Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Ogólnym celem tej procedury jest poprawa liczby i jakości dyfrakcji kryształów białek uzyskanych w eksperymencie przesiewowym krystalizacji. W tym celu identyfikuje się materiał krystaliczny lub wytrącony na podstawie istniejącego eksperymentu przesiewowego krystalizacji białek ustalonego przy użyciu docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania, materiał krystaliczny lub wytrącony jest zbierany, a następnie wykorzystywany do wytworzenia krystalicznego materiału siewnego. Następnie ustanawia się serię ekranów krystalizacji zawierających zarówno docelowe białko będące przedmiotem zainteresowania, jak i nasiona kryształów.

Na koniec zasiane ekrany krystalizacji są monitorowane pod kątem tworzenia się kryształów i charakteryzowane są wszelkie nowe kryształy białek. Ostatecznie zastosowanie tej procedury może skutkować zwiększeniem wielkości liczbowej i jakości dyfrakcyjnej kryształów białkowych uzyskanych z eksperymentów przesiewowych krystalizacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, na przykład tradycyjnym mikro lub makro seedingiem, jest to, że można ją przeprowadzić szybko, jest wysoce skalowalna i próbkuje znacznie więcej przestrzeni krystalizacji niż inne metody wysiewu.

Kolejną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona stosowania wysokiej jakości krystalicznego materiału wyjściowego do produkcji materiału siewnego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ podczas etapów zbierania kryształów i manipulacji wymagany jest znaczny stopień zręczności manualnej. Wizualna demonstracja tego, że metoda if jest krytyczna, ponieważ mikrozasiewy z matrycą losową znacznie odbiegają od innych metod zasiewania kryształów.

Subtelności tej metody są kluczem do sukcesu, a wiele z nich jest trudnych do dokładnego przekazania w formie tekstowej. Rozpocznij tę procedurę tylko od siedzącej tacki krystalizacyjnej za pomocą mikroskopu dwuokularowego lub systemu obrazowania kryształów. Sprawdzaj tacę codziennie przez pierwszy tydzień.

Następnie raz w tygodniu zanotuj rozmiar kryształu. Gdy tylko nie ma dowodów na dalszy wzrost, wybierz z tacy jedną lub więcej odpowiednich studzienek, z których chcesz zebrać materiał krystaliczny. Do generowania materiału siewnego można użyć dowolnego materiału, w tym cienkich igieł, lamp spialowych, mikrokryształów i nieregularnych, słabo uformowanych kryształów.

Starszy materiał jest bardziej skłonny do częściowego usieciowania i mniej nadaje się do wykorzystania w eksperymentach z wysiewem. W dniu zbiorów użyj bułek w stanie zapalnym, aby zrobić zaokrągloną sondę ze szklanej pipety pastwiskowej. Aby to zrobić, podgrzej pipetę w pobliżu środka, aż stanie się miękka.

Następnie szybko wyjmij go z płomienia i wyciągnij, rozsuwając końce. Staraj się ściągnąć szkło do średnicy mniejszej niż 0,25 milimetra w miejscu, w którym wynosi około 0,25 milimetra. Rozbij szklankę i na krótko zanurz złamany koniec w płomieniu.

Powtarzaj ten proces, aż na końcu utworzy się półkula szkła o średnicy około 0,75 milimetra. Umieść na lodzie mikroprobówkę wirówkową o pojemności 1,5 mililitra zawierającą kulkę nasienną. Następnie otwórz wybraną tacę krystalizacyjną.

Cóż, na 24 dobrze wiszące tace wrzutowe. Użyj pęsety, aby usunąć szkiełko nakrywkowe. Następnie odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na stabilnej, czystej powierzchni.

Na 96 dobrze osadzonych tac wrzutowych. Za pomocą skalpela przeciąć plastikową folię sufitową na górze wybranej studzienki, a następnie usuń wyciętą część folii sufitowej za pomocą pęsety. Usunąć 50 mikrolitrów roztworu zbiornika i przenieść ten płyn do probówki mikrowirówki zawierającej kulkę nasienną, upewniając się, że probówka pozostaje na lodzie przez cały czas. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest przygotowanie materiału siewnego.

Ważne jest, aby zrobić to dokładnie tak, jak opisano i tak szybko, jak to możliwe. Uważaj, aby dokładnie zmiażdżyć materiał siewny za pomocą sondy i odzyskać jak najwięcej podczas oglądania próbki pod mikroskopem. Za pomocą przygotowanej wcześniej szklanej sondy dokładnie rozdrobnić kryształki znajdujące się na pokrywie.

Spadki poślizgu. Dokładne zmiażdżenie małych kryształów może zająć kilka minut. Kryształy, które są łatwe do zmiażdżenia, nie są usieciowane i nie są kryształami soli.

Podczas gdy kryształy soli wytwarzają charakterystyczne kliknięcie, które można usłyszeć i poczuć, gdy są zgniatane. Następnie usuń pięć mikrolitrów roztworu zbiornika z probówki z kulkami nasiennymi i przenieś do równoważnej studzienki podwodnej w celu przeprowadzenia eksperymentu z kroplą siedzącą lub szkiełka nakrywkowego w przypadku eksperymentu z wiszącą kroplą zawierającą materiał krystaliczny, który ma zostać zebrany. Pipetować ten płyn w górę i w dół pięć do sześciu razy, aby ponownie zawiesić jak najwięcej zawartości substudzienki lub szkiełka nakrywkowego.

Umieść zawiesinę z powrotem w probówce z kulkami nasiennymi i powtórz ten krok jeszcze dwa razy, upewniając się, że zebrano jak najwięcej materiału krystalicznego. Wiruj, kulkę nasienną przez dwie minuty, zatrzymując się co 30 sekund, aby schłodzić rurkę na lodzie. W 1,5-mililitrowych probówkach zawierających roztwór zbiornika.

Wykonać serię rozcieńczeń w celu archiwizacji, rozcieńczając materiał siewny w roztworze zbiornikowym od czterech do 10 razy na każdym etapie. Jeśli nasiona, bulion i rozcieńczenia nie zostaną natychmiast zużyte, umieść od 10 do 20 mikrolitrów porcji w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub minus 80 stopni Celsjusza w celu przechowywania. Po zamrożeniu zapasy nasion mogą być przechowywane przez czas nieokreślony, aż będą potrzebne.

Przesiewanie krystalizacji RMMS można przeprowadzić przy użyciu 24-dołkowych tac wykorzystujących metodę dyfuzji pary wiszącej lub 96-dołkowych tac wykorzystujących metodę dyfuzji pary w pozycji siedzącej. Aby przeprowadzić nasze badanie przesiewowe MMS w 24 wiszących tacach wrzutowych, użyj pipety, aby ręcznie przenieść 300 mikrolitrów każdego stanu z 96-warunkowego sita krystalizacyjnego w 10 mililitrach. Format pojedynczej rurki do każdej studzienki 4 24.

Dobrze nasmarowane tacki krystalizacji z każdego zbiornika o pojemności 300 mikrolitrów przenoszą jeden mikrolitr każdego warunku krystalizacji na powierzchnię odpowiedniego plastikowego szkiełka nakrywkowego, z którego usunięto zarówno przednie, jak i tylne ochronne paski nośne do jednego mikrolitra. Na szkiełko nakrywkowe dodaj jeden mikrolitr roztworu białkowego, a następnie 0,5 mikrolitra krystalicznego bulionu siewnego. W pierwszej rundzie RMMS ważne jest, aby nie używać rozcieńczonego roztworu podstawowego nasion.

Ponieważ im większe stężenie nasion, tym więcej uderzeń krystalizacji zostanie uzyskanych. Odwrócić każde szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby kropla płynu była skierowana w dół i znajdowała się powyżej odpowiedniej. Dobrze dociśnij szkiełko nakrywkowe w dół, ściskając smar sufitowy i tworząc bezpieczne uszczelnienie.

Po ustaleniu wszystkich 96 kropli przenieś tackę do inkubatora w temperaturze od czterech do 18 stopni Celsjusza lub w pomieszczeniu o stałej temperaturze w celu przechowywania. Aby wykonać nasze badanie MMS w 96, dobrze osadzonych tacach wrzutowych. Użyj robota krystalizacyjnego lub pipety ośmiokanałowej, aby przenieść od 20 do 50 mikrolitrów każdego stanu z 96-stanowego sita krystalizacyjnego w formacie bloku głębokiej studzienki do każdej odpowiedniej studzienki tacy krystalizacyjnej.

Następnie przenieś 1,0 mikrolitra roztworu białkowego, 1,0 mikrolitra stanu krystalizacji i 0,5 mikrolitra materiału siewnego do kropli. Uszczelnić tackę za pomocą przezroczystego arkusza sufitowego i przenieść ją do inkubatora w temperaturze od czterech do 18 stopni Celsjusza lub w pomieszczeniu o stałej temperaturze do przechowywania, eksperymenty powinny być kontrolowane raz na 24 godziny przez pięć dni po ustaleniu, a następnie raz na siedem dni przez okres do czterech tygodni przy użyciu mikroskopu dwuokularowego lub systemu obrazowania kryształkowego. Sprawdź kolejno każdą studzienkę podwodną lub szkiełko nakrywkowe i zapisz wszelkie oznaki tworzenia się kryształów.

Porównaj wyniki naszych eksperymentów przesiewowych MMS z wynikami badań przesiewowych bez zaburzeń erekcji i zapisz wszelkie różnice. Może być wymagane zaobserwowanie wielu cykli RMMS. Przed uzyskaniem optymalnej jakości dyfrakcyjnej produkowane są kryształy dla dodatkowych cykli.

W razie potrzeby użyj zarchiwizowanych rozcieńczonych zapasów nasion, aby kontrolować liczbę kryształów w dołku. W celu wykazania skuteczności funkcji RMMS. Metody przesiewowe zastosowano do krystalizacji henny, białego lizozymu i katalizatora wątroby bydlęcej dla każdego białka 3 96 stanu.

Do ekranizacji krystalizacji użyto J-C-S-G-P-A-C-T i Morfeusz. Następnie, po pięciu dniach, z każdej tacki wybrano pojedynczy warunek, który okazał się wspomagać wzrost materiału krystalicznego i wykorzystano go do wytworzenia materiału siewnego. Po pięciu dniach przeprowadzono inspekcję tac krystalizacyjnych i zarejestrowano liczbę kropli z kryształami.

Rysunek ten podsumowuje wyniki tego eksperymentu i zapewnia analizę ilościową lizozymu białka jaja kurzego. Zaobserwowano od czterech do dziesięciu razy wzrost wskaźnika powodzenia krystalizacji w porównaniu z tackami bez zaburzeń erekcji, gdy RMMS zastosowano do tego białka. W szczególności w przypadku katalazy wątroby bydlęcej stwierdzono, że tylko jeden warunek w badaniu przesiewowym Morfeusza daje kryształy, w porównaniu z 55 stanami zidentyfikowanymi po zastosowaniu RMMS.

Co więcej, we wszystkich przypadkach nastąpił trzy- i dwukrotny wzrost wskaźnika sukcesu krystalizacji puszek z wątroby bydlęcej przy użyciu badań przesiewowych JCSG i PACT, i niezależnie od zastosowanego badania przesiewowego krystalizacji, nasze badanie przesiewowe MMS dało znacznie większą całkowitą liczbę kryształów niż badanie przesiewowe bez RMMS. Dochodzimy do wniosku, że nasz MMS jest prostym, ale skutecznym podejściem, które może znacznie zwiększyć wskaźnik sukcesu eksperymentów przesiewowych z krystalizacją białek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić losowy eksperyment przesiewowy z matrycą z mikronasionami, od identyfikacji i zbioru materiału krystalicznego, poprzez przygotowanie krystalicznego materiału siewnego, a na końcu ustanowienie zasianej krystalizacji po opanowaniu.

Tę technikę można wykonać w mniej niż godzinę. W przypadku losowych eksperymentów przesiewowych z mikrosiewem matrycowym wykonywanych przy użyciu robota do obsługi cieczy lub w ciągu około trzech godzin w przypadku eksperymentów wykonywanych ręcznie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie sita krystalizacji z nasionami są dobrze uszczelnione przed przechowywaniem.