Name: Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Poznaj metodę znakowania metabolicznego i frakcjonowania błonowego do analizy proteomicznej komórek Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia ilościowe badanie dystrybucji białek w podprzedziałach błonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasma+membrane+proteomics+identifies+components+of+transport%2C+signal+transduction+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking.</a> Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).</li>
<li>Brown, D. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+GPI-anchored+proteins+to+glycolipid-enriched+membrane+subdomains+during+transport+to+the+apical+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface.</a> Cell. 68, 533-544 (1992).</li>
<li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N-metabolic+labeling+for+comparative+plasma+membrane+proteomics+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells.</a> Proteomics. 7, 750-754 (2007).</li>
<li>Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratio-dependent+significance+thresholds+in+reciprocal+15N-labeling+experiments+as+a+robust+tool+in+detection+candidate+proteins+responding+to+biological+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment.</a> Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).</li>
<li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li>
<li>Simons, K., Ikonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rafts+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional rafts in cell membranes.</a> Nature. 387, 569-5672 (1997).</li>
<li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+fluid%2Ffluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).</li>
<li>Silvius, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+membrane+molecules+between+raft-and+non+raft-domains%3A+insights+from+model+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).</li>
<li>Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+plant+and+animal+cells%2C+detergent-resistant+membranes+do+not+define+functional+membrane+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts.</a> Plant Cell. , (2011).</li>
<li>Lauwers, E., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+yeast+transporters+with+detergent-resistant+membranes+correlates+with+their+cell-surface+location%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location.</a> Traffic. 7, 1-15 (2006).</li>
<li>Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Arabidopsis+sterol-rich+membrane+microdomains+by+differential+treatment+with+methyl-%C3%9F-cyclodextrin+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).</li>
<li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).</li>
<li>Maeda, Y., Kinoshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+remodeling%2C+trafficking+and+functions+of+glycosylphosphatidylinositol-anchored+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins.</a> Prog. Lipid Res. 50, (2011).</li>
<li>Keinath, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAMP-induced+changes+in+plasma+membrane+compartmentalization+reveal+novel+components+of+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity.</a> J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).</li>
<li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li>
<li>Minami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+detergent-resistant+plasma+membrane+microdomains+in+Arabidopsis+thaliana+during+cold+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation.</a> Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).</li>
<li>Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214, 67-74 (2001).</li>
<li>Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+synthesis+of+proteins+in+cell+suspensions+of+a+kinetin+dependent+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco.</a> Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).</li>
<li>Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+plant+cell+cultures+with+K15NO3+as+a+tool+for+quantitative+analysis+of+proteins+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites.</a> Plant Methods. 2, 1-11 (2006).</li>
<li>Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heavy+nitrogen+in+quantitative+proteomics+experiments+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants.</a> Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+And+Go+Extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).</li>
<li>Olsen, J. V., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+accuracy+mass+spectrometry+in+large-scale+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation.</a> Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).</li>
<li>Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+loss+activation+method+for+improved+phosphopeptide+sequence+analysis+by+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).</li>
<li>Frese, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+peptide+identification+by+targeted+fragmentation+using+CID%2C+HCD+and+ETD+on+an+LTQ-Orbitrap+Velos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Protrome+Research%22%5BJournal%5D)">Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos.</a> Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).</li>
<li>van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((StatQuant%3A+a+post-quantification+analysis+toolbox+for+improving+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).</li>
<li>Zauber, H., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+wants+cRacker%3A+Automated+standardized+data+analysis+of+LC%2FMS+derived+proteomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data.</a> J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).</li>
<li>Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+annotation+of+remorins%2C+a+plant-specific+protein+family%3A+Evolutionary+and+functional+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives.</a> Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).</li>
<li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondetergent+isolation+of+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li>
<li>Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li>
<li>Macdonald, L. J., Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+the+preparation+of+detergent-free+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts.</a> Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).</li>
<li>Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+shotgun+proteomics+using+a+uniform+15N-labeled+standard+to+monitor+proteome+dynamics+in+time+course+experiments+reveals+new+insights+into+the+heat+stress+response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739(2011).</li>
<li>Schulze, W., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).</li>
<li>Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+quantiative+proteomics+of+lipid+rafts+reveales+high+specificity+for+signaling+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).</li>
<li>Lilley, K. S., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+organelle+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant organelle proteomics.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).</li>
<li>Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-cellular+localization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sub-cellular localization of membrane proteins.</a> Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Autor, Witold Szymański, jest pracownikiem Instytutu Molekularnej Fizjologii Roślin im. Maxa Plancka. Autorka, Waltraud Schulze, jest pracownikiem Uniwersytetu w Hohenheim w Niemczech.

Protokół przedstawiony w tym artykule zawiera wiele etapów, z których wszystkie są kluczowe dla uzyskania czystego i reprezentatywnego frakcjonowania błony komórkowej rośliny na membrany odporne na detergenty i frakcje rozpuszczalne w detergentach. Dlatego ważne jest, aby postępować zgodnie z instrukcjami.
Traktowanie frakcji błony plazmatycznej detergentem niejonowym (krok 3.2) ma najsilniejszy wpływ na jakość frakcjonowania mikrodomen błonowych. Aby uzyskać powtarzalne wyniki dla różnych pre...

W 1972 roku Jonathan Singer i Garth Nicolson zaproponowali model płynnej mozaiki jako model struktury błon komórkowych, zastępując model kanapkowy białko-lipid-białko, który był ogólnie akceptowany na początku lat 60. Singer i Nicolson postulowali, że błonę biologiczną można uznać za dwuwymiarową ciecz, w której wszystkie cząsteczki lipidów i białek dyfundują swobodnie i łatwo 5. Od tego czasu model budowy błony plazmatycznej i wiedza na temat składu błony stały się jeszcze bardziej złożone. W szczególności w błonie komórkowej można zaobserwować struktury takie jak kompleksy białkowe i strukturalnie nieuporządkowane mikrodomeny oparte na lipidach/sterolach. W sztucznych błonach modelowych 6,7 sterole i sfingolipidy mogą poprzecznie oddzielać się od innych gatunków lipidów, tworząc regiony o zmienionych cechach fizycznych. Ta segregacja w błonie komórkowej jest spowodowana głównie właściwościami samoasocjacyjnymi między sterolami a silnie nasyconymi łańcuchami węglowodorowymi fosho- i sfingolipidów 8. W szczególności sztywne pierścienie sterolowe sprzyjają interakcjom ze sztywniejszymi i prostszymi nasyconymi gatunkami lipidów, a interakcje te zmuszają sąsiednie łańcuchy węglowodorowe do bardziej rozszerzonych konformacji, zwiększając grubość i twardość membrany.
Jedną z powszechnie obserwowanych cech mikrodomen membranowych wzbogaconych sterolami była ich nierozpuszczalność po leczeniu niejonowymi detergentami, takimi jak Triton X-100 czy Brij 35. Uważano, że frakcje te są identyczne z mikrodomenami membranowymi i nazwano je membranami odpornymi na detergenty (DRM) w oparciu o ich biochemiczną metodę przygotowania 2. Stosowanie niejonowych detergentów podczas ekstrakcji DRM spotkało się z pewną krytyką, ponieważ biochemiczny preparat DRM może nie odpowiadać bezpośrednio żadnemu konkretnemu przedziałowi błonowemu w żywej komórce 9. W szczególności stosunek detergentu do białka wydaje się kluczowy w takich preparatach, ponieważ różne detergenty, a także różne ilości detergentów mogą dawać różny skład frakcji membranowej odpornej na detergenty 10. Istnieją jednak dowody na to, że poszczególne gatunki białek specyficznie wiążą się z tymi bogatymi w sterole komórkowymi domenami błonowymi i że białka te są dobrze wzbogacone w biochemiczne preparaty frakcji membranowych odpornych na detergenty 11. Rdzeniem białek, które znaleziono we frakcji roślinnej DRM, a dla których obecność w DRM była zależna od steroli, były w szczególności białka zakotwiczone w GPI, takie jak fasciclinopodobne białka arabinogalaktanu (FLA) i członkowie rodziny białek SKU. Znaleziono również pewne białka sygnałowe, takie jak kinazy receptoropodobne lub fosfolipazy 11. Wyniki te są zgodne z wieloma badaniami proteomicznymi dotyczącymi mikrodomen błonowych ssaków 12,13. Również w przypadku roślin istnieje coraz więcej dowodów na rolę mikrodomen błonowych w kontekście reakcji na stres 14-16.
Opisany tutaj protokół zapewnia solidną metodę frakcjonowania mikrodomen błony plazmatycznej i szczególnie wykorzystuje stężenie białka do detergentu, co pozwala nam zobrazować wywołane stresem zmiany w przedziale membranowym bogatym w sterole 4,11,14.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI </td></tr><tr><td>Chemicals zostały zamówione w Sigma-Aldrich, chyba że zaznaczono inaczej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Amoniak (roztwór 25%)</td><td>WAKO</td><td>010-03166</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 10 &mu; m </td><td>GL-Science</td><td>5020-75010</td><td></td></tr><tr><td>Empore Disk C18</td><td>Varian</td><td>12145004</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy(PEG 3350)</td><td>Sigma</td><td>88276</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Roth</td><td>9219.2</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy ()</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>K15NO3</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-765-PK</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Optima L-80 XP Ultrawirówka </td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC II nano-chromatograf cieczowy</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy LTQ-Orbitrap</td><td>Wirówka Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5810R</td><td>Wirówka Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5417R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speed Vac RVC 2-25</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker Unimax 2010</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek arabidopsis thaliana

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Mikrodomeny błony plazmatycznej są cechami opartymi na fizycznych właściwościach środowiska lipidów i steroli i odgrywają szczególną rolę w procesach sygnalizacyjnych. Ekstrakcja mikrodomen błonowych wzbogaconych w sterole z komórek roślinnych do analizy proteomicznej jest trudnym zadaniem, głównie ze względu na wiele etapów przygotowania i źródeł zanieczyszczeń z innych przedziałów komórkowych. Błona plazmatyczna stanowi tylko około 5-20% wszystkich błon w komórce roślinnej, dlatego izolacja wysoko oczyszczonej frakcji błony plazmatycznej jest wyzwaniem. Często stosowana metoda polega na wodnym dwufazowym rozdzielaniu w glikolu polietylenowym i dekstranie, w wyniku czego powstają pęcherzyki błony komórkowej o czystości 95%1. Bogate w sterol mikrodomeny błonowe w błonie plazmatycznej są nierozpuszczalne po potraktowaniu zimnymi niejonowymi detergentami o zasadowym pH. Tę odporną na detergenty frakcję membranową można oddzielić od błony plazmatycznej przez ultrawirowanie w gradiencie sacharozy 2. Następnie białka można wyekstrahować z pasma o niskiej gęstości gradientu sacharozy przez wytrącanie metanolu/chloroformu. Wyekstrahowane białko zostanie następnie strawione trypsyną, odsolone i ostatecznie przeanalizowane przez LC-MS/MS. Nasz protokół ekstrakcji mikrodomen bogatych w sterole jest zoptymalizowany pod kątem przygotowania czystych, odpornych na detergenty frakcji membranowych z kultur komórkowych Arabidopsis thaliana.
Używamy pełnego znakowania metabolicznego kultur komórkowych zawiesiny Arabidopsis thaliana z K15NO3 jako jedynego źródła azotu do ilościowych porównawczych badań proteomicznych po leczeniu biologicznym będącym przedmiotem zainteresowania 3. Mieszając równe proporcje znakowanych i nieznakowanych kultur komórkowych w celu ekstrakcji białek stawowych, wpływ etapów przygotowania na końcowy wynik ilościowy jest ograniczony do minimum. Również utrata materiału podczas ekstrakcji wpłynie w ten sam sposób zarówno na próbki kontrolne, jak i poddane zabiegowi, a zatem stosunek peptydu lekkiego i ciężkiego pozostanie stały. W proponowanej metodzie znakowana lub nieznakowana hodowla komórkowa jest poddawana biologicznej obróbce, podczas gdy druga służy jako kontrola 4.

Dzięki przedstawionemu protokołowi z wykorzystaniem metabolicznie znakowanych kultur komórkowych Arabidopsis możliwe jest wyizolowanie błon plazmatycznych z tkanki roślinnej (krok 2, Rysunki 2 i 4) oraz wzbogacenie frakcji błon odpornych na detergenty w obrębie błony plazmatycznej (krok 3, Rysunki 3 i 5). Następnie protokół umożliwia ekstrakcję białek z tych frakcji błon odpornych na detergenty (krok 4) oraz trawienie białek w celu przeprowadzenia porównawczej analizy proteomicz...

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest oddzielenie różnych podkompartmentów błonowych i zbadanie ich zróżnicowanego składu białkowego. Osiąga się to poprzez stabilne znakowanie izotopowe komórek w różnych warunkach, co umożliwia rozróżnienie zastosowanych działań. W drugim kroku, podczas analizy spektrometrycznej, materiał komórkowy z obu grup traktowania jest mieszany, co zapewnia wspólne przetwarzanie próbek i redukuje zmienność między nimi.Następnie podkompartymenty błony plazmatycznej są oczyszczane i rozdzielane na podkompartymenty sterylne wzbogacone oraz sterylne zubożone za pomocą sacharozy. Uzyskano wyniki wirowania w gradiencie, które na podstawie danych z ilościowej spektrometrii mas wykazują różnice w zawartości białek w podkompartymentach przy zastosowaniu różnych traktowań. Główną zaletą tego protokołu w stosunku do istniejących metod, takich jak Western blotting, jest możliwość ilościowego zarejestrowania rozkładu tysięcy białek w podkompartymentach, co pozwala na odkrycie nowych kandydatów do procesów sygnalizacyjnych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ oczyszczanie z systemu dwufazowego jest trudne do opanowania. Wynika to z faktu, że proces ten obejmuje wiele etapów, a precyzyjna kontrola i staranna obsługa są niezwykle istotne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji poprzez odkrywanie nowych białek kandydacyjnych na regulatory procesów błonowych. Należy rozpocząć od hodowli znakowanych i nieznakowanych zawiesin komórek Arabidopsis thaliana, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Uhomogenizowane komórki z około jednego litra siedmiodniowych kultur zawiesin komórkowych w ciekłym azocie; w zlewce zmieszać takie same ilości zamrożonych kultur komórkowych znakowanych i nieznakowanych w oparciu o masę świeżą i dodać dwie objętości buforu H, a następnie natychmiast umieścić zlewkę na wytrząsarce i wytrząsać do momentu roztopienia materiału i całkowitego zaniku kryształków lodu. Homogenat przefiltrować przez jedną warstwę tkaniny lustrzanej do probówek wirówkowych o pojemności 250 ml, a po zbilansowaniu próbek buforem H odwirować przy 10 000 G przez osiem minut. Po wirowaniu nadsącz przenieść do schłodzonych wcześniej probówek do ultrawirowania o objętości około 32 ml.Po zrównoważeniu próbek buforem h, należy osadzić mikrosomy poprzez wirowanie przy 100, 000 Gs i temperaturze czterech stopni Celsius za 30 minut. Po wirowaniu należy usunąć nadsącz, który zawiera białka rozpuszczalne. Niewielką ilość tej frakcji można zachować do dalszego wytrącania białek i późniejszej analizy białek rozpuszczalnych. Następnie należy zawiesić osad błonowy każdej próbki w odpowiedniej ilości buforu R, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie nanieść go na górę systemu dwufazowego U one two.W przypadku zastosowania dwufazowego układu sześciogramowego, należy nanieść dokładnie 2 g resuspensowanego osadu błonowego oraz taką samą objętość czystego buforu R, jaka została użyta do resuspensji próbki, do probówki U2. Powoli wymieszać zawartość probówek U1 i U2 poprzez 30-krotne odwrócenie ich z częstotliwością około jednego odwrócenia na sekundę, a następnie wirować próbki przy 1500 ×g i 4 °C przez 10 minut. Po wirowaniu należy usunąć fazę górną z probówki U2. Przenieść fazę górną z probówki U1 do probówki U2, a następnie powtórzyć wirowanie przy zachowaniu tych samych parametrów. Następnie fazę górną z probówki U2 przenieść do probówek do ultrawirowania, rozcieńczyć pięciokrotną objętością buforu R i dokładnie wymieszać, po czym wirować próbki przy 200 000 ×g i 4 °C przez jedną godzinę.Na koniec należy przeprowadzić ponowne zawieszenie. Osad błonowy zawiesić w niewielkiej ilości buforu T i E w celu wyizolowania błon odpornych na detergenty. Po sprawdzeniu stężenia frakcji błony plazmatycznej za pomocą testu Bradforda, do frakcji błony plazmatycznej dodać Triton X 100, zachowując stosunek wagowy detergentu do białka od 13 do 15 oraz końcowe stężenie detergentu od 0,5 do 1%. Próbki mieszać na wytrząsarce z prędkością około 100 RPM w temperaturze czterech stopni Celsius w ciągu 30 minut.Następnie do jednej objętości przetworzonej błony plazmatycznej należy dodać trzy objętości sacharozy o stężeniu 2,4 M, aby uzyskać końcowe stężenie sacharozy 1,8 M. Gradient sacharozy przygotowuje się w probówkach do ultrawirówki, nakładając odpowiednie roztwory sacharozy na frakcję 1,8 M. Próbki wiruje się przy 250 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 18 godzin. Probówki do ultrawirówki należy ostrożnie wyjąć z rotora, aby uniknąć zaburzenia pasma o niskiej gęstości, które może być widoczne jako mleczny pierścień na granicy faz sacharozy 0,15 M i 1,4 M.Czasami nic nie jest widoczne, ale frakcja białek odpornych na detergenty nadal jest obecna. Pobierz frakcję o objętości 0,75 ml z górnej części gradientu, frakcje drugą i trzecią, które obejmują objętości około 1,5 ml powyżej pierścienia interfazy oraz 0,5 ml poniżej pierścienia interfazy.Przedstaw frakcję błon odpornych na detergenty. Zbierz te frakcje do probówek Falcon o pojemności 15 ml. Frakcje dziewiąta i dziesiąta zawierają frakcję błon rozpuszczalnych w detergentach i mogą zostać również zebrane w celu porównania.Aby rozpocząć ekstrakcję białek z frakcji odpornej na detergenty, należy dodać cztery objętości metanolu do zebranych frakcji i dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex. Następnie należy dodać jedną objętość chloroformu i ponownie dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex. Na koniec należy dodać trzy objętości wody, dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie wirować próbki z przyspieszeniem 2000 Gs przez pięć minut.Używając wirówki laboratoryjnej, usuń fazę wodną znajdującą się nad warstwą białek w interfazie. Następnie dodaj trzy objętości metanolu i wymieszaj w wortexie. Dokładnie usuń nadsącz S przed pobraniem osadu w celu przygotowania do trawienia w roztworze.Rozpocznij trawienie w roztworze (in-solution digestion), rozpuszczając próbkę w niewielkiej objętości 6 M mocznika i 2 M TRIS pH 8 (w skrócie UTU). Użyj jak najmniejszej objętości, która jest kompatybilna z próbką. Po odwirowaniu próbek i przeprowadzeniu trawienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym, rozcieńcz próbkę czterokrotnością objętości 10 mM TRIS-HCl pH 8.Następnie dodać jeden mikrolitr trypsyny na każde 50 mikrogramów białka próbki, inkubować przez noc w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu z prędkością 700 RPM, a następnie odwirować próbki z prędkością 4 000 GS przez 10 minut. Na koniec zakwasić próbki do końcowego stężenia 0,2% TFA, aby osiągnąć pH 2, dodając około 1/10 objętości 2% kwasu trifluorooctowego. Aby przygotować końcówki stage tip C 18, umieścić dysk C 18 na płaskiej, czystej powierzchni, takiej jak jednorazowa plastikowa szalka Petriego.Wytnij mały krążek, używając tępej igły hipodermycznej o średnicy 1,5 mm. Krążek przykleja się do igły, co umożliwia jego przeniesienie do końcówki pipety. Wypchnij krążek z igły i zamocuj go w zwężeniu końcówki pipety, używając kawałka topionego kwarcu lub rurki dopasowanej do wnętrza igły; uzależnij końcówkę etapu C 18, nakładając 50 µL roztworu B na przygotowaną końcówkę etapu.Wiruj końcówkę w wirówce z prędkością 2000 RPM przez dwie minuty. W wirówce laboratoryjnej przeprowadź równoważenie końcówki etapu, używając 100 µL roztworu a. Wiruj końcówkę z przyspieszeniem 5 000 g w wirówce laboratoryjnej. Powtórz proces równoważenia i wirowania.Nanieś próbkę na dysk, ostrożnie pipetując ją do końcówki pipety z umieszczonym wewnątrz dyskiem. Wiruj końcówki w wirówce do momentu, aż cała objętość próbki przejdzie przez dysk C 18. Przemyj końcówki etapu dwukrotnie 100 µL roztworu A. Po wirowaniu końcówek w wirówce, zbierz EIT do nowej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL zawierającej 40 µL roztworu B i odwiruj.Ponownie skoncentruj próbkę w wirówce próżniowej (speed vac) w optymalnych warunkach. Przerwij proces odparowywania, gdy pozostanie około 1-2 µL cieczy. W ostatnim kroku dodaj do próbki końcową objętość 9 µL roztworu zawiesiny Resus, a następnie przenieś ją na płytkę mikrotytrującą do analizy spektrometrią mas.Wzbogacenie białek błony plazmatycznej można wykazać poprzez analizę proteomiczną niewielkich ilości błony plazmatycznej, frakcji oraz białek w fazie dolnej układu dwufazowego. Faza dolna zawiera błony wewnętrzne komórki. Na przykład typowe białka błony plazmatycznej, takie jak białka kinaz receptorowych, wykazują wysoką zawartość we frakcji błony plazmatycznej i niską zawartość we frakcji fazy dolnej zawierającej błony wewnętrzne.Z kolei znane białka retikulum endoplazmatycznego wykazują wysoką zawartość w frakcji błony wewnętrznej i nie zostały zaobserwowane w frakcji błony plazmatycznej. Następujące wzbogacenie frakcji błon opornych na detergenty doprowadzi, w przypadkach idealnych, do utworzenia mlecznego pierścienia pęcherzyków błonowych o niskiej gęstości. Na wysokości około jednej piątej probówki, zgodnie z oczekiwaniami, stwierdzono najwyższą zawartość białka remn w frakcjach błon opornych na detergenty (DRM).Z kolei białka, które nie występują w mikrodomenach błonowych, takie jak transporter ABC, nie wykazują zwiększonej liczności we frakcji DRM. Ponadto typowe zanieczyszczenia, takie jak białko mitochondrialne z kompleksu F₀ syntazy ATP oraz białko rybosomalne z rybosomu 60s, nie wykazują wzbogacenia we frakcji DRM. Chociaż po analizie spektrometrią mas można wciąż zidentyfikować minimalne ilości tych białek, możliwe jest ilościowe rozróżnienie stosunków liczności białek oraz stanu ich fosforylacji w frakcjach błony plazmatycznej pochodzących z oznakowanych i nieoznakowanych kultur komórkowych.Typowe wyniki z okna kwantyfikacji MS powinny wykazywać stosunek intensywności jonów jeden do jednego dla większości zidentyfikowanych peptydów. Peptydy, których stosunek intensywności jonów znacząco odbiega od wartości jeden do jednego, są uznawane za różnicowo regulowane pomiędzy znakowaną a nieznakowaną hodowlą komórkową i stanowią kandydatów do przypisania do białek poddanych działaniu zastosowanej terapii. Dobrą kontrolą jakości pomyślnego znakowania metabolicznego jest koelucja obu wersji peptydów (znakowanej i nieznakowanej) jako pojedynczego piku w rozdziału nano HPLC, co przedstawiono tutaj.Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu trzech dni, od rozpoczęcia ekstrakcji aż do wprowadzenia próbki do spektrometru mas. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak Western Blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące suplementacji specyficznych białek docelowych. Zatem po obejrzeniu tego filmu powinniśmy mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak mieszać kultury komórek roślinnych znakowane stabilnymi izotopami, jak przeprowadzić oczyszczanie błony plazmatycznej w systemie dwufazowym oraz jak oddzielić podfrakcje błonowe wzbogacone w steryle od tych pozbawionych steryli.

metabolic-labeling-membrane-fractionation-for-comparative-proteomic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznakowywanie metaboliczne i frakcjonowanie błon do porównawczej analizy proteomiki kultur komórkowych Arabidopsis thaliana

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania nienaruszonych chloroplastów z liści Arabidopsis i ich trzech głównych podkomór (otoczka, zrąb i tylakoidy), używając kombinacji wirowania różnicowego, ciągłych gradientów Percoll i nieciągłych gradientów sacharozy. Metoda ta jest cenna dla subplastydialnej i subkomórkowej lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu i proteomiki.

Przygotowanie podkompartmentów chloroplastowych z Arabidopsis do analizy lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu lub proteomiki

Analiza wielu biomolekuł w całym systemie jest kluczowa dla uzyskania funkcjonalnego i mechanistycznego wglądu w procesy biologiczne. W niniejszym opisano obszerny protokół wysokoprzepustowej ekstrakcji lipidów, metabolitów, białek i skrobi z pojedynczej próbki pobranej z zsynchronizowanej kultury Chlamydomonas.

Multiomiczna metoda ekstrakcji do dogłębnej analizy zsynchronizowanych kultur zielonej algi Chlamydomonas reinhardtii

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Poznaj metodę znakowania metabolicznego i frakcjonowania błonowego do analizy proteomicznej komórek Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia ilościowe badanie dystrybucji białek w podprzedziałach błonowych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana (Wideo) | JoVE Journal

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Przeglądaj więcej filmów