Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest oddzielenie różnych podkompartmentów błonowych i zbadanie ich zróżnicowanego składu białkowego. Osiąga się to poprzez stabilne znakowanie izotopowe komórek w różnych warunkach, co umożliwia rozróżnienie zastosowanych działań. W drugim kroku, podczas analizy spektrometrycznej, materiał komórkowy z obu grup traktowania jest mieszany, co zapewnia wspólne przetwarzanie próbek i redukuje zmienność między nimi.

Następnie podkompartymenty błony plazmatycznej są oczyszczane i rozdzielane na podkompartymenty sterylne wzbogacone oraz sterylne zubożone za pomocą sacharozy. Uzyskano wyniki wirowania w gradiencie, które na podstawie danych z ilościowej spektrometrii mas wykazują różnice w zawartości białek w podkompartymentach przy zastosowaniu różnych traktowań. Główną zaletą tego protokołu w stosunku do istniejących metod, takich jak Western blotting, jest możliwość ilościowego zarejestrowania rozkładu tysięcy białek w podkompartymentach, co pozwala na odkrycie nowych kandydatów do procesów sygnalizacyjnych.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ oczyszczanie z systemu dwufazowego jest trudne do opanowania. Wynika to z faktu, że proces ten obejmuje wiele etapów, a precyzyjna kontrola i staranna obsługa są niezwykle istotne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji poprzez odkrywanie nowych białek kandydacyjnych na regulatory procesów błonowych. Należy rozpocząć od hodowli znakowanych i nieznakowanych zawiesin komórek Arabidopsis thaliana, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Uhomogenizowane komórki z około jednego litra siedmiodniowych kultur zawiesin komórkowych w ciekłym azocie; w zlewce zmieszać takie same ilości zamrożonych kultur komórkowych znakowanych i nieznakowanych w oparciu o masę świeżą i dodać dwie objętości buforu H, a następnie natychmiast umieścić zlewkę na wytrząsarce i wytrząsać do momentu roztopienia materiału i całkowitego zaniku kryształków lodu. Homogenat przefiltrować przez jedną warstwę tkaniny lustrzanej do probówek wirówkowych o pojemności 250 ml, a po zbilansowaniu próbek buforem H odwirować przy 10 000 G przez osiem minut. Po wirowaniu nadsącz przenieść do schłodzonych wcześniej probówek do ultrawirowania o objętości około 32 ml.

Po zrównoważeniu próbek buforem h, należy osadzić mikrosomy poprzez wirowanie przy 100, 000 Gs i temperaturze czterech stopni Celsius za 30 minut. Po wirowaniu należy usunąć nadsącz, który zawiera białka rozpuszczalne. Niewielką ilość tej frakcji można zachować do dalszego wytrącania białek i późniejszej analizy białek rozpuszczalnych. Następnie należy zawiesić osad błonowy każdej próbki w odpowiedniej ilości buforu R, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie nanieść go na górę systemu dwufazowego U one two.

W przypadku zastosowania dwufazowego układu sześciogramowego, należy nanieść dokładnie 2 g resuspensowanego osadu błonowego oraz taką samą objętość czystego buforu R, jaka została użyta do resuspensji próbki, do probówki U2. Powoli wymieszać zawartość probówek U1 i U2 poprzez 30-krotne odwrócenie ich z częstotliwością około jednego odwrócenia na sekundę, a następnie wirować próbki przy 1500 ×g i 4 °C przez 10 minut. Po wirowaniu należy usunąć fazę górną z probówki U2. Przenieść fazę górną z probówki U1 do probówki U2, a następnie powtórzyć wirowanie przy zachowaniu tych samych parametrów. Następnie fazę górną z probówki U2 przenieść do probówek do ultrawirowania, rozcieńczyć pięciokrotną objętością buforu R i dokładnie wymieszać, po czym wirować próbki przy 200 000 ×g i 4 °C przez jedną godzinę.

Na koniec należy przeprowadzić ponowne zawieszenie. Osad błonowy zawiesić w niewielkiej ilości buforu T i E w celu wyizolowania błon odpornych na detergenty. Po sprawdzeniu stężenia frakcji błony plazmatycznej za pomocą testu Bradforda, do frakcji błony plazmatycznej dodać Triton X 100, zachowując stosunek wagowy detergentu do białka od 13 do 15 oraz końcowe stężenie detergentu od 0,5 do 1%. Próbki mieszać na wytrząsarce z prędkością około 100 RPM w temperaturze czterech stopni Celsius w ciągu 30 minut.

Następnie do jednej objętości przetworzonej błony plazmatycznej należy dodać trzy objętości sacharozy o stężeniu 2,4 M, aby uzyskać końcowe stężenie sacharozy 1,8 M. Gradient sacharozy przygotowuje się w probówkach do ultrawirówki, nakładając odpowiednie roztwory sacharozy na frakcję 1,8 M. Próbki wiruje się przy 250 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 18 godzin. Probówki do ultrawirówki należy ostrożnie wyjąć z rotora, aby uniknąć zaburzenia pasma o niskiej gęstości, które może być widoczne jako mleczny pierścień na granicy faz sacharozy 0,15 M i 1,4 M.

Czasami nic nie jest widoczne, ale frakcja białek odpornych na detergenty nadal jest obecna. Pobierz frakcję o objętości 0,75 ml z górnej części gradientu, frakcje drugą i trzecią, które obejmują objętości około 1,5 ml powyżej pierścienia interfazy oraz 0,5 ml poniżej pierścienia interfazy.

Przedstaw frakcję błon odpornych na detergenty. Zbierz te frakcje do probówek Falcon o pojemności 15 ml. Frakcje dziewiąta i dziesiąta zawierają frakcję błon rozpuszczalnych w detergentach i mogą zostać również zebrane w celu porównania.

Aby rozpocząć ekstrakcję białek z frakcji odpornej na detergenty, należy dodać cztery objętości metanolu do zebranych frakcji i dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex. Następnie należy dodać jedną objętość chloroformu i ponownie dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex. Na koniec należy dodać trzy objętości wody, dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie wirować próbki z przyspieszeniem 2000 Gs przez pięć minut.

Używając wirówki laboratoryjnej, usuń fazę wodną znajdującą się nad warstwą białek w interfazie. Następnie dodaj trzy objętości metanolu i wymieszaj w wortexie. Dokładnie usuń nadsącz S przed pobraniem osadu w celu przygotowania do trawienia w roztworze.

Rozpocznij trawienie w roztworze (in-solution digestion), rozpuszczając próbkę w niewielkiej objętości 6 M mocznika i 2 M TRIS pH 8 (w skrócie UTU). Użyj jak najmniejszej objętości, która jest kompatybilna z próbką. Po odwirowaniu próbek i przeprowadzeniu trawienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym, rozcieńcz próbkę czterokrotnością objętości 10 mM TRIS-HCl pH 8.

Następnie dodać jeden mikrolitr trypsyny na każde 50 mikrogramów białka próbki, inkubować przez noc w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu z prędkością 700 RPM, a następnie odwirować próbki z prędkością 4 000 GS przez 10 minut. Na koniec zakwasić próbki do końcowego stężenia 0,2% TFA, aby osiągnąć pH 2, dodając około 1/10 objętości 2% kwasu trifluorooctowego. Aby przygotować końcówki stage tip C 18, umieścić dysk C 18 na płaskiej, czystej powierzchni, takiej jak jednorazowa plastikowa szalka Petriego.

Wytnij mały krążek, używając tępej igły hipodermycznej o średnicy 1,5 mm. Krążek przykleja się do igły, co umożliwia jego przeniesienie do końcówki pipety. Wypchnij krążek z igły i zamocuj go w zwężeniu końcówki pipety, używając kawałka topionego kwarcu lub rurki dopasowanej do wnętrza igły; uzależnij końcówkę etapu C 18, nakładając 50 µL roztworu B na przygotowaną końcówkę etapu.

Wiruj końcówkę w wirówce z prędkością 2000 RPM przez dwie minuty. W wirówce laboratoryjnej przeprowadź równoważenie końcówki etapu, używając 100 µL roztworu a. Wiruj końcówkę z przyspieszeniem 5 000 g w wirówce laboratoryjnej. Powtórz proces równoważenia i wirowania.

Nanieś próbkę na dysk, ostrożnie pipetując ją do końcówki pipety z umieszczonym wewnątrz dyskiem. Wiruj końcówki w wirówce do momentu, aż cała objętość próbki przejdzie przez dysk C 18. Przemyj końcówki etapu dwukrotnie 100 µL roztworu A. Po wirowaniu końcówek w wirówce, zbierz EIT do nowej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mL zawierającej 40 µL roztworu B i odwiruj.

Ponownie skoncentruj próbkę w wirówce próżniowej (speed vac) w optymalnych warunkach. Przerwij proces odparowywania, gdy pozostanie około 1-2 µL cieczy. W ostatnim kroku dodaj do próbki końcową objętość 9 µL roztworu zawiesiny Resus, a następnie przenieś ją na płytkę mikrotytrującą do analizy spektrometrią mas.

Wzbogacenie białek błony plazmatycznej można wykazać poprzez analizę proteomiczną niewielkich ilości błony plazmatycznej, frakcji oraz białek w fazie dolnej układu dwufazowego. Faza dolna zawiera błony wewnętrzne komórki. Na przykład typowe białka błony plazmatycznej, takie jak białka kinaz receptorowych, wykazują wysoką zawartość we frakcji błony plazmatycznej i niską zawartość we frakcji fazy dolnej zawierającej błony wewnętrzne.

Z kolei znane białka retikulum endoplazmatycznego wykazują wysoką zawartość w frakcji błony wewnętrznej i nie zostały zaobserwowane w frakcji błony plazmatycznej. Następujące wzbogacenie frakcji błon opornych na detergenty doprowadzi, w przypadkach idealnych, do utworzenia mlecznego pierścienia pęcherzyków błonowych o niskiej gęstości. Na wysokości około jednej piątej probówki, zgodnie z oczekiwaniami, stwierdzono najwyższą zawartość białka remn w frakcjach błon opornych na detergenty (DRM).

Z kolei białka, które nie występują w mikrodomenach błonowych, takie jak transporter ABC, nie wykazują zwiększonej liczności we frakcji DRM. Ponadto typowe zanieczyszczenia, takie jak białko mitochondrialne z kompleksu F₀ syntazy ATP oraz białko rybosomalne z rybosomu 60s, nie wykazują wzbogacenia we frakcji DRM. Chociaż po analizie spektrometrią mas można wciąż zidentyfikować minimalne ilości tych białek, możliwe jest ilościowe rozróżnienie stosunków liczności białek oraz stanu ich fosforylacji w frakcjach błony plazmatycznej pochodzących z oznakowanych i nieoznakowanych kultur komórkowych.

Typowe wyniki z okna kwantyfikacji MS powinny wykazywać stosunek intensywności jonów jeden do jednego dla większości zidentyfikowanych peptydów. Peptydy, których stosunek intensywności jonów znacząco odbiega od wartości jeden do jednego, są uznawane za różnicowo regulowane pomiędzy znakowaną a nieznakowaną hodowlą komórkową i stanowią kandydatów do przypisania do białek poddanych działaniu zastosowanej terapii. Dobrą kontrolą jakości pomyślnego znakowania metabolicznego jest koelucja obu wersji peptydów (znakowanej i nieznakowanej) jako pojedynczego piku w rozdziału nano HPLC, co przedstawiono tutaj.

Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu trzech dni, od rozpoczęcia ekstrakcji aż do wprowadzenia próbki do spektrometru mas. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak Western Blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące suplementacji specyficznych białek docelowych. Zatem po obejrzeniu tego filmu powinniśmy mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak mieszać kultury komórek roślinnych znakowane stabilnymi izotopami, jak przeprowadzić oczyszczanie błony plazmatycznej w systemie dwufazowym oraz jak oddzielić podfrakcje błonowe wzbogacone w steryle od tych pozbawionych steryli.