Name: Protokół trawienia trypsyny do analizy unaczynienia siatkówki w modelu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę trawienia trypsyną do analizy unaczynienia siatkówki w modelu myszy. Technika ta umożliwia wyraźną wizualizację całej sieci naczyniowej i zmian patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Society for Prevention of Blindness (JCC, AAF), nieograniczone fundusze dla Departamentu Okulistyki z Research to Prevent Blindness (RPB), NY oraz RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).

1. Przygotowanie siatkówki
<ol>
 <li>Wyłuszczenie oka myszy. Jedną ręką otwórz powieki tak, aby oko było widoczne. Z drugiej strony, używając zakrzywionych kleszczy (zakrzywionych skierowanych do góry), wywieraj nacisk na górne i dolne aspekty orbity, aż kula ziemska wysunie się. Delikatnie zamknij kleszcze w tylnej części oka i podnieś ciągłym ruchem, aby wyłuszczyć oko.</li>
 <li>Napraw oko 10% neutralną buforowaną formaliną przez co najmniej 24 godziny.</li>
 <li>Umieścić oko w roztworze PBS na małej szalce Petriego.</li>
 <li>Dokładnie wypreparuj siatkówkę pod mikroskopem, uważając, aby nie wywołać dużych łez. Wykonaj wstępne nacięcie w rogówce za pomocą nożyczek preparacyjnych. Następnie, przytrzymując obszar cięcia prostymi kleszczami, użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż granicy rogówki i twardówki, usuwając rogówkę. Za pomocą cienkich zakrzywionych i prostych kleszczy ostrożnie oderwij twardówkę i naczyniówkę od siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego. Ten krok wymaga cierpliwości, ponieważ szybkie uwolnienie siatkówki może prowadzić do łez. Usuń soczewkę i nadmiar tęczówki i zanieczyszczeń z siatkówki 16.</li>
</ol>
2. Mycie wodą
<ol>
 <li>Umieść siatkówkę w naczyniu z 24 dołkami i zalej wodą (około 500 μl, przefiltrowaną filtrem co najmniej 45 μm).</li>
 <li>Zmieniaj wodę co 30 min-1 godzinę, co najmniej 4-5 razy.</li>
 <li>Pozostaw na noc w wodzie z delikatnym wstrząsaniem o temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Uwaga: Etapy mycia są bardzo ważne, ponieważ pomagają oddzielić warstwy nerwowe siatkówki od naczyń krwionośnych.
3. Trawienie trypsyny
<ol>
 <li>Usunąć wodę i inkubować siatkówkę w roztworze 3% trypsyny (Difco 1:250) w 0,1 M buforze Tris (pH 7,8) w temperaturze 37 °C, delikatnie lub bez wstrząsania. Trawienie trypsyny jest zakończone, gdy tkanka zaczyna wykazywać oznaki rozpadu (około 1,5 godziny). Uwaga: Unikaj gwałtownego potrząsania, ponieważ może to uszkodzić naczynia krwionośne. </li>
 <li>Ostrożnie odpipetuj trypsynę do osobnego dołka za pomocą mikroskopu, aby uniknąć dotykania siatkówki. Ten nadmiar trypsyny można wykorzystać później, podczas manipulowania naczyniami pod mikroskopem, w kroku 4.3.</li>
</ol>
4. Oddzielanie naczyń krwionośnych
<ol>
 <li>Dodaj przefiltrowaną wodę do siatkówki. Następnie spróbuj odkleić wewnętrzną membranę ograniczającą za pomocą kleszczy, w razie potrzeby używając nożyczek. Wstrząsać z lekkim mieszaniem przez 5 minut. Ostrożnie odpipetuj wodę pod mikroskopem, aby uniknąć uszkodzenia siatkówki.</li>
 <li>Powtarzaj płukanie wodą (po 5 minut każde), aby pomóc uwolnić sieć naczyń z przylegającej tkanki siatkówki. Mycie wodą jest zakończone, gdy po umyciu w wodzie pozostaje niewiele zanieczyszczeń lub nie ma ich wcale.</li>
 <li>Konieczne są teraz ostrożne manipulacje pod mikroskopem preparacyjnym, aby jeszcze bardziej uwolnić sieć naczyń. Poniżej znajduje się kilka przydatnych technik, które mogą być stosowane kolejno lub indywidualnie, aby osiągnąć pożądany rezultat w oparciu o preferencje techniczne:
 <ol class="lalpha">
 <li>Za pomocą pipety o pojemności 200 μl ostrożnie odpipetuj wodę w górę i w dół w pobliżu naczyń, wdmuchując wodę do naczyń, powodując delikatne mieszanie.</li>
 <li>Za pomocą pipety o pojemności 200 μl odpipetuj trypsynę w górę i w dół, aby pokryć ścianki pipety. Następnie OSTROŻNIE odpipetuj całą sieć naczyń krwionośnych w górę iw dół, aby pomóc rozbić tkankę nienaczyniową. Uwaga: Wyśrodkowanie końcówki pipety na nerwie wzrokowym, a nie na krawędziach sieci naczyniowej, może również zapobiec przywieraniu układu krwionośnego do końcówki. </li>
 <li>Delikatnie wyjmij naczynia krwionośne cienkimi kleszczami z wody, aby usunąć elementy nienaczyniowe.</li>
 <li>Jeśli powyższe kroki nie zadziałają, dodaj trypsynę do siatkówki, aby pomóc w rozbiciu tkanki, i inkubuj w temperaturze 37 °C przez kilka minut. Następnie usuń trypsynę i powtórz kroki 4.1-4.3.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
Uwaga: Upewnij się, że wszystkie narzędzia, które będą miały kontakt z naczyniami, są pokryte trypsyną (np. końcówka pipety, kleszcze). Pomoże to uniknąć przylegania naczyń krwionośnych do sprzętu.
5. Wizualizacja układu naczyniowego
<ol>
 <li>Umieść kroplę wody na czystym szkiełku. Za pomocą pipety lub kleszczyków o pojemności 200 μl przenieś strawione naczynia do wody. Upewnij się, że płaski uchwyt naczyniowy jest rozłożony. Napięcie powierzchniowe wody pomaga rozwinąć przeźroczystą sieć naczyniową. Jeśli chusteczka się nie rozwija, dodaj więcej wody i delikatnie potrząśnij szkiełkiem, aby ułatwić rozkładanie.</li>
 <li>Nadmiar wody należy usuwać bardzo powoli, pipetując lub używając ręcznika papierowego.</li>
 <li>Pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia.</li>
 <li>Barwienie przesuwa się za pomocą odpowiedniego protokołu z barwieniem PAS/hematoksyliną lub H&E. Uwaga: PAS / hematoksylina jest przydatna do identyfikacji ścian naczyń i jąder komórkowych; H&E jest również przydatny do demonstracji RBC. </li>
 <li>Odwodnić i zamontować (medium montażowe Permount).</li>
</ol>

<ol><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li>
<li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li>
<li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRP%2Ftrypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li>
<li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model%3B+SHR%2FN%3AMcc-cp+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li>
<li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li>
<li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li>
<li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db%2Fdb+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li>
<li>Chapter 30. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diabetic+Retinopathy%22">Diabetic Retinopathy</a>. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).</li>
<li>Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenblatt%2C+B+%22Ophthalmology%22">Ophthalmology</a>. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).</li>
<li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li>
<li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li>
<li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li>
<li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li>
<li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%3A+a+model+of+vessel+loss%2C+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li>
<li>The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html">http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html</a> (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Trawienie trypsyny jest standardową metodą oceny unaczynienia siatkówki. Niestety, jest to wyzwanie techniczne i może skutkować dużą utratą próbki, jeśli nie zostanie wykonane prawidłowo. Co więcej, procedura ta jest szczególnie trudna u myszy, co może ograniczać zastosowanie tej techniki w powszechnie stosowanych genetycznych modelach zwierzęcych chorób oczu. Niniejszy artykuł zawiera wskazówki, jak skutecznie i konsekwentnie wykonywać zabieg w oczach myszy.
W protokole znajduje się kilka kry...

Wizualizacja unaczynienia siatkówki jest niezwykle ważnym podejściem do analizy mechanizmów różnych chorób oczu, takich jak retinopatia cukrzycowa. Pozwala na ocenę najwcześniejszych nieprawidłowości naczyniowych, w tym mikrotętniaków, zwyrodnień naczyń włosowatych i utraty okołocytów 8,9 . Do tej pory opracowano kilka technik analizy unaczynienia siatkówki. Perfuzja różnych barwników została użyta do podkreślenia naczyń, ale wszystkie miały podobne ograniczenia. Wstrzyknięcie rzadko uwydatnia całe unaczynienie siatkówki, chyba że jest podawane pod wysokim ciśnieniem, co grozi pęknięciem i uszkodzeniem naczyń krwionośnych 1. Barwienie immunologiczne śródbłonka naczyń krwionośnych izolektyną G B4 znakowaną fluoroforem (Alexa Fluor 594 sprzężona; I21413; Invitrogen; Rozcieńczenie 1:100) i płaskie mocowania siatkówki mogą podkreślić ogólną architekturę naczyń, ale bez szczegółowej wizualizacji naczyń włosowatych, błon podstawnych i perycytów. Friedenwald zauważył, że naczynia mogą być podświetlone przez barwienie płaskich mocowań siatkówki kwasem okresowym Schiffa (PAS) lub barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E) 10. Jednak barwienie nie było specyficzne dla naczyń i uwydatniało również tkankę nienaczyniową, co utrudniało rozróżnienie naczyń. W latach sześćdziesiątych XX wieku Cogan i Kuwabara opracowali technikę trawienia trypsyny, która ułatwiła wizualizację unaczynienia siatkówki poprzez trawienie nienaczyniowych składników siatkówki 1. Od tego czasu trawienie trypsyny stało się złotym standardem w analizie unaczynienia siatkówki 2-5. Należy jednak zauważyć, że opisano inne alternatywne techniki izolacji układu naczyniowego. Zastosowanie lizy osmotycznej zostało wykorzystane do izolacji układu naczyniowego i umożliwienia badań biochemicznych tkanki 11,12, ale procedura ta nie została wykorzystana jako podstawowa metoda badań anatomicznych. Metoda druku tkankowego została wykorzystana do izolacji dużych segmentów mikrokrążenia i pozwala na badanie elektrotonicznej architektury układu naczyniowego 13. Teoretycznie technika ta może być również wykorzystywana do badania zmian anatomicznych, ponieważ jakość naczyń jest wysoka. Jest jednak w stanie wyizolować tylko odcinki całej sieci naczyniowej. Chociaż metody te nie mogą zastąpić trawienia trypsyny, należy zauważyć, że mają one różne zalety i wady i są pod tym względem komplementarne.
Metoda trawienia trypsyny jest technicznie wymagająca i trudna do konsekwentnego wykonywania 6,7. Ponadto zauważono, że trawienie trypsyny jest szczególnie trudne w modelu mysim, szczególnie jeśli chce się zachować ogólną architekturę naczyniową siatkówki 6,7. Wyzwania obejmują (1) nadmierne trawienie siatkówki, które powoduje utratę zarówno układu naczyniowego, jak i tkanki nienaczyniowej, (2) niedostateczne trawienie, wymagające rozległej mechanicznej sekcji, która z kolei może prowadzić do uszkodzenia łożyska naczynia, (3) słabe oddzielenie tkanki nienaczyniowej od układu naczyniowego, co prowadzi do niespecyficznego barwienia. Kilka manuskryptów podkreślało te wyzwania, ale żaden z nich nie zawierał szczegółowego i spójnego protokołu, który pozwoliłby im przezwyciężyć 14,15. Niniejszy manuskrypt przedstawi krok po kroku metodologię szczegółowo opisującą technikę trawienia trypsyny na siatkówkach myszy i szczurów wraz ze szczegółowymi wskazówkami dotyczącymi radzenia sobie ze szczególnie trudnymi krokami. Schematyczny przegląd przedstawiono na rysunku 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Fischer Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (1:250)</td><td>Amresco</td><td>0458-50G</td><td>Wytwarzaj 3% trypsyny w 0,1 M Tris</td></tr><tr><td>TRIZMA baza</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Utwórz 0,1 M bufor Tris (pH 7,8 @ 37 &deg; C)</td></tr> <tr><td>TRIZMA</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>Steritop sterylna butelka próżniowa</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td>Tworzenie przefiltrowanej wody</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> preparacyjny <td>Każdy mikroskop, który umożliwia dobrą wizualizację siatkówki, jest wystarczający. (10x jest wystarczające przy odległości roboczej 24 mm)</td></tr><tr><td>Nożyczki proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>Krawędź tnąca: 8 mm; Średnica końcówki: 0,2 mm; Kleszcze proste 10 cm</td></tr><tr><td>(Inox)</td><td>Dumont #5</td><td>11252-20</td><td>Końcówka Biologie; 0,05 x 0,02 mm; 11 cm</td></tr><tr><td>Zakrzywione Forcepts (Dumostar)</td><td>Dumont #7</td><td>11297-10</td><td>Końcówka Biologie; 0,07 x 0,04 mm; 11,5 cm</td></tr><tr><td>Inkubator Dubnoff Metabolic Shaker</td><td>Precision Scientific BDG59442</td><td></td><td>Shaker opcjonalna</td></tr><tr><td>24-dołkowa szalka</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>82027-132</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół trawienia trypsyny do analizy unaczynienia siatkówki w modelu myszy

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trawienie trypsyny jest złotym standardem do analizy unaczynienia siatkówki 1-5. Umożliwia wizualizację całej sieci złożonych trójwymiarowych naczyń krwionośnych siatkówki i naczyń włosowatych poprzez tworzenie dwuwymiarowego płaskiego montażu połączonych ze sobą kanałów naczyniowych po strawieniu nienaczyniowych składników siatkówki. Pozwala to na badanie różnych patologicznych zmian naczyniowych, takich jak mikrotętniaki, zwyrodnienie naczyń włosowatych i nieprawidłowy stosunek śródbłonka do perycytów. Metoda ta jest jednak technicznie trudna, zwłaszcza u myszy, które stały się najszerzej dostępnym modelem zwierzęcym do badania siatkówki ze względu na łatwość manipulacji genetycznych 6,7. W oku myszy szczególnie trudno jest całkowicie usunąć składniki nienaczyniowe przy zachowaniu ogólnej architektury naczyń krwionośnych siatkówki. Do tej pory brakuje literatury, która szczegółowo opisuje technikę trawienia trypsyny u myszy. Ten manuskrypt zawiera szczegółową metodologię trawienia trypsyny krok po kroku w siatkówce myszy, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych kroków.

Końcowym produktem udanej procedury jest preparat typu flat-mount całej sieci naczyń krwionośnych siatkówki myszy z zachowaną architekturą, barwiony metodą PAS/hematoksyliną lub H&amp;E, jak pokazano na Rysunkach 2-4. Wyraźne rozróżnienie między komórkami śródbłonka a perycytami jest widoczne na Rysunku 3. W siatkówce jądra komórek śródbłonka są owalne lub wydłużone i znajdują się całkowicie w obrębie ściany naczynia. Jądra perycytów są małe, sferyczne, intensywnie barwią się i zazwyczaj...

Trawienie trypsyny jest jedną z najczęściej używanych metod analizy unaczynienia siatkówki. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje metodę, w tym kluczowe zmiany mające na celu optymalizację techniki i usunięcie tkanki nienaczyniowej przy jednoczesnym zachowaniu ogólnej architektury naczyń.

Protokół trawienia trypsyny do analizy unaczynienia siatkówki w modelu myszy

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie sieci naczyniowej siatkówki. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie serii płukań wodnych wyizolowanej siatkówki. W drugim kroku siatkówkę trawi się trypsyną w temperaturze 37 °C przez około jedną do półtorej godziny, w zależności od wielkości siatkówki.Następnie naczynia krwionośne są izolowane poprzez dodatkowe przemywanie wodą oraz dysekcję pod mikroskopem. W rezultacie można zwizualizować patologiczne zmiany naczyniowe, takie jak mikro tętniaki, degenerację naczyń włosowatych oraz nieprawidłowy stosunek komórek śródbłonka do pasożytów. Zatem główną zaletą metody try and digest w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przygotowywanie preparatów płaskich siatkówki, jest możliwość uwidocznienia całej sieci naczyniowej z bardzo dużą przejrzystością.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ jest ona wymagająca technicznie i trudna do powtarzalnego wykonania. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, gdyż etapy izolacji naczyń trudno opanować wyłącznie na podstawie opisów słownych. Jest to niezwykle cenne narzędzie w każdym laboratorium prowadzącym badania nad biologią naczyń siatkówki, np. w kontekście takich schorzeń jak retinopatia cukrzycowa; technikę tę zaprezentuje Jonathan Chow, utalentowany student medycyny z mojego laboratorium.Po utrwaleniu enukleowanego oka myszy w 10% neutralnym buforze formaliny przez 24 godziny, umieść oko w szalce Petriego i przykryj je niewielką ilością wody. Rozpocznij sekcję, używając nożyczek sekcyjnych do ostrożnego wykonania początkowego nacięcia w rogówce. Następnie, trzymając nacięty obszar pęsetą prostą, użyj nożyczek, aby wyciąć rogówkę wzdłuż granicy rogówki i twardówki, usuwając ją.Następnie należy użyć precyzyjnych pęset zakrzywionych i prostych. Należy powoli i ostrożnie oddzielić twardówkę i naczyniówkę od siatkówki w kierunku nerwu wzrokowego. Następnie usuwa się soczewkę oraz wszelkie pozostałości tęczówki i zanieczyszczenia z siatkówki, aby ułatwić oddzielenie warstw neuronowych siatkówki od naczyń krwionośnych.Nalej około 500 µL wody filtrowanej przez filtr 45 µm do płytki 24-dołkowej, umieść siatkówkę w dołku, a następnie delikatnie wstrząsaj przez cztery do pięciu godzin w temperaturze pokojowej, wymieniając wodę co 30 do 60 minut. Kontynuuj płukanie siatkówki w wodzie przez noc z delikatnym wstrząsaniem. Następnego dnia w temperaturze pokojowej usuń wodę i dodaj 3% trypsyny, a następnie sprawdź pod mikroskopem, czy w dołku nie znajdują się żadne zanieczyszczenia. Aby zapobiec przyleganiu naczyń krwionośnych, inkubuj tkankę w temperaturze 37 °C bez wstrząsania lub z delikatnym wstrząsaniem przez jedną do półtorej godziny.Gdy tkanka zacznie wykazywać oznaki dezintegracji, należy umieścić płytkę na stoliku mikroskopu, a następnie, unikając siatkówki, ostrożnie usunąć trypsynę, aby oddzielić układ naczyniowy. W pierwszej kolejności, za pomocą pęsety, należy dodać do siatkówki filtrowaną wodę.Odsłoń wewnętrzną błonę ograniczającą, która przejawia się jako cienka, przezroczysta warstwa. Potrząśnij płytką, stosując delikatne mieszanie. Po pięciu minutach ponownie umieść płytkę na stole mikroskopu i ostrożnie dolej wody, unikając uszkodzenia siatkówki, aby pomóc w uwolnieniu sieci naczyń z przylegającej tkanki siatkówkowej.Przemywaj siatkówkę w sposób zaprezentowany przed chwilą, aż w wodzie po ostatnim płukaniu nie pozostaną niemal żadne zanieczyszczenia. Zazwyczaj usunięcie całej tkanki nienaczyniowej jest najtrudniejszą częścią procedury. Poniższe techniki można stosować sekwencyjnie lub pojedynczo. Aby ułatwić izolację sieci naczyniowej, ważną wskazówką jest zanurzenie wszystkich narzędzi oraz trypsyny przed manipulowaniem przy siatkówce.Może to pomóc uniknąć przywierania tkanki do sprzętu. Napiwek mikropipety o pojemności 200 µL pokrywamy zarezerwowaną trypsyną, a następnie ostrożnie pipetujemy wodę w górę i w dół, w sąsiedztwie i w kierunku naczyń siatkówki, wywołując delikatne wzburzenie. Jeśli tkanka nienaczyniowa nadal stawia opór w centrum, należy umieścić napiwek mikropipety pokryty trypsyną przy nerwie wzrokowym i ostrożnie pipetować całą sieć naczyń w górę i w dół, aby pomóc w rozkładzie tkanki nienaczyniowej.Na koniec, przy użyciu pęsety można delikatnie unieść naczynia krwionośne znad powierzchni wody, aby usunąć wszelkie przylegające elementy nie naczyniowe. Wynikiem końcowym powinna być nienaruszona, wolna od zanieczyszczeń sieć naczyń krwionośnych siatkówki.Aby zwizualizować układ naczyniowy, najpierw nanieś kroplę wody na czyste szkiełko przedmiotowe. Następnie przenieś strawione naczynia do wody, kontrolując proces pod mikroskopem. Jeśli preparat naczyniowy (VAs flap mount) jest złożony lub rozłożony, należy pamiętać, że złożone naczynia prowadzą do słabej widoczności.Podczas barwienia, w przypadku pofałdowania tkanki, należy dodać wody i delikatnie potrząsnąć szkiełkiem, aby ułatwić rozprostowanie preparatu. Następnie za pomocą mikropipety należy powoli usunąć nadmiar wody. Końcowym produktem prawidłowo przeprowadzonej procedury jest płaski preparat całej sieci naczyń krwionośnych siatkówki myszy z zachowaną architekturą, zabarwiony hematoksyliną i eozyną.Jak pokazano tutaj, jak widać na tym obrazie, w siatkówce można zaobserwować wyraźne rozróżnienie między komórkami śródbłonka a perycytami. Jądra komórek śródbłonka, wskazane białą strzałką, są owalne lub wydłużone i znajdują się całkowicie w obrębie ściany naczynia. Jądra pasożyta, wskazane czarną strzałką, są małe, sferyczne, gęsto barwiące się i zazwyczaj występują w pozycji wypukłej wzdłuż ściany kapilary.Trawienie trypsyną jest powszechną procedurą stosowaną do analizy patologii naczyniowej w modelach zwierzęcych cukrzycy. Na obrazie przedstawiono przykład degeneracji naczyń włosowatego, wskazaną białą strzałką, zaobserwowaną u myszy DB DB, będącej modelem cukrzycy typu drugiego. Chociaż procedura ta została zoptymalizowana dla siatkówek mysich, podobne wyniki można uzyskać również w siatkówkach szczurzych.Warto zauważyć, że siatkówki szczura, przedstawione na tych obrazach, są większe od siatkówek myszy i wymagają zastosowania płytek 12-dołkowych zamiast 24-dołkowych. Sieć naczyniowa siatkówki szczura jest również mniej delikatna niż u myszy. Niezmiernie istotne jest usunięcie jak największej ilości tkanki nienaczyniowej.Wszelkie pozostałości doprowadzą do nieswoistego barwienia i utrudnią wizualizację naczyń krwionośnych. Na tym obrazie można na przykład zaobserwować skutek niepełnego usunięcia całej tkanki nienaczyniowej. Równie ważne jest, aby podczas montowania siatkówka była rozprostowana, co pozwala na lepszą wizualizację naczyń krwionośnych.Na tym obrazie przedstawiono nieudane rozłożenie preparatu naczyniowego w metodzie flat mount. Po opanowaniu tej trudnej technicznie procedury, rozcinanie i trawienie mogą stać się niezwykle cenną metodą pozwalającą na szczegółową wizualizację całej sieci naczyniowej.Dzięki udoskonaleniu tej techniki w oku myszy, badacze mogą wykorzystać myszy modyfikowane genetycznie do badania różnych szlaków, które mogą kontrolować naczyniówkę siatkówki, co pozwala na zrozumienie patofizjologii różnych chorób siatkówki. W rezultacie możemy poszerzyć naszą wiedzę na temat patologii chorób, takich jak retinopatia cukrzycowa. Badanie modeli mysich, takich jak mysz DVDB, może w ostateczności stworzyć możliwość znalezienia nowych potencjalnych interwencji terapeutycznych celujących w naczyniówkę siatkówki.

trypsin-digest-protocol-to-analyze-retinal-vasculature-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Protokół trawienia trypsyną do analizy unaczynienia siatkówki w modelu mysim

Siatkówka gryzonia od dawna jest uznawana za dostępne okno do mózgu. W tym artykule technicznym przedstawiamy protokół, który wykorzystuje mysi model retinopatii indukowanej tlenem do badania mechanizmów, które prowadzą do niepowodzenia regeneracji naczyń w ośrodkowym układzie nerwowym po urazie niedokrwiennym. Opisany system można również wykorzystać do zbadania strategii wspomagających odrastanie funkcjonalnych naczyń krwionośnych w obrębie siatkówki i ośrodkowego układu nerwowego.

Ocena regeneracji naczyń w OUN za pomocą siatkówki myszy

Wiele zagrażających wzrokowi chorób oczu jest związanych z dysfunkcyjnymi mikronaczyniami siatkówki. Dlatego pomiar odpowiedzi tętniczek siatkówki jest ważny dla zbadania podstawowych mechanizmów patofizjologicznych. W artykule opisano szczegółowy protokół izolacji i przygotowania tętniczek siatkówki myszy do oceny wpływu substancji wazoaktywnych na średnicę naczyń krwionośnych.

Etapy przygotowania do pomiaru reaktywności tętniczek siatkówki myszy ex vivo

Ten protokół opisuje szczegółową metodę przygotowania i immunofluorescencji barwienia płaskich mocowań siatkówki myszy oraz analizy. Szczegółowo opisano również zastosowanie angiografii dna oka fluoresceiny (FFA) u młodych myszy i przetwarzanie obrazu.

Monitorowanie dynamicznego wzrostu naczyń siatkówki w mysim modelu retinopatii indukowanej tlenem

Tutaj opisano szczegółowy protokół do przeprowadzania testu stresu mitochondrialnego i testu szybkości glikolitycznej w próbkach tkanki siatkówki ex vivo przy użyciu komercyjnego bioanalizatora.

Oznaczanie oddychania mitochondrialnego i glikolizy w próbkach tkanki siatkówki ex vivo

Retinopatia cukrzycowa jest jedną z głównych przyczyn ślepoty. Histologia, test rozpadu bariery krew-siatkówka i angiografia fluorescencyjna są cennymi technikami pozwalającymi zrozumieć patofizjologię siatkówki, co może jeszcze bardziej zwiększyć skuteczność badań przesiewowych leków przeciwko retinopatii cukrzycowej.

Ocena patofizjologiczna siatkówki w modelu szczurzym

Ten artykuł opisuje dobrze sprawdzony i powtarzalny test barwienia lektyny dla całego preparatu siatkówki Mount oraz protokoły wymagane do ilościowego pomiaru parametrów naczyniowych często zmienianych w retinopatiach proliferacyjnych i nieproliferacyjnych.

Kwantyfikacja parametrów naczyniowych w całych siatkówkach górskich myszy z retinopatiami nieproliferacyjnymi i proliferacyjnymi

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół immunohistochemiczny do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach.

Kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Test ochronny został opracowany do monitorowania odporności układu krwionośnego siatkówki na śmierć z powodu urazów związanych z cukrzycą/retinopatią cukrzycową, takich jak stres oksydacyjny i cytokiny.

Test do wykrywania ochrony naczyń krwionośnych siatkówki przed śmiercią związaną z cukrzycą u myszy

Niedawno zidentyfikowaliśmy usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako nowy paradygmat dysfunkcji siatkówki związanej z cukrzycą. W protokole tym omówiono etapy izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej z kultur śródbłonka siatkówki, a następnie opisano technikę pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Poznaj metodę trawienia trypsyną do analizy unaczynienia siatkówki w modelu myszy. Technika ta umożliwia wyraźną wizualizację całej sieci naczyniowej i zmian patologicznych.

Protokół trawienia trypsyny do analizy unaczynienia siatkówki w modelu myszy

Przeglądaj więcej filmów