Name: Metody wykonywania krzyżówek w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Naucz się metody krzyżowania Setaria viridis przy użyciu zabiegu gorącą wodą do eliminacji pyłku. Technika ta ułatwia kontrolowane zapylenie i odzysk nasion w warunkach laboratoryjnych, przyspieszając badania genetyczne traw.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sankalpi Warnasooriya i Amy Humboldt za krytyczne przeczytanie i redakcję rękopisu. Prace te były wspierane przez granty z Departamentu Energii (DE-SC0008769) i Narodowej Fundacji Nauki (IOS-1127017).

1. Wzrost S. viridis
<ol>
	<li>Ustaw warunki w komorze wzrostowej na 31 °C/22 °C (dzień/noc), 12 godzin światła/12 godzin ciemności, 50% wilgotności względnej z obróbką przed świtem 15 °C od 8:30 do 9:00. (Rysunek 1). W tych warunkach S. viridis A10.1 potrzebuje około 21-22 dni od wysiewu nasion do wykwitania.</li>
	<li>Wypełnij mieszkania (4 x 9 komórek) Metro Mix 360 i wyjmij jedną komórkę do podlewania.</li>
	<li>Lekko spryskaj wodą powierzchnię gleby.</li>
	<li>Wysiewaj nasiona na powierzchni gleby, po jednym nasionie na komórkę.</li>
	<li>Przykryj nasiona warstwą ziemi (około 0,5 cm)</li>
	<li>Zamgładź powierzchnię gleby i wody od dołu. Podlewaj od dołu po wysianiu nasion.</li>
	<li>Dla każdej krzyżówki, która zostanie wykonana, co najmniej trzy rośliny zostaną użyte jako rodzice płci żeńskiej, a dziewięć roślin zostanie użytych jako rodzice płci męskiej. Wysiew nasion należy rozłożyć w czasie, ponieważ nie wszystkie rośliny zakwitną tego samego dnia. Zaleca się wysiew nasion codziennie przez trzy dni.</li>
	<li>Podlewaj rośliny 1-2 razy dziennie, co zależy od wielkości roślin i stanu gleby. Nadmiar wody w glebie nie sprzyja optymalnemu wzrostowi roślin i może prowadzić do rozwoju grzybów w glebie i uszkodzenia tkanki liści.</li>
	<li>Rośliny nawozić dwa razy w tygodniu, używając Jack's 15-16-17 w stężeniu 100 ppm.</li>
</ol>
2. Przycinanie i opisywanie wiechy przed kastracją - Dzień 1
<ol>
	<li>Po południu lub wieczorem przed zapyleniem przenieś rośliny z komory wzrostowej do laboratorium (temperatura (T): 24,06 °C± 0,13 °C, wilgotność względna (RH) 21,79% ± 1,15%).</li>
	<li>Wybierz główne wiechy, które mają od 1 kwiatu do 1/3 kwiatów na wiechy, które już zakwitły.</li>
	<li>W tym badaniu cztery domeny w wiechy są zdefiniowane w następujący sposób (ryc. 2A; wierzchołek, dystalny środek, bliższy środek i podstawa).</li>
	<li>Najlepiej wybrać wiechę z 1-5 kwitnącymi kwiatami, odciąć czubek wiechy (dystalny koniec) i usunąć wszystkie kwiaty w bliższej części środkowej i podstawowej za pomocą wiosennych nożyczek lub cienkich kleszczy.</li>
	<li>Jeśli wiecha ma około 1/10 do 1/5 kwitnących kwiatów, odetnij końcówkę i przytnij kwiaty od podstawy wiechy, zachowaj tylko dolną część dystalnej środkowej części i górną część bliższego środka do dalszego przycinania.</li>
	<li>Jeśli wiecha ma około 1/4 do 1/2 kwitnących kwiatów, odetnij dystalną środkową część i zachowaj tylko bliższą środkową część do dalszego przycinania.</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby lekko przyciąć włosie.</li>
	<li>Usuń wszystkie kwiaty, które zakwitły i wszystkie niedojrzałe kwiaty, pozostawiając około 20-30 kwiatów/wiechy, które są równomiernie rozmieszczone w regionie (ryc. 3). Zachowaj ostrożność, aby zachować włosie w regionie, który będzie zapylany, aby chronić różyczki przed możliwymi uszkodzeniami cieplnymi. Dla każdego kłoska zachowaj górną, najbardziej dojrzałą różyczkę. Najwyżej położona różyczka będzie miała większe prawdopodobieństwo wystąpienia anozy w momencie zapylenia (ryc. 2B).</li>
	<li>Zaznacz jedną stronę każdego kwiatu czerwonym markerem permanentnym i zapisz liczbę różyczek na wiechy (ryc. 2B).</li>
	<li>Oznacz wiechę następującymi informacjami: datą kastracji, czasem trwania i temperaturą, w której przeprowadza się kastrację.</li>
	<li>Po przycięciu wiechy usuń wszystkie krzewy z każdej rośliny, aby zapewnić realokację większej ilości zasobów na rozwój głównej wiechy.</li>
</ol>
3. Kastracja z zanurzeniem w ciepłej wodzie - Dzień 1
<ol>
	<li>Ustawić łaźnię wodną na 48 °C ± 0,1 °C do obróbki cieplnej.</li>
	<li>Delikatnie zegnij przycięte wiechy i zanurz je w ciepłej wodzie o temperaturze 48 °C na 3-6 minut. Zachowaj ostrożność, aby nie złamać łodygi wiechy.</li>
	<li>Jednorazowo można zanurzyć w sobie około 3-4 wiech, zachowując wystarczającą przestrzeń między wiechami dla równomiernego rozprowadzenia ciepła. Podczas obróbki cieplnej konieczne jest zanurzenie całej wiechy w ciepłej wodzie. Liść flagowy (liść podchodzący do wiechy, który dostarcza składniki odżywcze do wiechy) nie powinien mieć kontaktu z ciepłą wodą, aby zapobiec uszkodzeniom cieplnym tkanki liścia.</li>
	<li>Gdy kastracja zostanie wykonana przez żądany czas, usuń wiechy z łaźni wodnej i delikatnie strząśnij wodę z wiechy.</li>
	<li>Umieść spersonalizowaną torbę na chleb z mikroperforacją, aby całkowicie zakryć wykastrowaną wiechę i zabezpiecz ją opaską zaciskową. Torebki na chleb z mikroperforacją można dostosować do wielkości wiechy (dołącz do wideo).</li>
	<li>Umieść rośliny z powrotem w komorze wzrostowej do następnego dnia.</li>
</ol>
4. Krzyżowanie/zapylanie po kastracji - Dzień 2 i Dzień 3
<ol>
	<li>O godzinie 9:00 w dniu 2 i 3 przenieś rodziców płci żeńskiej (wykastrowanej) i męskiej z komory wzrostowej do laboratorium (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) w celu wykonania krzyżówek.</li>
	<li>Obserwuj i dodaj kolejną czerwoną kropkę do kwiatów, które zakwitły lub kwitną, za pomocą czerwonego markera permanentnego. Zapisz całkowitą liczbę kwitnących kwiatów na wiechę.</li>
	<li>Zapisz datę zapylenia i imię męskiego rodzica na etykiecie, aby śledzić, jakie krzyżówki są wykonywane.</li>
	<li>Obserwuj szczytowy czas antynezy u rodziców płci męskiej. W warunkach panujących w naszej komorze (ryc. 1) kwiaty na wiechach samca rodzica zaczynają się synchronicznie otwierać około godziny 10:10. Od momentu otwarcia kwiatów całkowite wyciśnięcie pylników i uwolnienie pyłku nastąpi po 20 minutach.</li>
	<li>Idealnym etapem zapylania jest etap, w którym uwalniany jest pyłek męskiego rodzica. Kwiaty zamykają się po 20 minutach od uwolnienia pyłku. Stąd czas trwania antezy wynosi około 40 minut od momentu otwarcia kwiatów. Kolor pyłku zmienia się z żółtawo-białego na brązowy w ciągu około 30 minut po zamknięciu kwiatu.</li>
	<li>Rozpocznij zapylanie natychmiast po wyświetleniu żółtawo-białych pylników na kwiatach męskiego rodzica. Zapylanie przeprowadza się w dniu 2 i dniu 3 przy użyciu jednej z trzech technik:
	<ol>
		<li>Zapylanie wiechy do wiechy: używając jednej oderwanej wiechy jako samca, delikatnie pocieraj wiechę razem z wykastrowaną wiechą, aby ułatwić zapylanie i wyrzuć wiechę męską, aby uniknąć zanieczyszczenia. Powtarzaj proces zapylania, aż każda wykastrowana wiecha zostanie zapylona przez 2-3 wiechy.</li>
		<li>Zapylanie od pylnika do stygmatu: za pomocą kleszczy wybierz kwiat, który kwitnie żółtawo-białymi pylnikami lub wybierz pylniki i fizycznie dotknij znamienia kwiatu na żeńskim rodzicu. Użyj jednego kwiatu od męskiego rodzica, aby zapylić jeden kwiat na wykastrowanej wiechy. Powtarzaj proces zapylania, aż każde znamię na wykastrowanej wiechy zostanie zapylone przez kilka (około 2-3) kwiatów/pylników. Noszenie przyłbicy powiększającej zapewni lepszą widoczność podczas zapylania.</li>
		<li>Pomiędzy zapyleniami różnych męskich rodziców, zanurz kleszcze w 95% etanolu, a następnie przetrzyj chusteczkami Kimwipes, aby uniknąć zanieczyszczenia z powodu przenoszenia pyłku między różnymi krzyżówkami.</li>
		<li>Wiązanie wiechy: Po wykastrowaniu wybierz 3-4 wiechy na męskim rodzicu, które zakwitną następnego dnia. Zwiąż je razem z wykastrowaną wiechą rodzica za pomocą opaski zaciskowej. Umieść wykastrowaną wiechę nieco poniżej wiechy męskiego rodzica. Umieść worek szklany na wiechach i zabezpiecz worek u podstawy spinaczem do papieru. Można to zakończyć w 2 dniu, gdy wiechy samca rodzica zaczną się budzić.</li>
		<li>W okresie kwitnienia, rano dnia 2 i dnia 3, strzepnąć lub potrząsnąć torebką szklaną, aby ułatwić zapylenie. Kontynuuj trzepanie lub potrząsanie wiechami co 15 minut przez cały czas trwania antezy rano (między 9:00 a 11:00). Usuń wiechy męskiego rodzica po zapyleniu i oznacz przeciwną stronę kwitnących kwiatów na wykastrowanej wiechy. Zapisz liczbę kwitnących kwiatów na wiechy każdej płci żeńskiej rodzica.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wykonaniu zapylenia umieść dostosowaną torbę na chleb z mikroperforacją, aby przykryć wiechę rodzica płci żeńskiej i zabezpieczyć u podstawy za pomocą opaski zaciskowej po zapyleniu do zbioru nasion.</li>
</ol>
5. Zbiór nasion
<ol>
	<li>Nasiona zbierać po 2 tygodniach (14-16 dniach) od dnia zapylenia. Umieść przywieszkę w tej samej torbie z nasionami. Nasiona, które mają czerwone oznaczenia po obu stronach, reprezentują nasiona, które powstały w wyniku kontrolowanej krzyżówki genetycznej. Oczekuje się, że będzie to potomstwo krzyżowe.</li>
	<li>Wyrzuć wszystkie nasiona bez czerwonych oznaczeń, ponieważ reprezentują one nasiona, które powstają z nowo rozwiniętych kwiatów po wykastrowaniu. Nasiona z czerwonymi znaczeniami tylko po jednej stronie będą prawdopodobnie reprezentować nasiona powstałe w wyniku samozapylenia, ponieważ nie kwitły w czasie, gdy przeprowadzano kontrolowane krzyżówki.</li>
	<li>Suszyć nasiona w temperaturze 30 °C przez 2 dni w suszarce do nasion. Suszone nasiona należy przechowywać w laboratorium (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) lub w komorze nasiennej (T: 4,0 °C ± 1,0 °C, wilgotność względna: 20% ± 1%).</li>
</ol>

<ol><li>Bennetzen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genome+sequence+of+the+model+plant+Setaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reference genome sequence of the model plant Setaria.</a> Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+foxtail+millet+%28Setaria+italica%29+provides+insights+into+grass+evolution+and+biofuel+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential.</a> Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).</li>
<li>Li, P., Brutnell, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setaria+viridis+and+Setaria+italica%2C+model+genetic+systems+for+the+Panicoid+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses.</a> J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).</li>
<li>Brutnell, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setaria+viridis%3A+a+model+for+C4+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis.</a> Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).</li>
<li>Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxtail+millet%3A+a+sequence-driven+grass+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Foxtail millet: a sequence-driven grass model system.</a> Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).</li>
<li>Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+artificial+hybridization+of+foxtail+millet+%5BSetaria+italica+%28L.%29+Beauv.%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.].</a> Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).</li>
<li>Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+in+the+Breeding+of+Millet+%28Setaria+Italica+%28L.%29+Beauv.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Agron.+J%22%5BJournal%5D)">Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.).</a> Agron. J. 27, 963-970 (1935).</li>
<li>Willweber-Kishimoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+relationships+in+the+genus+setaria%5BTitle%5D)+AND+%22Contributions+from+the+Biological+Laboratory%2C+Kyoto+University%22%5BJournal%5D)">Interspecific relationships in the genus setaria.</a> Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).</li>
<li>Chang, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+flowering+and+hybridization+technique+in+Setaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nungyeh-hsueh+Pao+%28Jour.+Agric.%29+Act.+Agric.+Sin%22%5BJournal%5D)">Studies on flowering and hybridization technique in Setaria.</a> Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).</li>
<li>Darmency, H., Pernes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+wild+Setaria+viridis+%28L.%29+Beauv.+to+improve+triazine+resistance+in+cultivated+S.+italica+%28L.%29+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization.</a> Weed Research. 25, 175-179 (1985).</li>
<li>Sakai, S., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+hybridization+of+Setaria+italica+by+hot+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Fac.+Agric.+Kagoshima+Univ%22%5BJournal%5D)">Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment.</a> Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).</li>
<li>Malm, N. R., Rachie, K. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMalm%2C+NR+%22Setaria+millets%3A+A+review+of+the+world+literature+S.B%22">Setaria millets: A review of the world literature S.B</a>. , University of Nebraska, Lincoln. 513-529 (1971).</li>
<li>Miyaji, Y., Samura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+atmospheric+humidity+on+flowering+and+pollination+in+Setaria+italica%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Fac.+Agric.+Kagoshima+Univ%22%5BJournal%5D)">The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica.</a> Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).</li>
<li>Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+RFLP-based+maps+of+foxtail+millet%2C+Setaria+italica+%28L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Beauv.+Theoret.+Appl.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.).</a> P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).</li>
<li>RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+in+Setaria+italica+%28Beauv.%29%2C+the+Italian+millet.+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Agr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I.</a> Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).</li>
<li>Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthesis+of+Millet%2C+Setaria+Italica+%28L.%29+Beauv%5BTitle%5D)+AND+%22Agron.+J%22%5BJournal%5D)">Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv.</a> Agron. J. 29, 845-853 (1937).</li>
<li>Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+for+inflorescence+variation+between+foxtail+and+green+millet+%28poaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae).</a> Genetics. 169, 1659-1672 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Znaczenie leczenia przed świtem
Aby uzyskać wysoką częstotliwość krzyżowania potomstwa, konieczne jest posiadanie wysoce synchronicznej antezy rodziców płci męskiej i żeńskiej. Początkowo zmienialiśmy reżimy temperatury i oświetlenia (31 °C/22 °C, dzień/noc) i używaliśmy akcesu S. viridis A10.1 do wszystkich zapyleń. W tych warunkach większość kwiatów otwiera się wcześnie rano, zanim temperatura wzrośnie do 31 °C, chociaż niektóre kwiaty otwierają się losowo między 8:00 a 20:00. Wcześniejsze badania nad S. italica wskazują, że pora dnia, miejsce i pora roku przyczyniają się do zmienności antezy 7,15,16. Siles i wsp.6 zauważyło, że antyka była związana z szybkimi zmianami temperatury i wilgotności, ale nie z niską temperaturą i wysoką wilgotnością, per se, jak stwierdzono w poprzednich badaniach 7,15. W związku z tym zastosowaliśmy leczenie zimnem przed świtem w temperaturze 15 °C przez 30 minut (od 8:30 do 9:00), aby naśladować naturalne warunki przed świtem. To leczenie zimnem przed świtem pomogło w synchronizacji antydezy u rodziców. Zaobserwowaliśmy, że pomimo ustawienia wilgotności względnej na poziomie 50%, wilgotność względna wewnątrz komory wzrosła do poziomu powyżej 70%, gdy temperatura spadła z 22 °C do 15 °C i utrzymywała się powyżej 70%, aż temperatura stopniowo wzrosła do 31 °C po godzinie 9:30. O godzinie 9:00 do laboratorium przynoszone są wykastrowane samice i rośliny męskiego rodzica (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%). Kwiaty męskich rodziców zaczynają się otwierać około godziny 10:10, a zapylanie można przeprowadzić w godzinach 10:30-11:00. Szczegółowy wykaz wszystkich odczynników i sprzętu znajduje się w tabeli 2.
Znaczenie przygotowania wiechy do kastracji
W warunkach komorowych w tym badaniu (ryc. 1) czas trwania pierwotnego kwitnienia wiechy wynosił od 2 do 3 dni. Zazwyczaj kwiaty znajdujące się na dystalnym środku kwiatostanu (ryc. 2A) otwierają się jako pierwsze, a otwarcie poprzedza proksymalnie i dystalnie. Idealna liczba kwiatów, które należy zatrzymać na wiechy, to 20-30. Należy zachować ostrożność podczas usuwania niedojrzałych kwiatów, aby zachować tylko dobrze rozwinięte kwiaty (najwyższy kwiat lub największy na kłosie 17). Etykietowanie czerwonym markerem po obu stronach kwiatów pomaga skutecznie odróżnić domniemane potomstwo krzyżowe od nasion z nowo powstałych kwiatów po wykastrowaniu. Ponadto ważne jest, aby przed wykastrowaniem pozostawić włosie na wiechach, aby chronić różyczki przed rozległymi uszkodzeniami cieplnymi; jednak opcjonalnie można je usunąć po wykastrowaniu za pomocą nożyczek sprężynowych, aby ułatwić zapylanie, zwłaszcza gdy stosowana jest technika wiązania wiechy (ryc. 2C i 2D).
Zoptymalizowana temperatura i czas trwania zabiegu do uzdatniania ciepłej wody
Podstawą kastracji poprzez zanurzanie w ciepłej wodzie jest to, że pyłek jest bardziej wrażliwy na ciepło niż powierzchnia stygmatyczna. Jednak czas trwania i temperatura obróbki cieplnej mogą się różnić w zależności od gatunku Setaria i akcesji. Ogólnie rzecz biorąc, wyższa temperatura przy krótszym czasie leczenia lub niższa temperatura przy dłuższym czasie leczenia będzie miała taki sam wpływ na kastrację. Doniesiono, że obróbka cieplna w temperaturze 42 °C przez 20 min 10 lub 47 °C przez 10 min 14 spowodowała, że pyłek S. italica stał się niezdolny do życia, ale skuteczność tych zabiegów nie została określona. Opracowaliśmy nasz protokół, opierając się na hipotezie, że w zoptymalizowanej temperaturze i czasie trwania zabiegu pyłek wszystkich kwiatów zatrzymanych na rodzicu płci żeńskiej będzie nieżywotny, podczas gdy znamiona pozostaną podatne. Jednak po porównaniu i przeanalizowaniu wpływu kilku temperatur i okresów zapylania (tabela 1) stwierdziliśmy, że wrażliwość na obróbkę cieplną różni się wśród kwiatów zatrzymanych na każdej wiechy, dlatego trudno jest całkowicie wyeliminować nasiona powstałe w wyniku samozapylenia. Wnioskujemy, że efektywność produkcji potomstwa krzyżowego jest największa, gdy zabiegi wykonuje się w temperaturze 48 °C przez 3-6 minut w akcesji S. viridis A10.1.
Szczytowy czas antezy i zapylenia krzyżowego
Kiedy kwiaty osiągają dojrzałość i mają się otworzyć, pylniki są żółtawobiałe, a pyłek jest zrzucany, gdy tylko pylniki wydostaną się z kwiatów 8. Pylniki stopniowo brązowieją po zrzuceniu pyłku, gdy kwiaty zaczynają się zamykać. Po uwolnieniu żywotność pyłku jest nieznana. Dlatego tak ważne jest, aby jak najszybciej użyć pyłku z otwierających się lub świeżo otwartych kwiatów na męskim rodzicu. W naszych warunkach komorowych (ryc. 1) większość kwiatów męskich rodziców zaczyna się otwierać o godz. 10:10, a otwarte kwiaty wyrzucają pyłek o godz. 10:30. Tak więc pożądane okno do wykonania zapylenia to okres od 10:30 do 11:00. Znamiona pozostają na zewnątrz łusek po zamknięciu kwiatów i mogą być podatne na pyłek. Zostało to wcześniej zaobserwowane i potwierdzone u S. italica , że znamiona są otwarte przez około 48 godzin po otwarciu przez Siles i wsp.6, dlatego ważne jest, aby workować wiechy po obróbce cieplnej i po wykonaniu kontrolowanych krzyżówek. Jak wspomniano powyżej, zalecamy wykonywanie zapylania zarówno w dniu 2, jak i w dniu 3 po kastracji.
Metody zapylania
Porównaliśmy skuteczność trzech technik zapylania. Jeśli kwitnące kwiaty nie są ograniczające, zapylanie wiechy jest najbardziej efektywną techniką i daje większą liczbę potomstwa krzyżowego. Jeśli kwitnące wiechy są ograniczone, wyższa częstotliwość krzyżowania potomstwa będzie wytwarzana, gdy stosowana jest metoda pylnika do znamienia. Udało nam się uzyskać potomstwo krzyżowe z obu metod. Metoda "wiązania wiech" została użyta przy krzyżowaniu S. italica 6 , ale stwierdziliśmy, że ta metoda jest najmniej wydajna, ponieważ okno czasowe na wydalanie pyłku przez męskiego rodzica jest krótkie. Co więcej, kontrola nad zapylaniem jest mniejsza, a włosie wiech S. viridis może również utrudniać przemieszczanie się pyłku na powierzchnię stygmatyczną.
Zbiór, suszenie i przechowywanie nasion
Po zbiorach nasiona należy suszyć w temperaturze 30-33 °C przez 2 dni. W razie potrzeby anecium należy usunąć w celu barwienia GUS. Nasiona powinny być przechowywane w suchym, chłodnym miejscu (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) do krótkotrwałego przechowywania (mniej niż dwa lata) lub w komorze nasiennej (T: 4,0-10 °C ± 1,0 °C, wilgotność względna: 20% ± 1%) do długotrwałego przechowywania. Złe warunki przechowywania mogą skutkować niskimi wskaźnikami żywotności 8. Zaobserwowaliśmy, że zdolność kiełkowania S. viridis A10.1 wynosi około 5% po wysiewie 4 dni po zbiorach, ale może zostać zwiększona do 90-96% po przechowywaniu w laboratorium (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) przez 110 dni po zbiorach, a następnie trzydniowa stratyfikacja w temperaturze -80 °C w celu przerwania spoczynku nasion. W celu rozwarstwienia w temperaturze -80 °C suche nasiona można umieścić w hermetycznym pojemniku (np. probówce do mikrowirówki lub kopercie na monety w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie) i przechowywać w temperaturze -80 °C przez 3 dni przed sadzeniem. Po 16 miesiącach przechowywania w laboratorium (T: 24,06 °C ± 0,13 °C, wilgotność względna: 21,79% ± 1,15%) nadal można uzyskać procent kiełkowania 90-95%. Ponadto, aby przerwać spoczynek, nasiona można suszyć w temperaturze 30-33 °C przez 2 dni po zbiorach, a następnie poddać trzydniowej stratyfikacji w temperaturze -80 °C, a następnie usunąć antechium przed sadzeniem. Po tych zabiegach można osiągnąć zdolność kiełkowania nasion do 33%.
Zalety, ograniczenia i możliwe modyfikacje
Tutaj przedstawiamy pierwszy standardowy protokół wykonywania krzyżówek w S. viridis A10.1 przy użyciu obróbki cieplnej w celu kastracji. W przeciwieństwie do kastracji fizycznej, protokół ten jest mniej inwazyjny i stosunkowo łatwy do ustalenia w laboratorium. Zwykle przycinanie jednej wiechy zajmuje około 15 minut, a około 15 wiech można przyciąć i skrzyżować na osobę/dzień. Zakładając, że w zoptymalizowanych warunkach można odzyskać średnio 3-5 potomstwa/wiechy krzyżowej, jedna osoba może wyprodukować łącznie 45-75 potomstwa krzyżówkowego w ciągu jednego dnia. Co więcej, technika ta może być stosowana do krzyżówek z innymi gatunkami Setaria , choć prawdopodobne będą dodatkowe optymalizacje. Jeśli przestrzeń komory wzrostu jest ograniczona, rośliny można uprawiać w szklarniach lub komorach wzrostowych bez zabiegu przed świtem, aż do pojawienia się wiechy, zanim zostaną przeniesione do zoptymalizowanych warunków komory.

S. viridis to trawa NADP-ME podtypC 4 ściśle spokrewniona z proso bioenergetyczne (podtyp NAD-ME), proso wyczyniec polowy i trawa gwinejka rolnicza 5. Genom o długości 510 Mb hodowlanej formy Setaria, S. italica, został niedawno zsekwencjonowany 1,2, a sekwencja genomu o 25-krotnym pokryciu chwastów, S. viridis, jest w toku (nieopublikowana). S. viridis ma wiele cech, które sprawiają, że jest to potencjalnie doskonały modelowy system genetyczny, w tym szybki czas generacji, niski wzrost, proste wymagania dotyczące wzrostu i płodna produkcja nasion 3. Co ważne, w ostatnim czasie opracowano metody zarówno przejściowej, jak i stabilnej transformacji S. viridis, które dają możliwość tworzenia roślin transgenicznych 4. Jednak głównym wąskim gardłem w rozwoju narzędzi genetycznych dla S. viridis jest jego oporność na krzyżowanie. Do tej pory nie opublikowano żadnego standardowego protokołu, który pozwoliłby na szybką produkcję nasion z kontrolowanych krzyżówek.
Krzyżówki genetyczne u S. italica są zazwyczaj wykonywane przez kastrację poprzez usunięcie pylników z kwiatów 6,7,8 lub poprzez obróbkę cieplną kwiatów żeńskich rodziców 9-11. Po tych zabiegach pylniki lub wiechy z nietraktowanych kwiatów/męskich rodziców są delikatnie ścierane w celu uzyskania znamion uwalniających pyłek. W przypadku kastracji pylniki usuwa się za pomocą drobnych kleszczy natychmiast po otwarciu różyczki, a pylnik zaczyna się rozwijać, ale jeszcze nie zrzucił pyłku 6-8. Jednym z wyzwań związanych z tą ostatnią metodą jest trudność w wykonaniu kastracji w wąskim odstępie czasu między otwarciem a zrzuceniem pyłku kwiatu. Czas otwierania i zamykania pojedynczego kwiatu będzie się różnić w zależności od akcesji i warunków środowiskowych i może wynosić od 7 min 6 do 2,5 godz. 12 w S. italica. Ponieważ zrzucanie pyłku następuje w miarę wyrastania pylników z różyczki, pylniki należy usuwać ostrożnie i szybko, a zatem trudno jest uniknąć zanieczyszczenia z powodu samozapylenia. Ponadto, ponieważ zapylanie odbywa się natychmiast po kastracji, liczba krzyżówek, które można wykonać na osobę/dziennie, jest ograniczona.
Jako alternatywna metoda, dojrzałe wiechy mogą być zanurzone w ciepłej wodzie, aby zabić ciepło rozwijające się ziarna pyłku 9,10,13,14 z korzyścią wykonywania krzyżówek na dużej liczbie wiech. Jednak temperatura i czas trwania obróbki cieplnej różnią się znacznie w zależności od różnych doświadczeń (np. 47 °C przez 10 min 14 i 42 °C przez 20 min 10). Ponadto nie opublikowano systematycznych analiz dotyczących skuteczności kastracji za pośrednictwem ciepła. W związku z tym standardowa i prosta metoda przeprowadzania krzyżówek genetycznych u S. viridis znacznie przyspieszyłaby rozwój zasobów genetycznych i ustanowienie S. viridis jako systemu modelowego w społeczności naukowej.
Informujemy o rozwoju i optymalizacji standardowego protokołu do przeprowadzania krzyżówek genetycznych u S. viridis. Rośliny są uprawiane w kontrolowanym środowisku, aby zsynchronizować rozwój kwiatów i zwiększyć powtarzalność zabiegu. Krzyżówki są wykonywane przy użyciu transgenicznej linii S. viridis jako męskiego rodzica zawierającego gen reporterowy GUS 4, aby ułatwić identyfikację udanych kontrolowanych krzyżówek genetycznych. Transgen GUS jest napędzany przez promotor ubikwityny w ryżu, który umożliwia punktację nasion F1 natychmiast po zbiorach, a tym samym zapewnia łatwy test jakościowy w celu określenia skuteczności kastracji i zapylania. Zastosowaliśmy prostą obróbkę cieplną ciepłą wodą w celu wykastrowania, której towarzyszy etykietowanie kwiatów, które zostały wykastrowane w celu wyeliminowania nasion powstałych z nowo powstałych kwiatów po wykastrowaniu. Po przetestowaniu serii obróbki cieplnej w dopuszczalnych temperaturach i zmianie czasu zanurzania w ciepłej wodzie, ustaliliśmy optymalną temperaturę i czas trwania 48 °C od 3 do 6 minut. Stwierdzono, że leczenie zimnem przed świtem sprzyja synchronicznej antezie u obojga rodziców, aby ułatwić zapylenie krzyżowe. Omówiliśmy również kluczowe kroki w protokole i przyszłe zastosowanie tej metody do innych akcesji Setarii.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki, sprężyna</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>14126</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, Dumostar Biology Polerowane</td><td>SPI Materiały</td> Nożyczki chirurgiczne <td>TD5BP-XD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>14005-12</td><td></td></tr><tr><td>Europack Przezroczyste polipropylenowe mikroperforowane chrupiące torby na chleb 6 "x28"</td><td><a href="http://www.pjpmarketplace.com" target="_blank">http://www.pjpmarketplace.com</a></td><td>361001</td><td></td></tr><tr><td>Flats</td><td>T.O. Plastics</td><td>715401C</td><td></td></tr><tr><td>metro mix 360</td><td>Hommert International</td><td>10-0356-1</td><td></td></tr><tr><td>Jack's 15-16-17</td><td>Hommert International</td><td>07-5925-1</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR International</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Markery permanentne Sharpie Ultra Fine Point, czerwone</td><td>zszywki</td><td>37002</td><td></td></tr><tr><td>Lupa pałąkowa Donegan DA-10 OptiVisor, powiększenie 3,5x, ogniskowa 4"</td><td>Amazon</td><td>DA-10, B0015IP380</td><td></td></tr><tr><td>12 "24/7 Opakowanie Ręczna zgrzewarka impulsowa Zgrzewarka Poly Sealing Free Element Grip </td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr>kąpiel<td>wodna</td> Model <td>naukowy VWR</td><td>: 1166</td><td></td></tr><tr><td>Komora do uprawy roślin</td><td>Conviron</td><td>BDW 40</td><td></td></tr></tbody></table>

metody wykonywania krzyżówek w setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Setaria viridis to wyłaniający się system modelowy dla traw C4. Jest ściśle spokrewniony z bioenergetycznym materiałem paszowym proso rózgowatym i prosem zbożowym, wyczyniec polowy. Ostatnio genom o długości 510 Mb prosa wyczynowego, S. italica, został zsekwencjonowany 1,2, a sekwencja genomu o 25-krotnym pokryciu chwastów jest w toku. S. viridis ma szereg cech, które sprawiają, że jest to potencjalnie doskonały modelowy system genetyczny, w tym szybki czas generacji, niski wzrost, proste wymagania dotyczące wzrostu, płodna produkcja nasion 3 oraz rozwinięte systemy zarówno przejściowej, jak i stabilnej transformacji4. Jednak genetyka S. viridis jest w dużej mierze niezbadana, częściowo z powodu braku szczegółowych metod wykonywania krzyżówek. Do tej pory nie przyjęto żadnego standardowego protokołu, który pozwoliłby na szybką produkcję nasion z kontrolowanych krzyżówek.
Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany do przeprowadzania krzyżówek genetycznych u S. viridis, akces A10.1. Zastosowaliśmy prostą obróbkę cieplną ciepłą wodą w celu wykastrowania po przycięciu wiechy, aby zachować 20-30 różyczek i etykietowaniu kwiatów, aby wyeliminować nasiona powstałe z nowo rozwiniętych kwiatów po wykastrowaniu. Po przetestowaniu serii obróbki cieplnej w dopuszczalnych temperaturach i zróżnicowaniu czasu zanurzania, ustaliliśmy optymalny zakres temperatur i czasu 48 °C przez 3-6 minut. Dzięki tej metodzie jeden pracownik może wykonać co najmniej 15 krzyżówek dziennie i odzyskać średnio 3-5 potomstwa krzyżówek na wiechę. W związku z tym jedna osoba może wyprodukować średnio 45-75 potomstwa krzyżowego w ciągu jednego dnia. Szerokie zastosowanie tej techniki ułatwi rozwój rekombinowanych populacji linii wsobnych S. viridis X, S. viridis lub S. viridis X S. italica, mapowanie mutacji poprzez masową analizę segregantów i tworzenie mutantów wyższego rzędu do analizy genetycznej.

W niniejszym badaniu jako rodzica żeńskiego wykorzystano zsekwencjonowany dostęp S. viridis A10.1, a jako rodzica męskiego we wszystkich zapyleniach wykorzystano transgeniczną linię S. viridis (również A10.1) zawierającą gen reporterowy GUS4. W celu synchronizacji kwitnienia zastosowano zoptymalizowany reżim wzrostu, zgodnie z Rysunkiem 1. Przetestowano kilka kombinacji temperatury i czasu obróbki termicznej w celu przeprowadzenia wykastrowania, obserwując, że około 40-80% kwiatów pozostających na wykastrowanym wiechozakładzie rozkwitało w 2nd dniu, natomiast pozostałe zakwitły w 3rd dniu (Rysunek 2). Jednakże, jeśli obróbka termiczna była zbyt intensywna, na przykład 49 °C przez 4 min, w 2nd dniu zakwitło bardzo mało kwiatów lub nie zakwitł żaden. Zapylenie krzyżowe przeprowadzano w 2nd lub 3rd dniu po wykastrowaniu, w zależności od szczytowego czasu antytezy rodziców męskich.
Zaobserwowano, że młode kwiaty nadal rozwijały się po wykastrowaniu, dojrzewały i ulegały samopyleniu 3-6 dni po zapyleniach kontrolowanych. Po 7-10 dniach od zapylenia na panicle widoczne są białe kwiaty. Kwiaty te pozostają niezapylone z powodu uszkodzeń termicznych lub nieudanego zapylenia. Jednocześnie kwiaty, które zostały skutecznie zapylone, zaczynają wytwarzać ciemne nasiona i ulegają rozpadaniu po 14 dniach. Ciemne nasiona z czerwonymi oznaczeniami, zebrane w 14tym dniu po zapyleniu, można było wyraźnie odróżnić od nasion bez czerwonych oznaczeń, które wciąż były zielone i nie ulegały rozpadaniu. W przypadku opóźnienia zbioru, anthecium nasion z czerwonymi oznaczeniami oraz bez nich staje się ciemne, co utrudnia szybkie odróżnienie nasion z czerwonymi oznaczeniami w zebranych próbkach.
W celu optymalizacji protokołu krzyżowania przeprowadzono kilka eksperymentów z obróbką termiczną, których podsumowanie znajduje się w Tabeli 1. Z różnych eksperymentów z obróbką termiczną odzyskano średnio 0-10 nasion na wierzchołek. Po zbiorach nasion suszono w suszarce do nasion w temperaturze 30 °C przez 2 dni, a następnie usunięto antykium za pomocą urządzenia do usuwania antykium. Po usunięciu antykium prawdopodobne nasiona F1 zabarwiono roztworem do barwienia GUS; potomstwo z krzyżowań zewnętrznych przybrało niebieski kolor w ciągu 1-2 h (Rysunek 2F). Na podstawie tych wyników zalecamy obróbkę termiczną w temperaturze 48 °C przez 3-6 min. Ponadto zalecamy przeprowadzanie krzyżowań zarówno w 2., jak i 3. dniu po emaskulacji.
Aby zbadać skuteczność tej techniki w przeprowadzaniu krzyżówek z innymi akcesjami lub gatunkami Setaria, wykonano krzyżówki pomiędzy S. viridis A10.1 a ośmioma zróżnicowanymi akcesjami S. viridis oraz jedną akcesją S. pumila. Chociaż czas do kwitnienia różnił się w zależności od akcesji, stwierdzono, że kwiaty wszystkich ośmiu akcesji S. viridis i jednej akcesji S. pumila zaczynają otwierać się między godziną 10:00 a 11:00, z szczytem otwarcia w godzinach 10:20-11:00 po zastosowaniu przedświtowej obróbki chłodniczej. Wskazuje to, że przedświtową obróbkę chłodniczą można stosować u zróżnicowanych akcesji Setaria. Do emaskulacji S. viridis A10.1, która służyła jako rodzic żeński we wszystkich wykonanych krzyżówkach, zastosowano obróbkę termiczną w temperaturze 48 °C przez 5-6 min. Odzyskano od 1 do 12 nasion z krzyżówek pomiędzy A10.1 a trzema zróżnicowanymi akcesjami S. viridis oraz sześć nasion z pojedynczej krzyżówki pomiędzy S. viridis A10.1 a jedną akcesją S. pumila . Jednak w tej chwili nie ustalono, czy nasiona te były wynikiem udanego krzyżowania próbnego, czy też efektem samozapylenia. Niemniej jednak wstępne wyniki sugerują, że warunki wzrostu zastosowane dla S. viridis A10.1 mogą być wykorzystane do generowania krzyżówek z różnymi akcesjami S. viridis, a być może także z innymi gatunkami Setaria.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Temp. obróbki termicznej (°C)</td >
			<td >Czas obróbki termicznej (min)</td >
			<td >Liczba krzyżówek</td >
			<td >Śr. liczba kwiatów po przycinaniu</td >
			<td >Dzień zapylania (dzień po ewmaskulacji)</td >
			<td >Śr. liczba nasion (czerwonych)/wichrzy (średnia)</td >
			<td >Śr. % Gus (+)/nasion (czerwonych)</td >
			<td >Śr. liczba nasion hybrydowych (Gus+)</td >
			<td >Min. liczba nasion hybrydowych</td >
			<td >Max. liczba nasion hybrydowych</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >47</td >
			<td >10</td >
			<td >2</td >
			<td >27</td >
			<td >2. dzień</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >48</td >
			<td >3</td >
			<td >3</td >
			<td >36</td >
			<td >2. dzień</td >
			<td >5</td >
			<td >60</td >
			<td >3</td >
			<td >1</td >
			<td >5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >4</td >
			<td >3</td >
			<td >25</td >
			<td >3. dzień</td >
			<td >10</td >
			<td >50</td >
			<td >5</td >
			<td >3</td >
			<td >7</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >5</td >
			<td >8</td >
			<td >25</td >
			<td >2. dzień</td >
			<td >5</td >
			<td >60</td >
			<td >3</td >
			<td >1</td >
			<td >6</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >6</td >
			<td >3</td >
			<td >25</td >
			<td >2. dzień</td >
			<td >4</td >
			<td >75</td >
			<td >3</td >
			<td >0</td >
			<td >4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >7</td >
			<td >4</td >
			<td >24</td >
			<td >2. dzień</td >
			<td >3</td >
			<td >33</td >
			<td >1</td >
			<td >0</td >
			<td >4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >7</td >
			<td >1</td >
			<td >25</td >
			<td >3. dzień</td >
			<td >4</td >
			<td >75</td >
			<td >3</td >
			<td >N/D</td >
			<td >N/D</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >49</td >
			<td >1</td >
			<td >3</td >
			<td >23</td >
			<td >2. dzień</td >
			<td >5</td >
			<td >25</td >
			<td >1</td >
			<td >0</td >
			<td >2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >2</td >
			<td >7</td >
			<td >26</td >
			<td >2. dzień</td >
			<td >8</td >
			<td >25</td >
			<td >2</td >
			<td >0</td >
			<td >4</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >3</td >
			<td >5</td >
			<td >22</td >
			<td >2. dzień</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td > </td >
			<td >4</td >
			<td >4</td >
			<td >25</td >
			<td >2. dzień</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
			<td >0</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Optymalizacja obróbki termicznej dla emaskulacji. Wyniki zmiany temperatury oraz czasu obróbki termicznej. Zapylenia przeprowadzono jeden (2nd dzień) lub dwa dni (3rd dzień) po emaskulacji, a udane zapylenia krzyżowe oceniono za pomocą barwienia GUS
<img alt="Wykres harmonogramu temperatury i oświetlenia dla kwitnienia kwiatów i wykastrowania; RH: 70-80%." fo:content-src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1highres.jpg" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Zoptymalizowane warunki w komorze wzrostowej z przedświtową obróbką chłodniczą. Przedstawiono zakresy temperatur i okresy czasu zapewniające optymalny wzrost oraz synchronizację produkcji kwiatów. Zielone i czerwone strzałki wskazują odpowiednio optymalne okno czasowe dla przeprowadzania krzyżówek oraz wykastrowania.
<img alt="Schematy postępu antytezy; kłosy roślin z oznaczonymi sekcjami; kontrole eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/50527/50527fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Przygotowanie wiechy do krzyżowania i barwienie GUS potomstwa z krzyżowania zewnętrznego. (A) Wiecha Setaria viridis A10.1 przed przycięciem, wykazująca otwarcie około 1/10 kwiatów. Przedstawiono cztery sekcje oraz kierunek postępu antytezy wzdłuż wiechy. (B) Przycięta wiecha przed emaskulacją z zachowanymi szczecinkami. (C) Emaskulowana wiecha po usunięciu szczecinek. (D) Emaskulowana wiecha w 2. dniu po emaskulacji, wykazująca kwitnące kwiaty (zdjęcie wykonane o godzinie 10:30). (E) Kwitnąca wiecha rodzica męskiego (transgeniczna linia Setaria viridis A10.1 niosąca gen reporterowy β-glukuronidazy (GUS)) po zabiegu przed świtem (zdjęcie wykonane o godzinie 10:30). A–E, paski skali = 1 mm. (F) Prawdopodobne potomstwo z krzyżowania zewnętrznego po 2 h barwienia GUS, a następnie odbarwianiu w 70% (v/v) etanolu. Dwa nasiona po prawej stronie to odpowiednio kontrola negatywna i pozytywna.
<img alt="Schemat procesu przycinania wiech, emaskulacji termicznej, zapylania i zbioru nasion." src="/files/ftp_upload/50527/50527fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Schemat procedury Schematyczna reprezentacja głównych etapów przeprowadzania krzyżówek S. viridis.

Opracowaliśmy metodologię przeprowadzania krzyżówek w Setaria viridis (S. viridis). Metoda polega na przycięciu wiechy przed zabiegiem gorącej wody w celu zabicia żywotnego pyłku. Krzyżówki są wykonywane zgodnie z dobrze kontrolowanym reżimem wzrostu i zazwyczaj skutkują odzyskaniem od 1 do 7 nasion zapylonych krzyżowo na wiechę.

Metody wykonywania krzyżówek w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie sposobu przeprowadzania krzyżówek dla cter jako nowego systemu modelowego dla traw. Jest to osiągane poprzez uprzedni wybór, przycięcie i oznakowanie panikuli. Drugim krokiem jest emaskulacja przyciętej panikuli poprzez zanurzenie jej w kąpieli wodnej o temperaturze 48 °C.Następnie przycięty wierzchołek służy jako osobnik żeński do zapylenia przez wierzchołek uwalniający pyłek. Ostatnim krokiem jest zbiór nasion dwa tygodnie po zapyleniu krzyżowym. Ostatecznie, w celu wykazania skuteczności techniki, stosuje się barwienie Gus domniemanych nasion hybrydowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fizyczna emaskulacja, jest to, że jest ona mniej inwazyjna i stosunkowo łatwa do wdrożenia w laboratorium. Metoda ta pomoże przyspieszyć adaptację cter verus jako modelu genetycznego, ułatwiając przeprowadzanie krzyżówek. Aby zacząć, usuń jedną komórkę w celu podlewania, a następnie wypełnij tackę o wymiarach cztery na dziewięć komórek podłożem Metro Mix 360.Następnie lekko spryskaj komórki i wysiej nasiona na powierzchni gleby, umieszczając jedno nasiono w każdej komórce. Po tym przykryj nasiona warstwą gleby o grubości 0.5 centymetrów, spryskaj powierzchnię ziemi, aby je nawilżyć, a następnie podlej kasety od dołu. Kontynuuj podlewanie komórek od dołu jeden do dwóch razy dziennie po wysiewie nasion, dbając o to, aby nie przelać roślin.Ustaw warunki w komorze wzrostowej na 31°C w dzień i 22°C w nocy, z wstępną obróbką w temperaturze 15°C od godziny 8:30 do 9:00. Należy również zachować 12-godzinny cykl światła i ciemności oraz ustawić względną wilgotność na 50% w tych warunkach. Satter verus a 10.1 zakwitnie od 21 do 22 dni po wysiewie nasion. Optymalnie kastrację przeprowadza się po południu lub wieczorem.Wybierz główny kwiatostan na każdej roślinie, która ma od jednego do pięciu kwiatów w fazie kwitnienia. Następnie odetnij wierzchołek kwiatostanu i usuń wszystkie kwiaty w dolnej części sekcji środkowej proksymalnej oraz sekcji bazalnej, używając precyzyjnej pęsety. Jeśli roślina ma w kwitnieniu jedynie od jednej dziesiątej do jednej piątej kwiatów.Aby zachować dolną część dystalną, część środkową oraz górną część proksymalną środkową do dalszego przycinania, odetnij wierzchołek i usuń kwiaty z podstawy wiórka. Jeśli od jednej czwartej do jednej połowy kwiatów na wiórku jest w kwitnieniu, zachowaj proksymalną część środkową do dalszego przycinania i odetnij dystalną część środkową. Po odcięciu wiórka użyj nożyczek chirurgicznych, aby delikatnie przyciąć szczecinki.Należy zachować ostrogony w obszarze, który będzie zapylany, aby chronić kwiaty przed ewentualnym uszkodzeniem termicznym. W przypadku każdego kłoska należy pozostawić najwyższy dojrzały kwiat. Najwyższy kwiat będzie miał większą szansę na wystąpienie antytezy w momencie zapylania.Następnie usuń wszystkie kwiaty, które już zakwitły, oraz wszystkie niedojrzałe kwiaty, pozostawiając około 20 do 30 równomiernie rozmieszczonych kwiatów na każdym kwiatostanie. Następnie zaznacz jedną stronę każdego kwiatu czerwonym permanentnym markerem. Zapisz liczbę kwiatków w kwiatostanie i oznacz go następującymi informacjami: datą wykastrowania, czasem trwania zabiegu oraz temperaturą, w której przeprowadzono kastrację.Po przycięciu wiechy należy usunąć wszystkie pędy boczne każdej rośliny, aby zapewnić przekierowanie większej ilości zasobów na rozwój głównej wiechy. Na godzinę przed wykastrowaniem należy przygotować łaźnię wodną w temperaturze 48 °C do przeprowadzenia obróbki termicznej. Po rozgrzaniu wody należy delikatnie zgiąć przycięte wiechy i zanurzać je po trzy lub cztery sztuki jednocześnie w ciepłej wodzie przez okres od trzech do sześciu minut.Należy zachować ostrożność, aby nie złamać łodyżki pentakla. Liść flagowy, znajdujący się poniżej pentakla, nie powinien mieć kontaktu z ciepłą wodą. Ma to na celu zapobieganie uszkodzeniom termicznym tkanek liścia.Po przeprowadzeniu wykastrowania przez wymagany czas, należy wyjąć wiechy z łaźni wodnej i delikatnie strząsnąć z nich wodę. Następnie całkowicie przykryć wykastrowaną wiechę dostosowanym mikroperforowanym woreczkiem do pieczywa i zabezpieczyć go drucianą zawiązką. Mikroperforowane woreczki do pieczywa można dostosować do rozmiaru wiechy.Na koniec należy umieścić rośliny z powrotem w komorze wzrostowej do następnego dnia. O godzinie 9:00 w drugim i trzecim dniu należy przenieść wykastrowane rośliny żeńskie oraz niewykastrowane rośliny męskie z komory wzrostowej do laboratorium w celu wykonania krzyżówek, dokonania obserwacji i naniesienia kolejnej czerwonej kropki na kwiaty, które już zakwitły lub właśnie kwitną.Za pomocą czerwonego niezmywalnego markeru zapisz całkowitą liczbę rozwiniętych kwiatów na każdą wiązkę. Następnie zapisz datę zapylenia oraz nazwę rodzica męskiego na etykiecie, aby monitorować wykonane krzyżówki. Obserwując czas szczytu antytezy u rodziców męskich w warunkach laboratoryjnych, zauważono, że kwiaty na wiązkach rodzica męskiego zaczynają otwierać się synchronicznie około godziny 10:10. Po otwarciu, pełne wysunięcie pręcików i uwalnianie pyłku następuje po 20 minutach.Przystąp do zapylania niezwłocznie, gdy pręciki nabiorą żółtawego koloru. Białe pręciki są widoczne na kwiatach rodzica męskiego. Zapylanie przeprowadza się w drugim i trzecim dniu, stosując metodę zapylania panikla do panikla lub pręcika do znamienia.Używając jednego oddzielonego wiecha jako osobnika męskiego, delikatnie pocieraj go o wiecha poddany emaskulacji, aby ułatwić zapylenie, a następnie odrzuć wiech męski, aby uniknąć zanieczyszczenia; powtarzaj proces zapylania, aż każdy emaskulowany wiech zostanie zapylony przez dwa do trzech wiechów. Najskuteczniejszą metodą jest zapylanie z pręcika na znaczeń przy użyciu pęsety. Wybierz kwiat w fazie kwitnienia z żółtawo-białymi pręcikami lub pobierz pręciki i fizycznie dotknij nimi znaczenia kwiatu rośliny żeńskiej.Użyj jednego kwiatu od rodzica męskiego do zapylenia jednego kwiatu na wykastrowanym panicle pomiędzy zapyleniami od różnych rodziców męskich. Zanurz pęsetę w 95% etanolu, a następnie przetrzyj ją chusteczkami Kim wipes, aby uniknąć kontaminacji spowodowanej przeniesieniem pyłku między różnymi krzyżówkami. Po wykonaniu zapylenia przykryj panicle rodzica żeńskiego dostosowaną, mikroperforowaną torebką papierową i zabezpiecz ją u podstawy za pomocą opaski zaciskowej.Od momentu zapylenia do zbioru nasion, należy zebrać nasiona od 14 do 16 dni po dniu zapylenia i umieścić etykietę w tej samej kopercie co nasiona. Nasiona z czerwonymi oznaczeniami po obu stronach reprezentują nasiona powstałe w wyniku kontrolowanego krzyżowania genetycznego. Nasiona bez czerwonych oznaczeń należy odrzucić, ponieważ reprezentują one nasiona powstałe z nowo rozwiniętych kwiatów.Po wykastrowaniu nasion z czerwonymi oznaczeniami, tylko po jednej stronie prawdopodobnie będą znajdować się nasiona będące wynikiem samozapylenia. Na koniec suszyć nasiona w temperaturze 30 °C przez dwa dni. Przechowywać wysuszone nasiona w laboratorium lub najlepiej w komorze do przechowywania nasion.Gdy próbki będą gotowe do dalszej analizy, w razie potrzeby usuń fizy. Metody opisane w tym filmie są wynikiem licznych prób z zastosowaniem różnych temperatur i czasów obróbki w celu optymalizacji procesu emanukulacji. Sukces tego procesu mierzono liczbą uzyskanych nasion hybrydowych.Sześć nasion z jednego z krzyżowań testowych, w których rodzic męski posiadał gen reporterowy. Przedstawiono tutaj gen kodujący beta-glukuronidazę. Gen reporterowy powoduje zabarwienie nasion na niebiesko podczas barwienia, co ułatwia policzenie liczby nasion hybrydowych. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym przeprowadzeniu procedury, można skrzyżować do 15 pentakli dziennie.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania krzyżówek u Aria verus.

methods-for-performing-crosses-setaria-viridis-new-model-system-for

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Metody wykonywania skrzyżowań w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Imprinting jest zjawiskiem występującym w reprodukcji roślin i ssaków. Metylacja DNA odgrywa istotną rolę w mechanizmach imprintingu. Izolacja endospermy oraz określenie stanu metylacji genów podlegających imprintingowi u Arabidopsis mogą być trudne. W niniejszym protokole opisujemy, jak izolować endospermę i określać poziom metylacji za pomocą sekwencjonowania z bisulfitem.

Wyznaczanie metylacji DNA genów imprintowanych w endospermie Arabidopsis

Przedstawiamy tani i szybki protokół genotypowania molekularnego, który wykorzystuje specyficzne dla odmiany startery PCR celujące w różnice w sekwencji DNA w obrębie regionu spacerowego trnL-F chloroplastu, aby odróżnić odmiany Imperata cylindrica (trawa cogon), których nie można rozpoznać wyłącznie na podstawie morfologii. Odmiany te obejmują wpisaną na listę federalną roślinę inwazyjną, trawę cogon, oraz blisko spokrewnioną, powszechnie występującą odmianę ozdobną, I. cylindrica var.

Metoda genotypowania oparta na PCR do rozróżniania odmian dzikich i ozdobnych Imperata cylindrica

Celem jest zilustrowanie, że modelowa roślina strączkowa Medicago truncatula może być łatwo wykorzystana do zbadania regulacji wczesnej embriogenezy roślin, aby uzupełnić model rzodkiewnika nie-strączkowego. Morfologia strąków jest powiązana z etapami embriogenezy zygotycznej, a także opracowano protokół pobierania zarodków za pomocą hodowli tkankowej.

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Ten artykuł opisuje metody badania przesiewowego genów kontrolujących przepuszczalność plazmodalną, a tym samym gradient auksyny podczas odpowiedzi tropikalnej. Obejmuje to pomiar stopnia odpowiedzi tropikalnej u hipokotylu Arabidopsis thaliana i sprawdzenie przepuszczalności plazmodalnej przez obciążenie kwasem 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowym (HPTS) i wreszcie ocenę poziomu kalozy.

Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

Tutaj prezentujemy protokół oceny przeżywalności nasion, kiełkowania i spoczynku w warunkach polowych przy użyciu zakopanych, oznakowanych pasków nasion i testowania żywotności chlorku tetrazolu (TZ).

Wiarygodna metoda oceny kiełkowania, spoczynku i śmiertelności nasion w warunkach polowych

W tym protokole, metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek, są opisane dla mrówki Vollenhovia emeryi. Protokoły te są ważne dla eksperymentów mających na celu zrozumienie genetycznych podstaw systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych.

Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

Dostępny jest protokół o wysokiej przepustowości do powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optymalizujący etapy obsługi cieczy za pomocą prostego urządzenia ssącego zbudowanego z pompą próżniową. Setki próbek nasion można wysterylizować powierzchniowo w ciągu jednego dnia.

Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Ocena różnic anatomicznych między przekrojami poprzecznymi liści C3 i C4 pomaga zrozumieć efektywność fotosyntezy. W artykule opisano przygotowanie i badanie przekrojów poprzecznych liści z wolnej ręki i półcienkiej, wraz z zastrzeżeniami dotyczącymi przygotowania dla gatunków roślin uprawnych Triticum aestivum i Zea mays.

Ocena cech strukturalnych Triticum aestivum i Zea mays dla różnicowania fotosyntetycznego C3 i C4 przy użyciu przekrojów odręcznych i półcienkich

Tutaj prezentujemy badanie przeprowadzone w iDiv Ecotron, naziemnych komorach mezokosmicznych z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi nad i pod ziemią, w celu zbadania niezależnego i interaktywnego wpływu historii roślin i historii gleby na funkcjonowanie ekosystemu zbiorowisk trawiastych wzdłuż gradientu różnorodności roślin.

JenaTron - eksperymentalne podejście do badania wpływu historii roślin i historii gleby na funkcjonowanie ekosystemów użytków zielonych

Naucz się metody krzyżowania Setaria viridis przy użyciu zabiegu gorącą wodą do eliminacji pyłku. Technika ta ułatwia kontrolowane zapylenie i odzysk nasion w warunkach laboratoryjnych, przyspieszając badania genetyczne traw.

Metody wykonywania krzyżówek w Setaria viridis, nowym systemie modelowym dla traw

Przeglądaj więcej filmów