Name: Oznaczanie tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego i mysich makrofagów BALB/c (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę oznaczania tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny cholery przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego oraz mysich makrofagów BALB/c. Technika ta wykorzystuje test MTT do oceny przeżywalności komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pauli Cobos i Dr. Evrosowi Vassiliou za pomoc laboratoryjną i dostarczenie mysich makrofagów. Dziękujemy również naszemu kierownikowi laboratorium Richardowi Criasii za wskazówki i pomoc w przygotowaniu materiałów. Na koniec autorzy dziękują Ramanpreetowi Kaurowi za pomoc w produkcji wideo.

1. Hodowla tkankowa
<ol>
 <li>Użyj makrofagów Mus musculus (myszy BALB/c) do oznaczania toksyny. Początkowo należy wyhodować wszystkie komórki M. musculus zgodnie z instrukcjami dostawcy.</li>
 <li>Rozmnażaj komórki myszy BALB/c w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium z L-glutaminą uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% pożywką antybiotykową/przeciwgrzybiczą lub podstawową pożywką RPMI 1640 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 5% L-glutaminą i 1% odczynnikiem antybiotykowym/przeciwgrzybiczym.</li>
 <li>Hodować komórki w kolbach do corningu o średnicy 75cm2 z wentylowanymi nasadkami w temperaturze 37 °C, 95% powietrza i 5% CO2 .</li>
 <li>Przywołaj ludzkie komórki nabłonka jelitowego w ciągu 24 godzin od dostawy, zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi oznaczania kwasów tłuszczowych.</li>
 <li>Namnażać ludzkie komórki nabłonka jelitowego w kolbach rogowych o długości 75cm2 z wentylowanymi nasadkami w pożywce HybriCare uzupełnionej 10% FBS i 30 ng/ml ludzkiego EGF w temperaturze 37 °C. Nie należy używać odczynników antybiotykowych/przeciwgrzybiczych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
 <li>Podziel wszystkie komórki (1:3) przy około 70% zbieganiu.</li>
 <li>Zamroź i wydobądź wszystkie komórki przez cały czas trwania badania, stosując standardowe protokoły zamrażania.</li>
 <li>Uwaga: Do oznaczania stężenia kwasów tłuszczowych na większą skalę, początkowo użyj szybciej rosnących, łatwiejszych w utrzymaniu makrofagów mysich. Do oznaczania stężenia kwasów tłuszczowych w drobnej skali należy użyć ludzkich komórek nabłonkowych. Używaj makrofagów myszy do wszystkich metod leczenia toksyną (patrz dyskusja).</li>
</ol>
2. Leczenie kwasami tłuszczowymi i toksyną
<ol>
 <li>Przenieś kwasy oleinowy, linolowy i linolenowy z dostarczonych przez firmę szklanych ampułek do wysterylizowanych szklanych fiolek.</li>
 <li>Przenieś każdy kwas tłuszczowy do oddzielnej wysterylizowanej probówki Eppendorfa i rozpuść ją najpierw w 100% etanolu w rozcieńczeniu 1:6, a następnie w niekompletnym podłożu RPMI 1640 do końcowego stężenia 10 μg/μl.</li>
 <li>Zmieszać każdy roztwór i przenieść go do szklanych fiolek do przechowywania w zamrażarce (-20 °C).</li>
 <li>Komórki płytki w 2,500 komórkach / dołku na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych.</li>
 <li>Dodać odpowiednią kompletną pożywkę, aby zwiększyć całkowitą objętość studzienki do 200 μl w celu traktowania komórek kwasami tłuszczowymi w ramach przygotowań do testów MTT.</li>
 <li>Po 24-godzinnym okresie rozmnażania wyjmij nośnik i zastąp go nowym.</li>
 <li>Dodaj odpowiednie stężenia każdego kwasu tłuszczowego, który ma być badany, do studzienek (patrz wyniki). Dodaj kompletne media, aby zwiększyć całkowitą objętość studzienki do 200 μl.</li>
 <li>Inkubować płytki poddane działaniu środka przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT.</li>
 <li>Rozpuścić toksynę w PBS o stężeniu 1 mg/ml i podwielokrotność roztworu w kriowialach i przechowywać kriowiale w temperaturze 2-8 °C.</li>
 <li>W przypadku leczenia komórkami należy rozcieńczyć toksynę w stosunku 1:100 w wysterylizowanym PBS (pH 7,4) lub niekompletnym DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 1 ng/μl.</li>
 <li>Do leczenia komórek toksyną w ramach przygotowań do testów MTT, płytki komórkowej, jak opisano powyżej.</li>
 <li>Po 24-godzinnym okresie namnażania dodaj odpowiednie stężenia toksyny (nasze stężenia patrz wyniki), które zostaną przetestowane do studzienek zgodnie z procedurami stosowanymi w aplikacjach kwasów tłuszczowych (powyżej).</li>
 <li>Inkubować płytki poddane działaniu środka przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT.</li>
 <li>Jako dodatnia (dodatnie c w całym artykule) i ujemna kontrola (ujemne c), zarówno w przypadku leczenia kwasami tłuszczowymi, jak i toksyną, inkubuje się komórki odpowiednio z kompletną pożywką i 70% etanolem.</li>
 <li>W przypadku wszystkich próbek i zabiegów należy zastosować co najmniej trzy powtórzenia (n = 3), z większą liczbą powtórzeń dla kontroli pozytywnych (n = 6 w tym badaniu).</li>
</ol>
3. Test MTT
<ol>
 <li>Przygotować roztwór podstawowy MTT do stężenia 2,5 mg/ml.</li>
 <li>Usunąć roztwór z każdej studzienki z 96-dołkowej płytki, która ma być badana, i zastąpić go 200 μl świeżego kompletnego roztworu pożywki.</li>
 <li>Dodać 10 μl roztworu MTT do każdego dołka.</li>
 <li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny.</li>
 <li>Odrzucić roztwór pożywki i dodać 100 μl 0,04 M HCl w izopropanolu do każdej studzienki.</li>
 <li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.</li>
 <li>Przenieś roztwór z każdej studzienki do nowej probówki wirówkowej.</li>
 <li>Wirować przy 20 000 x g, w temperaturze pokojowej, przez 1 minutę lub do momentu powstania osadu.</li>
 <li>Przenieść od 20 do 40 μl każdej próbki do czytnika mikropłytek.</li>
 <li>Odczytać absorbancję przy 570 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>

<ol><li>Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleic+Acid%3A+Its+effects+on+stratum+corneum+in+relation+to+%28trans%29+dermal+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery.</a> Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).</li>
<li>Tandon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+and+spectroscopic+studies+of+oleic+acid-sodium+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction and spectroscopic studies of oleic acid-sodium acetate.</a> Chem. Phys. Lipids. 109 (1), 37-45 (1990).</li>
<li>Kris-Etherton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+about+n-6+polyunsaturated+fatty+acid+recommendations+for+cardiovascular+health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Diabetic+Association%22%5BJournal%5D)">The debate about n-6 polyunsaturated fatty acid recommendations for cardiovascular health.</a> Journal of the American Diabetic Association. 110 (2), 201-204 (2010).</li>
<li>Rizzo, W. B., Phillips, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenoleukodystrophy%3A+dietary+oleic+acid+lowers+hexacosanoate+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Adrenoleukodystrophy: dietary oleic acid lowers hexacosanoate levels.</a> Annals of Neurology. 21 (3), 232-239 (1987).</li>
<li>Bozan, B., Temelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+and+oxidative+stability+of+flax%2C+safflower+and+poppy+seed+and+seed+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Tech%22%5BJournal%5D)">Chemical composition and oxidative stability of flax, safflower and poppy seed and seed oil.</a> Bioresource Tech. 99, 6354-6359 (2005).</li>
<li>Krein, S., Meldurm, H., Hawkins, S., Foy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+benefits+of+conjugated+linoleic+acid+to+3-dimensional+wrinkle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Clinical benefits of conjugated linoleic acid to 3-dimensional wrinkle morphology.</a> J. American Academy of Dermatology. 60 (3), AB30(2009).</li>
<li>Yu, Y., Correll, P. H., Heuvel, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugated+linoleic+acid+decreases+production+of+pro-inflammatory+products+in+macrophages%3A+Evidence+for+a+PPARy+dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Conjugated linoleic acid decreases production of pro-inflammatory products in macrophages: Evidence for a PPARy dependent mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1581 (3), 89-99 (2002).</li>
<li>Palombo, J., Ganguly, A., Bistrian, B., Menard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-proliferative+effects+of+biologically+active+isomers+of+conjugated+linoleic+acid+on+human+colorectal+and+prostatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The anti-proliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells.</a> Cancer Letters. 177, 163-172 (2002).</li>
<li>Granda, M., Sinclair, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharm.+Design%22%5BJournal%5D)">Fatty acids and obesity.</a> Current Pharm. Design. 15 (36), 4117-4125 (2009).</li>
<li>Rosenstein, E., Kushner, L., Kramer, N., Kazandjian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+dietary+fatty+acid+supplementation+in+the+treatment+of+adult+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+Leukotrienes+and+Essential+F.A%22%5BJournal%5D)">Pilot study of dietary fatty acid supplementation in the treatment of adult periodontitis.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential F.A. 68 (3), 213-218 (2003).</li>
<li>Ferretti, A., Flanagan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antithromboxane+activity+of+dietary+alpha-linolenic+acid%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Leukot.+Essent.+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">Antithromboxane activity of dietary alpha-linolenic acid: a pilot study.</a> Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 54 (6), 451-455 (1995).</li>
<li>Arpita, C., Pradeep, K. D., Chowdhury, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Fatty+Acids+and+Cholesterol+Present+in+Bile+on+Expression+of+Virulence+Factors+and+Motility+of+Vibrio+cholera%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Effect of Fatty Acids and Cholesterol Present in Bile on Expression of Virulence Factors and Motility of Vibrio cholera.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1946-1953 (2007).</li>
<li>Yamasaki, S., Asakura, M., Neogi, S. B., Hinenoya, A., Iwaoka, E., Aoki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+virulence+potential+of+Vibrio+cholerae+by+natural+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds.</a> Indian J. Med. Res. 133 (2), 232-239 (2011).</li>
<li>WHO | Efforts must be intensified to control Zimbabwe cholera outbreak [WHO PRESS RELEASE] [Internet]. , World Health Organization. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.who.int/csr/don/2009_01_30/en/">http://www.who.int/csr/don/2009_01_30/en/</a> (2010).</li>
<li>Hendriksen, R. S., Price, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+Genetics+of+Vibrio+cholerae+from+Nepal+in+2010%3A+Evidence+on+the+origin+of+the+Haitian+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Population Genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: Evidence on the origin of the Haitian outbreak.</a> mBio. 2 (4), 1-6 (2011).</li>
<li>Schaeffler, A., Gross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+induction+of+Toll-like+receptor-4%2Fnuclear+factor-kappa+B+pathway+in+adipocytes+links+nutritional+signaling+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappa B pathway in adipocytes links nutritional signaling with innate immunity.</a> Immunology. 126 (2), 233-245 (2009).</li>
</ol>

Autorzy tego badania nie mają żadnego interesu finansowego w wynikach tego badania. Fundusze na to badanie zostały zapewnione FT przez Kean University; jednak FT jest obecnie pracownikiem Kingsborough Community College.

Sugestia stężenia kwasów tłuszczowych i toksyny
Chociaż dokładny mechanizm działania kwasów tłuszczowych wzmacniających odporność błony śluzowej nie jest znany, w kilku badaniach próbowano zbadać ich korzystne działanie. Nasze badanie ma na celu przedstawienie metodologii określania maksymalnego stężenia kwasów tłuszczowych, które komórki mogą tolerować, a także maksymalnego stężenia toksyny, które komórki mogą tolerować bez znaczącego wpływu na przeżycie komórek.
Aby ...

Korzyści zdrowotne wynikające z kwasów tłuszczowych, takich jak kwas oleinowy, linolowy i linolenowy, były i nadal są udokumentowane. Na przykład kwas oleinowy ułatwia przenikanie leków lipofilowych do organizmu1,2, zmniejsza chorobę niedokrwienną serca o 24%, gdy zastępuje nasycone kwasy tłuszczowe3 i jest stosowany w leczeniu chorób metabolicznych, takich jak adrenoleukodystrofia4, która jest genetycznym zaburzeniem metabolizmu kwasów tłuszczowych sprzężonym z chromosomem X. Chociaż kwas linolowy (w przeciwieństwie do kwasu oleinowego) jest niezbędnym prekursorem kwasu arachidonowego u ssaków, nie jest syntetyzowany przez organizm i musi być pozyskiwany ze źródeł zewnętrznych, takich jak spożycie nasion lnu. 5 Badania wykazują kilka korzystnych skutków zdrowotnych kwasu linolowego, takich jak: właściwości przeciwstarzeniowe dla skóry; 6 właściwości przeciwzapalnych; 7 zmniejszona proliferacja komórek raka jelita grubego i prostaty; 8 oraz zdolność do walki z otyłością i promowanie zdrowia układu sercowo-naczyniowego. 9 Kwas linolenowy odgrywa rolę w zmniejszaniu stanu zapalnego przyzębia10 oraz modulowaniu biosyntezy tromboksanu i prostacykliny. 11
Arpita12 badała wpływ żółciowych kwasów tłuszczowych i cholesterolu na ekspresję czynników wirulencji i ruchliwość V. cholerae. Yamasaki13 wskazał, że ekstrakt metanolowy z czerwonej papryczki chili i inne naturalnie ekstrahowane związki mogą potencjalnie zmniejszyć produkcję toksyny. Można sobie wyobrazić rozważenie stosowania produktów spożywczych bogatych w powyższe kwasy tłuszczowe (takich jak nasiona lnu) w zapobieganiu i łagodzeniu chorób zakaźnych, takich jak, poprzez zapewnienie odporności błony śluzowej. Przeprowadziliśmy badania w celu rozpuszczenia kwasów tłuszczowych i określenia, za pomocą testów proliferacji komórek, maksymalnego stężenia kwasów tłuszczowych, które ludzkie komórki nabłonka jelitowego mogą tolerować bez szkodliwego wpływu na żywotność komórek. Postawiliśmy hipotezę, że kwasy oleinowy, linolowy i linolenowy mają korzystny wpływ na żywotność komórek w niższych stężeniach, ale w wyższych stężeniach będą toksyczne dla komórek. Rozpuściliśmy również toksynę i określiliśmy maksymalne stężenie toksyny, które makrofagi myszy BALB/C mogą tolerować bez znacznego spadku żywotności komórek. Stawiamy hipotezę o toksycznym wpływie toksyny na żywotność komórek nawet na bardzo niskim poziomie. Metoda rozpuszczania toksyny i wykorzystania jej do określenia maksymalnej ilości toksyny, którą komórki mogą tolerować bez znacznego spadku przeżywalności, stanowi przewagę dla przyszłych badań. Na przykład połączenie powyższych metodologii można wykorzystać do określenia, czy kwasy tłuszczowe zapewniają komórkom odporność błony śluzowej na infekcje. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, ta racjonalność i metodologia nie zostały zbadane.
 Omawiamy, jak nasze wstępne dane mogą być wykorzystane w późniejszych badaniach, aby ustalić, czy kwas oleinowy, linolowy i linolenowy zapewniają komórkom odporność błony śluzowej na zakażenie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells/Reagent</td></tr><tr><td>Mus musculus makrofagi</td><td>ATCC</td><td>ATCC RAW 264.7</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ATCC</td><td>30-2115</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca </td><td>płodu Bio-west</td><td>S0250</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/ przeciwgrzybicze </td><td>Hyclon</td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki nabłonka jelitowego </td><td>ATCC</td><td>ATTC CCL-241</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka HybriCare </td><td>ATCC</td><td>46-X</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>Kwas linolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-1376</td><td></td></tr><tr><td>Kwas linolenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2376</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD Falcon 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td> Spektrofotometr 351172 <td></td></tr> z <tr><td>oprogramowaniem Dynex Revelations 4.22</td><td>Dynex</td><td>91000101</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego i mysich makrofagów balb/c

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Pozytywna rola kwasów tłuszczowych w zapobieganiu i łagodzeniu chorób innych niż ludzkie i ludzkie była i nadal jest obszernie udokumentowana. Role te obejmują wpływ na choroby zakaźne i niezakaźne, w tym zapobieganie stanom zapalnym, a także odporność błony śluzowej na choroby zakaźne. to ostra choroba jelit wywoływana przez bakterię Vibrio cholerae. Występuje w krajach rozwijających się i nieleczona może prowadzić do śmierci. Chociaż istnieją szczepionki przeciwko, nie zawsze są one skuteczne i potrzebne są inne metody zapobiegawcze. Postanowiliśmy określić dopuszczalne stężenia trzech kwasów tłuszczowych (kwasu oleinowego, linolowego i linolenowego) oraz toksyny przy użyciu odpowiednio mysich makrofagów BALB/C i ludzkich komórek nabłonka jelitowego. Rozpuściliśmy powyższe kwasy tłuszczowe i zastosowaliśmy testy proliferacji komórek, aby określić zakresy stężeń i określone stężenia kwasów tłuszczowych, które nie są szkodliwe dla żywotności ludzkich komórek nabłonka jelitowego. Rozpuściliśmy toksynę i użyliśmy jej w teście w celu określenia zakresów stężeń i specyficznych stężeń toksyny, które statystycznie nie zmniejszają żywotności komórek w makrofagach BALB/C. 
Stwierdziliśmy, że optymalne stężenia kwasów tłuszczowych wynoszą od 1 do 5 ng/μl, a dla toksyny < 30 ng na leczenie. Dane te mogą pomóc w przyszłych badaniach, które mają na celu znalezienie ochronnej roli kwasów tłuszczowych w błonie śluzowej w zapobieganiu lub łagodzeniu zakażeń.

Oznaczenie optymalnego stężenia kwasów tłuszczowych
Optymalne stężenie kwasów tłuszczowych definiuje się jako maksymalne stężenie, przy którym wzrost komórek jest porównywalny z wzrostem komórek kontrolnych lub go przekracza, przy stosunkowo niskiej zmienności wyników. Aby określić optymalne stężenie kwasów oleinowego, linolewowego i linolenowego, komórki poddawano początkowo działaniu różnych stężeń każdego kwasu tłuszczowego w dużych przyrostach, a następnie w mniejszych przyrostach. Ry...

Postanowiliśmy określić dopuszczalne stężenia trzech kwasów tłuszczowych (kwasu oleinowego, linolowego i linolenowego) oraz toksyny, które nie wpływały znacząco i negatywnie na przeżywalność komórek poprzez rozpuszczanie kwasów tłuszczowych i toksyny oraz używanie ich w testach przeżycia komórek.

Oznaczanie tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego i mysich makrofagów BALB/c

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie dopuszczalnych stężeń kwasów tłuszczowych oraz toksyny cholery, które nie wpływają negatywnie na przeżywalność komórek. W tym celu w pierwszej kolejności hoduje się odpowiedni typ komórek. Drugim krokiem jest inkubacja komórek z różnymi stężeniami trzech testowanych kwasów tłuszczowych lub z toksyną cholery.Po 24 godzinach przeżywalność komórek ocenia się za pomocą testu MTT. Ostatecznie dane spektrometryczne z testu MTT wskazują optymalne stężenia kwasów tłuszczowych i toksyny cholery, którymi można traktować komórki bez istotnego zmniejszenia przeżywalności. Znaczenie tej techniki wykracza w stronę zapobiegania zakażeniom cholerą, ponieważ szczepienia nie zawsze są skuteczne.Do wszystkich oznaczeń toksyn oraz do oznaczeń stężeń kwasów tłuszczowych w większej skali wykorzystane zostaną makrofagi Mus musculus z myszy bowel C; komórki te namnaża się w jednym z dwóch mediów: DMEM z L-glutaminą uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyku oraz środka przeciwgrzybiczego lub w pożywce podstawowej RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5% L-glutaminy i 1% antybiotyku oraz środka przeciwgrzybiczego. Zgodnie z tym protokołem, komórki bowel C hoduje się w kwadratowych kolbach Corning o powierzchni 75 cm² z odpowietrzanymi zakrętkami w temperaturze 37°C, w atmosferze 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla. Do precyzyjnego oznaczania stężenia kwasów tłuszczowych należy użyć ludzkich komórek nabłonka jelitowego namnażanych w kwadratowych kolbach Corning o powierzchni 75 cm² z odpowietrzanymi zakrętkami w pożywce HyperCare uzupełnionej o 10% FBS i 30 ng/mL.W przypadku ludzkiego EGF nie należy stosować odczynników antybiotycznych i przeciwgrzybiczych zgodnie z instrukcjami producenta; inkubować w temperaturze 37°C, w atmosferze 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla. Przesiewać wszystkie komórki w stosunku od 1:2 do 1:3 przy konfluencji około 70%, w zależności od rodzaju komórek; komórki są zazwyczaj przesiewane co dwa do pięciu dni przed traktowaniem kwasami tłuszczowymi. Przygotować kwasy tłuszczowe: najpierw przenieść kwas oleinowy, linolowy i linolenowy z dostarczonych przez firmę szklanych ampułek do sterylnych fiolek szklanych. Następnie przenieść każdy kwas tłuszczowy do oddzielnej sterylnej probówki typu Eppendorf.Każdy kwas tłuszczowy należy rozpuścić w 100% etanolu w rozcieńczeniu jeden do sześciu, a następnie dodać niepełne pożywkę RPMI 1640 do uzyskania stężenia końcowego 10 µg/µL. Każdy roztwór należy wymieszać w wirówce typu vortex i przenieść do szklanych fiolek w celu przechowywania w zamrażarce w temperaturze -20 °C.Ludzkie komórki nabłonka jelitowego w zagęszczeniu 2 500 komórek na dołek w 96-dołkowych płytkach hodowlanych uzupełnić odpowiednią pożywką kompletną, aby całkowita objętość w każdym dołku wyniosła 200 µL. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w atmosferze 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.Po 24-godzinnym okresie proliferacji usunąć medium. Do dołków dodać odpowiednie stężenia każdego z testowanych kwasów tłuszczowych jako kontrolę pozytywną. Komórki inkubować w medium kompletnym jako kontrolę negatywną oraz inkubować komórki w 70% etanolu.Następnie dodać pełną pożywkę, aby całkowita objętość w każdej studzience wyniosła 200 µL. Inkubować potraktowane płytki przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT. W celu przygotowania toksyny cholery do traktowania komórek, rozpuścić toksynę cholery w PBS do stężenia 1 mg/mL.Rozdziel roztwór do probówek kriogenicznych i przechowuj w temperaturze od 2 do 8 °C przed podaniem komórkom. Rozcieńcz toksynę w stosunku 1:100 w sterylnym PBS lub niepełnym DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 1 ng/µL na płytkę. Wysiej makrofagi w zagęszczeniu 2 500 komórek na dołek na płytce 96-dołkowej.Płytki hodowlane z dołkami inkubować w temperaturze 37 °C, w atmosferze 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Po 24-godzinnym okresie proliferacji usunąć medium i dodać do dołków odpowiednie stężenia testowe toksyny cholery. Podobnie jak w przypadku zabiegów kwasami tłuszczowymi, inkubować komórki z pełnym medium jako kontrolą pozytywną oraz z 70% etanolem jako kontrolą negatywną dla wszystkich próbek i traktowań.Należy przeprowadzić co najmniej trzy powtórzenia, stosując większą liczbę powtórzeń dla kontroli pozytywnych. Dodać pełną pożywkę, aby całkowita objętość w każdej studzience wyniosła 200 µL. Płytki traktowane toksyną cholery inkubować przez 24 godziny przed rozpoczęciem testu MTT.24 godziny po potraktowaniu komórek kwasami tłuszczowymi lub kolorotonem, żywotność komórek zostaje określona za pomocą testu MTT. Należy usunąć roztwór z każdej studzienki płytki 96-dołkowej przeznaczonej do badania i zastąpić go 200 µL świeżego, pełnego roztworu pożywki.Do każdego dołka dodaj 10 µL świeżo przygotowanego roztworu MTT o stężeniu 2,5 mg/mL. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy do czterech godzin. Po tym czasie usuń pożywkę i do każdego dołka dodaj 100 µL 0,04 M kwasu solnego w izopropanolu.Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przenieś roztwór z każdej studni do probówki do wirowania i wiruj przy 20 000 g przez jedną minutę lub do czasu utworzenia osadu. Przenieś od 20 do 40 µL każdej próbki do czytnika mikropłytek i zmierz absorbancję przy 570 nm za pomocą spektrofotometru.Rycina ta przedstawia przeżywalność większości makrofagów w funkcji kontroli dodatniej dla zabiegów z użyciem rosnących stężeń kwasu oleinowego, kwasu linolowego oraz kwasów linolowych. Wyraźnie widać, że komórki nie tolerują stężeń powyżej 100 ng/µL dla żadnego z kwasów tłuszczowych. Eksperyment powtórzono z użyciem ludzkich komórek nabłonkowych dla stężeń niższych niż 100 ng/µL w przyrostach 10 ng/µL, aż do 70 ng/µL.Wykres ten przedstawia przeżywalność komórek dla każdego stężenia kwasu oleinowego. Metoda One-way ANOVA wykazała, że jedna lub więcej z wartości średnich różniły się statystycznie. Jednak tylko w przypadku zabiegów przy wyższych stężeniach uzyskano wartości średnie statystycznie różne od wartości kontroli pozytywnej.Co ciekawe, zaobserwowane różnice wynikały ze wzrostu żywotności komórek przy większej zmienności. Podobne wyniki uzyskano dla kwasów linolowego i linolowego. Jednym ze sposobów.Analiza Inova wykazała, że żadna ze średnich dla grup traktowanych nie różniła się statystycznie od średniej kontroli pozytywnej, jednak zmienność zdaje się wzrastać dla niektórych wyższych stężeń, takich jak 60 ng/µL kwasu linolowego, co wynika z tych rezultatów. Optymalne stężenia kwasów tłuszczowych przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego wydają się mieścić w przedziale od 1 do 5 ng/µL. Przebadano również wpływ różnych stężeń toksyny kolerowej na przeżywalność większości makrofagów, stosując poziomy toksyny w stosunkowo dużych odstępach.Zaobserwowano trend spadkowy przeżywalności komórek, zgodnie z oczekiwaniami, że przeżywalność będzie znacznie się różnić dla poszczególnych wariantów traktowania. Duża zmienność przeżywalności sprawiła, że nie stwierdzono istotnych różnic między średnią dla kontroli pozytywnej a jakimkolwiek wariantem traktowania, co doprowadziło do dalszych badań przy poziomach toksyny wynoszących 100 ng lub mniej. Wykres ten przedstawia przeżywalność komórek dla wariantów traktowania z niższym poziomem toksyny.Żywotność komórek jest bardzo zmienna dla prawie wszystkich stężeń toksyny, choć w wyniku zastosowanych zabiegów zaobserwowano niewielkie wzrosty żywotności. Wzrosty te nie są istotne statystycznie dla żadnego z zabiegów w porównaniu ze średnią dla kontroli pozytywnej. Na podstawie tych wyników.Zalecane stężenie toksyny cholery wynosi mniej niż 30 ng na traktowanie w przypadku użycia makrofagów mysich z linii bowel C po ich namnożeniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie badań nad cholerą do sprawdzenia, czy kwasy tłuszczowe mogą wzmacniać odporność przeciwko zakażeniu Vibrio cholerae.

determination-tolerable-fatty-acids-cholera-toxin-concentrations

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena tolerancji kwasów tłuszczowych i stężenia toksyn cholery za pomocą ludzkich komórek nabłonka jelitowego i makrofagów myszy BALB/c

W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano metodologię szybkiej izolacji komórek dendrytycznych (DCs) oraz makrofagów z jelit myszy. Charakterystyka fenotypowa jelitowych komórek dendrytycznych i makrofagów jest przeprowadzana za pomocą wielokolorowej analizy cytometrycznej, natomiast wzbogacanie za pomocą kulek magnetycznych z następującym po nim sortowaniem komórek jest stosowane w celu uzyskania populacji o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

Opracowano wysokoprzepustowy test in vitro fenotypu Salmonelli lub innych bakterii asocjacyjnych, inwazyjnych i replikacyjnych w komórkach fagocytarnych o wysokiej przepustowości. Metodę wykorzystano do oceny zmutowanych szczepów z nokautem genu Salmonelli pod kątem ich udziału w interakcjach gospodarz-patogen.

Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Komórki Caco-2 mogą służyć jako model in vitro do badania transportu lipidów przez enterocyty oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków/witamin. Przepuszczalny system błonowy oddziela przedział wierzchołkowy od podstawno-bocznego, podczas gdy system ekspresji lentiwirusa oferuje skuteczną metodę nadekspresji genów. Izolacja lipoprotein jest potwierdzona przez TEM.

Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Ten protokół opisuje test do charakterystyki tworzenia się kropelek lipidowych (LD) w organoidach jelitowych człowieka po stymulacji kwasami tłuszczowymi. Omówiliśmy, w jaki sposób ten test jest używany do ilościowego oznaczania powstawania LD i jak można go wykorzystać do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które wpływają na tworzenie LD.

Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Escherichia coli powoduje sepsę u noworodków, które połykają bakterie w czasie porodu. Proces związany ze zdolnością E. coli do przemieszczania się z przewodu pokarmowego do krwiobiegu jest słabo poznany. Ten model in vitro ocenia zdolność szczepów E. coli do przemieszczania się przez komórki nabłonka jelitowego.

Ocena transcytozy jelitowej izolatów bakteriemii Escherichia coli u noworodków

Tutaj opisujemy konstrukcję podstawowego, trójwymiarowego (3D) modelu linii komórkowej jelitowej oraz protokołu osadzania parafiny do mikroskopowej oceny stałych jelitowych odpowiedników. Barwienie wybranych białek umożliwia analizę wielu parametrów wzrokowych z jednego eksperymentu do potencjalnego wykorzystania w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków.

Podstawowy trójwymiarowy (3D) model jelitowy z komponentem odpornościowym

Poznaj metodę oznaczania tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny cholery przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego oraz mysich makrofagów BALB/c. Technika ta wykorzystuje test MTT do oceny przeżywalności komórek.

Oznaczanie tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego i mysich makrofagów BALB/c (Wideo) | JoVE Journal

Oznaczanie tolerowanych stężeń kwasów tłuszczowych i toksyny przy użyciu ludzkich komórek nabłonka jelitowego i mysich makrofagów BALB/c

Przeglądaj więcej filmów