Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybka i czuła kwantyfikacja starzenia się komórek. W niniejszym opracowaniu demonstrujemy użyteczność tej metody w przesiewaniu potencjalnych leków chemioterapeutycznych. W pierwszej kolejności należy wywołać starzenie się komórek.

Do komórek nowotworowych dodaje się lek chemioterapeutyczny doksorubicynę. Następnie stosuje się Bain A one w celu neutralizacji niskiego pH lizosomów komórkowych. Po wniknięciu do wnętrza komórek dodawany jest przenikający przez błony komórkowe substrat beta-galaktozy C 12 FDG.

C 12 FDG ulega hydrolizie i wykazuje fluorescencję. Ponieważ beta GCSEs są wzbogacone w lizosomach komórek senescencyjnych, stają się one bardziej fluorescencyjne niż komórki niesenescencyjne. Aby ilościowo określić różnicę w fluorescencji, komórki są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej; analiza uzyskanych danych pozwala na określenie procentowej zawartości senescencyjnych komórek nowotworowych w różnych warunkach traktowania.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test beta-galaktozydazy, jest fakt, że ułatwia ona szybką i czułą kwantyfikację komórek senescencyjnych. W rzeczywistości pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy napotkaliśmy trudności z ilościowym oznaczaniem komórek senescencyjnych przy użyciu powszechnie stosowanego testu beta-galaktozydazy. Choć wykorzystujemy tę technikę do wykrywania senescencji w komórkach nowotworowych, można ją również zastosować w komórkach prawidłowych.

Metoda ta może pomóc w szybkim udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu onkologii, na przykład czy lek chemioterapeutyczny wywołał w komórkach nowotworowych proces sse, który może promować złośliwość nowotworu. Tym samym technika ta mogłaby ostatecznie pomóc w opracowaniu nowych metod leczenia raka. Pracując w dygestorium chemicznym, rozpuścić proszek C 12 FDG w DMSO do stężenia końcowego 20 millimolar, rozdzielić do probówek typu eppendorf o pojemności 0,5 mililitra i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

DMSO należy stosować przy zachowaniu odpowiednich zasad bezpieczeństwa. Proszek CIN A należy rozpuścić w DMSO do końcowego stężenia 0,1 mM. Roztwór należy rozdzielić do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.

Należy pamiętać, że z CIN należy korzystać przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności. Procedurę tę można przeprowadzić z użyciem komórek adherentnych lub nieadherentnych. W tym przypadku procedura jest zaprezentowana na ludzkiej linii komórkowej szpiczaka RPMI 8 2 2 6.

Komórki te rosną w zawiesinie; hodować komórki RPMI 8 2 2 6 w pożywce zawierającej 10% FBS i 1% antybiotyków w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Na 24 godziny przed przeprowadzeniem eksperymentu wysiać komórki na płytki sześciodołkowe w taki sposób, aby znajdowały się one w fazie logarytmicznej krzywej proliferacji komórkowej. W celu oznaczenia odsetka komórek senescencyjnych podczas eksperymentu wymagane będą trzy próbki komórek: komórki niepoddane działaniu czynnika i niebarwione SA, komórki niepoddane działaniu czynnika i barwione C 12 FDG oraz komórki poddane działaniu czynnika i barwione C 12 FTG.

Dla każdego warunku, do analizy indukowanej cytometrią przepływową senescencji komórek nowotworowych wymagane jest minimum 5 × 10⁵ komórek. Po dodaniu doksorubicyny, leku chemioterapeutycznego, stężenie leku oraz czas trwania terapii należy dostosować do typu komórek. Metoda została przetestowana dla komórek RPMI 8226.

Starzenie komórkowe można wywołać, traktując 10 z sześciu komórek na mililitr 15 nM doksorubicyny przez 48 h. Należy pamiętać o uwzględnieniu próbki nietraktowanej jako kontroli negatywnej, inkubowanej w 37 °C i 5% CO2. Leczenie lekami chemioterapeutycznymi może prowadzić do apoptozy komórek.

W związku z tym po dwóch dniach należy sprawdzić żywotność komórek metodą wykluczania błękitu trypanowego przy użyciu cytometru hematologicznego i mikroskopu. Jeśli odsetek żywotności jest mniejszy niż 70%, należy usunąć martwe komórki za pomocą odpowiedniego zestawu, takiego jak dead cell removal kit firmy Miltenyi Biotec, aby upewnić się, że martwe komórki nie wpłyną na wyniki późniejszej analizy. W przeciwnym razie należy usunąć pożywkę hodowlaną, wirowaćc komórki z prędkością 300 ×g przez pięć minut.

Następnie, po usunięciu supernatantu, należy dodać podgrzane świeże pożywkę hodowlaną zawierającą 100 nM bafilomycyny A1 w celu neutralizacji niskiego pH lizosomów i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnie należy rozpuścić substrat beta-galaktozydazy C12FDG w podgrzanej świeżej pożywce hodowlanej do stężenia końcowego 2 mM, po uprzedniej inkubacji z bafilomycyną.

Dodaj C 12 FDG bezpośrednio do komórek i pożywki do stężenia końcowego 33 µM. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po inkubacji odwiruj komórki przy 300 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu przemyj komórki dwukrotnie w PBS, za każdym razem wirując je w ten sam sposób co wcześniej i usuwając nadsącz po drugim przemyciu. Ponownie zawieś osad komórkowy w 500 µL zimnego PBS, a następnie przeprowadź przeciwciałowe znakowanie wielokrotne, aby dalej scharakteryzować populację komórek senescencyjnych. Jeśli nie posiadasz doświadczenia w cytometrii przepływowej, najtrudniejszym elementem tej procedury będzie przeprowadzenie analizy cytometrycznej.

Aby zapewnić sukces, należy uwzględnić odpowiednie kontrole i w razie potrzeby skorzystać z pomocy doświadczonej osoby. Przed analizą pierwszej próbki należy przygotować dwuparametryczny wykres przedstawiający kanał rozproszenia w przód FSC względem kanału rozproszenia bocznego SSC. Następnie należy przeanalizować pierwszą próbkę zawierającą nieznakowane komórki.

Ustaw fotopowielacze (PMT) i zdefiniuj obszar zainteresowania (region of interest), wykluczając martwe komórki oraz szczątki komórkowe, które mogły pojawić się podczas bramkowania przygotowania próbki. Ten obszar zainteresowania znajduje się na histogramie jednoparametrowym, który przedstawia fluorescencję C 12 FDG jako FL1 w skali logarytmicznej na osi X oraz liczbę zdarzeń na osi Y. Całkowita liczba zdarzeń reprezentuje liczbę analizowanych komórek.

Ustaw PMT w taki sposób, aby nieoznaczone komórki znajdowały się w pierwszej dekadzie logarytmicznej skali osi x. W razie potrzeby określ autofluorescencję komórek, przeprowadzając analizę nieoznaczonych komórek w cytometrze przepływowym. Przeanalizuj drugą próbkę zawierającą komórki niepoddane działaniu preparatu na histogramie jednego parametru wyświetlającym FL1, a następnie ustaw kursor za populacją słabo oznakowaną.

Próg ten pozwoli na rozróżnienie między komórkami niesenescencyjnymi, które są słabo znakowane, a komórkami senescencyjnymi, które wykazują silne znakowanie. Przeanalizuj trzecią próbkę zawierającą komórki poddane działaniu czynnika. Silnie znakowane komórki senescencyjne pojawiają się powyżej progu ustalonego w poprzednim kroku.

W razie potrzeby należy ocenić procent komórek senescencyjnych, dzieląc liczbę zdarzeń o wysokiej intensywności przez całkowitą liczbę zdarzeń. Aktywność beta-galaktozydazy można również oszacować za pomocą średniej intensywności fluorescencji, aby ocenić starzenie wywołane procedurą chemioterapeutyczną. Komercyjnie dostępna linia komórkowa szpiczaka mnogiego R RRP I 8 2 2 6 była traktowana przez dwa dni doxorubicyną, lekiem chemioterapeutycznym; w teście na senescencję opisanym w tym filmie, histogramy te przedstawiają fluorescencję komórek nietraktowanych po lewej stronie oraz komórek traktowanych po prawej stronie.

W obszarze V pojawia się populacja intensywnie oznakowanych komórek reprezentujących komórki senescencyjne. Równolegle tę samą próbkę komórek barwiono przy użyciu testu beta-galaktozydazy. Na tym reprezentatywnym zdjęciu pokazano komórki całkowicie niebieskie oraz częściowo niebieskie, aby zilustrować trudność w rozróżnianiu prawdziwie niebieskich komórek senescencyjnych. Aby zilustrować specyficzność C 12 FDG w określaniu procentowego udziału komórek senescencyjnych, komórki poddano również działaniu różnych stężeń doksorubicyny.

Procent komórek senescencyjnych określono poprzez podzielenie liczby zdarzeń jasnych przez całkowitą liczbę zdarzeń. Dla dawek doxorubicyny wynoszących odpowiednio 5, 25 i 50 nanomolar, odsetek komórek senescencyjnych wyniósł 0,8%, 15,78% oraz 26,31%. Dowodzi to, że znakowanie C 12 FTG jest specyficzne dla komórek senescencyjnych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić liczbę komórek senescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej, oraz w jaki sposób przeprowadzić procedury, takie jak znakowanie immunologiczne, w celu charakterystyki tych komórek. Należy pamiętać, że praca z DMSO lub komórkami nowotworowymi może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności.