają się w pobliżu interfejsu, ponownie ustaw ostrość mikroskopu, aby komórki bakteryjne były lekko rozogniskowane.
Komórki powinny leżeć około 10 do 30 mikronów od płaszczyzny ogniskowej, aby zapewnić optymalną rekonstrukcję. Po ponownym ustawieniu ostrości uzyskaj serię klatek wideo i zapisz jako nieskompresowany plik VI. Następnie uruchom oprogramowanie DIHM dostępne do bezpłatnego pobrania, aby przekonwertować klatkę wideo na numerycznie zogniskowany stos obrazów.
Przykładowe ramy są dostarczane z oprogramowaniem do rozpoczęcia rekonstrukcji. Wprowadź interesującą Cię ramkę i jej tło jako osobne pliki graficzne do pól. Obraz tła wiernie reprezentuje tło wideo w przypadku braku hologramu i zostanie wykorzystany do stłumienia wszelkich stałych dźwięków, które mogą zakłócać lokalizację i analizę holograficzną.
Następnie wprowadź parametry stosu wyjściowego w polach ustawień globalnych. Najpierw wprowadź położenie osiowe pierwszej klatki w początkowym ustawieniu ostrości. Następnie wprowadź liczbę plasterków w zrekonstruowanym stosie w liczbie kroków, a na koniec wprowadź rzeczywistą odległość między każdym plasterkiem w stosie w rozmiarze kroku.
Ustaw rozmiar kroku tak, aby był taki sam jak boczne odstępy między pikselami, aby zrekonstruować obiekty o prawidłowych proporcjach przy użyciu przykładowych danych. Wartość ta powinna wynosić 0,233 mikrometra. Następnie wprowadź oświetlenie kamery, długość fali i średni współczynnik załamania światła oraz boczną częstotliwość próbkowania.
W polu pikseli na mikron boczną częstotliwość próbkowania kamery można znaleźć, dzieląc powiększenie obiektywu przez rozmiar piksela czujnika aparatu. Korzystając z przykładowych danych, liczba wynosiłaby 60 x podzielona przez 14 mikrometrów, co równa się 4,29 piksela na mikron. Następnie, jeśli środek obiektu jest ciemny na hologramie, naciśnij przycisk odwrócenia gradientu Z.
Spowoduje to zastosowanie filtra, który wyodrębnia obiekty znajdujące się poniżej płaszczyzny ogniskowej w oryginalnej próbce. Następnie włącz filtr pasmowo-przepustowy, który jest odpowiedzialny za tłumienie udziału zaszumionych pikseli w obrazie. Jest on stosowany do każdego wycinka obrazu natychmiast po wygenerowaniu.
Następnie sprawdź stan włączenia przełącznika wyjścia pośredniego i upewnij się, że są włączone. Gdy te przełączniki są włączone, spowoduje to utworzenie dwóch filmów. Pierwszym wyjściem jest stos refokusa z nazwą pliku kończącą się na stos a V. Drugi stos to rzeczywista operacja gradientu z nazwą pliku kończącą się gradientem a VI.Idealnie, ten drugi stos będzie zawierał interesujący obiekt podświetlony jako jasny obiekt na ciemnym tle.
Po ustawieniu wszystkich parametrów naciśnij uruchom w oknie głównym, aby wykonać polecenia. Wybrana ramka pojawi się w głównym polu oprogramowania. Następnie użyj narzędzia lupy znajdującego się na pasku narzędzi po lewej stronie obrazu, aby powiększyć lub pomniejszyć.
Użyj narzędzia prostokąta, aby wybrać obszar zainteresowania lub ROI i uchwyć jak najwięcej prążków hologramów wewnątrz prostokąta, aby zoptymalizować rekonstrukcję. Na koniec naciśnij przycisk procesu, aby wygenerować dwa oddzielne stosy obrazów. Sprawdź wynikowe stosy za pomocą obrazu J dostępnego na tej stronie internetowej.
Jeśli interesujący obiekt jest wyraźnie widoczny w stosie obrazów gradientu, przejdź do sekcji renderowania, aby wyodrębnić współrzędne obiektu. Aby rozpocząć renderowanie, naciśnij przycisk wyodrębniania obiektów, aby włączyć funkcję lokalizacji współrzędnych X, Y, Z. Następnie wprowadź ścieżkę i rozszerzenie dla wyjściowego pliku współrzędnych, wybierz styl promienia POV w polu wyjściowy styl współrzędnych.
Powoduje to, że program zapisuje plik obiektu, który można wizualizować za pomocą bezpłatnego pakietu oprogramowania do śledzenia promieni POV, który można pobrać z tej witryny, ponownie przetwarza obrazy w celu wyodrębnienia współrzędnych obiektów. Program poda serię współrzędnych X, Y, Z w wybranym ROI zapisanym w nazwie pliku w polu przewodów wyjściowych. Ekstrakcja współrzędnych obiektów trwa znacznie dłużej niż generowanie stosów.
Upewnij się, że przykładowy plik promienia POV dostarczony z kodem rekonstrukcji znajduje się w tym samym folderze, co plik współrzędnych wyjściowych. Edytuj przykładowy plik pov z kropką i zastąp nazwę pliku cudzysłowem w wierszu. Dołącz mój plik NC z nazwą pliku danych wygenerowanego przez kod rekonstrukcji.
Następnie dostosuj pozycję kamery, oświetlenie, teksturę i opcje renderowania w promieniu POV. Po zakończeniu kliknij przycisk Uruchom, aby renderować obraz bitmapowy. Jest to obraz łańcucha bakterii paciorkowca, który był chwilowo zorientowany.
Zakończ na płaszczyźnie ogniskowej. Obiekty w tej konfiguracji są trudne do zrekonstruowania i zazwyczaj dają plamę blisko płaszczyzny ogniskowej. Pokazany tutaj jest prawidłowo wyrenderowany obraz reprezentatywny dla większości klatek z tej serii, w których łańcuch nie jest zorientowany bezpośrednio wzdłuż osi optycznej.
Kształt i położenie obiektu są wiernie odwzorowane w renderingu, jak widać na panelu po prawej stronie. Po opanowaniu tej techniki można to zrobić w ciągu kilku minut.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie demonstruje zastosowanie cyfrowej mikroskopii holograficznej w linii (DIHM) do rekonstrukcji trójwymiarowych pozycji i geometrii pływających komórek bakteryjnych. Technika ta umożliwia bezznacznikowe obrazowanie objętościowe z wysoką częstotliwością klatek, co zapewnia znaczącą przewagę nad tradycyjnymi metodami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Techniki obrazowania
Tło
- Cyfrowa mikroskopia holograficzna w linii (DIHM) jest zmodyfikowaną techniką mikroskopii.
- Umożliwia unikalne identyfikowanie słabo rozpraszających obiektów w trzech wymiarach.
- Holograficzne obrazowanie może rejestrować dynamiczne procesy w czasie rzeczywistym.
- Istniejące metody, takie jak mikroskopia konfokalna, często wymagają znaczników, które mogą zmieniać zachowanie próbek biologicznych.
Cel badania
- Rekonstrukcja 3D pozycji i geometrii pływających komórek bakteryjnych.
- Demonstracja skuteczności DIHM w rejestrowaniu dynamiki żywych komórek.
- Porównanie zalet DIHM z tradycyjnymi metodami obrazowania.
Stosowane metody
- Przygotowanie kultur komórek bakteryjnych w odpowiednich stężeniach.
- Wyrównanie źródła światła LED dla optymalnego obrazowania holograficznego.
- Wykorzystanie oprogramowania do rekonstrukcji do uzyskania współrzędnych 3D.
- Analiza wynikowych obrazów holograficznych w celu oceny konfiguracji komórek.
Główne wyniki
- Udane odtworzenie 3D pozycji komórek bakteryjnych.
- Technika wykazała się wysoką częstotliwością klatek bez potrzeby stosowania znaczników.
- Wyniki wskazują na wyraźną przewagę nad mikroskopia konfokalną pod względem szybkości obrazowania i integralności próbki.
- Holograficzne obrazowanie okazało się skuteczne w dynamicznych procesach biologicznych.
Wnioski
- DIHM jest potężnym narzędziem do badania dynamiki żywych komórek bakteryjnych.
- Metoda pozwala na szczegółowe obrazowanie 3D bez modyfikacji próbki.
- Ta technika może być zastosowana w różnych obszarach badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Digital inline holographic microscopy (DIHM) enables label-free volumetric imaging of weakly-scattering biological samples at high frame rates, addressing a key limitation in live-cell imaging where traditional methods require labeling or lack 3D spatial resolution. This capability supports early discovery workflows by providing quantitative, model-free measurements of cellular position and geometry in native conditions, reducing mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening. The technique’s compatibility with standard imaging hardware and scalable sample volumes positions it as a reusable platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables unambiguous, model-free measurement of object location and shape in microscopic samples, supporting therapeutic hypothesis interrogation without exogenous labels.
- Operational Value: Uses standard CMOS/CCD cameras and LED or laser illumination, allowing integration into existing microscopy workflows without specialized reagents.
- Predictive Value: Provides quantitative 3D coordinates of cellular structures, facilitating functional target validation and biological de-risking through direct observation of native dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Captures interference patterns that contain depth information for 3D reconstruction, enabling label-free assessment of cellular responses in complex microenvironments.
- Operational Value: Defines accessible sample volume via camera sensor size and illumination coherence, supporting standardization across platforms with volumes up to 5 mm³ using laser illumination.
- Predictive Value: Employs Rayleigh-Sommerfeld back propagation and Gouy phase anomaly heuristics to generate reproducible, quantitative outputs for assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time observation of dynamic biological processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Allows high-frame-rate imaging without sample alteration, preserving native behavior for longitudinal tracking in preclinical models.
- Predictive Value: Delivers mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular geometry and positioning, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
DIHM fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, particularly where label-free, volumetric, and dynamic imaging are required to compare experimental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing model-free 3D localization of weakly-scattering objects like bacterial cells or subcellular structures.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, refocused image stacks that allow comparison of cellular configurations across conditions.
- Analytics: Generates X, Y, Z coordinate outputs via feature extraction, enabling statistical analysis of spatial distributions and motion patterns.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving sample integrity during longitudinal imaging of dynamic processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability rather than a single-use technique, leveraging free reconstruction software and standard hardware.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free, model-free 3D reconstruction of object geometry and position.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via numerical refocusion and fixed-pattern noise suppression using background subtraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early, high-fidelity observation of native cellular dynamics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via quantitative spatial data that informs target confidence and lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holographic image acquisition and numerical reconstruction using Rayleigh-Sommerfeld back propagation.
- Needs instrumentation capable of plane-wave illumination and CMOS/CCD image capture at defined frame rates and resolutions.
- Demands cross-team standardization of illumination coherence, step size, and lateral sampling frequency for reproducible 3D reconstruction.
- Requires adaptation of output stack parameters (start focus, number of steps, step size) to match experimental scale and magnification.
- Practical limitation: optimal reconstruction requires objects to lie 10–30 microns from the focal plane, necessitating precise sample preparation and focusing.
