Skuteczna ręczna metoda odkostniania w celu przygotowania nienaruszonej tkanki nosowej myszy z zachowaną organizacją anatomiczną

Witam, nazywam się David Dunton i pracuję w laboratorium dr. Wung Lynn na UMBC. W tym filmie prezentujemy skuteczną technikę przygotowania tkanki nosowej myszy z zachowaniem organizacji anatomicznej. Metoda ta pozwala na uzyskanie pojedynczego preparatu zawierającego niemal całość tkanki nosowej, w tym tkanki oddechowej i węchowej, nabłonkowej oraz podnabłonkowej.

Przedstawiamy krok po kroku proces usuwania różnych kości twarzy otaczających tkankę nosową, który pozwala na zachowanie nawet najdelikatniejszych struktur, takich jak zakończenia głównego nabłonka węchowego. Nasza metoda wykazuje istotne zalety w porównaniu z metodami dekalcyfikacji, ponieważ pozwala uniknąć agresywnej obróbki chemicznej, a usunięcie kości można przeprowadzić w czasie od 20 do 30 minut. Innymi zaletami tej techniki są brak ograniczeń wynikających z wieku myszy oraz możliwość jej zastosowania zarówno w przypadku tkanek utrwalonych, jak i świeżych.

Zalety te sprawiają, że nasza technika jest idealna do badań morfologicznych, immunohistochemicznych i fizjologicznych. Przedstawiamy tutaj schematycznie widok grzbietowy kości czaszki i nosa. W tym filmie skupimy się na sekcji kości nosa.

Jest to schematyczny rysunek brzusznej strony kości czaszki i nosa. Przedstawiony jest widok grzbietowy z nieprepareowaną czaszką i nosem u góry oraz z preparatem nosa na dole. Widoczne są obecnie zakończenia głównego nabłonka węchowego.

Tutaj przedstawiamy kości nosa, zaczynając od widoku grzbietowego. Jest to część grzbietowa płytki jarzmowej, a następnie łuk jarzmowy. To jest kość nosowa, a następnie pokazana zostaje położona wewnątrz płytka sitowa.

Zwoj Gruenberga znajduje się znacznie bardziej przednio. Z perspektywy bocznej przedstawiamy fragment kości sitowej pokrywający pręga nabłonka węchowego, zwoj Gruenberga, szczękę oraz siekacze przednie. Przechodząc do perspektywy brzusznej, ukazaliśmy zęby trzonowe, siekacze przednie, kość podniebienną oraz kość jamistą.

Rozpocznij usuwanie kości vulner, oglądając brzuszna stronę nosa. Aby usunąć kość vulner, użyj pęsety, aby przełamać kość vulner wzdłuż jej długości, a następnie usuń fragmenty kości, odchylając je od leżącej poniżej tkanki, aby uniknąć uszkodzenia narządu nosowego RO. W tym celu użyj kleszczyków, aby złamać brzuszną część przednich siekaczy.

Stosując ruch ściskania, odłam przednie siekacze w kierunku kości ulmer. Po odłamaniu przednich siekaczy, usuń za pomocą pęsety pozostałe fragmenty kości połączone z tkanką. Aby poluzować szczękę, zacznij od strony brzusznej i odłam szczękę tuż brzusznie od łuków zygomatycznych.

Odchyl nos w stronę grzbietową i złam szczękę tuż przed łukiem jarzmowym. Aby poluzować szczękę i usunąć prawą stronę kości nosowej, usuń pozostałą część wyrostka czołowego po prawej stronie kości nosowej. Do tego zadania należy użyć kleszczy rongeura.

Podczas używania kleszczyków Ron należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia cienkiej blaszki sitowej, ponieważ jej uszkodzenie może spowodować pęknięcie nosa na pół. Odchylić i usunąć odłamany fragment kości. Następnie odsunąć grzbietową część blaszki jarzmowej od leżącej pod nią tkanki.

Rozdziel kość nosową wzdłuż jej linii środkowej. Używając pęsety lub gumki, chwyć kość pęsetą i delikatnie poruszaj nią na boki, jednocześnie unosząc ją do góry. Procedurę tę należy przeprowadzić z dużą ostrożnością, ponieważ podczas usuwania kości łatwo uszkodzić leżącą pod nią tkankę. Po usunięciu kości można zobaczyć oddzielnie tkankę podścielną, co przedstawiono na tym obrazie.

Aby usunąć kość, należy ją po prostu odciąć za pomocą pęsety lub nożyczek. Następnie należy usunąć przednią część szczęki. Jeśli nie została ona jeszcze usunięta, powinna być już luźna, więc należy ją usunąć, przerywając wszelkie pozostałe połączenia z tkanką.

Z perspektywy grzbietowej usuń kość czołową, która znajduje się bezpośrednio po lewej stronie kości nosowej. Użyj kleszczy Rongeura, aby złamać kość czołową. Do usunięcia tego fragmentu kości czołowej można użyć kleszczy lub pęsety.

W tym momencie można również poluzować szczękę, choć nie jest to konieczne. Aby usunąć lewą stronę kości nosowej, należy użyć pęsety i delikatnie oddzielić kość nosową od wielu otaczających ją kości. Następnie należy chwycić tę kość pęsetą i delikatnie poruszać nią na boki, jednocześnie unosząc ją, aby oddzielić kość nosową od tkanki podścielającej.

W miarę jak tkanka podścielająca oddziela się od kości, czasami można zastosować widok boczny, aby dostrzec tkankę połączoną z kością. Użyj pęsety, aby delikatnie oddzielić tkankę połączoną z kością, a następnie usuń kość za pomocą nożyczek lub pęsety. Po usunięciu kości nosowej usuń przednią część szczęki po lewej stronie nosa, stosując tę samą technikę, która posłużyła do usunięcia przedniej części szczęki po prawej stronie nosa.

Kolejnym krokiem jest usunięcie płytki jarzmowej po lewej stronie nosa. Płytka jarzmowa oraz leżąca pod nią tkanka mogą być nadal częściowo przytwierdzone; w takim przypadku można użyć pęsety, aby delikatnie zacisnąć i poluzować grzbietową część płytki jarzmowej. Następnie należy obejrzeć brzuszną stronę nosa.

Aby zidentyfikować zęby trzonowe i kość podniebienną, można usunąć albo zęby trzonowe, albo kość podniebienną. Najpierw przedstawiony jest widok boczny nosa, a ten widok pokazuje usuwanie zębów trzonowych z prawej strony nosa. Korzystając z urs z usuniętą prawą stroną szczęki, usuwa się kość podniebienną.

Następnie rozbij pozostałą część szczęki oraz zęby trzonowe i usuń wszelkie duże fragmenty kostne z kości podniebienia lub szczęki. Odłam i usuń wszelkie pozostałe fragmenty kości sitowej wystające w kierunku nabłonka. Umieść precyzyjną pęsetę pod kością i podważ ją, aby oddzielić ją od leżącej poniżej tkanki.

Alternatywnie można użyć kleszczy Rogersa, jak pokazano tutaj, aby złamać kość, a następnie użyć pęsety precyzyjnej, aby oddzielić kość od leżącej pod nią tkanki. Tak wygląda turbinata nabłonka węchowego człowieka. Po usunięciu kości sitowej, ta kość zostanie usunięta.

Następnie, w miejscu bocznym i przyśrodkowym względem kości nosowej, usuwa się tę kość za pomocą kleszczyków. Należy zachować ostrożność podczas tego etapu, aby uniknąć uszkodzenia blaszki sitowej. Po złamaniu kości należy ją usunąć za pomocą pęsety.

Następnie przedstawiono widok nosa. Po usunięciu tej kości ostatnim obszarem do sprawdzenia jest okolica narządu V nosowego. Wynika to z faktu, że pary rurek narządu V nosowego są oddzielone kością, którą właśnie usuwam w tej sekcji.

Jest to widok grzbietowy nosa zdissekowanego zgodnie z naszą techniką. Następnie obróciliśmy nos, aby ukazać jego różne aspekty. Jest to widok grzbietowy, po którym następuje widok boczny lewej strony nosa oraz widok brzuszny.

Poniżej szczegółowo przedstawiamy cechy nosa w pełni rozsektowanego zgodnie z naszą techniką, zaczynając od widoku grzbietowego nosa. Pierwszym elementem, który prezentujemy, są małżowiny nosowe z głównym nabłonkiem odruchowym. W tkance znajdującej się pod kośćmi nosowymi widoczne są pęcherzyki powietrza, które usuwa się poprzez odsysanie próbki z perspektywy bocznej.

Prezentujemy nienaruszony małżowiec nabłonka węchowego człowieka. Należy zauważyć obecność pęcherzyków powietrza w obrębie małżowieców. Tkanka gruczołowa znajduje się przed małżowiecem, a z tej bocznej perspektywy widoczny jest nabłonek oddechowy.

Z perspektywy brzusznej widoczny jest delikatny organ nosowy. Zdjęcie to przedstawia rozszerzenie naszej techniki sekcji, polegające na usunięciu opuszki węchowej mózgu oraz nosa w jednym preparacie. Aby przygotować tkankę do krojenia, należy najpierw wziąć plastikową formę i wypełnić ją medium OCT (optimum cutting temperature media).

Umieść badaną tkankę w wypełnionej formie, a następnie ustaw formę wewnątrz kręgu z smaru silikonowego na plastikowej płytce do hodowli; na kręgu smaru silikonowego zostanie umieszczona kolba, aby zapewnić szczelność układu próżniowego. W naszym laboratorium stosujemy próżnię generowaną przez przepływ wody. Po wytworzeniu próżni pęcherzyki powietrza są wyciągane z tkanki.

Próżnię wyłącza się poprzez zakręcenie dopływu wody i zwolnienie drenów. Następnie wyjmuje się plastikową formę. W tym miejscu ustawiam tkankę w pożądanej orientacji przed jej zamrożeniem.

W naszym laboratorium do zamrażania tkanek stosujemy suchy lód. Przedstawione wyniki ukazują przekroje nosa wykonane przy użyciu naszej techniki sekcji i zabarwione czerwienią neutralną. Jest to przekrój poziomy ukazujący małżowiny nosowe, nabłonek efektorowy, tkankę gruczołową oraz nabłonek oddechowy.

Drugi przekrój to przekrój czołowy, który ukazuje zawiły wzór fałdowania małżowin głównego nabłonka węchowego. W tym filmie prezentujemy technikę ręcznego usuwania kości z nosa w celu uzyskania preparatu idealnego do badań morfologicznych, immunohistochemicznych lub fizjologicznych.