Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie starzenia się komórek w szybki i czuły sposób. W tym artykule pokazujemy przydatność tej metody w badaniach przesiewowych potencjalnych leków chemioterapeutycznych. Pierwszy, który indukuje starzenie się komórek.

Lek chemioterapeutyczny doksorubicyna jest dodawany do komórek nowotworowych. Następnie stosuje się Bain A w celu zneutralizowania kwaśnego pH lizosomów komórkowych. Następnie po wychwycie komórkowym dodaje się substrat beta galakto permeatu komórkowego C 12 FDG.

C 12 FDG ulega hydrolizie i fluoryzuje. Ponieważ beta GCSE jest wzbogacona w lizosomy komórek starczych, stają się one bardziej fluorescencyjne niż komórki niestarzejące się. Aby określić ilościowo różnicę we fluorescencji, komórki są poddawane analizie cytometru przepływowego uzyskanych danych, co pozwala na ilościowe określenie procentu starzejących się komórek rakowych w różnych warunkach leczenia.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak beta galaktoza, jest to, że ułatwia szybką i czułą ocenę ilościową komórek starczych. W rzeczywistości po raz pierwszy dodajemy pomysł na tę metodę, gdy doświadczamy trudności z ilościowym określeniem komórek starczych przy użyciu powszechnie stosowanego beta-galaktozy asay. Chociaż używamy tej techniki do wykrywania starzenia się komórek rakowych, można ją również stosować na normalnych komórkach.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na szybkie pytania w dziedzinie raka, takie jak to, czy chemioterapeutyk indukuje komórki rakowe do sse, co może sprzyjać nowotworowi złośliwemu. W związku z tym technika ta może ostatecznie pomóc w notyfikacji nowych metod leczenia raka. Pracując w dygestorium chemicznym, rozpuszczono proszek C 12 FDG w DMSO do końcowego stężenia 20 milimolowych podwielokrotności w 0,5 mililitrowych probówkach einor i przechowywano w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

DMSO należy stosować w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa, również rozpuścić. CIN: Jeden proszek w DMSO do końcowego stężenia 0,1. Milimolowy roztwór Eloqua rozlać do 0,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych i przechowywać je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Należy pamiętać, że CIN powinien być używany z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności. Ta procedura może być wykonywana przy użyciu komórek przylegających lub nieprzylegających. Tutaj procedura jest demonstrowana przy użyciu ludzkiej linii komórkowej szpiczaka RPMI 8 2 2 6.

Komórki te rosną w zawiesinie, hodują komórki RPMI 8 2 2 6 w pożywce zawierającej 10% FBS i 1% antybiotyków w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 24 godziny przed wykonaniem eksperymentu zasiej komórki w sześciu płytkach dołkowych, tak aby znajdowały się w fazie logarytmicznej krzywej proliferacji komórkowej. W czasie eksperymentu w celu określenia procentowej zawartości komórek starczych wymagane będą trzy próbki komórek. Nieleczone i niebarwione ST komórki, nieleczone komórki barwione C 12 FDG i leczone komórki barwione C 12 FTG.

Dla każdego stanu wymagane jest co najmniej pięć razy 10 do piątej komórki do starzenia się komórek rakowych wywołanego cytometrią przepływową. Dodając lek chemioterapeutyczny doksorubicynę, stężenie leku i czas trwania leczenia powinny być dostosowane do typu komórek. Testowane dla komórek rpmi 8 2 2 6.

Starzenie się można indukować, traktując 10. z sześciu komórek na mililitr 15-nanomolową doksorubicyną przez 48 godzin. Nie zapomnij dołączyć niepoddanej działaniu substancji próbki jako inkubacji kontroli ujemnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Leczenie chemioterapeutykami może prowadzić do apoptozy komórek.

Dlatego po dwóch dniach sprawdź żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trianowego za pomocą hemo, cytometru i mikroskopu. Jeśli procent żywotności jest mniejszy niż 70%, usuń martwe komórki za pomocą odpowiedniego zestawu, takiego jak zestaw do usuwania martwych komórek firmy Milton E, aby upewnić się, że martwe komórki nie będą zniekształcać późniejszej analizy. W przeciwnym razie usuń pożywkę, obracając komórki w dół z prędkością 300 GS przez pięć minut.

Następnie po usunięciu supernatantu w Prewarm fresh culture pożywce zawierającej 100 anom lub cin, A w celu zneutralizowania kwaśnego pH lizosomów inkubuje się przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla rozpuszcza beta galakto substrat C 12 FDG w przedwojennej świeżej kulturze. Średnie do końcowego stężenia dwóch milimolów. Po inkubacji z beil mycyną.

Dodać C 12 FDG bezpośrednio do komórek i pożywki do końcowego stężenia 33. Mikromolowa inkubacja przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 300 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu przemyć komórki dwukrotnie, za pomocą PBS, za każdym razem obracając w dół, jak poprzednio, i usuwając supernatant po drugim płukaniu. Resus zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach zimnego PBS, a następnie wykonać znakowanie immunologiczne w celu dalszego scharakteryzowania populacji komórek starczych. Jeśli nie masz doświadczenia z cytometrią przepływową, najtrudniejszym aspektem tej procedury będzie wykonanie analizy cytometrii przepływowej.

Aby zapewnić sukces, pamiętaj o zastosowaniu odpowiednich środków kontroli i w razie potrzeby zwróć się o pomoc do niedoświadczonej osoby. Przed uruchomieniem pierwszej próbki należy przygotować dwuparametrową grafikę przedstawiającą przedni kanał rozproszony lub FSC w porównaniu z bocznym kanałem rozproszonym SSC. Następnie uruchom pierwszą próbkę zawierającą nieoznaczone komórki.

Ustaw lampy fotopowielacza lub PMT i zdefiniuj obszar zainteresowania, z wyłączeniem martwych komórek i resztek komórkowych, które mogły pojawić się podczas bramki przygotowania próbki. Ten obszar zainteresowania jest jednym parametrem histogram przedstawiający fluorescencję C 12 FDG jako FL jeden na skali logarytmicznej osi x i liczbę zdarzeń na osi Y. Łączna liczba zdarzeń reprezentuje liczbę analizowanych komórek.

Ustaw PMT tak, aby nieoznaczone komórki pojawiały się w pierwszej dekadzie na skali logarytmicznej osi x. W razie potrzeby określ autofluorescencję komórek, uruchamiając nieznakowane komórki w przepływie. Cytometr uruchamia drugą próbkę zawierającą nieleczone komórki na histogramie jednego parametru, wyświetlając FL w jednym miejscu, kursor po słabo oznaczonej populacji.

Próg ten pozwoli na rozróżnienie między komórkami niestarczymi, które są słabo oznakowane, a komórkami starczymi, które są jasno oznakowane. Uruchomić trzecią próbkę zawierającą komórki poddane działaniu środka. Jaskrawo oznaczone komórki starcze pojawiają się powyżej progu określonego w poprzednim kroku.

Oceń procent komórek starczych, dzieląc liczbę jasnych zdarzeń przez całkowitą liczbę zdarzeń, jeśli to konieczne. Aktywność tazy beta galakto można również oszacować za pomocą średniej intensywności fluorescencji w celu oceny starzenia się wywołanego procedurą chemioterapeutyczną. Dostępna na rynku linia komórkowa szpiczaka mnogiego R RRP I 8 2 2 6 była leczona przez dwa dni doksorubicyną, lekiem chemioterapeutycznym i testem starzenia się, jak opisano w tym filmie, histogramy te pokazują fluorescencję nieleczonych komórek po lewej stronie i leczonych komórek po prawej.

Populacja jaskrawo oznaczonych komórek reprezentujących komórki starcze pojawia się w regionie V.In równolegle, ta sama próbka komórek została wybarwiona za pomocą testu beta galakto sase. Na tym reprezentatywnym obrazie pokazano całkowicie niebieskie komórki i częściowo niebieskie komórki, aby zilustrować trudność w rozróżnieniu prawdziwie niebieskich komórek starczych. Aby zilustrować specyficzność C 12 FDG w oznaczaniu procentu komórek starczych, komórki potraktowano również różnymi stężeniami doksorubicyny.

Procent komórek starczych określono poprzez podzielenie liczby jasnych zdarzeń. Na całkowitą liczbę zdarzeń odsetek komórek starczych wynosił 0,8%15,78% i 26,31% dla dawki odpowiednio 5, 25 i 50 nanomolowej doksorubicyny. Pokazuje to, że znakowanie C 12 FTG jest specyficzne dla komórek starczych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo komórki starcze, które mogą być seryjnie lub nie za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie z tą procedurą metod takich jak znakowanie immunologiczne, które należy wykonać w celu scharakteryzowania komórek starczych. Nie zapominaj, że praca z DMSO lub komórkami rakowymi może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności.