Name: Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych z użyciem doksorubicyny. Ta technika umożliwia szybkie i czułe badanie indukcji senescencji w badaniach nad nowotworami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy SF 4206 ICORE (Université de Caen) za korzystanie z urządzenia do cytometrii. J.C. otrzymał stypendia podoktorskie od Conseil de Radioprotection d'EDF i Conseil Régional of Basse-Normandie. Dane te były częścią projektów finansowanych przez Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l'Orne et du Calvados.

1. Przygotowanie C12FDG, Bafilomycyny A1 i hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Rozpuścić proszek C12FDG w sulfotlenku dimetylu (DMSO) do końcowego stężenia 20 mM. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. DMSO należy stosować w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa.</li>
	<li>Rozpuścić proszek bafilomycyny A1 w DMSO do końcowego stężenia 0,1 mM. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. Bafilomycynę należy stosować w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa.</li>
	<li>Hodować linię komórkową RPMI 8226 lub inne linie komórkowe przylegające lub nie, w pożywkach zawierających 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyków, w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Oszacuj liczbę komórek potrzebnych do eksperymentu. Aby zarejestrować wystarczającą liczbę zdarzeń podczas analizy cytometrii przepływowej, wymagane jest 5 x 105 komórek. Aby określić procent komórek starczych, potrzebne są trzy próbki komórek: próbka nieznakowana, komórki niepoddane działaniu substancji barwione C12FDG, komórki poddane działaniu substancji wybarwione C12FDG.</li>
	<li>Wysiewaj komórki 24 godziny przed wykonaniem eksperymentu, aby komórki znajdowały się w fazie logarytmicznej krzywej proliferacji komórkowej.</li>
</ol>
2. Indukcja starzenia się
<ol>
	<li>Indukuj starzenie się komórek rakowych poprzez dodanie leku chemioterapeutycznego. Stężenie leku i czas trwania leczenia powinny być dostosowane do badanego typu komórek. Rozpocznij od 48-godzinnej kuracji w końcowym stężeniu doksorubicyny 50 nM dla stężenia komórek na poziomie około 10-6 komórek/ml. Nie zapomnij dołączyć próbki niepoddanej działaniu substancji (kontrola ujemna).</li>
</ol>
3. Leczenie bafilomycyną A1
<ol>
	<li>Sprawdź żywotność komórek, mieszając je z błękitem trypanowym (v/v), ponieważ lek chemioterapeutyczny zastosowany w poprzednim etapie może prowadzić do apoptozy komórek. Wypełnij do komory Malasseza i policz liczbę niebieskich komórek (martwych komórek) i białych krwinek (żywych komórek). Jeśli procent żywotności jest mniejszy niż 70%, martwe komórki można usunąć za pomocą odpowiedniego zestawu, aby zapewnić, że martwe komórki nie będą zniekształcać późniejszej analizy.</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną i zastąp ją wstępnie podgrzaną świeżą pożywką hodowlaną. Potraktować komórki końcowym stężeniem 100 nM bafilomycyny A1. Bafilomycyna A1 służy do neutralizacji kwaśnego pH lizosomów. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
4. C12FDG Barwienie
<ol>
	<li>Rozpuścić C12FDG w podgrzanych świeżych pożywkach do końcowego stężenia 2 mM.</li>
	<li>Dodać związek do komórek w końcowym stężeniu 33 μM i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . W przypadku stosowania komórek nieprzylegających, należy odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (może być konieczne dostosowanie prędkości do użytego typu ogniwa), przemyć 2x PBS. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl zimnego PBS. Jeśli używasz przylegających komórek, usuń pożywkę i przemyj 2x PBS. Zebrać przylegające komórki za pomocą roztworu trypsyny i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C (może być konieczne dostosowanie prędkości do użytego typu komórek). Zawiesić osad komórkowy w 500 μl zimnego PBS. W obu przypadkach stężenie komórek powinno wynosić około 106 komórek/ml.</li>
	<li>Wykonaj koimmunoznakowanie, aby dokładniej scharakteryzować populację komórek starczych.</li>
</ol>
5. Analiza cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Skalibrować cytometr przepływowy za pomocą kulek kontrolnych zalecanych przez producenta cytometru przepływowego. Dla wszystkich etapów należy zarejestrować co najmniej 104 zdarzenia.</li>
	<li>Uruchom pierwszą próbkę zawierającą komórki bez etykiet. Przygotuj dwuparametrową grafikę przedstawiającą Forward Scatter Channel (FSC) i Side Scatter Channel (SSC). Ustaw PhotoMultiplier Tubes (PMT) i zdefiniuj obszar zainteresowania z wyłączeniem martwych komórek i resztek komórkowych, które mogły pojawić się podczas przygotowywania próbki. Bramkuje ten obszar zainteresowania na histogramie z jednym parametrem wyświetlającym FL1 na skali logarytmicznej osi x i liczbę zdarzeń na osi y. Łączna liczba zdarzeń reprezentuje liczbę analizowanych komórek. Ustaw PMT tak, aby nieoznaczone komórki pojawiały się w pierwszej dekadzie na skali logarytmicznej osi x. W razie potrzeby określić autofluorescencję komórek.</li>
	<li>Uruchomić drugą próbkę zawierającą komórki niepoddane działaniu środka. Na jednoparametrowym histogramie wyświetlającym FL1 (fluorescencja C12FDG) umieść kursor za słabo oznaczoną populacją. Próg ten pozwoli na rozróżnienie między komórkami niestarczymi (słabo oznakowanymi komórkami) a komórkami starczymi (jasno oznaczonymi komórkami).</li>
	<li>Uruchomić trzecią próbkę zawierającą komórki poddane działaniu środka. Jaskrawo oznaczone komórki, czyli komórki starcze, pojawiają się powyżej progu określonego w poprzednim kroku. Oceń procent komórek starczych, dzieląc liczbę jasnych zdarzeń na całkowitą liczbę zdarzeń. W razie potrzeby aktywność β-galaktozydazy można również oszacować za pomocą średniej intensywności fluorescencji.</li>
</ol>

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li>
<li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li>
<li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li>
<li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis%3A+a+link+between+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li>
<li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li>
<li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%28beta%29-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446(2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiliśmy tutaj metodę opartą na cytometrii przepływowej do ilościowego określania starzenia się komórek w żywych komórkach nowotworowych. Metoda ta opiera się na zastosowaniu związku przepuszczalnego przez błonę, C12FDG, i dlatego może być stosowana w dowolnych typach komórek i po różnych zabiegach, o ile związek jest pobierany przez komórki. Po wychwycie komórkowym C12FDG jest hydrolizowany przez β-galaktozydazę, wzbogaconą w lizosomy komórek starczych. Po wzbudzeniu laserowym związek emituj...

Od wczesnych lat sześćdziesiątych i odkrycia przez Hayflicka i Moorheada, starzenie się nadal pozostaje komórkową ciekawostką 1. Ludzkie komórki nie rozmnażają się w nieskończoność, a przez starzenie się Hayflick i Moorhead ukuli komórkowy proces starzenia się. Starzenie się to stabilne zatrzymanie cyklu komórkowego, w którym komórki pozostają aktywne metabolicznie, w przeciwieństwie do śmierci komórkowej. Do tej pory wykazano, że cztery mechanizmy komórkowe indukują starzenie się: skracanie telomerów, uszkodzenie DNA, zaburzenia chromatyny i nieprawidłowa ekspresja mitogennych onkogenów 2. Oznacza to, że nie tylko normalne komórki, ale także komórki rakowe są w stanie ulec starzeniu 3. W rzeczywistości wykazano, że komórki nowotworowe ulegające starzeniu się stanowią barierę dla dalszej progresji guza 4-5. Jednak kilka doniesień wskazało, że w pewnych okolicznościach starzenie się komórek może również sprzyjać nowotworom złośliwym 6-7. Badanie starzenia się komórek nowotworowych wkrótce stanie się pilną potrzebą w badaniach nad rakiem, ponieważ obecnie stosowane leki chemioterapeutyczne mogą prowadzić do starzenia się komórek rakowych nie tylko in vitro, ale także in vivo 8.
Głównym testem do badania obecności komórek starczych jest test β-galaktozydazy o kwaśnym pH. Ten test histochemiczny odzwierciedla zwiększoną biogenezę lizosomalną zachodzącą w większości komórek starczych. Krótko mówiąc, egzogenny X-gal, nałożony na komórki, jest rozszczepiany przez β-galaktozydazę wzbogaconą w lizosomy komórek starczych, co daje niebieski kolor 9. Niebieskie komórki starcze można następnie określić ilościowo pod mikroskopem jasnego pola. Chociaż test β-galaktozydazy jest bardzo popularny, ma poważne wady. Po pierwsze, ten test jest wykonywany na stałych komórkach. Po drugie, jest to czasochłonne, ponieważ oznacza ilościowe określenie stopnia starzenia się poprzez zliczenie znacznie dużej liczby komórek starczych pod mikroskopem. Po trzecie, test ten nie jest czuły, ponieważ rozróżnienie między komórkami starczymi i niestarzejącymi się całkowicie zależy od obserwatora.
Omawiamy tutaj niewykorzystany, szybki i czuły test oparty na cytometrii do oceny obecności żywych komórek starczych. Test ten opiera się na hydrolizie cząsteczki przepuszczalnej przez błonę, 5-dodekanoiloaminofluoresceiny di-β-D-galaktopyranozydu (C12FDG), przez β-galaktozydazę wzbogaconą w komórki starcze. Po hydrolizie i wzbudzeniu laserowym C12FDG emituje zieloną fluorescencję i dlatego może być wykryty za pomocą cytometrii przepływowej 10, 11. Wykrywanie komórek starczych za pomocą cytometrii przepływowej ma tę wielką zaletę, że jest szybkie i czułe. Ponadto wykrywanie komórek starczych za pomocą cytometrii przepływowej może być połączone z wykrywaniem innych markerów komórkowych. Test ten może być stosowany do wykrywania komórek starczych w populacji komórek rakowych leczonych chemioterapią i może być rutynowo umieszczany na skrawkach tkanki, po dysocjacji komórek, w klinice.

<table><tbody><tr><td>5-dodekanylaminofluoresceina di-&#946;-D-galaktopyranozyd </td><td>Invitrogen</td><td>D-2893</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek </td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycyna A1</td><td>Sigma</td><td>B1793</td><td></td></tr><tr><td>Doksorubicyna</td><td>Sandoz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Lonza</td><td>BE12-702</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>PAA Laboratories GmBH</td><td>A15 101</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>Gibco</td><td>5290-018</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Gallios</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94291</td><td></td></tr></tbody></table>

właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Ludzkie komórki nie mnożą się w nieskończoność. Pod wpływem sygnałów zewnętrznych i/lub wewnętrznych komórki mogą umrzeć lub wejść w stabilne zatrzymanie cyklu komórkowego zwane starzeniem. Wykazano, że kilka mechanizmów komórkowych, takich jak skracanie telomerów i nieprawidłowa ekspresja onkogenów mitogennych, powoduje starzenie się. Starzenie się nie ogranicza się do normalnych komórek; Zgłaszano również, że komórki rakowe starzeją się.
	Wykazano, że leki chemoterapeutyczne wywołują starzenie się komórek rakowych. Pozostaje jednak kwestią sporną, czy starzenie się zapobiega, czy sprzyja nowotworzeniu. Ponieważ może to być ostatecznie specyficzne dla pacjenta, wkrótce potrzebna będzie szybka i czuła metoda oceny starzenia się komórek rakowych.
	W tym celu, standardowy test β-galaktozydazy, obecnie stosowana metoda, ma poważne wady: jest czasochłonny i niewrażliwy. Proponujemy tutaj test oparty na cytometrii przepływowej do badania starzenia się żywych komórek. Ten test ma tę zaletę, że jest szybki, czuły i może być sprzężony z znakowaniem immunologicznym różnych markerów komórkowych.

W celu oceny starzenia indukowanego procedurą chemoterapeutyczną wykorzystano szpiczak mnogą, nowotwór hematologiczny. W tym celu komercyjnie dostępną linię komórkową MM (RPMI 8226) traktowano przez 2 dni doksorubicyną, lekiem chemioterapeutycznym. Następnie komórki poddano działaniu bafilomycyny A1 i inkubowano dalej z C12FDG. Komórki analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Rysunek 1 ilustruje poszczególne etapy i pokazuje, że odsetek komórek starzejących się można określić w ciągu jed...

Czy starzenie się zapobiega lub sprzyja nowotworzenia, pozostaje kwestią sporną. Ponieważ leki chemoterapeutyczne mogą indukować starzenie się komórek rakowych, badanie starzenia się jest niezbędne do zaproponowania nowych terapii. Jednak standardowy i szeroko stosowany test β-galaktozydazy ma poważne wady. Proponujemy tutaj szybki i czuły test oparty na cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia starzenia.

Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka i czuła kwantyfikacja starzenia się komórek. W niniejszym opracowaniu demonstrujemy użyteczność tej metody w przesiewaniu potencjalnych leków chemioterapeutycznych. W pierwszej kolejności należy wywołać starzenie się komórek.Do komórek nowotworowych dodaje się lek chemioterapeutyczny doksorubicynę. Następnie stosuje się Bain A one w celu neutralizacji niskiego pH lizosomów komórkowych. Po wniknięciu do wnętrza komórek dodawany jest przenikający przez błony komórkowe substrat beta-galaktozy C 12 FDG.C 12 FDG ulega hydrolizie i wykazuje fluorescencję. Ponieważ beta GCSEs są wzbogacone w lizosomach komórek senescencyjnych, stają się one bardziej fluorescencyjne niż komórki niesenescencyjne. Aby ilościowo określić różnicę w fluorescencji, komórki są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej; analiza uzyskanych danych pozwala na określenie procentowej zawartości senescencyjnych komórek nowotworowych w różnych warunkach traktowania.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test beta-galaktozydazy, jest fakt, że ułatwia ona szybką i czułą kwantyfikację komórek senescencyjnych. W rzeczywistości pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy napotkaliśmy trudności z ilościowym oznaczaniem komórek senescencyjnych przy użyciu powszechnie stosowanego testu beta-galaktozydazy. Choć wykorzystujemy tę technikę do wykrywania senescencji w komórkach nowotworowych, można ją również zastosować w komórkach prawidłowych.Metoda ta może pomóc w szybkim udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu onkologii, na przykład czy lek chemioterapeutyczny wywołał w komórkach nowotworowych proces sse, który może promować złośliwość nowotworu. Tym samym technika ta mogłaby ostatecznie pomóc w opracowaniu nowych metod leczenia raka. Pracując w dygestorium chemicznym, rozpuścić proszek C 12 FDG w DMSO do stężenia końcowego 20 millimolar, rozdzielić do probówek typu eppendorf o pojemności 0,5 mililitra i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.DMSO należy stosować przy zachowaniu odpowiednich zasad bezpieczeństwa. Proszek CIN A należy rozpuścić w DMSO do końcowego stężenia 0,1 mM. Roztwór należy rozdzielić do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.Należy pamiętać, że z CIN należy korzystać przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności. Procedurę tę można przeprowadzić z użyciem komórek adherentnych lub nieadherentnych. W tym przypadku procedura jest zaprezentowana na ludzkiej linii komórkowej szpiczaka RPMI 8 2 2 6.Komórki te rosną w zawiesinie; hodować komórki RPMI 8 2 2 6 w pożywce zawierającej 10% FBS i 1% antybiotyków w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Na 24 godziny przed przeprowadzeniem eksperymentu wysiać komórki na płytki sześciodołkowe w taki sposób, aby znajdowały się one w fazie logarytmicznej krzywej proliferacji komórkowej. W celu oznaczenia odsetka komórek senescencyjnych podczas eksperymentu wymagane będą trzy próbki komórek: komórki niepoddane działaniu czynnika i niebarwione SA, komórki niepoddane działaniu czynnika i barwione C 12 FDG oraz komórki poddane działaniu czynnika i barwione C 12 FTG.Dla każdego warunku, do analizy indukowanej cytometrią przepływową senescencji komórek nowotworowych wymagane jest minimum 5 × 10⁵ komórek. Po dodaniu doksorubicyny, leku chemioterapeutycznego, stężenie leku oraz czas trwania terapii należy dostosować do typu komórek. Metoda została przetestowana dla komórek RPMI 8226.Starzenie komórkowe można wywołać, traktując 10 z sześciu komórek na mililitr 15 nM doksorubicyny przez 48 h. Należy pamiętać o uwzględnieniu próbki nietraktowanej jako kontroli negatywnej, inkubowanej w 37 °C i 5% CO2. Leczenie lekami chemioterapeutycznymi może prowadzić do apoptozy komórek.W związku z tym po dwóch dniach należy sprawdzić żywotność komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego przy użyciu cytometru hematologicznego i mikroskopu. Jeśli odsetek żywotności jest mniejszy niż 70%, należy usunąć martwe komórki za pomocą odpowiedniego zestawu, takiego jak dead cell removal kit firmy Miltenyi Biotec, aby upewnić się, że martwe komórki nie wpłyną na wyniki późniejszej analizy. W przeciwnym razie należy usunąć pożywkę hodowlaną, wirowaćc komórki z prędkością 300 ×g przez pięć minut.Następnie, po usunięciu supernatantu, należy dodać podgrzane świeże pożywkę hodowlaną zawierającą 100 nM bafilomycyny A1 w celu neutralizacji niskiego pH lizosomów i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnie należy rozpuścić substrat beta-galaktozydazy C12FDG w podgrzanej świeżej pożywce hodowlanej do stężenia końcowego 2 mM, po uprzedniej inkubacji z bafilomycyną.Dodaj C 12 FDG bezpośrednio do komórek i pożywki do stężenia końcowego 33 µM. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po inkubacji odwiruj komórki przy 300 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu przemyj komórki dwukrotnie w PBS, za każdym razem wirując je w ten sam sposób co wcześniej i usuwając nadsącz po drugim przemyciu. Ponownie zawieś osad komórkowy w 500 µL zimnego PBS, a następnie przeprowadź przeciwciałowe znakowanie wielokrotne, aby dalej scharakteryzować populację komórek senescencyjnych. Jeśli nie posiadasz doświadczenia w cytometrii przepływowej, najtrudniejszym elementem tej procedury będzie przeprowadzenie analizy cytometrycznej.Aby zapewnić sukces, należy uwzględnić odpowiednie kontrole i w razie potrzeby skorzystać z pomocy doświadczonej osoby. Przed analizą pierwszej próbki należy przygotować dwuparametryczny wykres przedstawiający kanał rozproszenia w przód FSC względem kanału rozproszenia bocznego SSC. Następnie należy przeanalizować pierwszą próbkę zawierającą nieznakowane komórki.Ustaw fotopowielacze (PMT) i zdefiniuj obszar zainteresowania (region of interest), wykluczając martwe komórki oraz szczątki komórkowe, które mogły pojawić się podczas bramkowania przygotowania próbki. Ten obszar zainteresowania znajduje się na histogramie jednoparametrowym, który przedstawia fluorescencję C 12 FDG jako FL1 w skali logarytmicznej na osi X oraz liczbę zdarzeń na osi Y. Całkowita liczba zdarzeń reprezentuje liczbę analizowanych komórek.Ustaw PMT w taki sposób, aby nieoznaczone komórki znajdowały się w pierwszej dekadzie logarytmicznej skali osi x. W razie potrzeby określ autofluorescencję komórek, przeprowadzając analizę nieoznaczonych komórek w cytometrze przepływowym. Przeanalizuj drugą próbkę zawierającą komórki niepoddane działaniu preparatu na histogramie jednego parametru wyświetlającym FL1, a następnie ustaw kursor za populacją słabo oznakowaną.Próg ten pozwoli na rozróżnienie między komórkami niesenescencyjnymi, które są słabo znakowane, a komórkami senescencyjnymi, które wykazują silne znakowanie. Przeanalizuj trzecią próbkę zawierającą komórki poddane działaniu czynnika. Silnie znakowane komórki senescencyjne pojawiają się powyżej progu ustalonego w poprzednim kroku.W razie potrzeby należy ocenić procent komórek senescencyjnych, dzieląc liczbę zdarzeń o wysokiej intensywności przez całkowitą liczbę zdarzeń. Aktywność beta-galaktozydazy można również oszacować za pomocą średniej intensywności fluorescencji, aby ocenić starzenie wywołane procedurą chemioterapeutyczną. Komercyjnie dostępna linia komórkowa szpiczaka mnogiego R RRP I 8 2 2 6 była traktowana przez dwa dni doxorubicyną, lekiem chemioterapeutycznym; w teście na senescencję opisanym w tym filmie, histogramy te przedstawiają fluorescencję komórek nietraktowanych po lewej stronie oraz komórek traktowanych po prawej stronie.W obszarze V pojawia się populacja intensywnie oznakowanych komórek reprezentujących komórki senescencyjne. Równolegle tę samą próbkę komórek barwiono przy użyciu testu beta-galaktozydazy. Na tym reprezentatywnym zdjęciu pokazano komórki całkowicie niebieskie oraz częściowo niebieskie, aby zilustrować trudność w rozróżnianiu prawdziwie niebieskich komórek senescencyjnych. Aby zilustrować specyficzność C 12 FDG w określaniu procentowego udziału komórek senescencyjnych, komórki poddano również działaniu różnych stężeń doksorubicyny.Procent komórek senescencyjnych określono poprzez podzielenie liczby zdarzeń jasnych przez całkowitą liczbę zdarzeń. Dla dawek doxorubicyny wynoszących odpowiednio 5, 25 i 50 nanomolar, odsetek komórek senescencyjnych wyniósł 0,8%, 15,78% oraz 26,31%. Dowodzi to, że znakowanie C 12 FTG jest specyficzne dla komórek senescencyjnych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić liczbę komórek senescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej, oraz w jaki sposób przeprowadzić procedury, takie jak znakowanie immunologiczne, w celu charakterystyki tych komórek. Należy pamiętać, że praca z DMSO lub komórkami nowotworowymi może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności.

a-sensitive-method-to-quantify-senescent-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Delikatna metoda ilościowego określania senescentnych komórek rakowych

Ten film ilustruje test oparty na cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania komórek raka starczego wywołanego terapią za pomocą podwójnych markerów starzenia. Wykrywanie i kwantyfikacja komórek starczych wymaga użycia substratu β-galaktozydazy. Substrat jest rozszczepiany przez aktywną lizosomalną β-galaktozydazę w komórkach starczych, wytwarzając produkt fluorescencyjny, który w połączeniu z granulkami autofluorescencyjnej lipofuscyny oznacza starcze komórki rakowe.

Kwantyfikacja starzejących się komórek nowotworowych wywołanych terapią za pomocą cytometrii przepływowej

Starzenie się komórek, nieodwracalny stan zatrzymania cyklu komórkowego, może być wywołane przez różne stresy komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokoły indukowania starzenia się komórek oraz metody oceny markerów starzenia.

Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

Tutaj omawiamy szereg protokołów do indukcji i walidacji starzenia się komórek w hodowanych komórkach. Skupiamy się na różnych bodźcach wywołujących starzenie i opisujemy kwantyfikację powszechnych markerów związanych ze starzeniem się. Przedstawiamy szczegóły techniczne na przykładzie fibroblastów, ale protokoły można dostosować do różnych modeli komórkowych.

Indukcja i walidacja starzenia się komórek w pierwotnych komórkach ludzkich

Wykazano, że wewnątrzkomórkowy ROS odgrywa ważną rolę w indukcji starzenia się komórek. W tym miejscu opisujemy czuły test do ilościowego określania poziomów ROS podczas starzenia się komórek. Udostępniamy również protokoły oceny fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się, który podobno przyczynia się do różnych dysfunkcji związanych z wiekiem.

Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Przedstawiono protokół fluorescencyjnej, cytometrycznej cytometrii przepływowej starzejących się komórek nowotworowych indukowanych przez chemioterapię w hodowli komórkowej lub w mysich modelach nowotworów. Opcjonalne procedury obejmują współbarwienie immunologiczne, utrwalanie próbki w celu ułatwienia analizy dużych partii lub punktów czasowych oraz wzbogacanie żywotnych komórek starczych przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej.

Sonda β-galaktozydazy związana ze starzeniem się w kolorze dalekiej czerwieni do identyfikacji i wzbogacania starzejących się komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej

Badanie to ocenia proliferacyjne efekty czynników wydzielniczych związanych ze starzeniem (SASP) pochodzących z komórek HeLa na komórki HeLa niestarzejące, wykorzystując trzy modele in vitro z monitoringiem w czasie rzeczywistym. Zalety i ograniczenia każdej metody były systematycznie porównywane, aby lepiej zrozumieć interakcje komórki w nowotworach.

Ocena wpływu czynników SASP na proliferację komórek nowotworowych za pomocą analizy porównawczej trzech różnych metodologii

Ten protokół przedstawia mikroskopie konfokalną światła odbitego do obiektywnej, pojedynczej komórkowej detekcji aktywności senescencji związanej z beta-galaktozydazą (SA-β-gal) w frakcji naczyniowej stromy izolowanych z ludzkiego tkanki tłuszczowej. Metoda jest kompatybilna z immunocytochemią, zawiera kontrole pH do oceny ilościowej i dodatkowo zapewnia bardziej wrażliwą i mniej subiektywną alternatywę dla konwencjonalnego barwienia SA-β-gal.

Wykrywanie starzenia się przy użyciu odbitego światła w frakcji naczyniowej tkanki tłuszczowej

Ten artykuł przedstawia protokół LysoTracker dla żywych komórek w celu zmierzenia remodelacji lizosomalnej podczas starzenia się w  fibroblastach ludzkich IMR-90.

Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych z użyciem doksorubicyny. Ta technika umożliwia szybkie i czułe badanie indukcji senescencji w badaniach nad nowotworami.

Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Przeglądaj więcej filmów