Name: Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj izolację neuronów czuciowych Aplysia californica do badań elektrofizjologicznych metodą patch clamp. Technika ta umożliwia pomiar prądów jonowych aktywowanych napięciem i agonistami w krótkoterminowej kulturze komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ufundowane przez NIH P40 OD010952, Fundację Korein, stypendium Uniwersytetu Miami dla SLC i stypendium Maytag dla ATK. Autorzy wyrażają wdzięczność pracownikom National Resource for Aplysia, a także Lauren Simonitis i Hannah Peck, które dostarczyły mikrofotografie do rysunku.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>W dniu 1 zważ i znieczul zwierzę.
 <ol>
 <li>Zważ zwierzę o wadze 30 g-1 kg. Znieczulenie w 5-10 objętościach zwierzęcych 1:1 wody morskiej: izotoniczny MgCl . 6H20 przez 1 godzinę z napowietrzaniem, takim jak elektryczna pompa powietrza do akwarium z dołączonym kamieniem napowietrzającym.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotuj materiały do preparacji.
 <ol>
 <li>Zamontuj czystą tacę preparacyjną za pomocą prostych kołków ze stali nierdzewnej, takich jak szpilki z tkaniny. Zebrać kilka szalek Petriego zawierających sztuczną wodę morską (ASW; patrz tabele 1 i 3) + penicylinę/streptomycynę (P/S).</li>
 <li>Przygotuj mikroskop o małej mocy. Przygotuj czyste narzędzia do preparacji, takie jak prążkowane nos i cienkie kleszcze chirurgiczne oraz cienkie i duże nożyczki chirurgiczne. Przed użyciem spryskaj narzędzia 70% alkoholem izopropolowym i pozostaw do wyschnięcia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Umieść zwierzę na tacy sekcyjnej.
 <ol>
 <li>Umieść zwierzę brzuszną stroną do dołu w tacce sekcyjnej. Przypnij zwierzę przez krawędzie ściany ciała i granice przypodialne, ale unikaj ogona i głowy, aby odsłonić powierzchnię grzbietową i rowek narządów płciowych</li>
 <li>Opłucz powierzchnię grzbietową w wolno płynącej zimnej wodzie z kranu. Nałóż lekki strumień 70% alkoholu izopropolowego z butelki do wyciskania wzdłuż rowka narządów płciowych i na czubek głowy.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wykonaj początkowe nacięcie.
 <ol>
 <li>Używając mikroskopu o małej mocy (patrz Tabela 2) i odbitego światła, aby obserwować punkt, w którym rowek narządów płciowych zaczyna się od przedniego brzegu muszli, napięto przytrzymaj kleszczami z żebrowanym nosem fałd tkanki na lewo od tego początku, jednocześnie wycinając płytką dziurę przez gładki, płaski obszar ściany ciała tuż po prawej stronie rowka narządów płciowych za pomocą cienkich nożyczek pod kątem.</li>
 <li>Należy obserwować, jak hemolimfa wylewa się z otworu, czasami niosąc ze sobą ganglion brzuszny i żołądek.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Rozszerz nacięcie.
 <ol>
 <li>Użyj dużych nożyczek, aby rozszerzyć nacięcie do przodu do punktu między nosorożcami, jednocześnie ciągnąc w górę dolnym ostrzem, aby uniknąć nacięcia jelita. Będzie można zaobserwować, że narządy wewnętrzne wylewają się z nacięcia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Usuń zwoje nerwowe.
 <ol>
 <li>Zmień położenie tacki i ponownie ustaw ostrość mikroskopu na obszarze głowy.</li>
 <li>Za pomocą czystych kleszczy i cienkich nożyczek usuń zwoje głowy, przecinając w pewnym momencie nerwy, które tworzą zwoje głowy w pierścień wokół przełyku, aby usunąć pedał opłucnowy i zwoje mózgowe jako grupę.</li>
 <li>Usuń zwój policzkowy, który przylega do brzusznej strony przełyku.</li>
 <li>Usuń zwój brzuszny, przecinając 4 duże łączniki nerwowe, które wychodzą z tego ganglionu.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Wyizoluj zwoje zainteresowania.
 <ol>
 <li>Rozsuń zwoje głowy, pozostawiając długość łączników przyczepioną do każdego interesującego zwoju, która jest równa co najmniej średnicy zwoju; opóźni to nadmierne trawienie enzymów w interesujących komórkach w następnym kroku.</li>
 <li>Przeprowadź każdy docelowy ganglion przez 2 płukania ASW + P/S, przesuwając się między płukaniami czystymi kleszczami.</li>
 <li>Jeśli celujesz w komórki PVC, pozostaw prawy hemiganglion opłucnej przymocowany do półramienia prawego pedału i podobnie pozostaw lewy hemiganglion opłucnej przymocowany do półramienia lewego pedału.</li>
 <li>Wyrzuć niechciane zwoje i resztę zwierzęcia zgodnie z przyjętą praktyką badawczą.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Enzymatycznie trawić zwoje jaj.
 <ol>
 <li>Dla każdego ganglionu przygotować 1 ml roztworu enzymatycznego składającego się z 3,75 mg dypazy, 1 mg hialuronidazy i 0,3 g kolagenazy typu XI na ml ASW + P/S w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml.</li>
 <li>Umieść wypłukane zwoje w roztworze enzymu i mocno przykręć nasadkę. Umieścić probówkę na boku na wytrząsarce obrotowej (patrz Tabela 2) na niskich obrotach przez 13-5 godzin przez noc w temperaturze około 23 °C (temperatura pokojowa).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotuj potrawy z kultur.
 <ol>
 <li>Przed mikrodysekcją (dzień 2) przygotuj szalki hodowlane pokryte poli-D-lizyną (PDL) w kapturze do hodowli tkankowych. Dodaj ~0,5 ml PDL (0,2 mg/ml sterylnej wody) do środka naczynia o średnicy 35 mm na ~25 min.</li>
 <li>Spłucz PDL 3x sterylną wodą. Pozostawić do wyschnięcia. Sterylizuj płytki promieniami UV.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Dzień 2 Wyizoluj neurony.
 <ol>
 <li>Napełnij środek naczyń o średnicy 35 mm, które zostały pokryte PDL i wysterylizowane promieniami UV, około 0,5 ml ASW + P/S, aby utworzyć wyspę podłoża wewnątrz suchego naczynia. Można to zrobić na stole, poza kapturem do hodowli tkankowych. Na każde skupisko komórek pochodzących z półzwoju należy przygotować jedno danie.</li>
 <li>Przygotować naczynie rozwarstwiające o średnicy 100 mm, wykonane przez powlekanie sylgardem i utwardzanie powierzchni rozwarstwiania o głębokości 5 mm, wyposażone w drobne szpilki preparacyjne o kilku rozmiarach, które mają być używane jako kołki i sondy (patrz Tabela 3). Opłucz to naczynie 70% alkoholem izopropolowym, następnie ASW + P/S, a na koniec napełnij je ASW + P/S.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przygotować mikrodysekcję strawionych zwojów nerwowych.
 <ol>
 <li>Wlać roztwór enzymu zawierający strawiony pedał opłucnowy i zwoje policzkowe do naczynia rozwarstwiającego.</li>
 <li>Umieść naczynie na stoliku mikroskopu na czarnej powierzchni w odbitym świetle.</li>
 <li>Za pomocą dołączonej tkanki łącznej przypnij każdą stronę grzbietową hemiganglion pedału opłucnej do góry. Tkanki będą miękkie i nietolerancyjne rozciągania.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Mikrodysekcja neuronów PVC.
 <ol>
 <li>Używając 2 par czystych, drobnych kleszczy i trzymając drobną szpilkę do wypreparowania w jednej parze kleszczy jako sondę, odizoluj komórki PVC od półzwoju opłucnej. Trawienie enzymatyczne usunie lub rozbije osłonkę tkanki łącznej pokrywającą klaster PVC, ale komórki będą ze sobą przylegać.</li>
 <li>Użyj sondy, aby odłączyć te komórki od łącznika pedał-opłucna18, a następnie pozwól, aby klaster komórek opadł na dno naczynia rozwarstwiającego.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przenieś neurony do naczynia hodowlanego.
 <ol>
 <li>Przenieś klaster komórek do przygotowanego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm, delikatnie zasysając klaster do końcówki lekko wypolerowanej jednorazowej szklanej pipety Pasteura, a następnie powoli dozując go do wyspy pożywki w naczyniu hodowlanym, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do pipety. Powtórzyć izolację klastra PVC drugiego hemiganglionu i umieścić w oddzielnym naczyniu hodowlanym.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Mikrodysekcja i transfer neuronów BSC.
 <ol>
 <li>Przypnij zwój policzkowy brzuszną stroną do góry, uważając, aby oszczędzić interesujące komórki. Powtórz krok 1.12 z 2 skupiskami komórek BSC w zwoju policzkowym10.</li>
 <li>Izolacja neuronów PVC i BSC pozwoli na uzyskanie 4 szalek hodowlanych zawierających klastry neuronów: 2 szalki zawierające klastry BSC i 2 szalki zawierające klastry PVC. Odrzucić resztę zwojów nerwowych i odłożyć naczynie do rozwarstwiania o średnicy 100 mm.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Oddziel skupiska komórek.
 <ol>
 <li>Umieścić naczynie hodowlane zawierające komórki na stoliku mikroskopu małej mocy i zdjąć pokrywę.</li>
 <li>Oddziel klaster PCW, delikatnie przesuwając dno naczynia hodowlanego przylegającego do klastra komórkowego za pomocą cienkiej szpilki rozwarstwiającej trzymanej w kleszczach. Flicking to wbijanie końcówki szpilki w plastik dna naczynia, jakby próbował wykopać drobinkę plastiku. Kiedy tarcie o plastik zwalnia punkt szpilki, przez medium wytwarzana jest fala udarowa, która rozbija pobliską kępę komórek.</li>
 <li>5-10 ruchów może być potrzebnych do prawie całkowitego rozdzielenia komórek, ale lepiej jest pozostawić małe skupiska komórek, niż pstrykać zbyt dużo, aby komórki nie zostały zniszczone przez mechaniczne prześwitywanie.</li>
 <li>Załóż pokrywę i powtórz z innymi naczyniami hodowlanymi.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Przechowuj kultury komórkowe.
 <ol>
 <li>Umieścić szalki hodowlane zawierające wyspy pożywki w ich środkach ze zdysocjowanymi komórkami w dużym pojemniku umożliwiającym cyrkulację powietrza, takim jak okrągła plastikowa szalka Petriego o wymiarach 150 x 25 mm, i umieścić tę szalkę w inkubatorze ustawionym na 17 °C.</li>
 <li>Zainstaluj w komorze otwarte naczynie z wodą jako źródło wilgoci. Pozostaw na noc w spokoju. Komórki będą przylegać do powłoki poli-D-lizynowej na środku naczynia.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Naczynia z kulturą powodziową.
 <ol>
 <li>W dniu 3 delikatnie zalej szalki 2,5 ml ASW + P/S. Zbadaj i policz komórki za pomocą mikroskopu z odwróconą hodowlą komórek. Przechowywać w inkubatorze w temperaturze 17 °C.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Elektrofizjologia
Metoda to standardowe zaciskanie łatek, które zostało opisane w licznych tekstach (np. Sakmann i Neher, 1995)16. Protokół ten będzie działał na komórkach o pojemności ≤100 pF lub komórkach o średnicy <60 μm w dniach 3 i 4 protokołu. Komórki bez procesów są optymalne do nagrywania. Obowiązują następujące uwagi specjalne:
<ol>
 <li>Większe ogniwa można dostosować za pomocą ustawienia konfiguracyjnego wzmacniacza Axopatch 200B ustawionego na β=0,1. Aktywacja bardzo dużych prądów może spowodować ucieczkę ogniw z cęgów napięciowych. Roztwory ASW podstawione zawartością soli (np. frakcja NaCl podstawiona nieprzepuszczalnym chlorkiem N-metylo-D-glukaminy) mogą być stosowane w celu zmniejszenia amplitudy prądu całego ogniwa.</li>
 <li>Odpowiednie są pipety z plastrami borokrzemianowymi wypełnione włóknami, naciągnięte na ściągacz do pipet i wypełnione do połowy roztworem wewnątrzkomórkowym (ICS) składającym się z 450 mM KCl i innych soli (patrz Tabela 1), które powinny mieć rezystancję około 0,5-1 MOhms. Jeśli pożądana jest izolacja określonych prądów jonowych, na przykład prądów Na+ przy braku prądów K, K+ w tym roztworze można zastąpić innymi jonami, takimi jak Cs+. Cl- zastąpienie ICS nieprzepuszczalnym anionem jest również uzasadnione, jeśli pożądany jest bardziej naturalny ICS9.</li>
 <li>Ogniwa są wytrzymałe i możliwe są zapisy trwające >1 godziny w temperaturze pokojowej. Zapis jest optymalny w 3 i 4 dniu protokołu, co odpowiada 24-48 godzinom w hodowli. Po 48 godzinach pojawiają się trudności z tworzeniem uszczelek gigaOhm, być może z powodu tworzenia się glikokaliksu na powierzchni komórki i problemów z zaciskiem przestrzennym spowodowanych przerostem procesu. Komórki są jednak przydatne do badań bez zacisku punktowego, takich jak toksykologia, które można ukończyć w ciągu <14 d.</li>
 <li>ASW i inne roztwory, które mają być dozowane z urządzenia do roztworu zasilanego grawitacyjnie, a także roztwór wewnątrzkomórkowy, powinny być filtrowane przez zamontowany w strzykawce filtr Acrodisk 0,2 μm (Tabela 3) w celu wyeliminowania drobnych cząstek, które zakłócają tworzenie się uszczelnienia gigaOhm.</li>
 <li>Odczulanie następuje przy stosowaniu agonistów, takich jak D-asparaginian (D-Asp), dlatego zaleca się ~1-2 minuty między aplikacjami agonistów. I odwrotnie, wzmocnienie jest często obserwowane przy szybkim, powtarzającym się stosowaniu agonistów, takich jak L-glutaminian (L-Glu).</li>
 <li>Prądy aktywowane przez agonistów, takie jak L-Glu, można badać, stosując agonistów za pomocą pipety picospritzer. Pipeta ta jest ciągnięta tak samo jak pipeta z plastrem i zawiera agonistę w ASW. Gdy końcówka tej pipety zostanie umieszczona poniżej rury odpływowej urządzenia do roztworu zasilanego grawitacyjnie i pod kątem 45° od rury odpływowej (rysunek 2F), agonista zostanie szybko wypłukany z ogniwa, a odczulanie zostanie zminimalizowane. Pipeta agonistyczna powinna tworzyć kąt 90° lub większy w stosunku do pipety z plastrem.</li>
</ol>

<ol><li>Buttner, N., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+modulation+of+a+hyperpolarization-activated+Cl%28-%29+current+in+Aplysia+sensory+neurons+by+SCP%28B%29+and+FMRFamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide.</a> J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).</li>
<li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).</li>
<li>Carlson, S. L., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).</li>
<li>Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evidence+that+D-Aspartate+activates+a+current+distinct+from+ionotropic+glutamate+receptor+currents+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Behav%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica.</a> Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).</li>
<li>Fieber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2B+and+Ca2%2B+currents+in+bag+cells+of+sexually+immature+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).</li>
<li>Fieber, L. .A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+D-Aspartate+ion+currents+in+the+Aplysia+nervous+system+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging.</a> Br. Res. 1343, 28-36 (2010).</li>
<li>Glansman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habituation+in+Aplysia%3A+The+Cheshire+Cat+of+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).</li>
<li>Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cellular+Mechanism+of+Classical+Conditioning+in+Aplysia%3A+Activity-Dependent+Amplification+of+Presynaptic+Facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%2C+New%22%5BJournal%5D)">A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation.</a> Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).</li>
<li>Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+acetylcholine+on+ventrocaudal+sensory+neurons+in+the+pleural+ganglia+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia.</a> Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Cellular+basis+of+behavior%22">Cellular basis of behavior</a>. , W.H. Freeman. New York. (1976).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+memory+storage%3A+a+dialog+between+nerves+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses.</a> Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).</li>
<li>Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+correlates+of+habituation+and+habituation+of+the+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).</li>
<li>Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+an+Aplysia+bag-cell+neuron+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+A+and+a+protein+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase.</a> J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).</li>
<li>R, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transcriptome+of+Aplysia%3A+neuronal+compartments+and+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry.</a> Cell. 127, 1453-1467 (2006).</li>
<li>Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+underlying+developmental+regulation+of+repetitive+firing+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. NY. (1995).</li>
<li>Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+Ca2%2B+current+contributes+to+a+prolonged+depolarization+in+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).</li>
<li>Schacher, S., Proshansky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+regeneration+by+Aplysia+neurons+in+dissociated+cell+culture%3A+modulation+by+Aplysia+hemolymph+and+the+presence+of+the+initial+axonal+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment.</a> J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).</li>
<li>Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoafferent+neurons+innervating+tail+of+Aplysia.+I.+Response+properties+and+synaptic+connections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections.</a> J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).</li>
<li>Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Ca%282%2B%29-sensitive+nonspecific+cation+channel+underlying+prolonged+repetitive+firing+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons.</a> J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).</li>
<li>White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li>
<li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J. Vis. Exp. (28), e1355(2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane tutaj techniki dysocjacji dają kultury neuronów czuciowych zawierające 50-100 izolowanych neuronów przeplatanych niewielką liczbą komórek glejowych i innych niezidentyfikowanych komórek. Najbardziej krytycznymi krokami w protokole są czas, w którym zwoje pozostają w roztworze enzymu, oraz migotanie, dysocjacja strawionych klastrów komórkowych w celu rozbicia klastra na pojedyncze komórki. Trawienie enzymatyczne (krok 1.8) musi być zoptymalizowane w dostępnej temperaturze. W temperaturze 23 °C z powolnym wstrząsan...

morski, Aplysia, jest użytecznym modelem neurobiologicznym od wielu dziesięcioleci. Najbardziej znany jest jako model habituacji i warunkowania klasycznego 7, 8. Badania nad uczeniem się i pamięcią w tym modelu zdobyły Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 2000 roku dla Erica R. Kandela, w nagrodzie, którą dzielił z Arvidem Carlssonem i Paulem Greengardem 10. Badania z udziałem zapisów elektrycznych ze zredukowanych preparatów, w których elementy układu nerwowego tego bezkręgowca są wycinane ze zwierzęcia z pozostawionymi nerwami i mięśniami, pomogły wyjaśnić rolę poszczególnych neuronów w Aplysia. Identyfikacja precyzyjnych mechanizmów molekularnych, które składają się na uczenie się w Aplysia, często wykorzystywała jednak inną technikę, długoterminowe kohodowle neuronu czuciowego i motoneuronu, uzyskiwane jeden po drugim od poszczególnych zwierząt dawców i pozwalane na utworzenie synapsy w naczyniu hodowlanym 21.
My i inni 1, 3, 6, 14, 15, 16 wykorzystaliśmy łatwość, z jaką zidentyfikowane neurony mogą być celem w tym modelu, jak również ich wytrzymałość w długoterminowych eksperymentach, aby stworzyć dysocjowane krótkoterminowe kultury klastrów nominalnie jednorodnych neuronów, w których badamy prądy jonowe pod zaciskiem napięcia w konfiguracji patch clamp. Wiele neuronów Aplysia wytrzymuje powtarzające się rundy zaciskania łat, aby dać czas na długotrwałe manipulacje eksperymentalne. Technika ta jest przydatna dla neuronów, takich jak komórki torebki neurowydzielniczej zwoju brzusznego oraz neurony czuciowe zwojów opłucnej i policzkowej, których dysocjację opisujemy tutaj, ale nie dla bardzo dużych neuronów o średnicy >60 μm, takich jak L7 lub R2 zwoju brzusznego. Nie stosujemy surowicy Aplysia w naszych hodowlach, w przeciwieństwie do kokultur neuronów czuciowo-ruchowych opisanych w innych miejscach. Większość neuronów uzyskanych przy użyciu tej procedury będzie pozbawiona procesów przez pierwsze 48 godzin w hodowli, co ułatwi rejestrację napięcia całej komórki, ale następnie wykiełkuje i rozwinie aksony i inne procesy przez około 14 dni, zanim umrze z powodu braku składników odżywczych i / lub czynników wzrostu.
Ta technika tworzy pierwotne kultury 50-100 neuronów na talerz z fizjologicznie udokumentowanych regionów zwojów policzkowych i opłucnowych. Protokół ten jest przydatny dla naukowców badających aspekty fizjologii pojedynczej komórki w eksperymentach, które wymagają wielu powtórzeń eksperymentalnych na zwierzę. Wytwarza dopasowaną parę kultur ze względu na anatomiczny podział komórek docelowych na lewą i prawą hemiganglia, co pozwala na badania, które korzystają z dopasowanych kultur poddanych działaniu substancji i kontrolnych.
Protokół jest skierowany do neuronów grupy S (BSC) w zwoju policzkowym oraz neuronów brzuszno-ogonowych opłucnej (PVC) w zwoju opłucnej. Komórki te mają odpowiedni rozmiar do zapisów napięcia całych komórek i wykazują silne odpowiedzi glutaminergiczne. Omawiana metodologia jest odpowiednia dla większości zwojów nerwowych układu nerwowego Aplysia.

<table><tbody><tr><td>Sztuczna woda morska ASW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>różne</td> <td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7,6</td></tr><tr><td>Roztwór wewnątrzkomórkowy</td><td>Sigma</td><td>różne</td> <td>(mM): 450 KCl, 2,9 CaCl2 (2 H2O), 2,5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA i 40 HEPES-KOH, pH 7,4</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna dodana do ASW o 1:100</td><td>Lonzo Walkersville, Inc.</td><td>17-603E</td><td>5 000 jednostek/ml penicyliny plus 5 000 mg/ml streptomycyny</td></tr><tr><td>Neutralna dyspaza II</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10165859001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>kolagenaza typu XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutaminian (L-Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-asparaginian (D-asp)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11200-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N-metylo-D-asparaginian (NMDA)</td><td>Biomol</td><td>100002-268</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asp</td><td>Sigma</td><td>A6683-25G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas alfa-amino-3-hydroksylo-5-metylo-4-izoksazolowo-propionowy (AMPA)</td><td>Sigma</td><td>A6816-5MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antagoniści L-Glu R</td><td>różne</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>agar</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>kynurenate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas DL-2-amino-5-fosfonopentanowy (antagonista NMDAR)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWRSP</td><td>BDH1133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór chlorujący</td><td>Sigma</td><td>różne</td><td>25 g FeCl3 + 25 ml stężonego HCl + 50 ml H2O</td></tr><tr><td>Silikon Sylgard 2-częściowy polimer</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYL184</td><td>Zapewnia powierzchnię wyprowadzającą dla małych naczyń preparacyjnych</td></tr><tr><td>Mikroskop z powiększeniem 0-40x do sekcji</td><td>Dziki</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Techniquip 150 watów Oświetlacz światłowodowy</td><td>Mikrooptyka Florydy</td><td>TQ FOI-150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Mieszarka <td></td><td></td><td>oscylacyjna RotoMix 50800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym Nikon Diaphot z obiektywami 4x, 20x (opcjonalnie) i 40x</td><td>SR Research Ltd.</td><td>Eyelink II&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Oscyloskop cyfrowy Tektronix</td><td>SR Research Sp. z o.o.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych pClamp 10</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Komputer PC z systemem operacyjnym Windows XP lub nowszym</td><td>Rozwiązania</td><td></td> komputerowe <td>Thinkserver z półprzewodnikowymi dyskami twardymi (80 GB) i monitorami o niskim poziomie szumów</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet P87 Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Axon Instruments Wzmacniacz cęgowy Axopatch 200B o zakresie kompensacji pojemności 1-1000 pF; przedwzmacniacz</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Zespół uchwytu elektrody Axon instruments do przedwzmacniacza Axopatch 200B</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td><td>CV203BU</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1200 Przetwornik A/D</td><td>Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Picospritzer, zasilany przez N2 z regulacją ciśnienia i czasu trwania</td><td>Parker Hannifin, Cleveland, OH&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>TMC Micro-G Stół wibroizolacyjny</td><td>Ametek</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Klatka</td><td></td><td></td><td>Faradaya produkcja na zamówienie</td></tr><tr><td>Burleigh Piezoelektryczne mikromanipulatory z klapką</td><td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td><td></td><td>obecnie PCS-5000; -6000 seria + mocowania</td></tr><tr><td>manipulatorów ręcznych Narishige M-152 (do systemu perfuzyjnego i pikospritzera)</td><td>Narishige USA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Szklana pipeta z filamentem, 1,5 mm średnica zewnętrzna, średnica wewnętrzna 0,84 mm -</td><td>WPI</td><td>1B150-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3 cale długości</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ag/AgCl półogniwo</td><td>WPI</td><td>EP4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml, 35-2097 Probówki wirówkowe BD Falcon*</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki kątowe</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15006-09</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumostar Szczypce do drobnych narzędzi</td><td>naukowych</td><td>11295-00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowych sokoła 35 mm</td><td>VWRSP</td><td>25382-064</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowych Falcon 150 x 25 mm; 1013</td><td>VWRSP</td><td>1013</td><td>można również przerabiać na małe naczynia rozwarstwiające z sylgardem</td></tr><tr><td></td><td>sylgard WPI</td><td>SYL184</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Taca do sekcji zwierząt</td><td>różne</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml, 35-2097 BD Falcon</td><td>VWRSP</td><td>21008-918</td><td>Do 6-otworowego grawitacyjnego systemu perfuzyjnego</td></tr><tr><td>Aluminiowe klipsy z końcówkami na</td> Sklep <td></td><td>z narzędziami</td><td>Do systemu perfuzyjnego</td></tr><tr><td>Igły o rozmiarze 23 (ręcznie piłuj punkty)</td><td>VWRSP</td><td></td><td>Do systemu perfuzyjnego</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa 0,022"ID x 0,042"OD; 427411</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>Do system perfuzyjny</td></tr><tr><td>H-7 stojak/uchwyt na pipety do mikronasadki do perfuzji</td><td>Narishige USA</td><td></td><td>Do</td></tr><tr><td>zaworów jednokierunkowych</td> systemu perfuzyjnego <td></td><td></td><td>Do systemu perfuzyjnego</td></tr><tr><td>Drummond Microcaps 1 &mu; l</td><td>VWRSP</td><td></td><td>Do systemu perfuzyjnego</td></tr><tr><td>18 igieł do odsysania (punkty spiłowania)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>Cole Parmer</td><td>4.27436E+11</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>drobne szpilki preparacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>rurki kapilarne</td><td>Kimble 71900-100</td><td></td><td>polerowane ogniowo i w kształcie litery U w płomieniu palnika Bunsena i wypełnione 3% agarem w</td></tr><tr><td>sklepie</td><td></td> z<td>plasteliną</td> ECS<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>uchwyt na talerz do stolika mikroskopowego z izolowaną kąpielą</td><td></td><td></td> gruntową <td>Pipety</td></tr><tr><td>pasteura</td> produkcji na zamówienie <td>VWRSP</td><td>14672-412</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>żarówki do pipet</td><td>VWRSP</td><td>53283-911</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>filtry strzykawkowe acrodisk</td><td>VWRSP</td><td>28144-040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>grubościenne szkło borokrzemianowe o średnicy 1,5 mm</td><td>WPI</td><td>1B150F-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Butla z azotem o wysokiej czystości i regulator</td><td></td><td></td> bifurcyjny<td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tabele 1-3. Wykazy odczynników, materiałów i sprzętu.</s></td></tr></tbody></table>

izolacja neuronów czuciowych aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Ślimak morski Aplysia californica ma długą historię jako model funkcjonowania układu nerwowego, ze szczególnym znaczeniem w badaniach nad uczeniem się i pamięcią. Typowymi przygotowaniami do takich badań są te, w których neurony czuciowe i ruchowe pozostają nienaruszone u minimalnie wypreparowanego zwierzęcia lub technicznie wyszukana współkultura neuronalna poszczególnych neuronów czuciowych i ruchowych. Rzadziej spotykany jest izolowany preparat neuronalny, w którym małe skupiska nominalnie jednorodnych neuronów są dysocjowane na pojedyncze komórki w krótkotrwałej hodowli. Takie wyizolowane komórki są przydatne do biofizycznej charakterystyki prądów jonowych przy użyciu technik patch clamp i ukierunkowanej modulacji tych przewodności. Opisano protokół przygotowania takich kultur. Protokół wykorzystuje łatwe do zidentyfikowania glutaminergiczne neurony czuciowe zwojów opłucnej i policzkowej oraz opisuje ich dysocjację i minimalne utrzymanie w hodowli przez kilka dni bez surowicy.

Lokalizacje neuronów sensorycznych w zwojach, które są celem w niniejszym protokole – neuronów BSC i PVC – przedstawiono na Rysunku 1. Neurony BSC znajdują się w dwóch symetrycznych owalnych skupiskach po stronie brzusznej zwoju gębowego, czyli na powierzchni skierowanej w stronę przeciwną do masy gębowej w nienaruszonym zwoju (Rysunek 1A). Neurony PVC tworzą obustronne skupiska w kształcie litery V, które owijają się wokół powierzchni grzbietowej zwoju pleadingowego w kierunku osi centr...

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie pojedynczych neuronów sensorycznych splotów w krótkotrwałej kulturze. W celu przeprowadzenia badań metodą patch clamp, osiąga się to najpierw poprzez wypreparowanie zzeń zawierających komórki sensoryczne z znieczulonego zwierzęcia. Drugim krokiem jest trawienie zzeń w roztworze enzymatycznym przez noc.Następnie z trawionych zwojów wypreparowuje się interesujące neurony sensoryczne. Ostatnim krokiem jest dysocjacja przygotowanych naczyń hodowlanych w celu umożliwienia przylegania do podłoża hodowlanego przez noc. Ostatecznie stosuje się metodę clampowania napięcia (voltage clamp), aby zbadać sterowane napięciem i agonistami prądy jonowe występujące w tych neuronach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak rejestracja komórek in situ, jest to, że izolacja neuronów umożliwia zastosowanie techniki clampingu napięciowego z wykorzystaniem pojedynczej elektrody. Metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych nieznanych kwestii w dziedzinie neurobiologii pszczół, takich jak tożsamość prądów jonowych aktywowanych przez neurotransmitery zaangażowane w procesy uczenia się i pamięci. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą napotykać trudności ze względu na wrażliwość neuronów na trawienie enzymatyczne i rozprzestrzenianie na naczyniach hodowlanych.Pomysł na tę metodę pojawił się u nas, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że pewne prądy glutaminergiczne, istotne dla procesów uczenia się i pamięci, zyskałyby na izolacji komórek zapewnianej przez tę technikę. Procedurę zaprezentują doktoranci, Andy Kesel i Justin Greer. Rozpocznij tę procedurę, kładąc znieczulone zwierzę stroną brzuszną do dołu w kuwecie sekcyjnej.Przypnij zwierzę przez krawędzie ściany ciała i brzegi okołopakietowe, unikając jednak ogona i głowy, aby odsłonić powierzchnię grzbietową bruzdy genitalnej. Następnie opłucz powierzchnię grzbietową pod powolnym strumieniem zimnej wody z kranu. Potem nanieś lekki strumień 70% isopropyl alcohol z butelki z dozownikiem wzdłuż bruzdy genitalnej oraz na górną część głowy.Aby wykonać początkowe nacięcie, należy mocno utrzymać fałd tkanki po lewej stronie podstawy bruzdy genitalnej za pomocą pęsety z tępym końcem (rib nose forceps), jednocześnie wycinając płytki otwór przez całą gładką, płaską powierzchnię ściany ciała, tuż po prawej stronie bruzdy genitalnej, za pomocą pary cienkich nożyczek kątowych. Następnie należy poszerzyć nacięcie w kierunku przednim do punktu między czwartymi ROF, jednocześnie odciągając dolne ostrze ku górze, aby uniknąć uszkodzenia jelita. W dalszej kolejności należy użyć czystej pęsety i cienkich nożyczek, aby usunąć zwoje gławne poprzez przecięcie miejsca, w którym nerwy tworzące zwoje gławne przekształcają się w pierścień wokół przełyku, co pozwoli na usunięcie zwojów plejralnych, pedalnych i mózgowych jako jednej grupy.Następnie należy usunąć zwoj podgardłowy przylegający do brzusznej strony przełyku. Aby wyizolować interesujące nas zwoje, należy rozdzielić zwoje głowowe, pozostawiając przy każdym z nich fragment tkanki łącznej o długości co najmniej równej średnicy zwoju. Zapobiegnie to nadmiernemu trawieniu komórek przez enzym w kolejnym kroku.Następnie należy dwukrotnie przepłukać każdy z docelowych zwojów w naczyniach z powierzchniową sztuczną wodą morską z dodatkiem penicyliny i streptomycyny. W przypadku targetowania komórek PVC należy pozostawić prawy półzwoj pleuralny połączony z prawym półzwojem petalnym, a analogicznie lewy półzwoj pleuralny połączony z lewym półzwojem petalnym. Następnie przepłukane zwoje należy umieścić w roztworze enzymu i szczelnie zamknąć zakrętką.Następnie umieść probówkę poziomo na wytrząsarku obrotowym i ustaw niską prędkość na 13 do 15 godzin w ciągu nocy w temperaturze około 23 °C. W tej procedurze wypełnij środek płytek 35 mm, które zostały pokryte PDL i wysterylizowane promieniami UV, około 0,5 mm sztucznej wody morskiej z penicyliną i streptomycyną, aby stworzyć wewnątrz wyspę pożywki. Aby przygotować mikrosekcję trawionych zwojów, wlej roztwór enzymatyczny zawierający trawione zwoje plejralne, stopowe i gębowe do naczynia sekcyjnego.Następnie umieść szalkę na stole mikroskopu na czarnym tle w świetle odbitym. Następnie, używając dołączonej tkanki łącznej, przypnij każdy półganglion pleuralny płatkiem stroną grzbietową do góry; tkanki będą miękkie i podatne na uszkodzenia przy rozciąganiu. Następnie wyizoluj komórki PVC z półganglionu pleuralnego za pomocą dwóch par pincet, trzymając jedną z nich z cienką igłą sekcyjną pełniącą funkcję sondy.Użyj sondy, aby oddzielić te komórki od łączyka płatków. Następnie pozwól, aby skupisko komórek opadło na dno naczynia sekcyjnego. Przenieś skupisko komórek do przygotowanej 35 mm szalki hodowlanej, delikatnie zasysając je końcówką jednorazowej szklanej pipety pasterskiej, której wierzchołek został lekko wypalony nad ogniem.Następnie powoli nanieś go na wyspę z pożywki w naczyniu hodowlanym, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do pipety. Powtórz izolację skupiska komórek PVC z drugiej połowy zwoju i umieść je w oddzielnym naczyniu hodowlanym. Oto mikrofotografia ciemnopomarańczowego, V-kształtnego skupiska komórek PVC z prawej połowy zwoju pleuralnego.Aby przeprowadzić sekcję neuronów BSC. Najpierw ostrożnie przypnij zwoj buccalny stroną brzuszną do góry, dbając o to, by nie uszkodzić komórek docelowych. Następnie wyizoluj komórki BSC, używając dwóch par pęset, trzymając jedną z nich z cienką igłą sekcyjną służącą jako sonda.Następnie za pomocą sondy oddziel te komórki od zwoju gwałtownych (buccal ganglion). Pozwól następnie komórkom opaść na dno naczynia do sekcji. Ten mikrofotograf przedstawia położenie komórek glutaminergicznych zwoju gwałtownych.Neurony BSC można zidentyfikować po ich ciemnopomarańczowym kolorze. Izolacja neuronów PVC i BSC daje cztery szalki hodowlane zawierające skupiska neuronów. Dwie szalki zawierają skupiska BSC, a dwie szalki zawierają skupiska PVC.Pozostałe zwoje odrzucić i odłożyć 100-milimetrową szalkę do sekcji w celu dysocjacji skupisk komórek. Umieścić naczynie hodowlane zawierające komórki na stoliku mikroskopu o małym powiększeniu i zdjąć pokrywkę. Delikatnie stuknąć w dno naczynia hodowlanego w miejscu przyległym do skupiska komórek.Używając precyzyjnej igły sekcyjnej trzymanej w pęsetie, może być konieczne wykonanie od 5 do 10 szybkich ruchów, aby całkowicie rozdzielić komórki. Następnie powtórzyć tę czynność w pozostałych naczyniach hodowlanych. W dalszej kolejności naczynia hodowlane zawierające wyspy medium z rozdzielonymi komórkami umieścić w dużym pojemniku zapewniającym cyrkulację powietrza, np. w okrągłej plastikowej płytce Petri o wymiarach 150 by 25 milimetrów.Następnie należy umieścić szalkę w inkubatorze ustawionym na 17 °C. Do komory należy wstawić otwartą szalkę z wodą w celu zapewnienia odpowiedniej wilgotności, a następnie pozostawić naczynia bez zakłóceń na noc, aby komórki mogły przytwierdzić się do powłoki z polilizyny w centrum szalki. Następnego dnia szalki należy delikatnie zalać 2,5 ml sztucznej wody morskiej z penicyliną i streptomycyną, a następnie zbadać i policzyć komórki przy użyciu odwróconego mikroskopu do hodowli komórkowych.Oto żywe neurony BSC po jednym dniu hodowli; komórki BSC są zazwyczaj większe od komórek PVC, osiągając 40 mikronów. Przedstawiono tutaj żywy neuron PVC po jednym tygodniu hodowli, wykazujący wzrost wypustek. Tutaj widoczny jest prąd pobudzający niesiony przez jony sodu w odpowiedzi na impuls AL glutamate, a tutaj prąd w odpowiedzi na D aspartate.Prądy aktywowane przez NMDA mają zazwyczaj mniejszą amplitudę niż prądy aktywowane przez inne agoniści. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o tym, by nie uszkodzić neuronów podczas dysocjacji. Jedną z zalet tej techniki jest to, że z każdego zwoju powstają dwie kultury, dzięki czemu jedna z nich może służyć jako kontrola dopasowana do kultury eksperymentalnej.Tę technikę można wykorzystać do tworzenia pierwotnych kultur neuronów z plegi lub innych morskich bezkręgowców. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak izolować neurony sensoryczne plegi poprzez trawienie enzymatyczne zwojów, a następnie staranną dysocjację interesujących nas komórek.

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja neuronów zmysłowych Aplysia californica dla zapisów ściągających łańcucha glutamergicznego

Pierwotne kultury neuronów czuciowo-ruchowych Aplysia stanowią modelowe przygotowanie do badania powstawania synaps i plastyczności synaps in vitro.  Film ten przedstawia identyfikację i mikrodysekcję neuronów czuciowych i ruchowych z Aplysia ganglia, a także metody tworzenia i utrzymywania neuronów czuciowo-ruchowych w hodowli.

Przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych Aplysia

Opisano technikę implantacji czterech elektrod in vivo w celu monitorowania neuromięśniowej kontroli zachowania żerowania u Aplysia californica.

Wytwarzanie i implantacja elektrod u Aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Opisujemy technikę pozwalającą na rejestrację i stymulację pozakomórkową nerwów, mięśni oraz pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów in vitro przy jednoczesnym wywoływaniu i obserwowaniu różnych rodzajów zachowań żerowania w aparacie gębowym Aplysia.

Przygotowanie in vitro do wywoływania i rejestrowania programów motorycznych żerowania z ruchami fizjologicznymi u Aplysia californica

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje procedurę mapowania połączeń synaptycznych poprzez zabezpieczenie wycinka mózgu, ustawienie pipet w celu uzyskania konfiguracji całych komórek i stymulowanie neuronów presynaptycznych do rejestrowania odpowiedzi postsynaptycznych, wyjaśniając w ten sposób łączność neuronalną.

Zapis sparowanych połączeń neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Rejestrowanie prądów Ca2+ na błonie czołowej uwalniania presynaptycznego jest kluczem do precyzyjnego zrozumienia wejścia Ca2+ i uwalniania neuroprzekaźników. Przedstawiamy ostrą dysocjację rdzenia kręgowego minoga, która daje funkcjonalne izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe, umożliwiające zapis bezpośrednio z błony czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne.

Ostra dysocjacja aksonów siateczkowo-rdzeniowych minoga w celu umożliwienia rejestracji z błony czołowej uwalniającej poszczególnych funkcjonalnych zakończeń presynaptycznych

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Poznaj izolację neuronów czuciowych Aplysia californica do badań elektrofizjologicznych metodą patch clamp. Technika ta umożliwia pomiar prądów jonowych aktywowanych napięciem i agonistami w krótkoterminowej kulturze komórkowej.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Przeglądaj więcej filmów