Name: Badanie komórek końcowych tchawicy larw Drosophila za pomocą mikroskopii świetlnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę szybkiej analizy komórek końcowych tchawicy larw Drosophila melanogaster za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencji GFP. Technika umożliwia badanie morfologii gałęzi i światła komórkowego w całych zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Gillian Stanfield za komentarze do manuskryptu. T.A.J. jest wspierany przez University of Utah Genetics Training Grant T32-GM007464 od NIH NIGMS.

1. Generowanie mozaiki
<ol>
	<li>Krzyżówka genetyczna 
	w FRT19A wanna: GAL80 FLP122/Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (samce) X * FRT19A/Bal (samice), gdzie * oznacza mutanta, który ma być badany. Uwaga: Ustaw krzyżówkę co najmniej jeden dzień przed eksperymentem, ponieważ pozwala to zwierzętom na odpowiednie kojarzenie się.</li>
	<li>Wstępne układanie: Przenieść krzyżówkę do fiolek z pokarmem dla much, rozmazając niewielką ilość świeżej pasty drożdżowej umieszczoną na podłożu. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Nieśność: Przenieść zwierzęta z fiolki przed złożeniem do świeżej fiolki z niewielką ilością świeżej pasty drożdżowej. Pozostawić na 6 godzin w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Przenieść dorosłe osobniki z powrotem do wstępnie zniesionej fiolki w celu przechowywania i wykorzystania w kolejnych eksperymentach. Natychmiast wstrząsnąć cieplnie fiolkę zawierającą zarodki w wieku 0-6 godzin przez 45 minut w temperaturze 38 °C, w łaźni wodnej z krążącą wodą. Uwaga: Powierzchnia pokarmu powinna znajdować się poniżej poziomu wody, aby sprawdzić, czy wszystkie zarodki są odpowiednio zszokowane termicznie.</li>
	<li>Inkubować fiolki ze szpicem cieplnym w temperaturze 25 °C przez 4-5 dni, aż larwy trzeciego stadium zaczną wędrować.</li>
</ol>
2. Ekran dla mozaikowych zwierząt
<ol>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium z boków fiolki i umieść je w schłodzonym 100% glicerolu na małej plastikowej płytce.</li>
	<li>Zbadaj larwy za pomocą mikroskopu preparacyjnego o dużym powiększeniu, wyposażonego w optykę fluorescencyjną. Zidentyfikuj larwy z mozaikową ekspresją fluorescencyjnie znakowanych komórek tchawicy. Zazwyczaj można to zrobić przy powiększeniu 10-20X.</li>
</ol>
3. Utrwalanie ciepła
<ol>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie wyjmij mozaikę zwierząt z naczynia i umieść ją w kropli świeżego 100% glicerolu na szkiełku mikroskopowym z białego szkła o wymiarach 75x25x1 mm. Uwaga: w kropli można umieścić wiele zwierząt (Rysunek 1A). 
	Zwierzęta można również umieścić w kropli glicerolu bezpośrednio na szkiełku nakrywkowym, ale należy zachować ostrożność podczas utrwalania (krok 3.2), ponieważ zwierzęta bardzo szybko się nagrzewają i mogą stać się nadmiernie unieruchomione.</li>
	<li>Umieść szkiełko podstawowe na bloku grzewczym o temperaturze 70 °C, aż zwierzęta przestaną się poruszać, nie dłużej niż 20 sekund w przypadku szkiełka podstawowego i 10 sekund w przypadku szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1B). Zwierzęta początkowo się wiercą, ale po śmierci zatrzymują się i stają się sztywne i wydłużone. Uwaga: zbyt długa ekspozycja na ciepło uszkodzi gałęzie końcowe i lumeny, a także sprawi, że sygnał GFP będzie przyciemniony i rozproszony. W celu uzyskania optymalnej wydajności zaleca się, aby blok grzewczy znajdował się w tym samym pomieszczeniu co mikroskopy.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie ustaw wszystkie larwy w kropli w jednym kierunku, tak aby wszystkie larwy na szkiełku były ustawione równolegle do siebie (ryc. 1C).</li>
	<li>Delikatnie umieść mikroszkiełko nakrywkowe o wymiarach 18x18 mm na larwach (lub odwróć szkiełko nakrywkowe na szklane szkiełko) i unikaj tworzenia się pęcherzyków (Rysunek 1D). Uwaga: szkiełko nakrywkowe może nie leżeć dokładnie płasko nad larwami, nie stanowi to problemu.</li>
	<li>Obraz larw w ciągu 30 minut. Utrwalone ciepło komórki końcowe ulegną degradacji, a sygnał GFP stanie się bardzo rozproszony.</li>
</ol>
4. Obrazowanie in vivo komórek końcowych tchawicy
<ol>
	<li>Umieść szkiełko na stoliku złożonego mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą obiektywu 5X zlokalizuj dwa równoległe pnie grzbietowe biegnące od przodu do tyłu na powierzchni grzbietowej zwierzęcia (ryc. 1F). Zlokalizuj dwie komórki końca grzbietowego, bezpośrednio między dwoma pniami grzbietowymi. Pomaga to zidentyfikować odpowiedni segment do analizy.</li>
	<li>Po orientacji obróć zwierzęta, aby zobrazować żądane komórki końcowe. W tym celu należy ostrożnie docisnąć szkiełko nakrywkowe do krawędzi kleszczami prostopadłymi do długiej osi larw, powoli tocząc larwy pod szkiełkiem nakrywkowym (ryc. 1E i 1G).</li>
	<li>Wybór odpowiednich komórek końcowych ma kluczowe znaczenie dla spójnych wyników i porównań między mutantami. Komórki końcowe gałęzi ciała tłuszczowego (FB) można łatwo znaleźć w sąsiedztwie pnia grzbietowego, bocznie do linii środkowej. Boczne komórki końcowe grupy G (LG) są łatwe do znalezienia i znajdują się tuż po stronie brzusznej linii środkowej (ryc. 1H). Uwaga: w najbardziej przednich (Tr1) i tylnych (Tr10) segmentach układ komórki końcowej jest rozbieżny z innymi segmentami. Analizujemy tylko komórki końcowe w segmentach Tr2-Tr9. Komórki końcowe grzbietowe mają bardziej stereotypowy wzór rozgałęzień niż inne komórki końcowe tchawicy. Może to zależeć od dodatkowych, nieautonomicznych sygnałów komórkowych i należy to wziąć pod uwagę przy podejmowaniu decyzji o uwzględnieniu ich w analizie.</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu interesującej nas komórki końcowej uchwyć obraz przy użyciu żądanego powiększenia; zazwyczaj najlepiej jest 10X lub 20X (Rysunek 2A). Uwaga: ze względu na zmienne wzorce rozgałęzień staraj się robić zdjęcia zawierające jak najwięcej gałęzi i końcówek gałęzi.</li>
	<li>Nie przesuwając stolika, wyłącz fluorescencję i włącz światło przechodzące, aby uchwycić obraz w jasnym polu tej samej komórki i płaszczyzny ogniskowej (rysunek 2B). Światło zostanie zwizualizowane jako ciemno kontrastujące w przestrzeni komórki końcowej. Jeśli planujesz ilościowe określenie gałęzi komórek końcowych i lumenów, zbierz wiele obrazów w wielu płaszczyznach ogniskowych każdej komórki końcowej.</li>
</ol>
5. Analiza i kwantyfikacja morfologii komórek końcowych za pomocą ImageJ
<ol>
	<li>Otwórz obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu za pomocą wtyczki ImageJ (<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>) (<a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</a>).</li>
	<li>Za pomocą narzędzia "Dodaj śledzenia" ręcznie prześledź gałęzie i światło całej komórki terminala.</li>
	<li>Korzystając z narzędzia "Obrysowywanie etykiet", zmień nazwę i ponowne kolorowanie, aby przypisać każdej linii w śladzie określone oznaczenie.</li>
	<li>Za pomocą narzędzia "Ustaw parametry" dostosuj szerokość linii w zakresie 6-10 pikseli (dla obrazów 512x512 uzyskanych z kamery cyfrowej podłączonej do mikroskopu złożonego. W przypadku kamer o wyższej lub niższej rozdzielczości szerokość pikseli powinna być odpowiednio przeskalowana), używając wszystkich innych ustawień domyślnych, a następnie wybierz "OK". Następnie użyj narzędzia "Utwórz migawkę", aby zrobić zdjęcie. Wybierz "Narysuj ślad", aby uzyskać migawkę śladu, którą można wyświetlić obok oryginału.</li>
	<li>Wybierz narzędzie "Zmierz trasy" i wybierz typ śledzenia (tj. które gałęzie mają być mierzone na podstawie konkretnych oznaczeń przypisanych w kroku 5.3). Następnie wybierz "Wyświetl pomiary śledzenia" i "Wyczyść poprzednie pomiary", a następnie kliknij "URUCHOM". Spowoduje to utworzenie arkusza kalkulacyjnego zawierającego nazwę, etykietę, długość (w pikselach) i inne dane obrazu. Dane te można następnie zapisać jako arkusz kalkulacyjny Microsoft Excel w celu dalszej analizy statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li>
<li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li>
<li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Zpr1+%28Zinc+Finger+Protein+1%29+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649(2012).</li>
<li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087(2011).</li>
<li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li>
<li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li>
<li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li>
<li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+GFP%2F%C3%9F-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li>
<li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila%3A+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Opisana tutaj technika utrwalania ciepła jest szybkim i wygodnym narzędziem do obrazowania końcowych komórek tchawicy larw Drosophila . Tutaj używamy tej techniki do zbadania rozgałęzienia i wzoru światła komórek typu dzikiego. Komórki tchawicy wykazujące ekspresję GFP, napędzane przez promotor specyficzny dla tchawicy bez oddychania, można łatwo uwidocznić przez naskórek larwy po utrwaleniu termicznym. Za pomocą tej metody można szybko zobrazować i zmierzyć specyficzne wzory rozgałęzień poszczególnych ...

Kształt komórki ma kluczowe znaczenie dla funkcjonowania poszczególnych komórek w organizmie, a także komórek, które funkcjonują jako część tkanki lub organu. Używamy komórek końcowych tchawicy Drosophila, składnika układu oddechowego owadów, do badania mechanizmów molekularnych, które uczestniczą w kontrolowaniu dwóch konserwatywnych typów morfologii komórkowej: rozgałęzień i tworzenia rurki (lumenogeneza). Komórki końcowe znajdują się na końcach sieci rozgałęzionych rurek, które służą do dostarczania tlenu do tkanek wewnętrznych1 i mają skomplikowaną rozgałęzioną morfologię, która zależy od szlaku sygnałowego FGF, który jest kontrolowany przez lokalne poziomy tlenu w tkankach docelowych2. Końcowe gałęzie komórkowe to cienkie rurki, z wypełnionym gazem subkomórkowym światłem biegnącym przez każdą gałąź. Odrębna architektura komórkowa komórek końcowych, wraz z łatwością, z jaką można przeprowadzić analizę genetyczną u Drosophila, sprawiają, że komórki te są doskonałym modelem do badania mechanizmów wzrostu komórek, rozgałęzień i tworzenia rurki wewnątrzkomórkowej. Komórki końcowe okazały się użytecznym modelem do zrozumienia niektórych szlaków sygnałowych prowadzących do różnicowania komórek rozgałęzionych, wzrostu i dojrzewania2-4. Korzystając z tego systemu, przeprowadzono bezstronne, zaawansowane genetyczne badania przesiewowe pod kątem mutantów morfogenezy komórek, dostarczając informacji na temat mechanizmów kontrolujących kształt komórki5,6. Na przykład badania przesiewowe ujawniły, że specyficzny RabGAP jest wymagany do polaryzacji cytoszkieletu i transportu pęcherzyków w tworzeniu światła i pozycjonowaniu7; że adhezja za pośrednictwem integryny jest wymagana dla stabilności gałęzi8; oraz że nabłonkowe białka o polarności PAR regulują spolaryzowany transport błonowy wymagany zarówno do rozgałęziania, jak i tworzenia światła9. Inne badania na komórkach terminalnych wykazały, że asymetryczna akumulacja aktyny i organizacja mikrotubul są wymagane do wydłużenia komórek i lumenogenezy10. W ten sposób różnorodne, konserwatywne mechanizmy biologiczne komórki przyczyniają się do końcowej morfogenezy komórki.
Tutaj opisujemy metodę szybkiego naprawiania nienaruszonych larw Drosophila w trzecim stadium do analizy rozgałęzień komórek końcowych i tworzenia światła. Protokół ten można również przeprowadzić zarówno na zwierzętach w pierwszym, jak i drugim stadium rozwojowym. Kluczem do tej techniki jest możliwość wizualizacji komórek końcowych, które są genetycznie znakowane przez fluorescencyjną ekspresję białka bezpośrednio przez naskórek larwalny nienaruszonych zwierząt. Ponieważ procedura ta nie wymaga żadnych manipulacji po utrwaleniu, takich jak barwienie przeciwciał, w celu obserwacji komórek, doskonale nadaje się do analizy wysokoprzepustowej, w tym badań genetycznych lub przesiewowych leków. Ekspresja białek fluorescencyjnych ujawnia strukturę gałęzi wypełnionych cytoplazmatycznymi. Tworzenie się rurki można monitorować równolegle za pomocą mikroskopii jasnego pola w celu zidentyfikowania światła wypełnionego gazem, które kontrastuje z otaczającymi tkankami wypełnionymi płynem.
Zawarte w tym protokole jest metoda generowania genetycznych mozaik opartych na systemie MARCM11, do produkcji homozygotycznych zmutowanych komórek końcowych znakowanych białkami fluorescencyjnymi u zwierząt nieoznakowanych. Jest to konieczne, ponieważ komórki końcowe rozwijają swoje złożone struktury dopiero stosunkowo późno w rozwoju; Mozaiki genetyczne pozwalają na ominięcie wymagań genowych w innych tkankach na wcześniejszym etapie rozwoju. Aby wygenerować klony MARCM, tchawica jest znakowana za pomocą specyficznego dla tchawicy sterownika do oddychania (btl)12. Opisany tutaj jest protokół dla chromosomu Drosophila X; W przypadku innych chromosomów można zastosować podobną procedurę, z odczynnikami genetycznymi odpowiednimi dla badanego chromosomu. W tym przypadku tchawica jest znakowana przez ekspresję cytoplazmatycznie zlokalizowanego GFP, ale procedura działa równie dobrze z ekspresją innych białek fluorescencyjnych, takich jak DsRed.
Dodatkowo, dołączyliśmy metodę ilościowego określania wzorów rozgałęzień i powstawania światła w komórkach końcowych, opartą na metodach opracowanych do charakteryzowania wzorców rozgałęzień neuronalnych13. Tego rodzaju dane ilościowe mogą mieć kluczowe znaczenie w rozpoznaniu dokładnej roli genów w procesie rozgałęziania lub lumenogenezy, a także umożliwiają bezpośrednie porównania między różnymi mutantami9.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze studenckie Dumont #5</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 Mikroskop preparacyjny (lub odpowiednik)</td><td>Mikroskop złożony Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>AxioImager M1 (lub odpowiednik)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Wyposażony w AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Zestaw filtrów 38HE</td></tr><tr><td>100% Glycerol</td><td>BioExpress</td><td>M152-4L</td><td></td></tr><tr><td>Genotyp muchy</td><td></td><td></td><td>: w FRT19A tuba:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td></tr><tr><td>Fly stock</td><td></td><td></td><td>Genotyp: y w FRT19A</td></tr></tbody></table>

badanie komórek końcowych tchawicy larw drosophila za pomocą mikroskopii świetlnej

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Kształt komórki ma kluczowe znaczenie dla jej funkcjonowania. Jednak pomimo znaczenia morfologii komórek, niewiele wiadomo o tym, w jaki sposób poszczególne komórki generują określone kształty. Końcowe komórki tchawicy Drosophila stały się potężnym modelem genetycznym do identyfikacji i wyjaśnienia ról genów wymaganych do generowania morfologii komórkowych. Komórki końcowe są składnikiem rozgałęzionej sieci rurkowej, systemu tchawicy, który służy do dostarczania tlenu do tkanek wewnętrznych. Komórki końcowe są doskonałym modelem do badania kwestii kształtu komórki, ponieważ posiadają dwie odrębne architektury komórkowe. Po pierwsze, komórki końcowe mają skomplikowaną rozgałęzioną morfologię, podobną do złożonych neuronów; Po drugie, końcowe gałęzie komórek są uformowane jako cienkie rurki i zawierają wewnątrzkomórkowe światło związane z błoną. Analiza ilościowa liczby gałęzi komórki końcowej, organizacji gałęzi i indywidualnego kształtu gałęzi może być wykorzystana do dostarczenia informacji na temat roli określonych mechanizmów genetycznych w tworzeniu komórki rozgałęzionej. Analiza tworzenia się rurki w tych komórkach może ujawnić konserwatywne mechanizmy tubulogenezy wspólne dla innych sieci kanalikowych, takich jak układ naczyniowy kręgowców. Tutaj opisujemy techniki, które można wykorzystać do szybkiego naprawiania, obrazowania i analizowania zarówno wzorów rozgałęzień, jak i tworzenia się rurki w końcowych komórkach larw Drosophila. Techniki te mogą być wykorzystywane do analizy komórek końcowych u zwierząt typu dzikiego i zmutowanego lub mozaik genetycznych. Ze względu na wysoką skuteczność tego protokołu, dobrze nadaje się on również do badań przesiewowych genetycznych, opartych na RNAi lub leków w układzie tchawicy Drosophila.

Wyniki przedstawiono na Rysunku 2. Pojedyncza komórka końcowa grupy bocznej (LG) wykazuje rozbudowane rozgałęzienia subkomórkowe (uwidocznione za pomocą GFP; A) oraz wypełnione gazem światło subkomórkowe przebiegające przez każdą z gałęzi (uwidocznione za pomocą mikroskopii w polu jasnym; B). Obrazy te pozyskano z mozaikowej larwy w stadium L3, wytworzonej przy użyciu systemu MARCM opisanego w sekcjach 1 i 2, a następnie utrwalonej termicznie i zobrazowanej zgodnie z opisem w sekcjach 3 i 4. Panele C i D...

Tutaj prezentujemy metodę analizy pod mikroskopem świetlnym komórek końcowych tchawicy u larw Drosophila. Metoda ta pozwala na szybkie zbadanie morfologii gałęzi i światła u całych zwierząt i byłaby przydatna do analizy pojedynczych mutantów lub badań przesiewowych w kierunku mutacji wpływających na rozwój komórek terminalnych.

Badanie komórek końcowych tchawicy larw Drosophila za pomocą mikroskopii świetlnej

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybka fiksacja nienaruszonych larw Drosophila w celu obrazowania morfologii rozgałęzień i rurek w końcowych komórkach tchawki. Osiąga się to najpierw poprzez wygenerowanie homozygotycznych komórek końcowych znakowanych białkiem fluorescencyjnym w zwierzętach mozaikowych genetycznie. Drugim krokiem procedury jest zebranie mozaikowych larw i ich fiksacja za pomocą ciepła.Trzecim krokiem jest obrazowanie znakowanych komórek terminalnych w utrwalonych zwierzętach z wykorzystaniem ekspresji GFP w celu obserwacji wypustek oraz mikroskopii w świetle przechodzącym w celu obserwacji cewek. Ostatnim krokiem jest ilościowa ocena morfologii komórek terminalnych. Ostatecznie uzyskane wyniki mogą posłużyć do rozróżnienia i skategoryzowania odmiennych morfologii komórkowych komórek terminalnych typu dzikiego oraz mutantów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fiksacja chemiczna, jest jej niezwykła szybkość, co pozwala na wykorzystanie jej do wysokoprzepustowej analizy terminalnych komórek tchawki. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ wybieranie larw w trzecim stadium (L3) i ich szybka fiksacja w celu zachowania morfologii wymagają dużego skupienia i staranności. Do przygotowania much mozaikowych.Zastosuj technikę Mark M u samic posiadających badaną mutację. Przygotuj krzyżówki w fiolkach przedskładniowych z warstwą świeżej pasty drożdżowej i pozwól muchom składać jaja przez jedną godzinę w temperaturze 25 °C. Następnie przenieś muchy z fiolki przedskładniowej do nowej fiolki ze świeżą pastą drożdżową i pozwól im składać jaja przez sześć godzin w temperaturze 25 °C.Po sześciu godzinach niezwłocznie przenieś dorosłe osobniki z powrotem do probówek przedskładania w celu przechowywania i wykorzystania w kolejnych eksperymentach. Poddaj probówki ze złożonymi jajami szokowi termicznemu w łaźni wodnej z cyrkulacją przez 45 minut w temperaturze 38 °C; powierzchnia pożywki powinna znajdować się poniżej poziomu wody, aby zapewnić odpowiedni szok termiczny wszystkich embrionów. Następnie inkubuj probówki po szoku termicznym w temperaturze 25 °C przez cztery do pięciu dni, aż do stadium trzeciego instaru larw.Rozpocznij proces przenoszenia, używając precyzyjnej pęsety. Delikatnie zbierz wędrujące larwy trzeciego stadium ze ścianek fiolki i umieść je w schłodzonym 100% glicerolu w małej plastikowej płytce. Obejrzyj larwy pod stereotypem o dużym powiększeniu, wyposażonym w optykę fluorescencyjną, przy powiększeniu 10 x lub 20 x.Zidentyfikuj larwy z mozaikową ekspresją fluorescencyjnie znakowanych komórek tchawkowych. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, ostrożnie wybierz te osobniki i umieść je w kropli świeżego 100% glicerolu na białym szkiełku mikroskopowym. Kilka osobników można umieścić w jednej kropli w tym samym pomieszczeniu, w którym znajduje się mikroskop.Umieść szkiełko przedmiotowe na bloku grzewczym o temperaturze 70 °C, aż zwierzęta przestaną się poruszać, co następuje w ciągu 20 sekund. Początkowo zwierzęta wiercą się, lecz następnie sztywnieją i wydłużają. Po śmierci zbyt długa ekspozycja prowadzi do uszkodzenia cieplnego gałęzi końcowych oraz uszkodzenia światła naczyń.Sygnał GFP staje się słaby i rozproszony. Czas utrwalania termicznego jest krytyczny, ponieważ zbyt długie utrwalanie może uszkodzić komórki, co prowadzi do błędnej lub utrudnionej analizy. Dlatego próbki należy umieścić w bloku grzewczym i utrwalać tylko do momentu, aż przestaną się poruszać, i nie dłużej.Używając teraz precyzyjnej pęsety, ostrożnie ułóż wszystkie utrwalone larwy równolegle do siebie. Następnie delikatnie nałóż na larwy szkiełko nakrywki, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Szkiełko nakrywkowe może nie przylegać idealnie płasko, ale nie stanowi to problemu.W ciągu następnych 30 minut należy wykonać obrazowanie larw, ponieważ komórki utrwalone termicznie szybko ulegają degradacji, a sygnały GFP stają się bardzo rozproszone. Następnie umieść preparat na stoliku stereomikroskopu złożonego.Używając obiektywu 5x, zlokalizuj dwa równoległe pnie grzbietowe biegnące od strony przedniej do tylnej na powierzchni grzbietowej zwierzęcia. Następnie zlokalizuj dwie grzbietowe komórki końcowe znajdujące się bezpośrednio pomiędzy dwoma pniami grzbietowymi. Pozwala to na zidentyfikowanie odpowiedniego segmentu do analizy.Po zorientowaniu zwierząt należy je obrócić, aby zobrazować pożądane komórki terminalne, ostrożnie przesuwając krawędź szkiełka nakrywki pęsetą. Wykonanie tego ruchu prostopadle do długiej osi zwierzęcia powoduje powolne turlanie larw. Wybór odpowiednich komórek terminalnych jest kluczowy dla uzyskania spójnych wyników i możliwości porównania mutantów.Komórki terminalne gałęzi ciała tłuszczowego są łatwo widoczne w sąsiedztwie grzbietowego pnia, bocznie od linii środkowej. Komórki terminalne grupy bocznej G są łatwo rozpoznawalne i znajdują się bezpośrednio bocznie od brzusznej linii środkowej w najbardziej przednich i tylnych segmentach. Układ komórek terminalnych różni się od układu w pozostałych segmentach.Segmentów tych nie należy badać, lecz skupić się zamiast tego na komórkach i segmentach. Grzbietowe komórki końcowe TR od drugiej do dziewiątej wykazują bardziej stereotypowy wzór rozgałęzień niż inne końcowe komórki tchawikowe. Może to zależeć od dodatkowych sygnałów nieautonomicznych komórkowo, co należy wziąć pod uwagę przy podejmowaniu decyzji o ich włączeniu do analizy.Po zidentyfikowaniu interesującej komórki końcowej należy wykonać zdjęcie przy powiększeniu 10x lub 20x ze względu na zmienność wzorców rozgałęzień. Należy dążyć do uchwycenia na zdjęciach jak największej liczby rozgałęzień i ich końcówek bez przesuwania stolika. Wyłącz fluorescencję i włącz światło przeświecone.Aby uzyskać obraz w jasnym polu tej samej komórki i płaszczyzny ogniskowania, światło (lumen) zostanie silnie skontrastowane w obrębie przestrzeni komórek końcowych. W celu ilościowego określenia rozgałęzień komórek końcowych oraz światła, należy zebrać wiele obrazów w wielu płaszczyznach ogniskowania dla każdej komórki końcowej. W przypadku niektórych komórek pojedynczy obraz wystarczy do zebrania odpowiednich danych, jednak inne mogą wymagać do trzech oddzielnych obrazów w różnych płaszczyznach ogniskowania.Aby uchwycić wszystkie odgałęzienia, otwórz obrazy jasnopoleowe fluorescencyjnego końca w programie ImageJ z zainstalowaną wtyczką NeuronJ. Używając narzędzia Add Tracings, ręcznie obrysuj odgałęzienia i światło całej komórki końcowej, a następnie za pomocą narzędzia Label Tracings zmień nazwę i kolor, aby przypisać każdej linii w obrysie konkretne oznaczenie dla obrazów o rozmiarze 5 12 na 5 12 pikseli. Użyj narzędzia Set Parameters, aby zmienić szerokość linii z 6 na 10 pikseli.Odpowiednio przeskaluj obrazy o wyższej lub niższej rozdzielczości. Pozostaw pozostałe ustawienia domyślne i zatwierdź operację przyciskiem OK. Następnie użyj narzędzia do tworzenia migawek.Aby wykonać obraz, wybierz opcję draw Trace, aby uzyskać migawkę śladu, którą można wyświetlić obok oryginalnego obrazu. Wybierz narzędzie measure tracings i zaznacz dany ślad. Wpisz liczbę rozgałęzień do pomiaru na podstawie określonych oznaczeń.Następnie wybierz opcję wyświetlania pomiarów obrysów (display tracing measurements). Następnie wyczyść poprzednie pomiary i kliknij uruchom (run). W rezultacie zostanie wygenerowana arkusz kalkulacyjny zawierający nazwę, etykietę, długość w pikselach oraz inne dane obrazu, które zostaną zapisane do analizy statystycznej.Zastosowano opisany protokół w celu analizy zmutowanych komórek tchawkowych w larwach Mosaic L trzech, wizualizowanych za pomocą GFP. Pojedyncza komórka terminalna grupy bocznej (oznaczona jako LG) wykazuje rozległe rozgałęzienie wewnątrzkomórkowe w świetle widnym. Przy użyciu programu Neuron J widoczny jest wypełniony gazem światło wewnątrzkomórkowe przebiegające przez każdą z gałęzi. Wykonano obrys gałęzi oraz obrys światła. W tym zwierzęciu niemozaikowym zidentyfikowano komórkę terminalną ciała tłuszczowego (oznaczoną jako FB).Zauważ, że GFP jest ekspresowane w całym układzie tchawkowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak szybko utrwalić obraz i przeprowadzić analizę ilościową komórek końcowych tchawki u nienaruszonych zwierząt po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom do wykorzystania komórek końcowych tchawki jako kluczowego modelu do zrozumienia aspektów morfogenezy komórkowej z wykorzystaniem komórek końcowych tchawki.

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie Drosophila komórki końcowych przewodów oddechowych larw za pomocą mikroskopii świetlnej

Opisujemy proces utrwalania, zatapiania, krojenia i obrazowania późnych stadiów embrionów Drosophila do transmisyjnej mikroskopii elektronowej w celu badania embrionalnej rurki serca. Technika ta umożliwia wizualizację światła rurki serca, a także błony podstawnej wyścielającej światło serca.

Przygotowanie embrionów do mikroskopii elektronowej rurki serca embrionów Drosophila

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Aby zrozumieć, w jaki sposób podczas rozwoju kształtowane są złożone formy komórek, takie jak dendryty neuronalne, kluczowa jest możliwość dokładnego badania organizacji mikrotubul. W niniejszej pracy opisujemy niezawodną metodę znakowania immunohistologicznego służącą do badania organizacji mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych o rozgałęzionym drzewku dendrytycznym, w tchawce, mięśniach oraz innych tkankach ściany ciała larwy Drosophila.

Immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy Drosophila

Ten film opisuje gruczoł limfatyczny Drosophila - główne miejsce hematopoezy u larw muchy - i pokazuje przykładowy protokół do preparowania i montowania narządu do immunohistochemii i obrazowania fluorescencyjnego.

Rozwarstwienie gruczołów limfatycznych larw: izolowanie narządu wytwarzającego hemocyty Drosophila

Ten film opisuje gruczoł pierścieniowy Drosophila, złożoną strukturę endokrynną ważną dla biosyntezy i wydzielania ekdysteroidów i innych hormonów. Przedstawiony protokół demonstruje jego rozwarstwienie, utrwalenie i barwienie immunologiczne.

Rozwarstwienie gruczołu pierścieniowego larw: izolacja rozwojowych narządów endokrynnych od Drosophila

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Opisana jest łatwa i niezawodna technika wizualizacji i ilościowego określania ruchliwości rzęsek w drogach oddechowych oraz przepływu generowanego przez rzęski za pomocą tchawicy myszy.  Technikę tę można zmodyfikować w celu określenia, w jaki sposób szeroki zakres czynników wpływa na ruchliwość rzęsek, w tym czynniki farmakologiczne, czynniki genetyczne, narażenie środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem.

Ex vivo Metoda obrazowania w wysokiej rozdzielczości ruchliwości rzęsek w nabłonku dróg oddechowych gryzoni

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Poznaj metodę szybkiej analizy komórek końcowych tchawicy larw Drosophila melanogaster za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencji GFP. Technika umożliwia badanie morfologii gałęzi i światła komórkowego w całych zwierzętach.

Badanie komórek końcowych tchawicy larw Drosophila za pomocą mikroskopii świetlnej

Przeglądaj więcej filmów