Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu
4 lipca 2013
Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.
W niniejszym protokole rozpoczynamy od karmienia larw o odpowiednim genotypie pokarmem opartym na E, zawierającym all trans A TR. Każda larwa zostaje unieruchomiona za pomocą szpilek i poddana sekcji w roztworze soli fizjologicznej; następnie sól fizjologiczną zastępuje się dwiema milimolarnymi roztworami Ringera z wapniem, a preparat LABA umieszcza się na stoliku mikroskopu. Ruchy wysekcowanego LABA są rejestrowane za pomocą kamery CCD. Poprzez lokalne naświetlanie układu nerwowego możemy zaburzać aktywność neuronów określonego podzbioru w ściśle określonym czasie, monitorując jednocześnie ruchy tego samego, nienaruszonego preparatu.
Cześć, jestem Tega z laboratorium dr. A. Cześć, jestem Hi Kosaka, również z laboratorium dr. A, poziom Oph.
Lokomocja stanowi użyteczny system modelowy do badania obwodów ruchowych. Dzięki wysoce rozwiniętym technikom genetycznym opisanym w niniejszym protokole, zastosujemy manipulację optogenetyczną neuronami ruchowymi przy jednoczesnym monitorowaniu poziomu ruchu. Wykorzystując lasery w mikroskopie konfokalnym, można stymulować podzbiór neuronów i analizować reakcje ruchowe na przestrzennie i czasowo ukierunkowane zaburzenia aktywności tych neuronów.
Zacznijmy zatem. Utrzymuj linie muszek K64US CHR2 lub K64US NPHR w plastikowych probówkach z biosferą zawierającymi standardową żywą pożywkę. Dodaj roztwór TL do podłoża drożdżowego w odpowiednich stężeniach i dokładnie wymieszaj. Rozprowadź podłoże drożdżowe na agarze z soku jabłkowego.
Pobrać drugą lub trzecią kolonię SLA z fiolek. Nanieść kolonię na płytkę z pożywką drożdżową zawierającą TR. Przykryć płytkę folią aluminiową, aby utrzymać TR w ciemności. Inkubować kolonię w temperaturze 25 °C przez odpowiedni czas.
Jest to kamera CCD służąca do wizualizacji nieuszkodzonego preparatu laboratoryjnego. Należy przymocować kamerę CCD do konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego za pomocą adaptera SEMA. Należy pobrać próbki z lobby A TRA i wypłukać je wodą.
Aby usunąć resztki pokarmu z organizmu, umieść larwę na chłodnej płytce z osłoną C stroną grzbietową do dołu. Przymocuj ją szpilkami entomologicznymi w okolicy głowy i ogona. Dodaj normalną sól fizjologiczną wolną od wapnia.
Za pomocą mikronożyczek wykonaj niewielkie nacięcie w pobliżu ogona. Następnie wykonaj cięcie podłużne wzdłuż linii środkowej grzbietu. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić brzusznego rdzenia nerwowego oraz nerwów obwodowych.
Wykonaj niewielkie nacięcie boczne głowicy w każdym narożniku rozciętej ściany ciała. Usuń organy wewnętrzne z wyjątkiem mózgu i brzusznego sznura nerwowego. Zastąp sól fizjologiczną roztworem Ringera z wapniem dla modelu 2 milion.
Zamocuj suchy obiektyw o pełnej aperturze w mikroskopie konfokalnym i umieść preparat laboratoryjny na stoliku mikroskopu. Wykonaj obraz transmisyjny zdyssekowanego preparatu przy użyciu czerwonego lasera, aby zlokalizować brzuszny sznur nerwowy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wyznacz obszar zainteresowania na obrazie transmisyjnym; użycie powiększenia jest pomocne w określeniu konkretnego obszaru zainteresowania.
Zmień zestaw filtrów mikroskopu, aby uzyskać oświetlenie światłem o długości 488 nanometrów lub 559 nanometrów. Zwizualizuj ścianę ciała, oświetlając preparat lampą halogenową. Monitoruj preparat za pomocą kamery CCD podłączonej do mikroskopu konfokalnego.
Przywołaj ruch ściany ciała i przełącz wiązkę lasera tylko w celu tymczasowej manipulacji aktywnością neuronalną, podczas gdy ruch perystaltyczny w tej samej nienaruszonej preparacji jest obserwowany i rejestrowany przez kamerę CCD. W tym laboratorium neurony motorowe wykazują ekspresję CHL two. Oświetlenie jednego lub dwóch segmentów brzusznego sznura nerwowego aktywuje neurony motorowe w tych segmentach, co z kolei indukuje skurcz mięśni w odpowiadających im segmentach ściany ciała, stymulując inne segmenty w brzusznej części nerwu.
Zimno indukuje skurcz innych segmentów ciała. NPHL ulegała ekspresji w neuronach ruchowych, gdy kilka segmentów brzusznego sznura nerwowego było stymulowanych żółtym laserem. Propagująca fala została zatrzymana na odpowiadającym jej segmencie ściany ciała.
Fala następnie powróciła do ruchu z zatrzymanego segmentu po wyłączeniu wiązki lasera. Niniejszy protokół wyjaśnia procedurę przeprowadzania optogenetycznej perturbacji aktywności neuronalnej za pomocą laserów w tym samym nieaktywnym kolistym poziomie w ruchu. Sznur nerwowy brzuszny oraz nerwy obwodowe nie mogą zostać uszkodzone podczas tej dyssekcji, aby zapewnić skuteczną stymulację.
Moc oświetlenia należy dostosować poprzez zmianę mocy lasera, prędkości skanowania lub liczby powtórzeń w mikroskopie konfokalnym. To cały protokół. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronów u częściowo intaktnych larw Drosophila. Dzięki zastosowaniu laserów w mikroskopie konfokalnym badacze mogą monitorować skurcze mięśni i wyjaśniać dynamikę obwodów ruchowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Optogenetyka
- Obwody motoryczne
Wstęp
- Optogenetyka umożliwia precyzyjną kontrolę aktywności neuronalnej.
- Larwy Drosophila służą jako model do badania obwodów ruchowych.
- Zrozumienie efektów ruchowych jest kluczowe dla poznania dynamiki neuronalnej.
- Technika ta wykorzystuje mikroskopię konfokalną do monitorowania w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- W celu optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronów.
- W celu obserwacji zmian w skurczu mięśni w odpowiedzi na zaburzenia neuronalne.
- W celu analizy dynamiki obwodów ruchowych w preparacie półintaktnym.
Zastosowane metody
- Przygotowanie larw Drosophila z określonymi modyfikacjami genetycznymi.
- Disekcja i montaż larw na stoliku mikroskopowym.
- Wykorzystanie laserów do stymulacji konkretnych neuronów przy jednoczesnym monitorowaniu skurczów mięśni.
- Rejestracja odpowiedzi motorycznych przy użyciu kamery CCD.
Główne wyniki
- Lokalne oświetlenie brzusznego sznura nerwowego wywołało skurcze mięśni.
- Zaburzenie aktywności neuronalnej doprowadziło do obserwowalnych zmian w lokomocji.
- Reakcje różniły się w zależności od czasu i miejsca stymulacji.
- Protokół pozwolił na skuteczne wyjaśnienie dynamiki obwodów motorycznych.
Wnioski
- Niniejszy protokół stanowi podstawę do badania obwodów ruchowych u Drosophila.
- Manipulacja optogenetyczna jest skuteczną metodą analizy dynamiki neuronalnej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu eksploracji bardziej złożonych interakcji neuronalnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna perturbacja optogenetyczna w półzachowanych larwach Drosophila umożliwia wysokorozdzielcze mapowanie funkcji obwodów neuronalnych podczas aktywnego zachowania. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez izolację przyczynowego wpływu konkretnych zespołów neuronalnych na wyjście motoryczne. Metoda ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka na wczesnym etapie odkryć, dostarczając informacji dla decyzji portfelowych w rozwoju związków neuroaktywnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia przestrzennie i czasowo rozdzielone badanie funkcji obwodów neuronalnych w systemie podatnym na modyfikacje genetyczne.
- Wspiera funkcjonalną walidację potencjalnych neuronalnych celów poprzez powiązanie aktywności z mierzalnymi efektami motorycznymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolowanie wpływu konkretnych podzbiorów neuronów na zachowanie.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie doboru i priorytetyzacji dalszych celów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowaną, powtarzalną platformę do ilościowego określania reakcji motorycznych na perturbacje neuronalne.
- Umożliwia standaryzację parametrów stymulacji optogenetycznej w celu opracowania testów.
- Zapewnia ilościowe odczyty w oparciu o wideo, odpowiednie do analizy porównawczej pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Wspiera wiarygodną ocenę związków neuroaktywnych w kontrolowanym, półintaktym systemie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje manipulację obwodami neuronalnymi z fenotypami ruchowymi istotnymi dla choroby, jeśli jest to możliwe.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od odkrycia genetycznego do funkcjonalnej walidacji przedklinicznej w organizmie modelowym.
- Wspiera dostosowane do ryzyka opracowywanie celów neurobiologicznych w oparciu o dane dotyczące efektów funkcjonalnych.
- dostarcza wglądu w mechanizmy, które pomagają w opracowywaniu strategii biomarkerów translacyjnych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejszy protokół optogenetyczny wpisuje się w proces badawczy, od wczesnego etapu weryfikacji hipotez, poprzez identyfikację wiodących cząsteczek, aż po walidację przedkliniczną celów neuroaktywnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji neuronalnych oraz mapowanie szlaków w żywym, poruszającym się systemie.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych danych dotyczących wyników motorycznych w celu standaryzacji analiz i przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie reakcji motorycznych w warunkach określonych zaburzeń neuronalnych.
- Badania translacyjne: Łączy manipulacje genetyczne z funkcjonalnym fenotypowaniem istotnym dla modeli przedklinicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Zapewnia platformę wielokrotnego użytku do iteracyjnej walidacji celów i badań mechanistycznych w ramach programów neurobiologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje perturbacje optogenetyczne i ilościowe odczyty behawioralne dla skalowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka we wczesnych etapach badania celów neurobiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów odkrywania substancji neuroaktywnych.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu optogenetyki, genetyki Drosophila oraz mikroskopii konfokalnej.
- Wymaga dostępu do mikroskopii konfokalnej z oświetleniem laserowym i funkcją rejestracji wideo o wysokiej rozdzielczości.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów sekcji, oświetlenia i rejestracji pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych populacji neuronów lub paradygmatów behawioralnych.
- Zależy od precyzyjnej kontroli parametrów oświetlenia oraz ostrożnego obchodzenia się z tkankami w celu uniknięcia efektów zakłócających.
