Name: Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę losowych badań przesiewowych matrycy mikronasion w celu zwiększenia liczby i jakości dyfrakcyjnej kryształów białkowych. Technika ta usprawnia proces krystalizacji i zapewnia stałe dostarczanie kryształów do dalszych badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez BBSRC (BB/1006478/1). PRR jest stypendystą Royal Society University Research Fellowship.

1. Rozważania strategiczne
<ol>
	<li>Wybór kryształów zarodkowych używanych do eksperymentów z mikrosiewem będzie się różnił w zależności od celu eksperymentu. Na początku projektu pomocne jest znalezienie kilku trafień krystalizacji, które mogą stanowić alternatywne punkty wyjścia do optymalizacji kryształów. rMMS znacznie zmniejsza potrzebę optymalizacji kryształów, ponieważ dobrej jakości kryształy z większym prawdopodobieństwem rosną w strefie metastabilnej diagramu fazowego, tj. w obszarze, w którym po zakłóceniu lub zarodkowaniu system powraca do równowagi. Dlatego sugerujemy rutynowe stosowanie rMMS, gdy tylko uzyskane zostaną pierwsze kryształy (lub, dokładniej, gdy tylko pierwsze kryształy przestaną rosnąć).</li>
	<li>W początkowej rundzie rMMS materiał siewny powinien być wykonany z jak największej ilości materiału krystalicznego. Jeśli dostępny jest tylko jeden dołek, który zawiera kryształy lub jeśli kryształy są małe, pomocne może być ustawienie wielu powtórzeń oryginalnego uderzenia (bez rozsiewania), aby zwiększyć podaż kryształów. Jeśli jednak uzyska się kilka różnych trafień, kryształy zarodkowe można zebrać z kilku warunków i zmieszać ze sobą.</li>
	<li>Aby uniknąć separacji faz, kryształy hodowane w warunkach wysokiej zawartości soli powinny być zbierane oddzielnie od kryształów hodowanych w warunkach wysokiego PEG. Jeśli kryształy z kilku studzienek zostaną zmieszane, do zawiesiny nasion należy wybrać roztwór zbiornikowy, w którym jest mniej prawdopodobne, że da kryształy soli. Na przykład należy unikać wysokich stężeń fosforanów, siarczanów, wapnia i magnezu.</li>
	<li>W dalszej części projektu ważne może być poszukiwanie kryształów z różnymi komórkami elementarnymi w celu poprawy dyfrakcji, uniknięcia bliźniaczych kryształów i uzyskania kryształów, które są odpowiednie do wiązania ligandów. Na tym etapie do produkcji materiału siewnego należy używać tylko najbardziej odpowiednich kryształów (np. tych, które najlepiej ulegają dyfrakcji). Czasami wymagane są powtarzające się rundy mikrosiewu, w których tylko "najlepsze" kryształy są używane do produkcji materiału siewnego na kolejną rundę. Jeśli to możliwe, należy użyć "neutralnego" środka strącającego, takiego jak PEG 3000, do zawieszenia kryształów zarodkowych w celu zachęcenia do nowych kontaktów kryształów i krystalizacji kompleksów, które mogą być niestabilne w roztworach o wysokiej zawartości soli 12.</li>
	<li>Klasyczne eksperymenty z mikrosiewem, w których stosuje się warunek pojedynczej krystalizacji, są często pomocne po zidentyfikowaniu obiecującego warunku i podczas późniejszej optymalizacji. Często konieczne jest rozcieńczenie materiału siewnego, aby uzyskać pożądaną liczbę kryształów na kroplę. "Kombinatoryczny" eksperyment z mikrosiewem (w którym do stanu krystalizacji dodaje się serię nasion o rosnącym rozcieńczeniu) jest szybką metodą znalezienia optymalnego rozcieńczenia materiału siewnego. To podejście zostało opisane poniżej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiału siewnego
<ol>
	<li>Wykonaj zaokrągloną szklaną sondę ze szklanej pipety Pasteura za pomocą płomienia Bunsena.
	<ol>
		<li>Podgrzej pipetę w pobliżu środka, aż stanie się miękka, a następnie szybko zdejmij ją z płomienia i wyciągnij, rozsuwając końce. Staraj się ściągnąć szkło do średnicy poniżej 0.25 mm.</li>
		<li>Rozbij szklankę w miejscu, w którym znajduje się na około 0,25 mm i na krótko zanurz pęknięty koniec w płomieniu. Powtarzaj to, aż na końcu utworzy się półkula szkła o średnicy ~0,75 mm. Sonda ta jest przydatna do kruszenia materiału krystalicznego, ponieważ jest odpowiednio dobrana do uderzania w ciała stałe w skali 0,01-1,0 mm i nie uszkadza plastikowej powierzchni tacki krystalizacyjnej, sub-studzienki lub szkiełka nakrywkowego. Większe sondy (~1,0 mm) mogą skuteczniej kruszyć małe kryształy, ponieważ kryształy są uwięzione między szkłem a plastikiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść na lodzie probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającą koralik nasienny.</li>
	<li>Sprawdzić wstępnie ustaloną tacę krystaliczną za pomocą mikroskopu dwuokularowego lub systemu obrazowania kryształów i wybrać z tacy jeden lub więcej odpowiednich dołków, z których chcesz zebrać materiał krystaliczny do wytworzenia materiału siewnego. Można użyć dowolnego materiału, w tym cienkich igieł, sferulitów, mikrokryształów i nieregularnych, słabo uformowanych kryształów. Materiał siewny powinien być wykonany jak najszybciej po tym, jak kryształy przestaną rosnąć, ponieważ istnieje większe prawdopodobieństwo, że starszy materiał zostanie częściowo usieciowany, co zmniejszy jego przydatność do wykorzystania w doświadczeniach z wysiewem. Jeżeli istnieją jakiekolwiek wątpliwości co do tego, czy materiał krystaliczny, który ma zostać zebrany, jest solą czy białkiem, studzienka może być uwidoczniona za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego UV lub systemu obrazowania przed otwarciem, lub materiał krystaliczny można poddać analizie dyfrakcji rentgenowskiej in situ na tacy. Przy użyciu pierwszego podejścia kryształy białek będą fluoryzować pod wpływem promieniowania UV, kryształy soli będą wydawać się bezbarwne.</li>
	<li>Otwórz dobrze wybraną tacę krystalizacyjną. W przypadku 96-dołkowych tacek wrzutowych należy przeciąć górny plastikowy arkusz uszczelniający wokół wybranej studzienki za pomocą ostrza skalpela. W przypadku 24-dołkowych wiszących tac wrzutowych usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety. Odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na stabilnej, czystej powierzchni. Usunąć 50 μl roztworu zbiornika i przenieść ten płyn do probówki mikrowirówki zawierającej kulkę nasienną, upewniając się, że probówka pozostaje na lodzie przez cały czas.</li>
	<li>Dokładnie rozdrobnić kryształy w kroplach z dołka (taca 96-dołkowa) lub szkiełka nakrywkowego (taca 24-dołkowa), używając szklanej sondy przygotowanej w sekcji 2.1, oglądając wyniki pod mikroskopem. Dokładne zmiażdżenie małych kryształów może zająć kilka minut. Ten krok pozwala eksperymentatorowi sprawdzić, czy kryształy są łatwe do zgniecenia i dlatego nie są usieciowane, a także, czy nie są kryształami soli. Kryształy soli wytwarzają charakterystyczne kliknięcie, które można usłyszeć i poczuć, gdy są zgniatane. Jeśli kryształy są twarde i trudne do zmiażdżenia, spróbuj uzyskać i użyć świeższego materiału.</li>
	<li>Usunąć 5 μl roztworu zbiornika z probówki z kulkami nasiennymi i przenieść do równoważnej studzienki cząstkowej (doświadczenie z kroplą siedzącą) lub szkiełka nakrywkowego (doświadczenie z kroplą wiszącą) zawierającego materiał krystaliczny, który ma być zebrany. Odpipetuj ten płyn w górę i w dół 5-6 razy, aby ponownie zawiesić jak najwięcej zawartości sub-studzienki lub szkiełka nakrywkowego. Umieść zawiesinę z powrotem w probówce z kulką nasienną i powtórz ten krok jeszcze dwa razy, upewniając się, że zebrano jak najwięcej materiału krystalicznego.</li>
	<li>Obracaj kulkę nasienną przez dwie minuty, zatrzymując się co 30 sekund, aby schłodzić rurkę na lodzie.</li>
	<li>Wykonać serię rozcieńczeń, rozcieńczając materiał siewny w roztworze zbiornikowym przez współczynnik od 4 do 10 na każdym etapie. Zazwyczaj przy użyciu nierozcieńczonego materiału siewnego uzyskuje się zbyt wiele kryształów, więc użyj rozcieńczonych zapasów nasion, aby kontrolować liczbę kryształów w studzience. W pierwszej rundzie rMMS ważne jest, aby nie rozcieńczać roztworu podstawowego nasion, ponieważ im większe stężenie nasion, tym więcej uderzeń krystalizacji zostanie uzyskane.</li>
	<li>Jeżeli nie ma być natychmiast zużyty, przenieść zawiesinę materiału siewnego i rozcieńczony materiał siewny do zamrażarki w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu przechowywania. Aby zapobiec powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania, które mogą zmniejszyć skuteczność materiału siewnego, należy przechowywać ten materiał w porcjach o małej objętości, tj. 10-20 μl. Po zamrożeniu zapasy nasion mogą być przechowywane przez czas nieokreślony, aż będą potrzebne.</li>
</ol>
3. Założenie tac krystalizacyjnych
<ol>
	<li>W zależności od dostępności urządzeń do krystalizacji i preferencji eksperymentatora, badanie przesiewowe krystalizacji rMMS można przeprowadzić przy użyciu 24-dołkowych tac wykorzystujących metodę dyfuzji pary z wiszącą kroplą lub 96-dołkowych tac wykorzystujących metodę dyfuzji pary z siedzącą kroplą. Tace krystalizacyjne dla rMMS można ustawiać ręcznie, za pomocą automatycznego dozownika do obsługi cieczy lub za pomocą kombinacji tych dwóch.</li>
	<li>Typowy eksperyment rMMS przeprowadzany ręcznie składa się z 1,0 μl roztworu białka, 1,0 μl warunku krystalizacji i 0,5 μl materiału siewnego. Typowy eksperyment przeprowadzany przy użyciu robota krystalizacyjnego składa się z 0,3 μl roztworu białkowego, 0,2 μl warunku krystalizacji i 0,1 μl materiału siewnego.</li>
	<li>Aby przeprowadzić badanie przesiewowe rMMS w 24-dołkowych wiszących tacach wrzutowych, najpierw, za pomocą pipety ręcznej, przenieś 300 μl każdego warunku z 96-dołkowego sita krystalizacyjnego w formacie 10 ml z pojedynczą probówką do każdej studzienki 4 x 24-dołkowych, wstępnie natłuszczonych tacek krystalizacyjnych.
	<ol>
		<li>Przenieść 1 μl każdego warunku krystalizacji z każdego zbiornika o objętości 300 μl na powierzchnię odpowiedniego szkiełka nakrywkowego z tworzywa sztucznego, z którego usunięto zarówno przednie, jak i tylne ochronne paski nośne.</li>
		<li>Do 1 μl każdego warunku krystalizacji dodać 1 μl roztworu białkowego, a następnie 0,5 μl krystalicznego materiału siewnego. Odwrócić każde szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby kropla płynu była skierowana w dół i umieścić powyżej odpowiedniego dołka.</li>
		<li>Dociśnij szkiełko nakrywkowe w dół, ściskając smar uszczelniający i tworząc bezpieczne uszczelnienie. Po ustaleniu wszystkich 96 kropli tackę należy przenieść do inkubatora lub pomieszczenia o stałej temperaturze, zwykle w zakresie 4-18 °C w celu przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przeprowadzić badanie przesiewowe rMMS w 96-dołkowych tacach do osadzania, najpierw przenieś 20-50 μl każdego stanu z 96-dołkowego sita krystalizacyjnego w formacie bloku głębokiej studzienki do każdej odpowiedniej studzienki tacy krystalizacyjnej. Ten etap transferu można wykonać za pomocą robota krystalizacyjnego lub ręcznego transferu za pomocą pipety 8-kanałowej.
	<ol>
		<li>Przenieść roztwory zbiornikowe, białkowe i wyjściowe nasion do kropli ręcznie lub za pomocą robota, korzystając z objętości wyszczególnionych w ppkt 3.1. Niektóre dostępne na rynku roboty krystalizacyjne nie stykają się z dozownikiem, a przenoszenie nasion za pomocą takiego systemu może spowodować zablokowanie końcówek dozujących lub powiązanych przewodów. Kolejność dozowania jest zmienna: niektóre roboty dozują wszystkie roztwory jednocześnie. Jeśli nie jest to możliwe, najpierw dozuj białko, następnie zbiornik, a następnie materiał siewny.</li>
		<li>Jeśli robot dozujący kontaktowy nie jest dostępny, przenieś nasiona za pomocą szklanej strzykawki o małej objętości wyposażonej w igłę. Opłucz igłę, przepuszczając ją przez roztwór zbiornika, a następnie dozuj materiał siewny do każdej kropli.</li>
		<li>Uszczelnij tackę za pomocą przezroczystego arkusza uszczelniającego i przenieś do inkubatora lub pomieszczenia o stałej temperaturze w celu przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Inspekcja tacek krystalizacyjnych
<ol>
	<li>Wizualizuj wszystkie eksperymenty krystalizacji za pomocą mikroskopu dwuokularowego lub systemu obrazowania kryształów. Pierwsza z nich zazwyczaj daje użytkownikowi większą kontrolę nad głębią widoku i stopniem powiększenia niż druga, ale jest bardziej czasochłonna.</li>
	<li>Sprawdzić kolejno każdą studzienkę podwodną/szkiełko nakrywkowe i zarejestrować wszelkie oznaki tworzenia się kryształów. Eksperymenty powinny być kontrolowane raz na 24 godziny przez 5 dni po założeniu, a następnie raz na 7 dni przez okres do 4 tygodni.</li>
	<li>Często wymagane są wielokrotne cykle rMMS, zanim zostaną wytworzone kryształy o optymalnej jakości dyfrakcyjnej.</li>
</ol>

<ol><li>Bergfors, T. Protein Crystallization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+T+%22IUL+Biotechnology+Series%22">IUL Biotechnology Series</a>. , 2nd, (2009).</li>
<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Priciples%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Funct.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeds+to+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li>
<li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li>
<li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li>
<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li>
<li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li>
<li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+Sect.+F.+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li>
<li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol+.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li>
<li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li>
<li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+Microseeding%3A+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li>
<li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li>
<li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+matrix+microseeding%3A+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li>
<li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme%3A+a+model+enzyme+in+protein+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li>
<li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W artykule opisano ogólną metodę przesiewowego badania przesiewowego krystalizacji białek rMMS. Wykazaliśmy przy użyciu dwóch białek testowych znaczną poprawę wskaźnika powodzenia krystalizacji przy użyciu tej metody. Analiza dyfrakcyjna z wykorzystaniem promieniowania synchrotronowego podzbioru kryształów wygenerowanych przy użyciu metod rMMS i innych niż rMMS wykazała niewielkie różnice w jakości dyfrakcji między kryształami wyhodowanymi przy użyciu obu metod, chociaż poprzedni autorzy informowali, że kryształy dobrej ...

Od jej początkowego zastosowania przez Perutza, Kendrew i współpracowników do określania struktur hemoglobiny i mioglobiny, do nowoczesnych, wysokowydajnych zautomatyzowanych potoków konsorcjów genomiki strukturalnej, makromolekularna krystalografia rentgenowska dała nam bezprecedensowy strukturalny wgląd w świat białek. Technika ta pozostaje najszerzej stosowaną metodą eksperymentalną, która pozwala na bezpośrednią wizualizację struktury białka w rozdzielczości atomowej lub bliskiej atomowej (tj. w zakresie 1-3 A). Warunkiem wstępnym zastosowania dyfrakcji rentgenowskiej do białka jest to, że najpierw musi ono zostać skrystalizowane i to właśnie ten etap procesu pozostaje największym pojedynczym krokiem ograniczającym szybkość w określaniu struktury metodami dyfrakcyjnymi 1, 2. Pomimo znacznego postępu w naszym zrozumieniu procesu krystalizacji białek oraz znacznej poprawy jakości i dostępności ekranów krystalizacji, tacek i powiązanych technologii, nadal niemożliwe jest wiarygodne przewidzenie prawdopodobieństwa powodzenia krystalizacji 3. Metody biochemiczne i biofizyczne można zastosować do oceny, czy białko będące przedmiotem zainteresowania wykazuje korzystne cechy dla zarodkowania i wzrostu kryształów, tj. czy jest dobrze pofałdowane, jednorodne, monodyspersyjne itp., jednak te spostrzeżenia w żaden sposób nie zapewniają ostatecznego predyktora skłonności do krystalizacji. 	
	Seeding od dawna uważany jest za realną metodę poprawy liczby, rozmiaru i jakości istniejących kryształów lub materiału krystalicznego 4-7. Podejście to opiera się na założeniu, że warunek, który wspiera zarodkowanie kryształów, może nie być optymalny dla późniejszego wzrostu kryształów i odwrotnie. Przenosząc materiał jądrzasty z jednego stanu do drugiego, można próbować skutecznie rozdzielić te procesy, dając w ten sposób dostęp do nowej, jeszcze niezbadanej przestrzeni krystalizacji, a w rezultacie zwiększając ogólny wskaźnik sukcesu eksperymentu przesiewowego. Udokumentowano ustalone metody (i) makrorozsiewu, czyli przeniesienia pojedynczego kryształu w całości z jednego stanu do drugiego 8, (ii) zasiewu smugowego, czyli przenoszenia materiału jądrzastego, zwykle uzyskiwanego przez zastosowanie ciśnienia kierunkowego przy użyciu na przykład kociego wąsa na powierzchnię istniejącego kryształu, po którym następuje przejście wiskera przez nową kroplę krystalizacji 9oraz (iii) "klasyczne" mikrosiewanie, czyli przenoszenie kryształowych "nasion", powstałych w wyniku zbierania pokruszonych kryształów (lub materiału krystalicznego), do warunków podobnych do tych, w których powstały nasiona 10. Warto zauważyć, że wszystkie te trzy metody są czasochłonne i słabo skalowalne, z pewnością w porównaniu z tym, co można osiągnąć za pomocą nowoczesnej robotyki krystalizacyjnej zajmującej się obsługą cieczy. Czynniki te przyczyniły się, przynajmniej na pewnym poziomie, do przekonania, że wysiew jest metodą, którą należy stosować tylko wtedy, gdy inne podejścia nie przyniosły rezultatów.	
	Random Matrix Microseeding (rMMS) to najnowsza innowacja metodologiczna, która łączy zalety tradycyjnego mikrosiewu z korzyściami płynącymi z wysokiej przepustowości i skalowalności 11-13. Podejście to opiera się na wytwarzaniu materiału siewnego, wyprodukowanego z jądrzastego materiału krystalicznego, który może być porcjowany do / na każdym basenie / szkiełku nakrywkowym w standardowym 96-stanowym sicie krystalizacji. Metoda ta ma zastosowanie zarówno do eksperymentów z dyfuzją kropli pary w pozycji siedzącej, jak i wiszącej, przeprowadzanych ręcznie lub przy użyciu robotyki do obsługi cieczy, w formacie tacy 24-dołkowej lub 96-dołkowej. Eksperymentalnie wykazano, że rMMS znacznie zwiększa wskaźnik powodzenia krystalizacji i wytwarza kryształy o większej jakości i ilości dyfrakcyjnej 11, 13, 14 i stanowi innowacyjne narzędzie w arsenale podejść krystalografów w trwających wysiłkach na rzecz sukcesu krystalizacji. W tym miejscu opisujemy ogólną metodę dla rMMS i podajemy przykładowe dane ilustrujące skuteczność tej techniki.

<table><tbody><tr><td>Tace do krystalizacji MRC 96 well</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD11-00-100</td><td>Niekompatybilne z promieniowaniem UV, do ekranów utworzonych przez robota</td></tr><tr><td>Arkusze uszczelniające ClearView</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD6-01S</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>~95% czystości</td></tr><tr><td>Katylaza wątroby bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322></td><td> 95% czystości</td></tr><tr><td>Ksylanaza</td><td>Hampton Research</td><td>HR7-104</td><td></td></tr><tr><td>Taumatyna z Thaumatococcus daniellii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7630</td><td></td></tr><tr><td>Termolizyna z Bacillus thermoproteolyticus rokko</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1512</td><td></td></tr><tr><td>Ekran JCSG-plus HT-96</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-40</td><td>Do ekranów utworzonych przez robota</td></tr><tr><td>PACT premier HT-96 ekran</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-36</td><td>Dla ekranów utworzonych przez robota</td></tr><tr><td>Morpheus HT-96 ekran</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-47</td><td>Dla ekranów utworzonych przez robota</td></tr><tr><td>Crystal Ph&#8211; System obsługi cieczy nix</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>602-0001-10</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw koralików nasiennych</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>Lornetka stereoskopowa</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2646-100EA</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 0,1-2,5 &mu; l pipeta</td><td>Starlab</td><td>S7100-0125</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 2-20 &mu; l pipeta</td><td>Starlab</td><td>S7100-0221</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 100-1000 &mu; l pipeta</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ekran JCSG-plus</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-37</td><td>Do ekranów tworzonych ręcznie</td></tr><tr><td>Ekran PACT premier</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-29</td><td>Do ekranów tworzonych ręcznie</td></tr><tr><td>Ekran Morfeusza</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>Do ekranów tworzonych ręcznie</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5415-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe CrystalClene 18 mm</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD4-17</td><td></td></tr><tr><td>2 ml szklane pipety Pasteura</td><td>Mieszalnik Vortex Sigma-Aldrich</td><td>Z722669</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa taca do krystalizacji XRL</td><td>Molecular Dimensions Limited</td><td>MD3-11</td><td>Do ekranów tworzonych ręcznie</td></tr><tr><td>30% (w/v) PEG 8000, 0,2 M siarczan amonu, 0,1 M kakodylan sodu pH 6,5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% (w/v) PEG 8000, 0,2 M octan magnezu, 0,1 M kakodylan sodu pH 6,5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM kwas cytrynowy pH 5,0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Losowe przesiewanie matryc mikronasion (rMMS) to technika krystalizacji białek, w której kryształy zarodkowe są dodawane do losowych ekranów. Zwiększając prawdopodobieństwo, że kryształy będą rosły w strefie metastabilnej diagramu fazowego białka, często uzyskuje się dodatkowe przewody krystalizacyjne, można zwiększyć jakość wytwarzanych kryształów i zapewnić dobry zapas kryształów do zbierania danych i eksperymentów z moczeniem. W tym miejscu opisujemy ogólną metodę dla rMMS, która może być stosowana do eksperymentów z dyfuzją pary w pozycji siedzącej lub wiszącej, ustalonych ręcznie lub przy użyciu robotyki do obsługi cieczy, w formacie tacki 96-dołkowej lub 24-dołkowej.

(A) Przykład eksperymentu rMMS
Aby zademonstrować skuteczność przesiewania rMMS, zastosowaliśmy tę metodę do krystalizacji lizozymu białka jaja kurzego (HEWL) oraz katalazy wątroby bydlęcej (BLC). Oba te enzymy wykazują wysoką zdolność do krystalizacji i są strukturalnie dobrze scharakteryzowanymi celami 15, 16. W związku z tym stanowią one doskonałe obiekty testowe do zilustrowania zwiększonego wskaźnika sukcesu krystalizacji, który można osiągnąć dzięki rMMS. Eksperymenty krystalizac...

Tutaj opisujemy ogólną metodę losowego przesiewania matryc mikronasion. Wykazano, że technika ta znacznie zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentów przesiewowych krystalizacji białek, zmniejsza potrzebę optymalizacji i zapewnia niezawodne dostarczanie kryształów do zbierania danych i eksperymentów z moczeniem ligandów.

Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Ogólnym celem tej procedury jest zwiększenie liczby oraz poprawa jakości dyfrakcyjnej kryształów białek otrzymanych w wyniku eksperymentu przesiewowego krystalizacji. W tym celu, z istniejącego eksperymentu przesiewowego krystalizacji białka docelowego identyfikuje się materiał krystaliczny lub osad, który następnie jest zbierany i wykorzystywany do przygotowania zapasu nasion kryształów. Następnie przeprowadza się serię przesiewów krystalizacji, zawierających zarówno białko docelowe, jak i nasiona kryształów.Na koniec monitoruje się ekrany krystalizacji z zaszczepionymi kryształami pod kątem powstawania nowych kryształów, a następnie przeprowadza się charakterystykę wszelkich nowo powstałych kryształów białka. W rezultacie zastosowanie tej procedury może doprowadzić do zwiększenia liczby, rozmiaru oraz jakości dyfrakcyjnej kryształów białek uzyskanych w eksperymentach przesiewowych krystalizacji. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, np. tradycyjnym mikroszczepieniem lub makroszczepieniem, są szybkość wykonania, wysoka skalowalność oraz możliwość przebadania znacznie większej przestrzeni krystalizacji niż w przypadku innych metod szczepienia.Kolejną zaletą tej techniki jest fakt, że nie wymaga ona zastosowania wysokiej jakości krystalicznego materiału wyjściowego do produkcji zapasu zarodków. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ kroki związane ze zbiorami i manipulacją kryształami wymagają znacznej zręczności manualnej. Prezentacja wizualna tej metody jest kluczowa, gdyż mikrosiewanie w macierzy losowej znacznie odbiega od innych metod siewania kryształów.Subtelności tej metody są kluczowe dla osiągnięcia sukcesu, a wiele z nich trudno jest precyzyjnie przekazać w formie tekstu. Rozpocznij tę procedurę wyłącznie przy użyciu tacy do krystalizacji z osadem, wykorzystując mikroskop binokularny lub system obrazowania kryształów. Przez pierwszy tydzień sprawdzaj stan tacy każdego dnia.Następnie, raz w tygodniu, zapisuj wielkość kryształów. Gdy nie będzie już widocznych oznak dalszego wzrostu, wybierz jedną lub więcej odpowiednich studzienek z tacki, z których pobrzesz materiał krystaliczny. Do wytworzenia zapasu nasion można wykorzystać dowolny materiał, w tym drobne igły, lekkie spirale, mikrokryształy oraz nieregularne, słabo uformowane kryształy.Starszy materiał z większym prawdopodobieństwem jest częściowo sieciowany i mniej nadaje się do użytku w eksperymentach z wysiewem. W dniu zbioru należy użyć palnika, aby wykonać zaokrągloną sondę z szklanej pipety pasterskiej. W tym celu należy podgrzewać pipetę w okolicy środka, aż stanie się miękka.Następnie szybko wyjmij szkło z płomienia i wyciągnij je, rozsuwając końce. Dąż do tego, aby w miejscu, gdzie szkiełko ma około 0,25 milimetra, zmniejszyć jego średnicę do mniej niż 0,25 milimetra. Odłam szkło i krótko zanurz złamany koniec w płomieniu.Powtarzaj ten proces, aż na końcówce utworzy się szklana półkula o średnicy około 0,75 mm. Umieść w lodzie probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającą kuleczkę nasienną (seed bead). Następnie otwórz wybraną tackę do krystalizacji.W przypadku tac do metody wiszącej kropli z 24 dołkami, należy użyć pęsety, aby zdjąć szkiełko nakrywkowe. Następnie należy odwrócić szkiełko nakrywkowe i położyć je na stabilnej, czystej powierzchni.W przypadku płytek z 96 studniami do metody siedzącej kropli. Za pomocą skalpela należy wyciąć plastikową folię osłonową nad wybraną studnią, a następnie usunąć wyciętą część folii pęsetą. Należy pobrać 50 µL roztworu z rezerwuaru i przenieść go do probówki do mikrocentryfugi zawierającej kulek-nosiciel (seed bead), dbając o to, aby probówka przez cały czas pozostawała w lodzie. Najtrudniejszym elementem całej tej procedury jest przygotowanie zapasu materiału wyjściowego.Ważne jest, aby wykonać tę czynność dokładnie zgodnie z opisem i tak szybko, jak to możliwe. Należy zadbać o dokładne rozdrobnienie materiału nasiennego za pomocą sondy i odzyskanie jak największej ilości próbki podczas obserwacji pod mikroskopem. Użyj przygotowanej wcześniej szklanej sondy, aby dokładnie rozgnieść kryształy na szkiełku nakrywnym.Krople poślizgowe. Małe kryształy mogą wymagać kilku minut, aby zostały całkowicie zmiażdżone. Kryształy, które łatwo się kruszą, nie są sieciowane i nie są kryształami soli.Kryształy soli podczas kruszenia wydają charakterystyczne kliknięcie, które można usłyszeć i poczuć. Następnie należy pobrać 5 µL roztworu z rezerwuaru z probówki z kuleczkami seed bead i przenieść do odpowiedniego dołka w eksperymencie z kroplą osiadłą lub na szkiełko nakrywkowe w eksperymencie z kroplą wiszącą, zawierających materiał krystaliczny przeznaczony do zbioru. Płyn ten należy pipetować w górę i w dół od pięciu do sześciu razy, aby resuspenderć jak największą ilość zawartości dołka lub szkiełka nakrywkowe.Przenieś zawiesinę z powrotem do probówki z koralikami startowymi i powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby odzyskać jak największą ilość materiału krystalicznego. Mieszaj na wortexie z koralikami startowymi przez dwie minuty, przerywając co 30 sekund, aby schłodzić probówkę na lodzie. W probówkach 1,5 ml zawierających roztwór rezerwuarowy.Przygotuj serię rozcieńczeń, rozcieńczając zapas startowy w roztworze rezerwowym czterokrotnie do dziesięciokrotnie na każdym etapie. Jeśli zapas startowy i rozcieńczenia nie zostaną użyte natychmiast, przelej alikwoty o objętości 10 do 20 µL do zamrażarki w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu przechowywania. Po zamrożeniu zapasy startowe można przechowywać w nieskończoność do momentu ich użycia.Przesiewanie krystalizacji RMMS można przeprowadzić z wykorzystaniem tacek 24-dołkowych z zastosowaniem metody dyfuzji pary w kropli wiszącej lub tacek 96-dołkowych z zastosowaniem metody dyfuzji pary w kropli osiadłej. Aby przeprowadzić przesiewanie MMS w tackach 24-dołkowych w układzie kropli wiszącej, należy użyć pipety do ręcznego przeniesienia 300 µL każdego z 96 warunków przesiewu krystalizacji z formatu pojedynczej probówki o objętości 10 mL do każdego dołka w czterech tackach 24-dołkowych.Z dobrze nasmarowanych tłuszczem kuwet do krystalizacji, z każdego zbiorniczka o pojemności 300 µL, przenosi się 1 µL każdego z warunków krystalizacji na powierzchnię odpowiedniego szkiełka nakrywki z tworzywa sztucznego, z którego usunięto oba paski ochronne (przedni i tylny) w miejscu aplikacji 1 µL. Na szkiełku nakrywce należy dodać 1 µL roztworu białka, a następnie 0,5 µL roztworu zarodników kryształów. W pierwszej rundzie metody RMMS ważne jest, aby nie używać rozcieńczonego roztworu zarodników.Ponieważ im większe stężenie nasion, tym więcej punktów krystalizacji zostanie uzyskanych, odwróć każde szkiełko nakrywkowe tak, aby kropla cieczy była skierowana w dół, i umieść je nad odpowiednim dołkiem. Mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe, ściskając smar uszczelniający i tworząc szczelne zamknięcie.Po przygotowaniu wszystkich 96 kropel, przenieś tackę do inkubatora w temperaturze od 4 do 18°C lub do pomieszczenia o stałej temperaturze w celu przechowywania. Aby przeprowadzić przesiewanie MMS w 96-dołkowych tackach do metody siedzącej kropli, użyj robota do krystalizacji lub pipety ośmiokanałowej, aby przenieść od 20 do 50 µL każdego warunku z 96-warunkowego przesiewania krystalizacji w formacie głębokich dołków do każdego odpowiadającego mu dołka tacki krystalizacyjnej.Następnie przenieś 1,0 µL roztworu białka, 1,0 µL warunków krystalizacji oraz 0,5 µL roztworu ziaren do kropel. Uszczelnij tackę za pomocą przezroczystej folii pokrywowej i przenieś ją do inkubatora w temperaturze od 4 do 18 °C lub do pomieszczenia o stałej temperaturze. Eksperymenty przechowywania należy sprawdzać raz na 24 h przez pięć dni od momentu ich ustanowienia, a następnie raz na siedem dni przez maksymalnie cztery tygodnie, używając mikroskopu binokularnego lub systemu obrazowania kryształów. Sprawdzaj kolejno każdą mikrowydzielenie lub szkiełko nakrywkę i zapisuj wszelkie dowody formowania się kryształów.Porównaj wyniki naszych eksperymentów z przesiewu MMS z wynikami przesiewów non-ED i odnotuj wszelkie różnice. Może być wymagane przeprowadzenie wielu cykli RMMS, zanim zostaną otrzymane kryształy o optymalnej jakości dyfrakcyjnej dla kolejnych cykli.W razie potrzeby należy wykorzystać zarchiwizowane rozcieńczone zapasy kryształów zalążkowych, aby kontrolować liczbę kryształów w każdej studzience. Aby zademonstrować skuteczność RMMS, metody przesiewowe zastosowano do krystalizacji henny, białej lizozymy oraz katalazy wątrobowej bydlęcej dla każdej z 3 96 warunków białkowych.Do badań wykorzystano ekrany krystalizacji J-C-S-G-P-A-C-T oraz Morpheus. Po pięciu dniach z każdej tacki wybrano jeden warunek, który sprzyjał wzrostowi materiału krystalicznego, i wykorzystano go do przygotowania zapasu kryształów zasiewnych. Po upływie pięciu dni dokonano inspekcji tacek krystalizacyjnych i odnotowano liczbę kropli zawierających kryształy.Rysunek ten podsumowuje wyniki przeprowadzonego eksperymentu i przedstawia analizę ilościową dla lizozymu z białka jaja kurzego. W przypadku zastosowania RMMS dla tego białka zaobserwowano od czterokrotnego do dziesięciokrotnego wzrostu skuteczności krystalizacji w porównaniu do tacek bez ED. Co istotne, w przypadku katalazy z wątroby bydlęcej tylko jeden warunek w przesianiu Morpheus przyniósł kryształy, podczas gdy po zastosowaniu RMMS zidentyfikowano 55 takich warunków.Ponadto, w każdym przypadku odnotowano odpowiednio trzykrotny i dwukrotny wzrost skuteczności krystalizacji puszek wątroby bydlęcej przy użyciu ekranów JCSG i PACT, a niezależnie od zastosowanego ekranu krystalizacyjnego, nasze przesiewanie MMS przyniosło znacząco większą całkowitą liczbę kryształów niż przesiewanie bez zastosowania RMMS. Wnioskujemy, że nasze MMS jest prostym, a zarazem potężnym podejściem, które może znacząco zwiększyć skuteczność eksperymentów z przesiewaniem krystalizacji białek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić eksperyment z losowym przesiewaniem macierzy z mikroziarnami, od identyfikacji i pozyskiwania materiału krystalicznego, poprzez przygotowanie zapasu ziaren kryształów, aż po końcowe ustanowienie krystalizacji z ziarenami po opanowaniu tej metody.Tę technikę można przeprowadzić w mniej niż jedną godzinę w przypadku eksperymentów przesiewowych z mikrosiewaniem w macierzach losowych wykonywanych za pomocą robota do obsługi cieczy, lub w około trzy godziny w przypadku eksperymentów przeprowadzanych ręcznie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest upewnienie się, że wszystkie zasiane ekrany krystalizacji są szczelnie zamknięte przed przechowywaniem.

improving-success-rate-protein-crystallization-random-microseed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe przesiewanie matryc mikrokryształków

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

Protokoły opisują kluczowe etapy otrzymywania kryształów białka błonowego o jakości dyfrakcyjnej, począwszy od rekonstytucji białka w lipidowej fazie kubicznej (LCP), poprzez wyznaczanie warunków wstępnych za pomocą testów prekrystalizacyjnych LCP-FRAP, aż po przygotowanie prób krystalizacji w LCP i pozyskiwanie kryształów.

Krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Badania strukturalne biomakromolekuł za pomocą krystalografii wymagają kryształów wysokiej jakości. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys (w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium) i/lub przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

W artykule przedstawiono metodę generowania kryształów białek pochodzonych z I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy) za pomocą mikrozasiewania do generowania nowych warunków krystalizacji w rzadkich przesiewach matrycowych. Tacy można ustawić za pomocą robotów do dyspensowania płynów lub ręcznie.

Deriwatyzacja kryształów białek za pomocą I3C za pomocą losowego przesiewania macierzy mikronasion

Celem tego artykułu jest dać widzowi solidne zrozumienie, jak przekształcić ich protokół małej objętości dyfuzji parowej, do hodowli dużych, pojedynczych kryształów białka, w metodę mikrokrystalizacji wsadowej o dużej objętości dla krystalografii szeregowej.

Optymalizacja wzrostu kryształów endotiapepsyny do eksperymentów krystalografii seryjnej

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Ten protokół szczegółowo opisuje wysokoprzepustowe badanie przesiewowe krystalizacji, począwszy od przygotowania 1 536 mikropróbek do końca 6-tygodniowego okna eksperymentalnego. Znajdują się tam szczegółowe informacje na temat konfiguracji próbki, uzyskanego obrazowania oraz sposobu, w jaki użytkownicy mogą wykonywać analizy za pomocą graficznego interfejsu użytkownika opartego na sztucznej inteligencji, aby szybko i skutecznie zidentyfikować warunki krystalizacji makromolekularnej.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu uzyskania trafień kryształów do krystalografii białek

Poznaj metodę losowych badań przesiewowych matrycy mikronasion w celu zwiększenia liczby i jakości dyfrakcyjnej kryształów białkowych. Technika ta usprawnia proces krystalizacji i zapewnia stałe dostarczanie kryształów do dalszych badań.

Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Przeglądaj więcej filmów