Name: Pomiar dynamiki wzrostu i ekspresji genów bakterii S. typhimurium ukierunkowanych na nowotwór (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj dynamikę ekspresji genów bakterii S. typhimurium w nowotworach u myszy z wykorzystaniem bioluminescencyjnego obrazowania in vivo. Ta metoda pozwala ilościowo mierzyć wzrost bakterii w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy H. Flemingowi za krytyczne przeczytanie i redakcję rękopisu. Praca ta była wspierana przez stypendium podoktoranckie Misrock (TD) i stypendium dla absolwentów NDSEG (AP). SNB jest badaczem HHMI.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Pasażowanie linii komórkowych przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych. W tym eksperymencie wykorzystaliśmy komórki OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Hoduj komórki do docelowej konfluencji 80 - 100%. </li>
 <li>Inkubuj komórki z 5 ml trypsyny przez 5 minut, a następnie dodaj 5 ml pożywki RPMI + FBS, aby dezaktywować trypsynę. </li>
 <li>Zbierz i policz komórki na hemocytometrze. Zawiesić w DMEM wolnym od czerwieni fenolowej w docelowym stężeniu 5 x 107 komórek/ml lub około 200 μl na kolbę. </li>
 <li>Dodać 15% zredukowany czynnik wzrostu Matrigel (BD Biosciences) i utrzymywać zawiesinę komórkową na lodzie do momentu implantacji. </li>
</ol>
2. Implantacja guza
<ol>
 <li>Znieczulij 4-tygodniowe samice myszy Ncr/Nu za pomocą 3% izofluranu i odczekaj około 5 minut, aby zapewnić głębokie znieczulenie. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. </li>
 <li>Załaduj komórki (100 μl na guz) do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocuj igłę o rozmiarze 27 1/2.</li>
 <li>W każdym z dwóch obustronnych miejsc wstrzyknięcia tylnego boku delikatnie unieś skórę kleszczami, aby utworzyć namiot i wstrzyknąć komórki u podstawy. Uważaj, aby nie wniknąć zbyt głęboko, wytwarzając krew. Użyj pęsety, aby delikatnie usunąć strzykawkę bez rozprysków.</li>
 <li>Monitoruj wzrost guza codziennie przez 10 - 20 dni, aż do osiągnięcia średnicy guza 2 - 4 mm. </li>
</ol>
3. Przygotowanie bakterii 
<ol>
 <li>Rozpocznij nocną hodowlę bakterii w 3 ml pożywki LB + Ampicylina z bulionu zamrażarki w temperaturze -80 C lub płyty chłodniczej. W tym eksperymencie użyliśmy szczepu S. typhimurium ELH430 (SL1344 PhoPQ- aroA-).</li>
 <li>Rano rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:100 do przefiltrowanego LB i wyrosnąć do OD600 0,4 - 0,6. </li>
 <li>Odwirować i przemyć 3 razy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ponownie zawiesić na końcowym OD600 0,1 (około 1 x 107 komórek/ml). </li>
</ol>
4. Wstrzykiwanie bakterii 
<ol>
 <li>Znieczul zwierzę i połóż się na boku z ogonem skierowanym w stronę twojej dominującej ręki. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. </li>
 <li>Rozszerz żyłę ogonową za pomocą ciepłej wody lub lampy grzewczej. </li>
 <li>Załaduj bakterie (100 μl na mysz) do strzykawki o pojemności 1 ml i zegnij końcówkę pod kątem mniejszym niż 90 stopni.</li>
 <li>Dopasuj końcówkę strzykawki do żyły ogonowej, wniknij na płytką głębokość (nie powinno być odczuwalnego oporu) i wstrzyknij bakterie. Należy obserwować przemieszczenie przepływu krwi, aby wstrzyknięcie zakończyło się sukcesem. </li>
</ol>
5. Obrazowanie myszy 
<ol>
 <li>Znieczulenie zwierząt w komorze indukcyjnej, a następnie umieszczenie każdej myszy na platformie obrazowania. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Utrzymuj precyzyjne pozycjonowanie, aby zapewnić ilościowe wyniki między punktami czasowymi. </li>
 <li>Obrazuj zwierzęta za pomocą systemu obrazowania IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Jeśli obrazujesz więcej niż 1 zwierzę, umieść między nimi bariery świetlne, aby zapobiec oświetleniu krzyżowemu. Zwierzęta należy najpierw zobrazować po stronie brzusznej, aby potwierdzić lokalizację bakterii. </li>
 <li>Obrazuj zwierzęta grzbietowo za pomocą IVIS co 2 godziny przez cały czas trwania eksperymentu (36 godzin). Wygeneruj przebieg czasowy dla danego zwrotu z inwestycji. </li>
</ol>
6. Kwantyfikacja biodystrybucji bakterii
<ol>
 <li>Poddaj zwierzęta eutanazji za pomocą CO2 i ułóż na plecach na chłonnej pieluszce.</li>
 <li> Obróć zwierzę, aby odsłonić dwa podskórne guzy tylnego boku. Przetnij otaczającą tkankę skórną, aby oddzielić i usunąć guzy. Trzymając guz pęsetą, usuń skórę za pomocą odwróconych ruchów nożycowych. Gdy większość skóry zostanie oddzielona, całkowicie usuń guz za pomocą pęsety.</li>
 <li>Umieść narządy w wstępnie zważonych probówkach do mikrowirówek. Ponieważ masa tych probówek może się znacznie różnić, ważne jest, aby je wstępnie zważyć w celu uzyskania wyników ilościowych. </li>
</ol>
7. Kwantyfikacja biodystrybucji bakterii
<ol>
 <li>Dla każdego punktu czasowego wyciąć i zważyć guzy.</li>
 <li>Dodać 500 μl PBS + 15% glicerolu i homogenizować za pomocą Tissue-Tearor (BioSpec). Przepłukać homogenizator 3 razy etanolem między próbkami. </li>
 <li>Generuj seryjne rozcieńczenia i płytkę do zliczania kolonii bakteryjnych. Do nakładania wielu rozcieńczeń na jedną płytkę należy używać płytek o wstępnie pokrojonych fragmentach. </li>
</ol>

<ol><li>Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+phoP%2FphoQ-deleted%2C+aroA-deleted+live+oral+Salmonella+typhi+vaccine+strain+in+human+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers.</a> Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).</li>
<li>Leschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Invasion+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+Is+Accompanied+by+Strong+Hemorrhage+Promoted+by+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha.</a> Plos One. 4 (8), (2009).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+tumor-targeting+bacteria+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals.</a> Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).</li>
<li>Min, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+real-time+imaging+of+tumors+and+metastases+using+tumor-targeting+light-emitting+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli.</a> Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).</li>
<li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).</li>
<li>Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-targeted+Salmonella+as+a+novel+anticancer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.</a> Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).</li>
<li>Fu, X., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+carcinoma+metastatic+models+constructed+in+nude+mice+by+orthotopic+transplantation+of+histologically-intact+patient+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens.</a> Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).</li>
<li>Ozbudak, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).</li>
<li>Elowitz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Toso, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+the+intravenous+administration+of+attenuated+Salmonella+typhimurium+to+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma.</a> J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).</li>
<li>Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+intravenous+administration+of+live+genetically+modified+salmonella+typhimurium+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma.</a> J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).</li>
<li>Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+perfect+%28bacterial%29+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+gene+by+shRNA-expressing+Salmonella-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi.</a> Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-seeking+Salmonella+amino+acid+auxotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).</li>
<li>Nguyen, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+Salmonella+typhimurium+as+an+imageable+therapeutic+probe+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.</a> Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+with+a+Salmonella+typhimurium+leucine-arginine+auxotroph+cures+orthotopic+human+breast+tumors+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice.</a> Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synchronized+quorum+of+genetic+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synchronized quorum of genetic clocks.</a> Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li>
<li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+gene+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensing+array+of+radically+coupled+genetic+%27biopixels%27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'.</a> Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).</li>
<li>Xu, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+delivery+of+siRNAs%3A+a+new+approach+to+solid+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy.</a> Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).</li>
<li>Zheng, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+amplified+protein+expression+therapy%3A+Salmonella+as+a+tumor-selective+protein+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector.</a> Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+balanced-lethal+host-vector+system+based+on+glmS%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS.</a> Plos One. 8 (3), e60511(2013).</li>
<li>Prindle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Circuits+in+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Circuits in Salmonella typhimurium.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Danino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+expression+dynamics+of+tumor-targeted+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. , (2012).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+imaging+of+bacterial+infection+and+antibiotic+response+in+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Za pomocą tej procedury jesteśmy w stanie wygenerować przebiegi czasowe dla dynamiki wzrostu i ekspresji genów bakterii kolonizujących nowotwory. Chociaż pomiary te są rutynowo wykonywane in vitro w hodowlach okresowych lub urządzeniach mikrofluidycznych, są one znacznie trudniejsze do wykonania in vivo. 
Istnieje kilka modyfikacji, które można zastosować do tych metod. Podczas gdy użyliśmy linii komórkowej OVCAR-8 do wygenerowania naszych modeli mysich, wiele innych linii ko...

Biologia syntetyczna szybko się rozwinęła w ciągu ostatniej dekady i jest teraz w stanie wpłynąć na ważne problemy w energetyce i zdrowiu. Ekspansja na arenę kliniczną została jednak spowolniona przez obawy dotyczące bezpieczeństwa i brak opracowania kryteriów projektowania obwodów genetycznych in vivo. Przyspieszenie zastosowań medycznych o dużym wpływie będzie wymagało wykorzystania metod, które łączą się bezpośrednio z infrastrukturą medyczną, obwodami genetycznymi, które działają poza kontrolowanymi warunkami laboratoryjnymi oraz bezpiecznymi i akceptowanymi klinicznie gospodarzami mikrobiologicznymi. 
Wiele szczepów zostało przebadanych pod kątem terapii raka ze względu na ich zdolność do preferencyjnego wzrostu w nowotworach. Należą do nich C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum i S. typhimurium3-8. S. typhimurium wzbudził szczególne zainteresowanie, ponieważ wykazał bezpieczeństwo i tolerancję w wielu badaniach klinicznych na ludziach9-12. Początkowo wykazano, że bakterie te wywołują działanie przeciwnowotworowe poprzez stymulację układu odpornościowego gospodarza i wyczerpanie składników odżywczych wymaganych do metabolizmu komórek rakowych. Produkcja ładunku terapeutycznego została później rozszerzona poprzez modyfikacje genetyczne. Chociaż badania te stanowią ważny postęp w stosowaniu bakterii w leczeniu nowotworów, większość istniejących wysiłków opierała się na ekspresji na wysokim poziomie, która zwykle skutkuje dostarczaniem wysokich dawek, efektami niezamierzonymi i rozwojem oporności gospodarza13-16. 
Teraz, biologia syntetyczna może dodać programowalną produkcję ładunku, wykorzystując obliczeniowo zaprojektowane obwody genetyczne, które mogą wykonywać zaawansowane wykrywanie i dostarczanie17-20. Obwody te można zaprojektować tak, aby działały jako systemy dostarczania, które wyczuwają bodźce specyficzne dla guza i w razie potrzeby samoregulują produkcję ładunku. Jednak badanie funkcji tych obwodów in vivo było do tej pory wyzwaniem. 
Ponieważ plazmidy są powszechnym szkieletem dla obwodów syntetycznych, opisujemy metodę charakteryzowania dynamiki ekspresji genów opartych na plazmidzie in vivo za pomocą modelu mysiego. Metody te wykorzystują poklatkowe obrazowanie luminescencyjne i ilościowy pomiar biodystrybucji. Razem podejścia te zapewniają ramy do badania sieci opartych na plazmidach in vivo do zastosowań klinicznych.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>3/10 cc Strzykawka insulinowa</td><td>BD Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Igła PrecisionGlide </td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X), płyn, z L-glutaminą</td><td>Invitrogen</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Rosół</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Rosół Luria-Bertani</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar dynamiki wzrostu i ekspresji genów bakterii s. typhimurium ukierunkowanych na nowotwór

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Celem tych eksperymentów jest wygenerowanie ilościowych danych o przebiegu czasowym wzrostu i dynamiki ekspresji genów osłabionych kolonii bakterii S. typhimurium rosnących wewnątrz guzów. 
Stworzyliśmy modelowe guzy ksenoprzeszczepu u myszy poprzez podskórne wstrzyknięcie linii komórkowej ludzkiego raka jajnika, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). 
Przekształciliśmy atenuowane szczepy bakterii S. typhimurium (ELH430:SL1344 phoPQ- 1) z konstytutywnie wyrażonym plazmidem lucyferazy (luxCDABE) dla wizualizacji2. Szczepy te specyficznie kolonizują nowotwory, pozostając zasadniczo niezjadliwe dla myszy1. 
Po ustaleniu mierzalnych guzów, bakterie zostały wstrzyknięte dożylnie przez żyłę ogonową z różnymi dawkami. Zlokalizowana w guzie ekspresja genów bakteryjnych była monitorowana w czasie rzeczywistym w ciągu 60 godzin za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS). W każdym punkcie czasowym guzy zostały wycięte, zhomogenizowane i posiane w celu ilościowego określenia kolonii bakteryjnych w celu korelacji z danymi dotyczącymi ekspresji genów. 
Razem, te dane dają ilościową miarę dynamiki wzrostu in vivo i ekspresji genów bakterii rosnących wewnątrz guzów.

Stosując niniejszy protokół, jesteśmy w stanie uzyskać dane na temat dynamiki wzrostu in vivo oraz ekspresji genów bakterii celujących w nowotwory. Cały przebieg procesu przedstawiono na Rysunku 1.
W pierwszym etapie wstrzykujemy bakterie (zielone) i obrazujemy zwierzę za pomocą systemu IVIS, aby zmierzyć ekspresję genów z wykorzystaniem luminescencji (niebieskiej) jako reportera.
Następnie, w drugim etapie, wycinamy, homogenizujemy i wysie...

Celem tych eksperymentów jest wygenerowanie ilościowych danych o przebiegu czasowym wzrostu i dynamiki ekspresji genów osłabionych kolonii bakterii S. typhimurium rosnących wewnątrz guzów. Ten film obejmuje przygotowanie i implantację komórek nowotworowych, przygotowanie i wstrzyknięcie bakterii, obrazowanie luminescencyjne całego zwierzęcia, wycinanie guza i zliczanie kolonii bakteryjnych.

Pomiar dynamiki wzrostu i ekspresji genów bakterii S. typhimurium ukierunkowanych na nowotwór

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest badanie dynamiki ekspresji genów in vivo bakterii S tyrian rosnących wewnątrz guzów. W modelu ksenoprzeszczepu nowotworowego u myszy bakterie są wstrzykiwane dożylnie przez żyłę ogonową. Bakterie kolonizują guz i rosną wykładniczo, podczas gdy ekspresja genów jest wizualizowana przy użyciu reporterów luminescencyjnych.Obrazowanie bioluminescencyjne całego zwierzęcia jest wykonywane przy użyciu systemu obrazowania spektralnego IVIS. W ciągu 24 do 48 godzin pobierana jest seria obrazów IVIS w określonych odstępach czasu. Seria obrazów ta jest korelowana z liczbą kolonii uzyskaną poprzez homogenizację i wysiew guzów.Łącznie dane te pozwalają na ilościowe pomiary ekspresji genów oraz dynamiki populacji bakterii ukierunkowanych na nowotwór in vivo w czasie rzeczywistym podczas przygotowania komórek, pasażowania linii komórkowych z wykorzystaniem standardowych technik hodowli komórkowej. W tym doświadczeniu użyliśmy komórek ocar eight, osiągając docelową konfluencję od 80 do 100%. Zebrać i policzyć komórki za pomocą hemocytometru, następnie zawiesić w DMEM bez czerwieni fenolowej do docelowego stężenia 5×10⁷ komórek/ml, czyli około 200 µL na kolbę. Dodać 15% Matrigel z obniżoną zawartością czynników wzrostu i przechowywać zawiesinę komórkową w lodzie do momentu implantacji nowotworu.Zanurzono czterytygodniowe samice myszy nago w narkozie z użyciem 3% izofluranu. Pobrano komórki w objętości 100 µL na guz do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocowano igłę o rozmiarze 27,5 G dla każdego z dwóch bocznych miejsc iniekcji w tylnych flankach. Delikatnie uniesiono skórę pęsetą, tworząc tzw. namiot, a następnie wstrzyknięto komórki u podstawy.Należy uważać, aby nie wprowadzić igły zbyt głęboko, co mogłoby spowodować krwawienie. Używając pęsety, należy ostrożnie usunąć strzykawkę, aby uniknąć rozpryskiwania cieczy. Wzrost guza należy monitorować codziennie przez 10 do 20 dni, aż do momentu osiągnięcia przez guz średnicy od dwóch do czterech milimetrów.Przygotowanie bakterii: rozpocząć hodowlę nocną bakterii w 3 ml pożywki LB z dodatkiem antybiotyków, wykorzystując zapas z zamrażarki -80°C lub płytkę przechowywaną w lodówce. W tym eksperymencie zastosowano szczep E. coli ELH430. Rano rozcieńczyć kulturę 1:100 w filtrowanej pożywce LB i hodować do uzyskania OD600 na poziomie 0,4–0,6.Odwiruj i przemyj trzy razy w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, a następnie resuspenduj do końcowej gęstości optycznej OD 600 wynoszącej 0,1 lub około 1 × 10⁷ komórek/ml. Przed iniekcją bakterii znieczul zwierzęta i ustaw je tak, aby ogon był skierowany w stronę Twojej dominującej ręki. Zlokalizuj żyłę ogonową i rozszerz ją, używając ciepłej wody lub lampy grzewczej.Należy pobrać bakterie w ilości 100 µL na mysz do strzykawki o pojemności 1 ml i zgiąć igłę pod kątem nieco mniejszym niż 90 stopni. Końcówkę strzykawki należy ustawić w linii z żyłą ogonową, wprowadzić ją na niewielką głębokość, nie napotykając oporu, a następnie wstrzyknąć bakterie. Prawidłowe wykonanie iniekcji potwierdza obserwacja przemieszczenia przepływu krwi.Odczekać około 12 do 18 godzin przed obrazowaniem, aby umożliwić kolonizację. W celu obrazowania myszy należy znieczulić zwierzęta w komorze indukcyjnej. Następnie każdą mysz należy umieścić na platformie obrazującej.Zachowaj precyzyjne pozycjonowanie, aby zapewnić powtarzalność wyników ilościowych pomiędzy punktami czasowymi; obrazuj zwierzęta przy użyciu systemu obrazowania Ibis Spectrum. W przypadku obrazowania więcej niż jednego zwierzęcia, umieść między nimi bariery świetlne, aby zapobiec wzajemnemu oświetleniu. Przeprowadź sekcję zwierzęcia, trzymając guz tylnymi pęsetą. Usuń skórę, wykonując ruch odwrotny nożyczkami.Kiedy większość skóry zostanie oddzielona, całkowicie usuń guz za pomocą pęsety. Umieść organy w wcześniej zważonych probówkach do mikrocentryfugowania. Ponieważ masa tych probówek może się znacznie różnić, ważne jest ich wcześniejsze zważenie w celu uzyskania wyników ilościowych.Ilościowe określenie biodystrybucji bakterii dla każdego punktu czasowego: wyciąć i zważyć guzy, dodać 500 µL PBS z dodatkiem 15% glicerolu i homogenizować za pomocą homogenizatora tkankowego, przygotować rozcieńczenia szeregowe i wysiać na płytki w celu zliczenia kolonii bakteryjnych (wyniki reprezentatywne). Stosując ten protokół, jesteśmy w stanie uzyskać dane na temat dynamiki wzrostu in vivo i ekspresji genów bakterii ukierunkowanych na guz. Cały przebieg prac podsumowano tutaj.W pierwszym etapie wstrzyknięto bakterie i wykonano obrazowanie zwierzęcia za pomocą systemu ivus, aby zmierzyć ekspresję genów, wykorzystując luminescencję jako reporter. Następnie, w drugim etapie, guzy wycięto, zhomogenizowano i wysiano na podłoża w celu policzenia kolonii, co pozwoliło określić liczbę bakterii rozwijających się w guzie. Bioluminescencja generowana przez szczepy bakteryjne jest wizualizowana za pomocą ivus; sygnał wzrasta wraz z wstrzykniętą dawką, przy czym minimalna dawka kolonizacyjna wynosi we wszystkich przypadkach około 5×10⁵ ze względu na tłumienie sygnału.Bakterie albo specyficznie kolonizują guzy, albo nie wykazują znaczącego wzrostu u myszy; sygnał jest kwantyfikowany w jednostkach radiancji w celu normalizacji czasu ekspozycji, przy czym typowe wartości powyżej 10⁶ lub wyższe świadczą o kolonizacji w danej infekcji. Sygnał wzrasta w czasie w ciągu 24 do 48 godzin. Szczyt występuje tutaj około 36 godzin po iniekcji, jednak czas ten może się różnić w zależności od użytego szczepu i plazmidu. Należy pamiętać o pozycjonowaniu myszy w dokładnie ten sam sposób za każdym razem, aby zapewnić wyniki ilościowe w kolejnych seriach eksperymentów.Biodystrybucję bakterii określa się ilościowo w celu pomiaru ich wzrostu w czasie w różnych narządach; liczbę żywych bakterii w guzach wyznacza się poprzez wycięcie i homogenizację guza, a następnie wysianie jego rozcieńczeń seryjnych. Można w ten sposób analizować również inne narządy. W niniejszym badaniu wykorzystano śledzionę, ponieważ stosunek liczby bakterii w guzie do ich liczby w śledzionie jest typową miarą specyficzności bakteryjnej, obliczaną po uwzględnieniu czynnika rozcieńczenia.Liczenia te pozwalają mierzyć liczebność konkretnej populacji bakterii w czasie. Po lewej stronie widać, że liczba bakterii stale rośnie przez cały czas trwania eksperymentu. Czas podwojenia wynosi od jednej do trzech godzin, co jest wartością znacznie niższą niż w eksperymentach z kulturami okresowymi.Jest to prawdopodobnie spowodowane niekorzystnymi warunkami odżywczymi w mikrośrodowisku guza. Po prawej stronie określono ilościowo stosunek guza do śledziony, obserwując, że wartość ta wzrasta w trakcie trwania eksperymentu. Celem tych doświadczeń jest ilościowe monitorowanie dynamiki wzrostu i ekspresji genów bakterii oraz środowisk guzowych przy użyciu obrazowania IVUS i technik liczenia kolonii.Wykazaliśmy, że populacje bakterii mogą być charakteryzowane in vivo w środowisku nowotworowym. W przyszłości możliwe będzie projektowanie i tworzenie bardziej złożonych programów ekspresji genów w celu budowy zaawansowanych bakteryjnych systemów dostarczania terapeutyków.

measuring-growth-gene-expression-dynamics-tumor-targeted-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena wzrostu i dynamiki ekspresji genów bakteryjnych S. Typhimurium ukierunkowanych na guz

Źródło: Liu, P. C., et al. Zaprojektowanie i zastosowanie niedrogiego, zautomatyzowanego morbidostatu do adaptacyjnej ewolucji bakterii przy doborze antybiotyków. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje zastosowanie chipa mikroprzepływowego do wizualizacji i porównania wzrostu i morfologii szczepów E. coli typu dzikiego i opornych na trimetoprim w warunkach stresu związanego z antybiotykiem trimetoprimu.

Wzrost bakterii na chipie mikroprzepływowym w celu zbadania antybiotykooporności

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Tutaj prezentujemy fenomiczne podejścia do funkcjonalnej charakterystyki domniemanych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny.

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Ilościowa ocena wzrostu bakterii jest niezbędna do zrozumienia fizjologii drobnoustrojów jako zjawiska na poziomie systemu. Wprowadzono protokół manipulacji eksperymentalnej i podejście analityczne, pozwalające na precyzyjną, wysokoprzepustową analizę wzrostu bakterii, który jest kluczowym przedmiotem zainteresowania biologii systemów.

Precyzyjna, wysokoprzepustowa analiza wzrostu bakterii

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Wzrost kultur bakterii znakowanych radioaktywnie w mikromiareczkowych szalkach ułatwia pobieranie próbek o wysokiej przepustowości, co pozwala na wiele technicznych i biologicznych testów replikacji obfitości puli nukleotydów, w tym (p)ppGpp. Można monitorować skutki przemian wzrostowych wywołanych przez źródła stresu fizjologicznego, a także powrót do zdrowia po stresie.

Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Trwałość antybiotyku opisuje zdolność małych subpopulacji we wrażliwej populacji izogenicznej do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Niniejszy protokół łączy podejścia do scharakteryzowania fenotypu trwałości antybiotyku na poziomie molekularnym i komórkowym po wystawieniu Escherichia coli na działanie śmiertelnych dawek ofloksacyny.

Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

Poznaj dynamikę ekspresji genów bakterii S. typhimurium w nowotworach u myszy z wykorzystaniem bioluminescencyjnego obrazowania in vivo. Ta metoda pozwala ilościowo mierzyć wzrost bakterii w czasie rzeczywistym.

Pomiar dynamiki wzrostu i ekspresji genów bakterii S. typhimurium ukierunkowanych na nowotwór

Przeglądaj więcej filmów