Oznaczanie tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego i mysich makrofagów BALB/c

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie dopuszczalnych stężeń kwasów tłuszczowych oraz toksyny cholery, które nie wpływają negatywnie na przeżywalność komórek. W tym celu w pierwszej kolejności hoduje się odpowiedni typ komórek. Drugim krokiem jest inkubacja komórek z różnymi stężeniami trzech testowanych kwasów tłuszczowych lub z toksyną cholery.

Po 24 godzinach przeżywalność komórek ocenia się za pomocą testu MTT. Ostatecznie dane spektrometryczne z testu MTT wskazują optymalne stężenia kwasów tłuszczowych i toksyny cholery, którymi można traktować komórki bez istotnego zmniejszenia przeżywalności. Znaczenie tej techniki wykracza w stronę zapobiegania zakażeniom cholerą, ponieważ szczepienia nie zawsze są skuteczne.

Do wszystkich oznaczeń toksyn oraz do oznaczeń stężeń kwasów tłuszczowych w większej skali wykorzystane zostaną makrofagi Mus musculus z myszy bowel C; komórki te namnaża się w jednym z dwóch mediów: DMEM z L-glutaminą uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyku oraz środka przeciwgrzybiczego lub w pożywce podstawowej RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5% L-glutaminy i 1% antybiotyku oraz środka przeciwgrzybiczego. Zgodnie z tym protokołem, komórki bowel C hoduje się w kwadratowych kolbach Corning o powierzchni 75 cm² z odpowietrzanymi zakrętkami w temperaturze 37°C, w atmosferze 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla. Do precyzyjnego oznaczania stężenia kwasów tłuszczowych należy użyć ludzkich komórek nabłonka jelitowego namnażanych w kwadratowych kolbach Corning o powierzchni 75 cm² z odpowietrzanymi zakrętkami w pożywce HyperCare uzupełnionej o 10% FBS i 30 ng/mL.

W przypadku ludzkiego EGF nie należy stosować odczynników antybiotycznych i przeciwgrzybiczych zgodnie z instrukcjami producenta; inkubować w temperaturze 37°C, w atmosferze 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla. Przesiewać wszystkie komórki w stosunku od 1:2 do 1:3 przy konfluencji około 70%, w zależności od rodzaju komórek; komórki są zazwyczaj przesiewane co dwa do pięciu dni przed traktowaniem kwasami tłuszczowymi. Przygotować kwasy tłuszczowe: najpierw przenieść kwas oleinowy, linolowy i linolenowy z dostarczonych przez firmę szklanych ampułek do sterylnych fiolek szklanych. Następnie przenieść każdy kwas tłuszczowy do oddzielnej sterylnej probówki typu Eppendorf.

Każdy kwas tłuszczowy należy rozpuścić w 100% etanolu w rozcieńczeniu jeden do sześciu, a następnie dodać niepełne pożywkę RPMI 1640 do uzyskania stężenia końcowego 10 µg/µL. Każdy roztwór należy wymieszać w wirówce typu vortex i przenieść do szklanych fiolek w celu przechowywania w zamrażarce w temperaturze -20 °C.

Ludzkie komórki nabłonka jelitowego w zagęszczeniu 2 500 komórek na dołek w 96-dołkowych płytkach hodowlanych uzupełnić odpowiednią pożywką kompletną, aby całkowita objętość w każdym dołku wyniosła 200 µL. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w atmosferze 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.

Po 24-godzinnym okresie proliferacji usunąć medium. Do dołków dodać odpowiednie stężenia każdego z testowanych kwasów tłuszczowych jako kontrolę pozytywną. Komórki inkubować w medium kompletnym jako kontrolę negatywną oraz inkubować komórki w 70% etanolu.

Następnie dodać pełną pożywkę, aby całkowita objętość w każdej studzience wyniosła 200 µL. Inkubować potraktowane płytki przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT. W celu przygotowania toksyny cholery do traktowania komórek, rozpuścić toksynę cholery w PBS do stężenia 1 mg/mL.

Rozdziel roztwór do probówek kriogenicznych i przechowuj w temperaturze od 2 do 8 °C przed podaniem komórkom. Rozcieńcz toksynę w stosunku 1:100 w sterylnym PBS lub niepełnym DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 1 ng/µL na płytkę. Wysiej makrofagi w zagęszczeniu 2 500 komórek na dołek na płytce 96-dołkowej.

Płytki hodowlane z dołkami inkubować w temperaturze 37 °C, w atmosferze 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Po 24-godzinnym okresie proliferacji usunąć medium i dodać do dołków odpowiednie stężenia testowe toksyny cholery. Podobnie jak w przypadku zabiegów kwasami tłuszczowymi, inkubować komórki z pełnym medium jako kontrolą pozytywną oraz z 70% etanolem jako kontrolą negatywną dla wszystkich próbek i traktowań.

Należy przeprowadzić co najmniej trzy powtórzenia, stosując większą liczbę powtórzeń dla kontroli pozytywnych. Dodać pełną pożywkę, aby całkowita objętość w każdej studzience wyniosła 200 µL. Płytki traktowane toksyną cholery inkubować przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT.

24 godziny po potraktowaniu komórek kwasami tłuszczowymi lub kolorotonem, żywotność komórek zostaje określona za pomocą testu MTT. Należy usunąć roztwór z każdej studzienki płytki 96-dołkowej przeznaczonej do badania i zastąpić go 200 µL świeżego, pełnego roztworu pożywki.

Do każdego dołka dodaj 10 µL świeżo przygotowanego roztworu MTT o stężeniu 2,5 mg/mL. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy do czterech godzin. Po tym czasie usuń pożywkę i do każdego dołka dodaj 100 µL 0,04 M kwasu solnego w izopropanolu.

Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przenieś roztwór z każdej studni do probówki do wirowania i wiruj przy 20 000 g przez jedną minutę lub do czasu utworzenia osadu. Przenieś od 20 do 40 µL każdej próbki do czytnika mikropłytek i zmierz absorbancję przy 570 nm za pomocą spektrofotometru.

Rycina ta przedstawia przeżywalność większości makrofagów w funkcji kontroli dodatniej dla zabiegów z użyciem rosnących stężeń kwasu oleinowego, kwasu linolowego oraz kwasów linolowych. Wyraźnie widać, że komórki nie tolerują stężeń powyżej 100 ng/µL dla żadnego z kwasów tłuszczowych. Eksperyment powtórzono z użyciem ludzkich komórek nabłonkowych dla stężeń niższych niż 100 ng/µL w przyrostach 10 ng/µL, aż do 70 ng/µL.

Wykres ten przedstawia przeżywalność komórek dla każdego stężenia kwasu oleinowego. Metoda One-way ANOVA wykazała, że jedna lub więcej z wartości średnich różniły się statystycznie. Jednak tylko w przypadku zabiegów przy wyższych stężeniach uzyskano wartości średnie statystycznie różne od wartości kontroli pozytywnej.

Co ciekawe, zaobserwowane różnice wynikały ze wzrostu żywotności komórek przy większej zmienności. Podobne wyniki uzyskano dla kwasów linolowego i linolowego. Jednym ze sposobów.

Analiza Inova wykazała, że żadna ze średnich dla grup traktowanych nie różniła się statystycznie od średniej kontroli pozytywnej, jednak zmienność zdaje się wzrastać dla niektórych wyższych stężeń, takich jak 60 ng/µL kwasu linolowego, co wynika z tych rezultatów. Optymalne stężenia kwasów tłuszczowych przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego wydają się mieścić w przedziale od 1 do 5 ng/µL. Przebadano również wpływ różnych stężeń toksyny kolerowej na przeżywalność większości makrofagów, stosując poziomy toksyny w stosunkowo dużych odstępach.

Zaobserwowano trend spadkowy przeżywalności komórek, zgodnie z oczekiwaniami, że przeżywalność będzie znacznie się różnić dla poszczególnych wariantów traktowania. Duża zmienność przeżywalności sprawiła, że nie stwierdzono istotnych różnic między średnią dla kontroli pozytywnej a jakimkolwiek wariantem traktowania, co doprowadziło do dalszych badań przy poziomach toksyny wynoszących 100 ng lub mniej. Wykres ten przedstawia przeżywalność komórek dla wariantów traktowania z niższym poziomem toksyny.

Żywotność komórek jest bardzo zmienna dla prawie wszystkich stężeń toksyny, choć w wyniku zastosowanych zabiegów zaobserwowano niewielkie wzrosty żywotności. Wzrosty te nie są istotne statystycznie dla żadnego z zabiegów w porównaniu ze średnią dla kontroli pozytywnej. Na podstawie tych wyników.

Zalecane stężenie toksyny cholery wynosi mniej niż 30 ng na traktowanie w przypadku użycia makrofagów mysich z linii bowel C po ich namnożeniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie badań nad cholerą do sprawdzenia, czy kwasy tłuszczowe mogą wzmacniać odporność przeciwko zakażeniu Vibrio cholerae.