Test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) in ovo jest przeszczepiona świeżymi tkankami nowotworowymi pochodzącymi z mięsaka, ich pojedynczymi zawieszeniami komórkowymi oraz stałymi i przejściowymi fluorescencyjnie znakowanymi liniami komórkowymi mięsaka. Model służy do badania zachowań przeszczepu (żywotność, wskaźnik proliferacji Ki67, martwica, infiltracja) i gospodarza (naciekanie fibroblastów, wrastanie naczyń).

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie testu błony choal toic lub CAM w celu zbadania zachowania mięsaka, komórek lub przeszczepu. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw okienka w skorupce jaja w trzecim dniu inkubacji. W drugim etapie, w dziewiątym dniu inkubacji, przygotowuje się materiał nowotworowy.

Następnie, po usunięciu warstwy nabłonkowej, guz jest dodawany do krzywki Podczas ostatniego etapu w 16 dniu inkubacji, CAM jest fotografowany, zbierany i utrwalany w formalinie w celu oceny histologicznej. Ostatecznie klasyczna histologia h i d oraz immunohistochemia są wykorzystywane do wykazania mięsaka, proliferacji komórek i unaczynienia inwazji oraz reakcji gospodarza. Główną zaletą tej techniki spośród istniejących metod, takich jak ksenoprzeszczep większości modeli, jest to, że jest łatwa do nauczenia i stosunkowo tania.

Pozwala również na zbadanie niezliczonych czynności związanych z przerzutami w bardzo krótkim czasie i nie wymaga komisji etycznej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad mięsakami, takie jak wpływ interakcji gospodarza guza na przeżycie guza, odtworzenie mikrośrodowiska guza i rekrutacja komórek zrębu. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku spersonalizowanej terapii mięsaka, ponieważ można badać własny materiał pacjenta.

Wszystkie te nowe techniki mogą dostarczyć nam nowych informacji na temat neurogenezy SAR. Ma to również duże zastosowanie w innych systemach, takich jak onkogeneza w ogóle. Zacznij od użycia sterylnego skalpela, aby pociąć próbkę guza na małe kawałki, nie większe niż jeden milimetr sześcienny, usuwając wszystkie zwapniałe obszary.

Następnie zważyć próbkę i przenieść od dwóch do czterech gramów tkanki do probówki dysocjującej. Trawić tkankę w 2,5 mililitra kolagenazy dwa i 2,5 mililitra roztworów DN a. Po przetworzeniu tkanki, zgodnie z protokołem dysocjacji guza H, przefiltruj powstałą zawiesinę przez sitko komórkowe o wielkości 150 mikronów.

Teraz odwiruj zawiesinę z odpowiednią siłą odśrodkową, taką jak 100 do 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po ostrożnym usunięciu supernatantu za pomocą pipety, inkubować osad w 10 mililitrach lizy erytrocytów, buforować w temperaturze pokojowej z okazjonalnym tationem. Po 10 minutach dodaj 25 mililitrów pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję po ponownym odwirowaniu zawiesiny, osad powinien być biały, wyrzuć supernatant i dodaj pięć mililitrów pożywki do komórek, a następnie przefiltruj zawiesinę przez sitko do komórek o wielkości 70 mikronów.

Użyj automatycznego licznika komórek, aby określić liczbę żywych komórek na mililitr podczas opracowywania. Dzień trzeci, włóż igłę o rozmiarze 18 G do końcówki jajka i usuń dwa mililitry albuminy, aby obniżyć poziom błony lub krzywki OVO chorio all. Teraz nałóż półprzepuszczalną folię samoprzylepną na zaznaczoną górną stronę muszli, aby zapobiec rozsypywaniu się cząstek skorupy na krzywkę podczas cięcia okna.

Następnie wykonaj otwór wprowadzający z małym wszystko na powierzchni jajka. Nie uszkodzenie krzywki podczas otwierania skorupy jest najtrudniejszą częścią procedury. Używamy ostrych nożyczek, trzymając je poziomo w jednej ręce, a jajko trzymając w drugiej ręce.

Teraz użyj sterylnych, ostrych, spiczastych nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć jednocentymetrowe kwadratowe okienko w skorupie. Pulsujące serce i przylegające do niego naczynia zarodka powinny być teraz widoczne na powierzchni żółtka jaja. Usuń wszelkie niezapłodnione jaja lub martwe zarodki.

Następnie uszczelnij okno bardziej półprzepuszczalną folią samoprzylepną. Po ponownym odkręceniu zawiesiny guza, ponownie zawieś osad w schłodzonym żelu macierzy zewnątrzkomórkowej raz od 10 do sześciu komórek na 100 mikrolitrów żelu. Trzymaj ten roztwór na topniejącym lodzie.

Następnie, przy przepływie laminarnym, użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć część półprzepuszczalnej folii samoprzylepnej. Usuń warstwę komórek nabłonka, lekko dotykając krzywki sterylnym szklanym prętem. Następnie dodaj 4 25 mikrolitrów zawiesiny żelu ECM do krzywki, umożliwiając polimeryzację żelu ECM między aplikacjami.

W ten sposób powstaje przylegająca blaszka nazębna zawierająca komórki rakowe. Następnie ponownie uszczelnij okno skorupy półprzepuszczalną folią samoprzylepną. Po odpowiednim okresie inkubacji eksperymentalnej użyj nożyczek chirurgicznych, aby powiększyć okno muszli, uważając, aby nie ciąć zbyt nisko.

Następnie za pomocą pipety dodaj od 300 do 500 mikrolitrów PBS na sekcję CAM zawierającą zaszczepiony materiał. Następnie sfotografuj kamerę przez stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny. Następnie za pomocą sterylnych nożyczek przeciąć membranę na granicy przylegającej do skorupy i umieścić zebraną krzywkę na sterylnej szalce Petriego wypełnionej PBS lub buforowanym formaldehydem.

Następnie sfotografuj zarówno górną, jak i dolną stronę kamery, zarówno z filtrem, jak i bez, jak pokazano. Na tym pierwszym rysunku przeszczepy guza przylegają do krzywki. W tym przypadku na tych dwóch obrazach można zaobserwować zawiesinę pojedynczej komórki z materiału pacjenta wykazującą wysuszoną, lekko wypukłą płytkę nazębną.

Pokazane jest wyraźne marszczenie membrany, które występuje po wycięciu krzywki. Dwie linie SAO tworzą płytkę rozsiewającą się nad CAM z wyraźnym wzrostem powierzchni od siódmego dnia. Po inokulacji sygnał GFP pozostaje silny, co wskazuje na żywotne komórki.

Te blaszki zawierające komórki SW 1 3 53 wykazują zmniejszenie powierzchni i mają tendencję do skurczenia krzywki, co powoduje pomarszczoną błonę. Po zbiorach od siódmego dnia często obserwuje się krwawienie. Sygnał DSR zmniejsza się, gdy sonda fluorescencyjna ulega rozcieńczeniu po wielu podziałach komórkowych, a także w przypadku wystąpienia krwawienia.

W większości przypadków obserwuje się reakcję naczyniową CAM, gdy do próbki dostają się nowe, kręte naczynia. Na przykład rozgałęzienia wskazane przez groty strzałek i zespolenie oznaczone gwiazdkami w tym punktowym krwawieniu, jak wskazano strzałkami, można również zaobserwować na całej płytce nazębnej. Zwróć uwagę na migrację SAO dwóch komórek równolegle do naczyń krzywki.

Tę reakcję naczyniową można uwidocznić po wycięciu krzywki w dolnym widoku, pokazując kręte naczynia otaczające przeszczep lub płytkę nazębną. Reakcję naczyniową CAM obserwuje się w grupie przeszczepów nowotworowych i grupie zawiesiny jednokomórkowej. Dowody histologiczne wskazują, że dwie komórki SAO utrzymują wygląd pojedynczej komórki w całej objętości żelu macierzy zewnątrzkomórkowej, powodując zwiększenie grubości i średnicy płytki nazębnej.

Komórki nowotworowe atakują warstwę mezodermalną krzywki, jak wskazano tutaj strzałką, zwiększając w ten sposób odległość między warstwami endodermalnymi i skórnymi krzywki, jak otwierany zamek błyskawiczny. Jak wskazuje podwójna strzałka, wzorzec wzrostu komórek SW 1 3 5 3 i zawiesiny pojedynczej komórki świadomego mięsaka pacjenta jest bardziej skupiony z wyspami komórek na przestrzeni żelu macierzy zewnątrzkomórkowej. Jak wskazuje strzałka, nie wytrzymując ich ektopowego miejsca wzrostu, stwierdziliśmy, że podstawowe cechy i cechy immunohistochemiczne pierwotnych guzów mięsaka zostały zachowane w krzywce.

Ponadto przeszczepy nowotworowe uległy rewaskularyzacji, o czym świadczy pojawienie się ciemnoróżowo-niebieskich jądrzastych erytrocytów piskląt, jak wskazują groty strzałek i znalezione w naczyniach, liczenie komórek KI 67 dodatnich i KI 67 ujemnych wykazuje stały wzrost całkowitej liczby komórek od czwartego dnia dla obu linii komórkowych. Po tym dniu całkowita liczba komórek pozostaje stabilna siedem dni po inokulacji, liczba komórek dodatnich KI 67 i całkowita liczba komórek zaczyna spadać. Większą część komórek dodatnich KI 67 obserwuje się w pobliżu krzywki i obserwuje się większą część komórek ujemnych KI 67 na powierzchni płytki nazębnej.

Po opanowaniu, technika cam SA może być używana do analizy 50 x w ciągu 14 godzin w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Można wykonać dodatkowe barwienia i ocenę h i e, które wymagają trzech godzin na 10 warunków Zgodnie z tą procedurą. Dodatkowe metody, takie jak obrazowanie stylu życia, mogą być wykonane w celu rozwiązania dodatkowych problemów, takich jak wynaczynienie lub izacja komórek rakowych znakowanych grypą.

Tak więc, dzięki opracowaniu tej nowej techniki, pozwala to naukowcom zajmującym się badaniami przedklinicznymi badać nowe czynniki prognostyczne i terapeutyczne u pacjentów z mięsakami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować materiał nowotworowy w CMAA i jak przełożyć swoje obserwacje mikroskopowe i mikroskopowe na lepsze zrozumienie interakcji gospodarza guza