Name: Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj optogenetyczną manipulację aktywnością neuronów motorycznych u częściowo nienaruszonych larw Drosophila przy użyciu oświetlenia laserowego w mikroskopie konfokalnym. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki obwodów motorycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grant-in-Aid na badania naukowe w innowacyjnych obszarach "Mesoscopic Neurocircuitry" (nr 22115002) i "Comprehensive Brain Science Network" (nr 221S0003) Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii, Japonia dla A.N. oraz Grant-in-Aid dla Młodych Naukowców (B) (nr 21700344) Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) dla H.K.

1. Przygotowanie larw 
<ol>
 <li>Utrzymuj linki muchowe OK6-Gal4, UAS-ChR2 lub OK6-Gal4, UAS-NpHR2 w plastikowych fiolkach zawierających standardowy pokarm dla much. </li>
 <li>Rozprowadź pastę drożdżową zawierającą all-trans retinal (ATR) w odpowiednich stężeniach (1 mM dla ChR2, 10 mM dla NpHR2 ("w skrócie NpHR") na płycie z sokiem jabłkowym. </li>
 <li>Pobrać z fiolek 2. lub 3. larwy w trzecim stadium rozwojowym i umieścić je na płytce zawierającej ATR. </li>
 <li>Hodować je w temperaturze 25 °C w ciemności przez odpowiedni okres czasu (1 dzień dla ChR2, 2 dni dla NpHR). </li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu
<ol>
 <li>Podłącz kamerę CCD (XCD-V60, Sony) do konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego (w naszym przypadku FV1000, Olympus) z mocowaniem C-mount (powiększenie 0,35x). </li>
 <li>Jeśli na drodze światła od soczewki obiektywu do kamery CCD znajduje się migawka, która zamyka się podczas skanowania laserowego, należy ją ostrożnie zdjąć. Ponieważ ten krok zależy od konfiguracji mikroskopu, w razie potrzeby skontaktuj się z producentem mikroskopu w celu uzyskania pomocy technicznej. </li>
</ol>
3. Sekcja
<ol>
 <li>Opłucz larwy karmione ATR wodą, aby usunąć resztki pokarmu z organizmu.</li>
 <li>Umieść larwę na naczyniu pokrytym sylgardem, grzbietem do góry (strona grzbietowa ma dwie rurki tchawicy biegnące wzdłużnie, po jednej z każdej strony grzbietowej linii środkowej). Grubość sylgarda wynosi około 5 mm. </li>
 <li>Włóż szpilkę do owadów (szpilki do owadów Austerlitz, Φ0,10 mm, stal nierdzewna) w ogon między rurkami dotchawiczymi za pomocą kleszczyków (#5 Inox, FST firmy Dumont, Szwajcaria). Kołki o długości około 10 mm powinny być wygięte lub przycięte tak, aby były wystarczająco krótkie (~2 mm długości), aby uniknąć uderzenia i uszkodzenia powierzchni soczewki obiektywu. Następnie umieść drugą szpilkę owada w głowie larwy w pobliżu haczyka gębowego, czarnej struktury przypominającej pazur na przednim końcu. </li>
 <li>Dodaj sól fizjologiczną wolną od Ca2+ (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sacharoza 36 mM (pH 7,1)), aby larwa była wilgotna. </li>
 <li>Wykonaj małe nacięcie w pobliżu ogona za pomocą mikronożyczek (MB-50-7, Napox, Japonia). </li>
 <li>Od nacięcia wykonaj podłużne cięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej w kierunku głowy. Uważaj, aby nie uszkodzić brzusznego rdzenia nerwowego (VNC) i aksonów. </li>
 <li>Wykonaj małe nacięcie na głowie z boku. </li>
 <li>Umieść 4 kołki w każdym rogu rozciętej ściany ciała. Ściana ciała powinna być wystarczająco rozciągnięta, aby uwidocznić segmentowy wzór ściany ciała, ale nie za bardzo, aby utrudnić ruch perystaltyczny. </li>
 <li>Usunąć narządy wewnętrzne z wyjątkiem mózgu i VNC i przepłukać próbkę solą fizjologiczną wolną odCa2+. </li>
 <li>Dostosuj orientację brzusznego rdzenia nerwowego, aby była obustronnie symetryczna, zmieniając położenie i orientację szpilek owadów na ścianie ciała. Aby ustalić położenie brzusznego rdzenia nerwowego, włóż szpilkę przez tkankę między mózgiem a zaczepem ustnym w dół do sylgardu.</li>
 <li>Zastąp bufor roztworem Ringera 2 mM Ca2+ (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sacharoza 36 mM (pH 7,3)). </li>
</ol>
4. Obrazowanie z oświetleniem laserowym
<ol>
 <li>Zamocuj suchą soczewkę obiektywową 4x (UPlanSApo 4x, NA 0.16, Olympus, Japonia) w mikroskopie konfokalnym i ustaw preparat larwy na scenie.</li>
 <li>Uzyskaj obraz transmisyjny wypreparowanego preparatu za pomocą czerwonego lasera (633 nm) w celu zlokalizowania brzusznego rdzenia nerwowego za pomocą mikroskopu konfokalnego. Do tego skanowania nie należy używać lasera 488 nm lub 559 nm, który wywołuje niepożądaną stymulację odpowiednio ChR2 lub NpHR.</li>
 <li>Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) na obrazie transmisji. Tryb powiększenia może być przydatny do szczegółowego określenia zwrotu z inwestycji. </li>
 <li>Zmień zestaw filtrów mikroskopu, aby oświetlał światłem 488 nm lub 559 nm. </li>
 <li>Oświetl preparat lampą halogenową, aby uwidocznić ścianę ciała. Preparat może być monitorowany za pomocą kamery CCD dołączonej do mikroskopu konfokalnego. </li>
 <li>Rejestruj ruch ściany ciała i włączaj i wyłączaj wiązkę laserową podczas monitorowania ruchu. </li>
</ol>

<ol><li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).</li>
<li>Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+and+modulation+of+locomotion+pattern+generators+in+Drosophila+larvae%3A+effects+of+altered+biogenic+amine+levels+by+the+tyramine+beta+hydroxlyase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation.</a> J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).</li>
<li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva%3A+more+sense+than%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).</li>
<li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Suster, M. L., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+assembly+of+a+central+pattern+generator+without+sensory+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input.</a> Nature. 416, 174-178 (2002).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li>
<li>Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+and+control+of+genetically+designated+neurons+in+functioning+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li>
<li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+neuronal+activation+by+Channelrhodopsin-2+and+TRPA1+determine+behavioral+output+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae.</a> J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).</li>
<li>Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+the+teaching+laboratory%3A+using+channelrhodopsin-2+to+study+the+neural+basis+of+behavior+and+synaptic+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Physiol.+Educ%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila.</a> Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).</li>
<li>Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+dissection+of+neural+circuits+responsible+for+Drosophila+larval+locomotion+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin.</a> PLoS One. 6, e29019(2011).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).</li>
<li>Hildebrand, E., Dencher, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photosystems+controlling+behavioural+responses+of+Halobacterium+halobium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium.</a> Nature. 257, 46-48 (1975).</li>
<li>Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+long-lifetime+photointermediate+of+s-rhodopsin+is+a+receptor+for+negative+phototaxis+in+Halobacterium+halobium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446, 633-639 (2007).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+NMJ+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J. Vis. Exp. (24), e1107(2009).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Czasowe i lokalne zakłócenia aktywności neuronalnej są nieocenioną techniką analizy dynamiki sieci obwodów neuronalnych. W tym protokole przedstawiamy metodę manipulowania aktywnością neuronalną za pomocą optogenetyki za pomocą lasera. Wysoka kierunkowość lasera pozwala na bardziej miejscową stymulację optogenetyczną niż stymulacja szerokopolowa przy użyciu lampy rtęciowej lub ksenonowej. Chociaż oświetlenie laserowe zostało już zastosowane w optogenetyce w poprzednich badaniach, w większości poprzednich badań wymagane są specjalne konfiguracje, takie jak włókno szklane, mikromanipulator i źródło lasera. W tym protokole używamy konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej do oświetlenia miejscowego. Ponieważ system mikroskopu konfokalnego jest szeroko stosowany, metoda ta otworzy możliwość zastosowania optogenetyki o wyższej rozdzielczości w wielu laboratoriach.
Protokół ma dwa krytyczne punkty: rozwarstwienie larw i moc lasera. Po pierwsze, jeśli mózg, brzuszny rdzeń nerwowy lub nerw ruchowy zostanie uszkodzony podczas sekcji, larwy będą wykazywać mniejszy lub żaden spontaniczny ruch perystaltyczny. Precyzja jest więc niezbędna, zwłaszcza przy wykonywaniu nacięcia po stronie grzbietowej nożyczkami sprężynowymi i usuwaniu narządów wewnętrznych za pomocą kleszczy. Szczegóły dotyczące sekcji zostały zgłoszone wcześniej21. Po drugie, jeśli ma zostać osiągnięta wystarczająca stymulacja, wymagana jest moc lasera około 0,1 ~ 1 mW / mm2 dla ChR2 lub 1 ~ 10 mW /mm2 dla NpHR. Oceniliśmy moc lasera jako całkowitą moc światła pod soczewką obiektywu podzieloną przez szacowany obszar oświetlenia. Zmierzyliśmy całkowitą moc światła za pomocą miernika mocy (mobiken, Sanwa M.I. Technos, Japonia). Oszacowaliśmy obszar oświetlenia jako stałą kołową pomnożoną przez kwadrat długości fali lasera, co w przybliżeniu daje oświetlany obszar w granicy dyfrakcji. Efektywna moc oświetlenia próbki może być regulowana nie tylko przez moc wyjścia lasera, ale także przez zmianę prędkości skanowania i liczby powtórzeń. Skanowaliśmy laser z prędkością 20-100 μs/piksel 63 razy. Ponadto poziom ekspresji białka optogenetycznego i ilość ATR mają również kluczowe znaczenie dla skuteczności stymulacji. W związku z tym, jeśli larwy nie wykazały odpowiedzi optogenetycznej, należy sprawdzić i skorygować następujące punkty: 1) moc lasera (poprzez optymalizację systemu mikroskopowego), 2) poziom ekspresji białka optogenetycznego (poprzez sprawdzenie genotypu i temperatury hodowli) oraz 3) ilość ATR (poprzez dostosowanie stężenia ATR i okresu karmienia). NpHR wymaga wyższego stężenia ATR niż ChR2 z nieznanych przyczyn 13. ChR2 dobrze sprawdza się u larw hodowanych w pokarmie zawierającym mniej ATR (np. 0,1 mM) niż opisane tutaj (1 mM). Ponieważ karmienie larw do 1 mM ATR jest wystarczające do wytworzenia ChR2 fotoreaktywnego, zalecamy to stężenie do pierwszej próby w eksperymentach ChR2. Stężenie ATR można następnie zmniejszyć z poziomu 1 mM. Jeśli chodzi o czas ekspozycji na ATR, zalecamy czas opisany tutaj w celu zapewnienia solidnej kontroli optogenetycznej. Często nie udawało nam się zaobserwować reakcji optogenetycznej podczas karmienia larw ATR przez krótszy czas.
W tym protokole oświetlenie laserowe i akwizycja obrazu są obsługiwane przez oddzielny komputer. Tak więc wyraźne wykrycie czasoprzestrzennego wzorca oświetlenia laserowego przez kamerę CCD ma kluczowe znaczenie dla analizy danych. Jeśli plamka lub linia lasera jest przyciemniona na obrazie CCD, należy zoptymalizować moc lampy halogenowej i zwiększyć wartość kamery CCD, aby zobrazować oświetlenie laserowe, zachowując widoczność ściany ciała.
Oświetlenie czasoprzestrzenne pokazane w tym protokole dostarcza informacji o obwodach motorycznych larw; Metoda ta ma jednak pewne ograniczenia. Jeśli chodzi o aspekt "przestrzenny", lokalizacja oświetlenia jest rejestrowana przez obraz CCD o małym powiększeniu, używany do filmowania ruchów ścian ciała. W związku z tym obszar oświetlenia można przypisać na poziomie segmentu, ale nie na poziomie komórkowym. Jeśli chodzi o aspekt "czasowy", opóźnienie czasowe między włączeniem skanowania laserowego za pomocą mikroskopu konfokalnego a oświetleniem laserowym zależy od systemu mikroskopu konfokalnego i warunków skanowania. W związku z tym wymagane jest przeprowadzenie pewnych testów metodą prób i błędów, aby dostosować czas oświetlenia. Ponieważ czas oświetlenia można określić w filmach z obrazem CCD za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak ImageJ, krytycznym czynnikiem w rozdzielczości czasowej jest liczba klatek na sekundę obrazowania z kamery CCD. Zazwyczaj ustawiamy liczbę klatek na sekundę na 7,5-15 klatek na sekundę.
Postęp w narzędziach optogenetycznych daje nam szansę na modyfikację tego protokołu. Użyliśmy larw 3stopnia rozwojowego posiadających OK6-Gal4 i UAS-ChR2 [H134R] lub UAS-NpHR2. Inne narzędzia optogenetyczne zamiast ChR2[H134R] lub NpHR2, takie jak ChR2[T159C/E123T], NpHR3 lub Arch, mogą zwiększyć skuteczność kontroli aktywności22. Ponadto użycie innych linii gal4 lub analiza w innych stadiach rozwoju może dostarczyć więcej informacji o obwodach silnikowych.
W tym protokole aktywność ruchowa była monitorowana poprzez transmisję obrazów skurczu ściany ciała za pomocą kamery CCD. Aktywność neuronów ruchowych z wrażliwymi na wapń cząsteczkami fluorescencji (np. GCaMP) może być również bezpośrednio monitorowana podczas manipulowania aktywnością neuronalną za pomocą ChR2 lub NpHR. W takim przypadku zamiast lampy halogenowej i zwykłej kamery CCD opisanej wcześniej w niniejszym dokumencie stosuje się oświetlenie światłem niebieskim na dużym obszarze i kamerę CCD o wysokiej czułości (np . kamerę EMCCD). Aby poprawić rozdzielczość przestrzenną stymulacji przy jednoczesnym monitorowaniu ruchu ścian ciała, bardziej zaawansowaną metodą może być zastosowanie dodatkowej soczewki obiektywowej: oświetlenie brzusznego rdzenia nerwowego przez soczewkę obiektywową o dużym powiększeniu (np. 40x) znad próbki i monitorowanie ściany ciała za pomocą soczewki o małym powiększeniu (np. 4x) poniżej próbki. Ten system podwójnych soczewek może pozwolić nam na stymulację układu nerwowego w wyższej rozdzielczości przestrzennej. 
Przedstawiony tutaj protokół można zastosować do innych obwodów neuronalnych, pod warunkiem, że narzędzia optogenetyczne mogą być wyrażane w układzie nerwowym i można ustalić przygotowanie, w którym można dostarczyć wystarczającą ilość światła do tkanki nerwowej.

Przemieszczanie się do przodu w locie perystaltycznym u larw Drosophila następuje poprzez rozprzestrzenianie się skurczu mięśni z segmentów tylnych do przednich. Ruch ten jest realizowany przez sekwencyjną aktywację neuronów ruchowych w obrębie brzusznego rdzenia nerwowego wzdłuż podłużnej osi ciała. Aby zbadać obwody stojące za tą wzorcową aktywnością propagacyjną, lokalne zakłócenia aktywności neuronalnej mogą być podejściem informacyjnym. Chociaż test farmakologiczny może kontrolować określone substancje, takie jak neuroprzekaźniki, w tkance nerwowej, działanie leków farmakologicznych może być podobne w prawie wszystkich segmentach, ponieważ larwalny brzuszny rdzeń nerwowy jest powtarzalną strukturą złożoną z podobnych neuromerów wzdłuż osi podłużnej. Alternatywnie, można wyrazić optogenetyczne lub wrażliwe na temperaturę cząsteczki sondy w niewielkiej liczbie segmentów. Jednak tak specyficzne linie gal4 są bardzo trudne do wygenerowania. W tym miejscu przedstawiamy metodę manipulowania neuronami w kilku segmentach za pomocą oświetlenia laserowego. Wykorzystując ograniczone przestrzennie oświetlenie w mikroskopii konfokalnej, można zaburzyć aktywność neuronów w okolicy. W połączeniu ze wzorcem ekspresji sondy za pomocą podzbiorów specyficznych dla neuronów linii gal4, ta metoda oświetlenia laserowego znacznie poprawia rozdzielczość przestrzenną dla perturbacji. A ponieważ metoda ta wymaga jedynie konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego, zakup dodatkowego sprzętu laboratoryjnego zazwyczaj nie jest konieczny. 
Korzystając z tej techniki, zbadaliśmy rolę aktywności neuronów ruchowych podczas propagacji wyjścia motorycznego13. Blokując aktywność neuronów ruchowych w obrębie kilku segmentów podczas ruchu perystaltycznego, byliśmy w stanie sprawdzić, czy aktywność samych neuronów ruchowych jest wymagana do propagacji motorycznego sygnału wyjściowego. Miejscowa i przejściowa blokada neuronów ruchowych zahamowała propagację ruchu perystaltycznego. Po usunięciu blokady propagacja pojawiła się na odcinku, na którym fala została zatrzymana. Zjawisko to sugeruje, że bez aktywacji neuronów ruchowych fala propagacyjna nie może dalej postępować wzdłuż brzusznego rdzenia nerwowego, a zatem aktywacja neuronów ruchowych jest niezbędna do ruchu perystaltycznego. Wcześniej informowaliśmy o szczegółowych danych i dyskusjach na temat tego zjawiska w Inada et al. (2011) 13. W tym miejscu opisujemy metodę interaktywnego zakłócania aktywności neuronalnej przy jednoczesnym monitorowaniu ruchu wypreparowanych larw. Korzystając z różnych linii gal4 i serii wzorców czasoprzestrzennych do manipulacji aktywnością, można badać logikę obwodów poprzez właściwości odpowiedzi perturbacyjnej obwodu motorycznego.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop BX61WI</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluoview FV1000 system konfokalny</td><td>Olympus Corporation</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Sony</td><td>XCD-V60</td><td></td></tr><tr><td>all-trans siatkówka</td><td>Sigma</td><td>R2500-500MG</td><td>200 mM w 95% EtOH</td></tr><tr><td>Silpot184</td><td>Dow Corning Toray</td><td>3255981</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw drosophila w ruchu

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Lokomocja larw Drosophila jest wspaniałym modelowym systemem w neuronauce rozwojowej i fizjologicznej, dzięki dostępności genetycznej podstawowych składników neuronalnych w obwodach1-6. Zastosowanie optogenetyki7,8 w obwodzie nerwowym larw pozwala nam manipulować aktywnością neuronalną w sposób przestrzenny i czasowy9-13. Zazwyczaj próbki są szeroko oświetlone lampą rtęciową lub diodą LED, więc specyficzność docelowych neuronów jest kontrolowana przez binarne systemy ekspresji genów, takie jak system Gal4-UAS14,15. W tej pracy, aby poprawić rozdzielczość przestrzenną do "rozdzielczości subgenetycznej", lokalnie oświetliliśmy podzbiór neuronów w brzusznym rdzeniu nerwowym za pomocą laserów zaimplementowanych w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Monitorując ruch ściany ciała częściowo nienaruszonych larw, interaktywnie aktywowaliśmy lub hamowaliśmy aktywność neuronalną za pomocą rodopsyny kanałowej16,17 lub halorodopsyny18-20, odpowiednio. Poprzez ograniczone przestrzennie i czasowo oświetlenie tkanki nerwowej możemy manipulować aktywnością określonych neuronów w obwodzie w określonej fazie zachowania. Metoda ta jest przydatna do badania związku między aktywnością lokalnego zespołu neuronalnego w brzusznym rdzeniu nerwowym a czasoprzestrzennym wzorcem wyjścia motorycznego.

Lokalna i przejściowa aktywacja neuronów ruchowych za pomocą ChR2.
Wyrażyliśmy ChR2 w neuronach ruchowych. Aksony neuronów ruchowych wychodzące z każdego segmentu VNC rzutują do odpowiadającego im segmentu ściany ciała. Po stymulacji jednego lub dwóch segmentów VNC niebieskim laserem, mięśnie w odpowiadających im segmentach wykazywały skurcze (Rycina 1).
Lokalna i przejściowa inhibicja neuronów ruchowych z użyciem NpHR.
Wyrażyliśmy NpHR w neuronach ruchowych. Gdy podczas perystaltycznych skurczów mięśni stymulowaliśmy kilka (1~2) segmentów VNC żółtym laserem, rozprzestrzeniająca się fala została zatrzymana na odpowiadających im segmentach ściany ciała (Rysunek 2). Następnie fala wznowiła bieg od zatrzymanych segmentów po wyłączeniu naświetlania laserem13.
<img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig1.jpg" alt="Schemat skurczu mięśni i obraz mikroskopowy; światło niebieskie włączone/wyłączone; orientacja przednio-tylna." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Lokalna aktywacja neuronów ruchowych za pomocą ChR2. A. Schemat lokalnej aktywacji preparatu w formie płata. Poprzez naświetlanie światłem niebieskim kilku segmentów brzusznego sznura nerwowego wykazujących ekspresję ChR2 w neuronach ruchowych, dochodzi do skurczu mięśni w odpowiadających im segmentach (grot strzałki). B. Obrazy transmisyjne zdyssekowanej larwy. Lokalna iluminacja brzusznego sznura nerwowego (groty strzałek) indukuje segmentowy skurcz mięśni ściany ciała (strzałki).
<img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="Schemat skurczu i rozkurczu mięśni z efektem światła na włóknach mięśniowych, obraz mikroskopowy." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 2. Lokalna inhibicja neuronów ruchowych za pomocą NpHR. A. Schemat lokalnej inhibicji preparatu filatu. Poprzez naświetlanie światłem żółtym kilku segmentów brzusznego sznura nerwowego wykazujących ekspresję NpHR w neuronach ruchowych, skurcze mięśni podczas spontanicznego ruchu perystaltycznego (grot strzałki u góry) ulegają rozkurczowi (grot strzałki na dole). B. Obrazy transmisyjne zdyssekowanej larwy. Lokalna iluminacja brzusznego sznura nerwowego (groty strzałek) spowodowała rozkurcz spontanicznie skurczonych segmentów ściany ciała (strzałki).

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

W niniejszym protokole rozpoczynamy od karmienia larw o odpowiednim genotypie pokarmem opartym na E, zawierającym all trans A TR. Każda larwa zostaje unieruchomiona za pomocą szpilek i poddana sekcji w roztworze soli fizjologicznej; następnie sól fizjologiczną zastępuje się dwiema milimolarnymi roztworami Ringera z wapniem, a preparat LABA umieszcza się na stoliku mikroskopu. Ruchy wysekcowanego LABA są rejestrowane za pomocą kamery CCD. Poprzez lokalne naświetlanie układu nerwowego możemy zaburzać aktywność neuronów określonego podzbioru w ściśle określonym czasie, monitorując jednocześnie ruchy tego samego, nienaruszonego preparatu.Cześć, jestem Tega z laboratorium dr. A. Cześć, jestem Hi Kosaka, również z laboratorium dr. A, poziom Oph.Lokomocja stanowi użyteczny system modelowy do badania obwodów ruchowych. Dzięki wysoce rozwiniętym technikom genetycznym opisanym w niniejszym protokole, zastosujemy manipulację optogenetyczną neuronami ruchowymi przy jednoczesnym monitorowaniu poziomu ruchu. Wykorzystując lasery w mikroskopie konfokalnym, można stymulować podzbiór neuronów i analizować reakcje ruchowe na przestrzennie i czasowo ukierunkowane zaburzenia aktywności tych neuronów.Zacznijmy zatem. Utrzymuj linie muszek K64US CHR2 lub K64US NPHR w plastikowych probówkach z biosferą zawierającymi standardową żywą pożywkę. Dodaj roztwór TL do podłoża drożdżowego w odpowiednich stężeniach i dokładnie wymieszaj. Rozprowadź podłoże drożdżowe na agarze z soku jabłkowego.Pobrać drugą lub trzecią kolonię SLA z fiolek. Nanieść kolonię na płytkę z pożywką drożdżową zawierającą TR. Przykryć płytkę folią aluminiową, aby utrzymać TR w ciemności. Inkubować kolonię w temperaturze 25 °C przez odpowiedni czas.Jest to kamera CCD służąca do wizualizacji nieuszkodzonego preparatu laboratoryjnego. Należy przymocować kamerę CCD do konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego za pomocą adaptera SEMA. Należy pobrać próbki z lobby A TRA i wypłukać je wodą.Aby usunąć resztki pokarmu z organizmu, umieść larwę na chłodnej płytce z osłoną C stroną grzbietową do dołu. Przymocuj ją szpilkami entomologicznymi w okolicy głowy i ogona. Dodaj normalną sól fizjologiczną wolną od wapnia.Za pomocą mikronożyczek wykonaj niewielkie nacięcie w pobliżu ogona. Następnie wykonaj cięcie podłużne wzdłuż linii środkowej grzbietu. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić brzusznego rdzenia nerwowego oraz nerwów obwodowych.Wykonaj niewielkie nacięcie boczne głowicy w każdym narożniku rozciętej ściany ciała. Usuń organy wewnętrzne z wyjątkiem mózgu i brzusznego sznura nerwowego. Zastąp sól fizjologiczną roztworem Ringera z wapniem dla modelu 2 milion.Zamocuj suchy obiektyw o pełnej aperturze w mikroskopie konfokalnym i umieść preparat laboratoryjny na stoliku mikroskopu. Wykonaj obraz transmisyjny zdyssekowanego preparatu przy użyciu czerwonego lasera, aby zlokalizować brzuszny sznur nerwowy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wyznacz obszar zainteresowania na obrazie transmisyjnym; użycie powiększenia jest pomocne w określeniu konkretnego obszaru zainteresowania.Zmień zestaw filtrów mikroskopu, aby uzyskać oświetlenie światłem o długości 488 nanometrów lub 559 nanometrów. Zwizualizuj ścianę ciała, oświetlając preparat lampą halogenową. Monitoruj preparat za pomocą kamery CCD podłączonej do mikroskopu konfokalnego.Przywołaj ruch ściany ciała i przełącz wiązkę lasera tylko w celu tymczasowej manipulacji aktywnością neuronalną, podczas gdy ruch perystaltyczny w tej samej nienaruszonej preparacji jest obserwowany i rejestrowany przez kamerę CCD. W tym laboratorium neurony motorowe wykazują ekspresję CHL two. Oświetlenie jednego lub dwóch segmentów brzusznego sznura nerwowego aktywuje neurony motorowe w tych segmentach, co z kolei indukuje skurcz mięśni w odpowiadających im segmentach ściany ciała, stymulując inne segmenty w brzusznej części nerwu.Zimno indukuje skurcz innych segmentów ciała. NPHL ulegała ekspresji w neuronach ruchowych, gdy kilka segmentów brzusznego sznura nerwowego było stymulowanych żółtym laserem. Propagująca fala została zatrzymana na odpowiadającym jej segmencie ściany ciała.Fala następnie powróciła do ruchu z zatrzymanego segmentu po wyłączeniu wiązki lasera. Niniejszy protokół wyjaśnia procedurę przeprowadzania optogenetycznej perturbacji aktywności neuronalnej za pomocą laserów w tym samym nieaktywnym kolistym poziomie w ruchu. Sznur nerwowy brzuszny oraz nerwy obwodowe nie mogą zostać uszkodzone podczas tej dyssekcji, aby zapewnić skuteczną stymulację.Moc oświetlenia należy dostosować poprzez zmianę mocy lasera, prędkości skanowania lub liczby powtórzeń w mikroskopie konfokalnym. To cały protokół. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.

optogenetic-perturbation-neural-activity-with-laser-illumination-semi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Optogenetyczne Zakłócenie Aktywności Neuronowej za Pomocą Oświetlenia Laserowego w Półprzejrzystych Larwach Drosophila W Ruchu

Ten film opisuje dwufotonową laserową ablację aksonów u larwy Drosophila melanogaster oraz przykładowy protokół wywoływania obrażeń i obrazowania miejsca urazu.

Uszkodzenie neuronów wywołane laserem dwufotonowym: metoda obserwacji zwyrodnienia i regeneracji aksonów u larw Drosophila

Optogenetyka umożliwia użycie światła do manipulowania neuronami, które są genetycznie modyfikowane do wyrażania specyficznych opsyn, wrażliwych na światło białek, których aktywacja światłem powoduje zmianę stanu neuronu. Tutaj opisujemy podejście optogenetyczne u Drosophila przy użyciu opsyny Channelrhodopsin2. Przykładowy protokół zawiera test optogenetyczny ustawiony do badania obwodów neuronalnych stojących za zachowaniem ucieczki muchy.

Drosophila Optogenetyka: metoda manipulowania obwodami neuronalnymi

Ten film pokazuje badanie zachowania nawigacyjnego larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych (ORN). Transgeniczne larwy Drosophila wykazujące ekspresję światłoczułych kanałów jonowych w ORN są umieszczane na agarozie w obrębie areny behawioralnej. Stymulacja optogenetyczna światłem otwiera kanały, powodując napływ kationów, który wyzwala przekazywanie sygnału do mózgu, a zachowanie nawigacyjne jest rejestrowane.

Zachowania nawigacyjne larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację węchowych neuronów czuciowych

Ten film demonstruje metodę wywoływania ukierunkowanego uszkodzenia neuronów u larw Drosophila za pomocą lasera o dużej mocy. Po umieszczeniu larwy pod mikroskopem, laser o małej mocy skanuje w poszukiwaniu neuronów fluorescencyjnych, a następnie zwiększa moc lasera w celu wywołania miejscowego uszkodzenia. Uraz potwierdza zwiększona fluorescencja i krater w miejscu urazu.

Wywoływanie ukierunkowanego uszkodzenia neuronów za pomocą lasera o dużej mocy u larwy Drosophila

Genetycznie kodowane narzędzia optogenetyczne umożliwiają nieinwazyjną manipulację specyficznymi neuronami w mózgu Drosophila. Takie narzędzia mogą identyfikować neurony, których aktywacja jest wystarczająca do wywołania lub stłumienia określonych zachowań. W tym miejscu przedstawiamy metodę aktywacji rodopsyny kanałowej2, która ulega ekspresji w docelowych neuronach u swobodnie chodzących muszek.

Optogenetyczna stymulacja zachowań ucieczkowych u Drosophila melanogaster

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Ten protokół wprowadza test plamki świetlnej do zbadania fototaktycznego zachowania larw Drosophila. W tym teście plamka świetlna jest generowana jako stymulacja światłem, a proces unikania światła larwalnego jest rejestrowany przez system obrazowania oparty na świetle podczerwonym.

Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Ten protokół ocenia aktywność synaptyczną funkcjonalną między określonymi partnerami neuronowymi in vivo w centralnym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster przy użyciu genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych cIVda neuronów sensorycznych za pomocą CsChrimson indukuje fotokonwersję zależną od wapnia CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.

Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI

Poznaj optogenetyczną manipulację aktywnością neuronów motorycznych u częściowo nienaruszonych larw Drosophila przy użyciu oświetlenia laserowego w mikroskopie konfokalnym. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu (Wideo) | JoVE Journal

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

Przeglądaj więcej filmów