Protokół trawienia trypsyny do analizy unaczynienia siatkówki w modelu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie sieci naczyniowej siatkówki. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw serii płukania wodą izolowanej siatkówki. W drugim etapie siatkówka jest trawiona w trypsynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około jedną do półtorej godziny, w zależności od wielkości siatkówki.

Następnie izoluje się naczynia krwionośne poprzez dodatkowe płukanie wodą i preparację pod mikroskopem. Ostatecznie można uwidocznić patologiczne zmiany naczyniowe, takie jak mikrotętniaki, zwyrodnienie naczyń włosowatych i nieprawidłowy stosunek komórek śródbłonka do pasożytów. Tak więc główną zaletą try and digest w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przygotowanie płaskich mocowań siatkówki, jest to, że cała sieć naczyniowa może być uwydatniona z dużą jasnością.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ jest ona technicznie trudna i trudna do konsekwentnego wykonywania. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji naczyń krwionośnych są trudne do nauczenia się za pomocą samych słów. Jest to bardzo cenne narzędzie w każdym laboratorium, które przeprowadza badania biologii naczyniowej siatkówki, takie jak niektóre choroby, takie jak retinopatia cukrzycowa, demonstrując tę technikę Jonathan Chow, utalentowany student medycyny z mojego laboratorium.

Po utrwaleniu wyłuszczonego oka myszy i 10% neutralnej buforowanej forminy przez 24 godziny, umieść oko na szalce Petriego i zalej niewielką ilością wody. Rozpocznij sekcję od użycia nożyczek do preparacji, aby ostrożnie wykonać wstępne nacięcie rogówki. Następnie, przytrzymując obszar cięcia prostymi kleszczami, użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż granicy rogówki i twardówki usuwającej rogówkę.

Następnie użyj cienkich, zakrzywionych i prostych kleszczy. Aby powoli i ostrożnie oderwać twardówkę i naczyniówkę od siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego. Następnie usuń soczewkę i nadmiar tęczówki i zanieczyszczeń z siatkówki, aby pomóc oddzielić warstwy siatkówki nerwowej od naczyń krwionośnych.

Przy około 500 mikrolitrach 45 mikrometrów przefiltruj wodę na płytkę 24-dołkową i umieść siatkówkę w dołku, a następnie delikatnie potrząsaj przez cztery do pięciu godzin w temperaturze pokojowej, zmieniając wodę co 30 do 60 minut. Kontynuuj mycie siatkówki w wodzie przez noc, delikatnie potrząsając W temperaturze pokojowej następnego dnia usuń wodę i przy 3% trypsyny sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że w studni nie znaleziono żadnych zanieczyszczeń. Aby uniknąć przylegania do niego układu krwionośnego, inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając lub bez potrząsania przez jedną do półtorej godziny.

Kiedy tkanka zacznie wykazywać oznaki rozpadu, umieść płytkę na stoliku mikroskopu, a następnie omijając siatkówkę. Ostrożnie usuń trypsynę, aby oddzielić naczynia krwionośne. Najpierw dodaj przefiltrowaną wodę do siatkówki za pomocą kleszczy.

Oderwij wewnętrzną membranę ograniczającą, która ma postać cienkiej, przezroczystej warstwy. Wstrząsnąć płytką z lekkim poruszeniem. Po pięciu minutach ponownie umieść płytkę na stoliku mikroskopu i ostrożnie wymień wodę, unikając uszkodzenia siatkówki, aby pomóc uwolnić sieć naczyń z przylegającej tkanki siatkówki.

Umyj siatkówkę, jak właśnie pokazano, aż po ostatnim praniu w wodzie pozostanie niewiele zanieczyszczeń lub nie ma ich wcale. Dlatego zazwyczaj usunięcie całej tkanki nienaczyniowej jest najtrudniejszą częścią procedury. Następujące techniki mogą być stosowane sekwencyjnie lub pojedynczo Aby ułatwić izolację sieci naczyniowej, jedną z ważnych wskazówek jest zanurzenie wszystkich narzędzi i trypsyny przed manipulowaniem siatkówką.

Może to pomóc w uniknięciu przywierania chusteczki do sprzętu. Pokryj końcówkę mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów zarezerwowaną trypsyną, a następnie ostrożnie pipetuj wodę w górę iw dół, przylegając do naczyń siatkówki i w ich kierunku, powodując delikatne mieszanie. Jeśli tkanka nienaczyniowa jest nadal oporna w środku, mikropipeta pokryta trypsyną kończy się na nerwie wzrokowym i ostrożnie pipetuje całą sieć naczyń w górę iw dół, aby pomóc rozbić tkankę nienaczyniową.

Wreszcie dobrze. Kleszcze mogą być używane do delikatnego podnoszenia naczyń krwionośnych z wody, aby usunąć wszelkie przylegające elementy nienaczyniowe. Efektem końcowym powinna być nienaruszona sieć naczyniowa siatkówki wolna od zanieczyszczeń.

Aby uwidocznić układ naczyniowy, najpierw umieść kroplę wody na czystym szkiełku. Następnie przenieś strawione naczynia do wody pod kontrolą lunety. Jeśli mocowanie klapy VA jest złożone lub rozłożone, złożone naczynia prowadzą do słabej widoczności.

Po zabarwieniu, jeśli chusteczka jest złożona, dodaj więcej wody i delikatnie potrząśnij szkiełkiem, aby ułatwić rozłożenie. Następnie użyj mikropipety, aby powoli usunąć nadmiar wody. Produktem końcowym udanego zabiegu jest płaskie mocowanie całej sieci unaczynienia siatkówki myszy z zachowaną architekturą i wybarwioną hematem, toiną i eoiną.

Jak pokazano tutaj, jak widać na tym obrazie, w siatkówce można zaobserwować wyraźne różnicowanie między komórkami śródbłonka a perycytami. Jądra komórek śródbłonka, jak wskazano białą strzałką, są owalne lub wydłużone i leżą w całości w ścianie naczynia. Jądra pasożyta są oznaczone czarną strzałką, są małe, kuliste i na ogół mają wypukłe położenie wzdłuż ściany naczynia włosowatego.

Trypsyna i trawienie jest powszechną procedurą stosowaną do analizy patologii naczyniowej w modelach zwierzęcych z cukrzycą. Ten obraz przedstawia przykład zwyrodnienia naczyń włosowatych wskazywanego białą strzałką obserwowaną u myszy DB DB, modelu cukrzycy typu drugiego. Chociaż procedura ta została zoptymalizowana dla siatkówki myszy, podobne wyniki można również uzyskać w siatkówkach szczurów.

Ważne jest, aby pamiętać, że siatkówki szczurów, jak pokazano na tych zdjęciach, są większe niż siatkówki myszy i wymagają 12, a nie 24 płytek. Sieć naczyniowa siatkówki szczura jest również mniej delikatna niż jej mysi odpowiednik. Niezwykle ważne jest usunięcie jak największej ilości tkanki nienaczyniowej.

Wszelkie pozostałości doprowadzą do niespecyficznego zabarwienia i doprowadzą do słabej wizualizacji układu naczyniowego. Na tym obrazie można zaobserwować na przykład nieudane usunięcie całej tkanki nienaczyniowej. Podobnie, ważne jest również, aby siatkówka była rozłożona podczas montażu, aby poprawić wizualizację układu naczyniowego.

To zdjęcie pokazuje nieudane rozwinięcie płaskiego mocowania naczyniowego. Po opanowaniu tej technicznie trudnej procedury. Tripy i digesty mogą być niezwykle cenną metodą, która pozwala na szczegółową wizualizację całej sieci naczyniowej.

Ulepszając tę technikę w oku myszy, naukowcy mogą wykorzystać genetycznie zmodyfikowane myszy do badania różnych ścieżek, które mogą przejąć kontrolę nad unaczynieniem siatkówki i pozwolić nam zrozumieć patofizjologię różnych chorób siatkówki. W rezultacie możemy lepiej zrozumieć patologie chorobowe, takie jak retinopatia cukrzycowa. Badając modele myszy, takie jak mysz DVDB, może to ostatecznie dać możliwość znalezienia nowych potencjalnych interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na unaczynienie siatkówki.