Name: Test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T21:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Poznaj test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka do badania dynamiki wzrostu nowotworu i interakcji z gospodarzem. Ta metoda umożliwia analizę proliferacji, inwazji i rewaskularyzacji bez zgody komisji etycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Komórki z linii komórkowej chrzęstniakomięsaka SW1353 zostały uprzejmie dostarczone przez Prof. Dr. P.C.W. Hogendoorn i Prof. Dr. J. Bovée z Uniwersytetu w Lejdzie, Holandia. Dziękujemy J. Mestach i G. Wagemans za doskonałą pomoc techniczną oraz G. De Bruyne za profesjonalny rysunek przeglądu naszego protokołu.

Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z przeglądem.
Materiał nowotworowy
1. Pobieranie i przygotowanie próbek nowotworów
Do wykorzystania materiałów pacjenta niezbędna jest zgoda Komisji Etycznej i musi być uzyskana świadoma zgoda pacjenta.
<ol>
 <li>Zebrać reprezentatywny materiał (co najmniej 1cm3) w czasie interwencji, biopsji lub resekcji mięsaka. Właściwe miejsce biopsji określa się za pomocą rezonansu magnetycznego z kontrastem dynamicznym.</li>
 <li>Natychmiast umieścić materiał w sterylnej fiolce zawierającej DMEM uzupełnioną 1000 j. penicyliny i 1 mg/ml streptomycyny.</li>
 <li>Fiolkę należy natychmiast przetransportować (30 - 90 min) do laboratorium.</li>
</ol>
Wszystkie poniższe procedury są wykonywane przy przepływie laminarnym.
<ol start="4">
 <li>Wlać zawartość fiolki na sterylną szalkę Petriego.</li>
 <li>Umieść próbkę guza na małe części o maksymalnej wielkości 1 mm3 za pomocą sterylnego skalpela. Usuń wszystkie zwapniałe części, ponieważ mają one tendencję do utrudniania dalszego przetwarzania tkanki.</li>
 <li>Losowo weź 10 przeszczepów guza do aplikacji na CAM.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych pochodzących z nowotworu
Przybliżony czas trwania: 3 godziny.
<ol>
 <li>Zważyć pozostałą tkankę próbki.</li>
 <li>Umieść 2 - 4 g tkanki w probówce dysocjatora, może być potrzebna więcej niż jedna rurka do strawienia całej pozostałej tkanki nowotworowej.</li>
 <li>Do trawienia 2 - 4 g tkanki dodać 2,5 ml roztworu kolagenazy 2 (500 U/ml RPMI 1640) i 2,5 ml roztworu DNazy (22 KU/ml RPMI 1640).</li>
 <li>Przetwarzaj tkankę zgodnie z protokołem dysocjatora h_tumor. Obejmuje to 2 cykle inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 , podczas gdy probówka jest delikatnie wstrząsana przez 30 minut.</li>
 <li>Przefiltrować pozostałą zawiesinę przez sitko o wielkości 150 μm.</li>
 <li>Odwirować lizat z prędkością 1 000 obr./min przez 5 min.</li>
 <li>Usunąć supernatant.</li>
 <li>Zawiesić osad w 10 ml buforu do lizy erytrocytów (ELB), pozostawiając 10 minut inkubacji ze zwykłą zawiesiną.</li>
</ol>
Uwaga: bufor do lizy erytrocytów jest produkowany w następujący sposób: Dodaj 0,037 g EDTA, 0,99 g K2HPO4, 8,29 g NH4Cl do 1,000 ml aqua, użyj 10 N NaOH, aby dostosować pH do 7,3, przefiltruj pod ciśnieniem przez filtr 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
<ol start="9">
 <li>Dodać 25 ml pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny), aby zatrzymać reakcję.</li>
 <li>Odwirować zawiesinę przy 1 000 obr./min przez 5 min. Kolor granulatu powinien być teraz biały.</li>
 <li>Usunąć supernatant.</li>
 <li>Dodać 5 ml pożywki do granulki. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o pojemności 70 μm.</li>
 <li>Policz liczbę żywych komórek/ml za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
</ol>
3. Linie komórek rakowych
Komórki kostniakomięsaka SAOS2 (numer ATCC: HTB-85) wyrażające wzmocnione białko zielonej fluorescencji zostały wyelektroporowane przez wektor peGFP-C1 przy użyciu Cell Line Nucleofector Kit V zgodnie z protokołem producenta. Aby ustalić stabilne linie komórkowe, transfekowane komórki wybrano w G418 (1 mg / ml) przez 4 tygodnie zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem20. Ponadto sortowanie przeprowadzono metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) zgodnie z instrukcjami producenta.
Komórki z linii komórkowej chrzęstniakomięsaka SW1353 (numer ATCC: HTB-94) lub świeżo przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek guza są znakowane za pomocą czerwonego fluorescencyjnego barwnika lipofilowego błony.
<ol>
 <li>Usunąć komórki z kolby hodowlanej w klasyczny sposób, używając roztworu trypsyny (0,5% wag./obj.) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA; 0,2% wag./obj.).</li>
 <li>Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 1 000 obr./min.</li>
 <li>Usunąć supernatant.</li>
 <li>Dodać 1 ml pożywki bez serum i 5 μl DiI (Vybrant Red)/106 komórek.</li>
 <li>Zawinąć fiolkę w folię aluminiową i umieścić w inkubatorze CO2 na 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Ponownie odwirować przez 5 minut przy 1 000 obr./min i usunąć supernatant.</li>
</ol>
Test błony kosmówkowej
1. Inkubacja jaj
<ol>
 <li>Wymagane są zapłodnione jaja z lokalnej komercyjnej wylęgarni gwarantujące zapłodnienie jaj w 95%.</li>
 <li>Zapłodnione jaja można przechowywać w temperaturze pokojowej do 10 dni.</li>
</ol>
Uwaga: przed rozpoczęciem inkubacji, brud, pióra i ekskrementy są ostrożnie usuwane ze skorupek jaj mechanicznie poprzez przecieranie na sucho ręcznikami papierowymi, które mają raczej szorstką niż miękką strukturę powierzchni. Wycieranie jaj 70% denaturowanym etanolem lub innym odczynnikiem czyszczącym znacznie zmniejsza przeżywalność zarodków piskląt.
<ol start="3">
 <li>Umieść jaja w inkubatorze z jednej strony, zaznaczając górną powierzchnię. Dzień, w którym jaja są umieszczane w inkubatorze, wyznacza się jako dzień 0 rozwoju zarodkowego.</li>
 <li>Ustaw temperaturę inkubacji na 37.8 °C, a wilgotność na 47%. Upewnij się, że opcja automatycznego obracania jest wyłączona.</li>
</ol>
2. Otwarcie jaj
Czas trwania: ± 60 min na 25 jaj.
W trzecim dniu rozwoju, jaja są otwierane pod laminarnym przepływem powietrza. Otwarcie jaj na dalszym etapie rozwoju powoduje uszkodzenie CAM, ponieważ błona ma tendencję do przyklejania się do skorupy. Lampa na podczerwień służy do utrzymywania jaj w cieple podczas zabiegu. W celu poprawy sterylności zalecamy stosowanie rękawiczek ręcznych.
<ol>
 <li>Umieść jajko w kubku na jajka, zaznaczoną stroną do góry.</li>
 <li>Obniżyć poziom CAM, usuwając dwa ml białka za pomocą igły 18 G umieszczonej na końcu jaja. Jeśli igła jest po przebiciu kilku skorupek jaj, wymień igłę. W przeciwnym razie należy przyłożyć zbyt dużą siłę, co skutkuje uszkodzeniem żółtka jaja lub pęknięciem skorupki. Czasami igła jest blokowana przez gradówkę, jedną z 2 spiralnych wstęg zawieszających żółtko w białku. Można to rozwiązać, delikatnie popychając tłok z powrotem w dół, aż blok zostanie rozwiązany. Jeśli żółtko jaja zostanie zassane do strzykawki, należy wymienić igłę i strzykawkę. Czasami zarodek umiera po tym wydarzeniu. Jeśli usunięta zostanie niewystarczająca ilość białka, CAM zostanie uszkodzony po usunięciu skorupy.</li>
 <li>Nałóż półprzepuszczalną folię samoprzylepną na zaznaczoną górną stronę skorupy, aby zapobiec rozlaniu się cząstek skorupy na CAM podczas cięcia okna.</li>
 <li>Zrób otwór wprowadzający z małym szydłem na powierzchni jajka.</li>
 <li>Wytnij okienko o długości 1cm2 w skorupie, używając sterylnych nożyczek chirurgicznych o ostrych zakończeniach.</li>
 <li>Pulsujące serce zarodka i przylegające do niego naczynia można zaobserwować na powierzchni żółtka jaja. Usuń niezapłodnione jaja lub martwe zarodki. Przerwany aspekt naczyń krwionośnych charakteryzuje martwe zarodki.</li>
 <li>Uszczelnij okno półprzepuszczalną folią samoprzylepną. Nie ma potrzeby zakrywania miejsca nakłucia, chyba że skorupa pękła podczas wprowadzania igły.</li>
</ol>
3. Procedura szczepienia
Czas trwania: ± 1 godzinę na linię komórkową.
W 9 dniu rozwoju embrionalnego piskląt, jaja są zaszczepiane pod laminarnym przepływem powietrza.
Ocena rozprzestrzeniania się komórek rakowych w CAM wymaga zabezpieczenia komórek na ograniczonej powierzchni podczas inokulacji. Matrigel to żel do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm, często stosowany w eksperymentalnych warunkach hodowli komórkowych. Po schłodzeniu jest cieczą, ale po doprowadzeniu do temperatury 20 - 40 °C ulega polimeryzacji aktywowanej termicznie, tworząc w ten sposób stabilny żel. Podczas eksperymentów Matrigel jest przechowywany w pudełku zawierającym topniejący lód.
Uwaga: Nalegamy, aby nie używać perforowanych szkiełek nakrywkowych. Zaobserwowaliśmy przyczepianie się i wzrost przeszczepionych komórek rakowych na plastikowym dysku, co zaburzało potencjał wzrostu komórek na samej błonie.
<ol>
 <li>Zawiesić osad komórkowy w schłodzonym żelu ECM o stężeniu 106 komórek/100 μl żelu ECM. Trzymaj ten roztwór na topniejącym lodzie.</li>
 <li>Wyciąć część półprzepuszczalnej membrany za pomocą pary sterylnych środków chirurgicznych pod laminarnym przepływem powietrza. Jeśli folia samoprzylepna zostanie całkowicie usunięta, spowoduje to większą część śmierci zarodka z powodu zanieczyszczenia.</li>
 <li>Delikatnie dotknij CAM tuż pod okienkiem muszli sterylnym szklanym prętem, aby usunąć warstwę komórek nabłonka. Dotknięcie CAM sterylnym szklanym prętem okazuje się mniej traumatyczne niż użycie skalpela nr 11, który wymaga większej zręczności i doświadczenia. Mogą wystąpić niewielkie krwotoki.</li>
 <li>Dodawanie materiału nowotworowego.</li>
 <li>W przypadku przeszczepów nowotworowych: delikatnie opuść jeden kawałek tkanki na CAM za pomocą pary sterylnych kleszczyków, nie ściskając go.</li>
 <li>W przypadku procedury z użyciem żelu ECM: Dodaj 4 x 25 μl zawiesiny żelu cell-ECM do CAM, jeden na drugim, umożliwiając polimeryzację żelu ECM między aplikacjami. W ten sposób powstaje przylegająca blaszka miażdżycowa zawierająca komórki rakowe.</li>
 <li>Ponownie uszczelnij okno skorupy półprzepuszczalną folią samoprzylepną.</li>
</ol>
4. Obrazowanie i zbieranie CAM
Czas trwania: 2 godziny na 25 jaj.
W 16 dniu rozwoju zarodkowego piskląt, zbierane są CAM-y. Praca przy laminarnym przepływie powietrza nie jest konieczna.
<ol>
 <li>Powiększ okno za pomocą nożyczek chirurgicznych. Upewnij się, że nie tniesz zbyt nisko, w przeciwnym razie CAM zostanie uszkodzony, co spowoduje krwawienie z uszkodzonych naczyń.</li>
 <li>Dodać 300 - 500 μl PBSD za pomocą pipety do sekcji CAM zawierającej zaszczepiony materiał. Jeśli nie stosuje się sond fluorescencyjnych, można zastosować buforowany formaldehyd, ponieważ powoduje to usztywnienie membrany, ułatwiając jej przecięcie.</li>
 <li>Wykonaj zdjęcie CAM w jaju za pomocą stereomikroskopowego mikroskopu fluorescencyjnego, wyposażonego w kolorową kamerę cyfrową, używając zarówno filtra GFP, jak i DSR, bez filtra. W przypadku przeszczepów nowotworowych wszystkie zdjęcia są wykonywane bez filtrów. Podczas fotografowania zdecydowanie zaleca się oświetlenie od góry za pomocą diod LED (Rysunek 2).</li>
 <li>Rejestruj migrację komórek nowotworowych dla oznaczonych komórek. Granice guzów mogą być nieregularne i postrzępione. Rozproszone komórki mogą być obecne w pobliżu granic guza. W niektórych próbkach można zaobserwować rzędy komórek nowotworowych (ryc. 3).</li>
 <li>Przetnij membranę sterylnymi nożyczkami na granicy przylegającej do skorupy.</li>
 <li>Umieść zebrany CAM na sterylnej szalce Petriego wypełnionej PBSD lub buforowanym formaldehydem.</li>
 <li>Zrób zdjęcie zarówno górnej, jak i dolnej strony kamery CAM, zarówno z filtrem, jak i bez.</li>
 <li>Umieść membranę w oznakowanym pojemniku z buforowanym formaldehydem na co najmniej 72 godziny.</li>
 <li>Zanurz CAM w parafinie i przygotuj je do badania histologicznego. Uważaj, aby przeciąć przeszczepy guza w środku guzka, upewniając się, że powierzchnia cięcia jest równoległa do dna kasety. Jeśli nie, interakcja między CAM a przeszczepem guza nie będzie widoczna. Ta sama strategia dotyczy płytek żelowych ECM: powierzchnia skierowana w stronę ostrza tnącego powinna być prostopadła do płytki nazębnej.</li>
</ol>
5. Ocena histologiczna
Barwienie Hematoksyliną-Eozyną i immunohistochemia Ki-67 zostały przeprowadzone w celu dalszego wyjaśnienia, jeśli było to potrzebne. Immunohistochemię przeprowadzono na utrwalonych w formalinie skrawkach tkanek zatopionych w parafinie o grubości 3,5 μm, przy użyciu automatycznego barwnika szkiełkowego zgodnie z instrukcjami producenta. Zastosowano mysie pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne przeciwko Ki-67 (klon MIB-1, rozcieńczenie 1/100). Indukowane ciepłem pobieranie epitopów przeprowadzono przy użyciu kondycjonowania komórek 1, a wizualizację uzyskano za pomocą uniwersalnego zestawu do wykrywania DAB, zgodnie z instrukcjami producenta. Odwodnienie skrawków tkanek przeprowadzono za pomocą automatycznego szkiełka nakrywkowego.
Dla linii komórkowych SAOS2 i SW1353, liczba jąder komórkowych Ki67-dodatnich i Ki67-ujemnych/100μm2 została policzona w trzech strefach: jedna blisko granicy CAM, jedna blisko powierzchni i jedna w środku płytki żelowej ECM. Procedura ta była powtarzana 6x dla każdego barwionego szkiełka Ki-67. Wskaźnik proliferacji określono dla każdego szkiełka, dzieląc liczbę komórek Ki67-dodatnich przez całkowitą liczbę zliczonych komórek.
Martwica jest definiowana przez utratę drobnej dyspersji chromatyny w jądrze komórkowym, której towarzyszy zanikanie wyraźnych marginesów komórkowych. W przypadku ksenoprzeszczepów martwicę ocenia się jako całkowitą, częściową (często na powierzchni) lub nieobecną. Naciekanie komórek nowotworowych do CAM definiuje się na podstawie obserwacji komórek nowotworowych w mezodermie CAM i jest oceniane jako obecne lub nieobecne.
Trzy elementy są oceniane za zachowanie gospodarza. Naciek fibroblastów definiuje się jako wydłużone komórki opuszczające CAM i atakujące przeszczep / płytkę miażdżycową guza, i jest oceniane jako obecne lub nieobecne. Wrastanie naczyń krwionośnych można zaobserwować jako wrastanie proliferujących naczyń piskląt, charakteryzujące się obecnością jądrzastych erytrocytów piskląt.

<ol><li>Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+data+for+648+patients+with+osteosarcoma+treated+at+one+institution%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).</li>
<li>Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+drug+sensitivity+and+expression+of+multidrug+resistance+markers+in+early+passage+human+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas.</a> Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).</li>
<li>Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22CA+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2001.</a> CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).</li>
<li>Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterisation+of+a+continuous+human+chondrosarcoma+cell+line%2C+ch-2879%3A+Comparative+histologic+and+genetic+studies+with+its+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigations%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin.</a> Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).</li>
<li>Taylor, B. S., Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+sarcoma+genomics+and+new+therpeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).</li>
<li>Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Sarcoma.</a> Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).</li>
<li>Nielsen, T. O., West, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+gene+expression+into+clinical+cara%3A+sarcomas+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm.</a> Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).</li>
<li>Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).</li>
<li>DeRose, Y. S., Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).</li>
<li>Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).</li>
<li>Bertotti, A., Migliardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecularly+annotated+platform+of+patient-derived+xenografts+%28%22xenopatients%22%29+identifies+HER2+as+an+effective+therapeutic+target+in+cetuximab-resistant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer.</a> Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).</li>
<li>Decaudin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+tumor+xenografted+models+%28%27tumorgrafts%27%29+for+good+management+of+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer.</a> Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+The+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Sys, G., Van Bockstal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+sarcoma+patients+tumor+morphology%2C+viability%2C+and+invasion+potential+and+indicate+disease+outcomes+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model.</a> Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).</li>
<li>Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+invasion+and+intramesenchymal+infiltration+of+the+chick+embryo+chorioallantois+by+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines.</a> Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).</li>
<li>Deryugina, E., Quigly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).</li>
<li>Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avascular+and+vascular+phases+of+tumor+growth+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo.</a> British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).</li>
<li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J. Vis. Exp. (33), e1620(2009).</li>
<li>Balke, M., Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Research Notes. 3, 58(2010).</li>
<li>Hendrix, A., Maynard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+secretory+small+GTPase+Rab27B+on+breast+cancer+growth%2C+invasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).</li>
<li>Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+normal+and+neoplastic+tissues+grafted+to+the+chick+chorioallantois%3A+role+of+host+and+preexisting+graft+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels.</a> American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).</li>
<li>Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+Chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+Assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).</li>
<li>Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+and+its+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+for+the+in+vivo+evaluation+of+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).</li>
<li>Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).</li>
<li>De Wever, O., Hendrix, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+quantification+of+cancer+cell+invasion+through+collagen+type+I+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices.</a> International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).</li>
<li>Albini, A., Benelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemoinvasion+assay%3A+A+method+to+assess+tumor+and+endothelial+cell+invasion+and+its+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation.</a> Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Czas inokulacji i zbioru
Czas do dnia inokulacji przeprowadzono przy użyciu SAOS2 w żelu ECM (36 CAM) i różnił się między 5. a 10. dniem rozwoju embrionalnego.
Przed 9 dniem inkubacji CAM nie był wystarczająco duży, aby utrzymać zastosowany przez nas żel ECM. Podczas pobierania komórki nowotworowe czasami musiały być pobierane z głębszego CAM, a niektóre próbki żelu ECM leżały luzem w białku lub na CAM. W dniach 5 i 6 trudno było uniknąć umieszczenia komórek nowotwor...

Mięsak jest rzadkim nowotworem tkanki łącznej o wysokiej śmiertelności z powodu oporności na terapię1,2. Postęp w przeżywalności pacjentów jest utrudniony ze względu na ich niską roczną częstość występowania, dużą różnorodność oraz fakt, że komórki mięsaka są trudne do hodowli in vitro3,4.
Wykorzystanie hodowanych komórek do oceny terapii przedklinicznej ujawniło, że nowe, pozornie aktywne cząsteczki in vitro nie zawsze odzwierciedlają wyniki w warunkach klinicznych. Co więcej, aberracje genomu ujawnione przez macierze ekspresji genów nie zawsze są skorelowane z cechami zachowania guza u poszczególnych pacjentów5-7. Aby spróbować rozwiązać te problemy, na znaczeniu zyskała medycyna spersonalizowana, co znajduje odzwierciedlenie w wzmożonych poszukiwaniach modeli ksenoprzeszczepów8-12.
Test in vivo ma tę zaletę, że odzwierciedla złożone wzajemne oddziaływanie między komórkami rakowymi a środowiskiem tkanki gospodarza w guzach litych, niezbędne do proliferacji i inwazji raka13. Obecnie badamy zastosowanie testu błony moczowo-omoczniowej (test CAM) jako powtarzalnego modelu ksenoprzeszczepu mięsaka14,15. Test ten jest szeroko stosowany do badania angiogenezy nowotworów16,17. W literaturze znaleźliśmy jednak różne protokoły dla tego testu, podczas gdy inne badania zaobserwowały wyraźną różnicę we wzroście lub angiogenezie zgodnie z różnymi protokołami18,19.
W tym artykule badamy wpływ różnych warunków testu CAM na zachowanie komórek za pomocą przeszczepów nowotworowych, zawiesin pojedynczych komórek pochodzących z guza i ustalonych hodowli komórek mięsaka.

<table><tbody><tr><td>Zestaw Cell Line Nucleofector V</td><td>Amaxa</td><td>VCA-1003</td><td></td></tr><tr><td>roztwór kolagenazy 2 (500 U/ml RPMI 1640)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór dnazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>11811031</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1270</td><td></td></tr><tr><td>mysie pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne Ki67</td><td>Dako Dania</td><td>MIB-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fluka</td><td>D76240</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012019</td><td></td></tr><tr><td>PBSD</td><td>Invitrogen</td><td>14040083</td><td></td></tr><tr><td>wektor peGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>632470</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Znakowanie komórek Vybrant DiI</td><td>Lifetechnologies</td><td>22885</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>cyfrowy aparat kolorowy</td><td>Leica</td><td>DFC 340 FX</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy inkubator jaj</td><td>Auto Elex Co</td><td>R-COM 50</td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAriaIII</td><td></td></tr><tr><td>Gentlemacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Gentlemacs Disocjator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Gentlemacs Disocjator Instrukcja obsługi zawierający protokół h_tumor</td><td>Miltenyi Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>półprzepuszczalna folia samoprzylepna (Suprasorb F)</td><td>Lohmann& Stereoskopowy</td> mikroskop fluorescencyjny Rauscher <td>20468</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Film zautomatyzowane szkiełko nakrywkowe Sakura</td><td></td><td>6400</td><td></td></tr><tr><td>ultraView Uniwersalny zestaw do wykrywania DAB</td><td>Ventana Medical Systems Inc</td><td>760-500</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny barwnik do szkiełek</td><td>Ventana Medical Systems</td><td>Benchmark XT</td><td></td></tr></tbody></table>

test cam in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Mięsak jest bardzo rzadką chorobą, która ma niejednorodną naturę, co utrudnia rozwój nowych terapii. Pacjenci z mięsakami są idealnymi kandydatami do medycyny spersonalizowanej po stratyfikacji, co wyjaśnia obecne zainteresowanie opracowaniem powtarzalnego i taniego modelu ksenotransplantacji dla tej choroby. Błona kosmówkowo-omocznikowa piskląt jest naturalnym żywicielem z niedoborem odporności, zdolnym do podtrzymywania przeszczepionych tkanek i komórek bez ograniczeń specyficznych dla gatunku. Ponadto jest łatwo dostępny, manipulowany i obrazowany za pomocą stereomikroskopii optycznej i fluorescencyjnej. Histologia pozwala ponadto na szczegółową analizę heterotypowych interakcji komórkowych.
Ten protokół szczegółowo opisuje szczepienie in ovo błony kosmówkowo-omoczniowej świeżymi tkankami nowotworowymi pochodzącymi z mięsaka, ich pojedynczymi zawieszeniami komórkowymi oraz stałymi i przejściowymi fluorescencyjnie znakowanymi liniami komórkowymi mięsaka (Saos-2 i SW1353). Przeżywalność piskląt wynosi do 75%. Model służy do badania zachowań przeszczepu (żywotność, wskaźnik proliferacji Ki67, martwica, infiltracja) i gospodarza (naciekanie fibroblastów, wrastanie naczyń). W przypadku miejscowego szczepienia zawiesin pojedynczych komórek, żel ECM zapewnia znaczące korzyści w porównaniu z obojętnymi materiałami zabezpieczającymi. Wskaźnik proliferacji Ki67 jest związany z odległością komórek od powierzchni CAM i czasem stosowania na CAM, przy czym ten ostatni określa ramy czasowe dodawania produktów terapeutycznych.

Ocena CAM
Przeszczepy guza przylegają do CAM (Rysunek 2A). Zawiesiny pojedynczych komórek z materiału pacjenta często tworzą wysuszoną, lekko wypukłą blaszkę (Rysunek 2D). Po wycięciu CAM następuje wyraźne pomarszczenie błony (Rysunki 2E i 2F).
W przypadku komercyjnych linii komórkowych plama staje się z czasem bardziej nieprzezroczysta, co wskazuje na proliferację komórek. Różne linie komórkowe w żelu...

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) in ovo jest przeszczepiona świeżymi tkankami nowotworowymi pochodzącymi z mięsaka, ich pojedynczymi zawieszeniami komórkowymi oraz stałymi i przejściowymi fluorescencyjnie znakowanymi liniami komórkowymi mięsaka. Model służy do badania zachowań przeszczepu (żywotność, wskaźnik proliferacji Ki67, martwica, infiltracja) i gospodarza (naciekanie fibroblastów, wrastanie naczyń).

Test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie testu na błonie chorioallantoicznej zarodka kurczaka (CAM) w celu zbadania zachowania komórek nowotworowych, komórek sarcoma lub przeszczepów. Jest to realizowane poprzez wykonanie w pierwszej kolejności okna w skorupce jaja w trzecim dniu inkubacji. W drugim etapie, w dziewiątym dniu inkubacji, przygotowywany jest materiał nowotworowy.Następnie, po usunięciu warstwy nabłonka, guz zostaje przeniesiony na błonę żółtkową (CAM). W ostatnim kroku, w 16. dniu inkubacji, błonę CAM fotografuje się, pobiera i utrwala w formalinie w celu oceny histologicznej. W końcowej fazie wykorzystuje się klasyczną histologię oraz immunohistochemię, aby wykazać obecność mięsaka, proliferację i inwazję komórek, unaczynienie oraz reakcje gospodarza. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak większość modeli ksenoprzeszczepów, jest łatwość nauki oraz stosunkowo niski koszt.Pozwala ona również na badanie wielu procesów związanych z przerzutowaniem w bardzo krótkim czasie i nie wymaga zgody komisji etycznej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad sarkomami, takie jak wpływ interakcj

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test CAM in ovo jako model przeszczepu obcego tkankowo (Xenograft) dla mięsaków

Aby zbadać wzrost guza oraz mikrośrodowisko nowotworowe in vivo, zastosowaliśmy syngeniczny i ortotopowy model raka jajnika u immunokompetentnych myszy. Przetransdukowaliśmy linię komórkową nowotworu mysiego (MOV1) białkiem fluorescencyjnym Katushka (MOV1KAT), a w niniejszej pracy przedstawiamy sposób jej ortotopowej implantacji do jajnika oraz obrazowanie in vivo.

Ortotopowy model surowiczego raka jajnika u immunokompetentnych myszy do obrazowania guzów in vivo i monitorowania odpowiedzi immunologicznych guza

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) jest niedoszczepiona immunologicznie i wysoce unaczyniona, co czyni ją naturalnym modelem in vivo wzrostu guza i angiogenezy. W tym protokole opisujemy wiarygodną metodę hodowli trójwymiarowych, unaczynionych guzów raka wątrobowokomórkowego (HCC) za pomocą testu CAM.

Test błony chorioomoczniowej piskląt in ovo (CAM) jako skuteczny model ksenoprzeszczepu raka wątrobowokomórkowego

Ludzkie komórki szpiczaka mnogiego (MM) wymagają wspierającego mikrośrodowiska komórek mezenchymalnych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej do przetrwania i proliferacji. Stworzyliśmy model zarodka kurczaka in vivo z wszczepionym ludzkim szpiczakiem i komórkami mezenchymalnymi, aby zbadać wpływ leków przeciwnowotworowych na wzrost, inwazję i angiogenezę guza.

Opracowanie modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka mnogiego u kurcząt w celu zbadania wzrostu, inwazji i angiogenezy guza

Ten manuskrypt opisuje rozwój modelu zwierzęcego, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na przerzuty i rozszyfrowywanie mechanizmów jego działania. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na mięsaku Ewinga, podobne podejście można zastosować do innych typów nowotworów.

In vivo (in vivo) Model do badania wpływu hipoksji na przerzuty nowotworu

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Obecny protokół opisuje wstrzykiwanie komórek do kostniakomięsaka kości piszczelowej w celu wygenerowania modeli myszy z ortotopowym kostniakomięsakiem i przerzutami do płuc.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Tutaj opisujemy protokół rozwoju modelu ksenoprzeszczepu błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) dla ludzkiej tkanki jajnika i demonstrujemy skuteczność tej techniki, ramy czasowe rewaskularyzacji przeszczepu oraz żywotność tkanki w ciągu 6-dniowego okresu szczepienia.

Model błony moczowo-omoczniowej kurcząt (CAM) jako narzędzie do badania przeszczepu tkanki jajnika

Obecny protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) przy użyciu ludzkiej tkanki kostniakomięsaka.

Opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z tkankami ludzkiego kostniakomięsaka

Protokół ten opisuje ksenoprzeszczep in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, który występuje 4 dni po wstrzyknięciu.

In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)

Poznaj test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka do badania dynamiki wzrostu nowotworu i interakcji z gospodarzem. Ta metoda umożliwia analizę proliferacji, inwazji i rewaskularyzacji bez zgody komisji etycznej.

Test CAM in ovo jako model ksenoprzeszczepu mięsaka

Przeglądaj więcej filmów