Name: Pasywacja powierzchniowa w badaniach białek jednocząsteczkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj metodę pasywacji powierzchni szkła za pomocą dwuetapowego pokrycia PEG, która zmniejsza niespecyficzne wiązanie białek w mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.D.C., A.C.H. i C.J. były wspierane przez Starting Grants (ERC-StG-2012-309509) przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych. J.-M.N. był wspierany przez Narodową Fundację Badawczą (NRF) (2011-0018198) z Korei; oraz program Pioneer Research Center (2012-009586) za pośrednictwem NRF of Korea, finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (MSIP). Prace te były również wspierane przez Center for BioNano Health-Guard finansowane przez MSIP z Korei jako Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). Y.K.L. i J.-H.H. były wspierane przez Seoul Science Fellowship Program z Seoul City w Korei. Oznaczone białko Rep było hojnym prezentem od dr Sua Myong.

1. Przygotowanie i czyszczenie szkiełek
Komora mikroprzepływowa składa się ze szkiełka kwarcowego i szkiełka nakrywkowego. W mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia typu pryzmatycznego (TIRF) obrazowana jest powierzchnia szkiełka kwarcowego. Dlatego ważne jest, aby dokładnie wyczyścić szkiełko kwarcowe za pomocą roztworówH2O, acetonu, KOH i piranii. Wieloetapowe czyszczenie eliminuje fluorescencyjne cząsteczki organiczne na powierzchni, które zakłócają pomiary fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Dodatkowo trawienie piranii sprawia, że powierzchnia kwarcu staje się hydrofilowa poprzez wytwarzanie grup hydroksylowych. Wolne grupy hydroksylowe są niezbędne w reakcji aminosilanizacji w kroku 3.
<ol>
	<li>Wiercenie zjeżdżalni kwarcowych. Wywierć parę otworów w szkiełku kwarcowym za pomocą wiertła diamentowego 3/4 mm (Rysunek 2a). Jeśli pożądanych jest wiele kanałów, wywierć więcej par otworów (Rysunek 2b). Otwory te służą do wstrzykiwania roztworów do komory mikroprzepływowej w kroku 7.
	<ol>
		Podczas <li>wiercenia utrzymuj wiertło mokre w H2O. H2O działa jako smar, co wydłuża żywotność wiertła.</li>
		<li>Okazjonalne wycieranie końcówki wiertła pomaga w wierceniu otworów.</li>
		<li>Po wywierceniu otworów należy oznaczyć jedną stronę szkiełka, aby ułatwić identyfikację podczas procesu PEGylacji. Znaczniki mogą służyć jako odniesienie, aby uniknąć późniejszych nieporozumień. Do znakowania można użyć wiertła diamentowego. Nie używaj długopisu, ponieważ atrament może dostać się na powierzchnię.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie za pomocąH2O. Umieścić szkiełka w szklanym słoiku do barwienia. Zazwyczaj w jednym słoiku można umieścić od 5 do 15 szkiełek. Opłucz szkiełka za pomocą MilliQ H2O. Powtórz to 3 razy i poddaj sonikacji szkiełek za pomocą MilliQ H2O przez 5 minut, aby usunąć brud. Wylać wodę i ponownie przepłukać szkiełka 3 razy za pomocą MilliQH 2O. Należy pamiętać, że 130 W to moc sonikacji używana w tym protokole. Wyższa moc sonikacji może skrócić żywotność szkiełek kwarcowych.</li>
	<li>Czyszczenie acetonem. Zastąp MilliQ H2O acetonem. Sonikować szkiełka acetonem przez 20 minut lub dłużej.</li>
	<li>Płukanie za pomocąH2O. Wyrzucić aceton i przepłukać szkiełka MilliQH2O. Powtórzyć tę czynność 3 razy w celu usunięcia pozostałości acetonu.</li>
	<li>Czyszczenie za pomocą KOH. Zastąp wodę 1 M KOH i sonikuj szkiełka przez 20 minut lub dłużej. Nadmierne trawienie (np. nocna obróbka KOH) poprawi jakość powierzchni, ale wprowadzi rysy, które mogą zakłócać obrazowanie fluorescencyjne.</li>
	<li>Płukanie za pomocąH2O. Przepłukać szkiełka środkiem MilliQH 2O 3 razy, aby usunąć ślady KOH.</li>
	<li>Akwaforta pirania.
	<ol>
		<li>Przenieś szkiełka do uchwytu na szkiełka Duran lub wykonanego na zamówienie uchwytu teflonowego i umieść je w zlewce (1 l) znajdującej się w kapturze chemicznym.</li>
		<li>Napełnić zlewkę 450 ml H2SO4.</li>
		<li>Dodać 150 mlH2O2w stosunku 3:1 międzyH2SO4 iH2O2. Gdy roztwór zaczyna spontanicznie wrzeć, temperatura wzrasta o ponad 90 °C. Przed rozpoczęciem reakcji upewnić się, że roztwórH2O2ma temperaturę pokojową. W przeciwnym razie temperatura wrzącego roztworu może być niższa niż 90 °C.</li>
		<li>Wymieszaj roztwór w celu prawidłowego wymieszania i pozostaw zlewkę w spokoju przez 20 minut.</li>
		<li>Wyjąć szkiełka z roztworu piranii wraz z uchwytem szkiełka i umieścić je w uchwycie na szkiełko zawierające MilliQ H2O. W międzyczasie wyrzuć roztwór piranii do wyznaczonej butelki na odpady, gdy osiągnie temperaturę pokojową.</li>
		<li>Przepłukać szkiełka 3 razy preparatem MilliQ H2O. W dalszych krokach należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia szkiełek. Przejdź do kroku 3. Zaleca się natychmiastowe wykonanie następujących kroków. 
		* Uwaga: Roztwór piranii jest wyjątkowo reaktywny. Podczas obchodzenia się z tym roztworem należy zachować szczególną ostrożność. Ponadto, gdy zostanie przypadkowo zmieszany z rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak aceton, może spowodować wybuch.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
Komora mikroprzepływowa składa się ze zjeżdżalni kwarcowej i pokrywy. Gdy używany jest pryzmatyczny mikroskop TIRF, powierzchnia szkiełka nakrywkowego nie jest obrazowana. Dlatego wystarczy wyczyścić szkiełko nakrywkowe tylko za pomocąH2Oi KOH. W przypadku, gdy konieczne jest zobrazowanie szkiełka nakrywkowego (np. za pomocą obiektywowego mikroskopu TIRF), zaleca się potraktowanie szkiełek nakrywkowych roztworem piranii (krok 1.7). Należy zauważyć, że jeśli pegylacja powierzchni szkiełka nakrywkowego nie jest wysokiej jakości, może działać jako pochłaniacz dla białek i powodować zmiany w stężeniu białka.
<ol>
	<li>Płukanie za pomocąH2O. Umieścić szkiełka nakrywkowe (24 x 30, 24 x 40 lub 24 x 50 mm2) w szklanym słoiku do barwienia. Zazwyczaj w jednym słoiku można umieścić od 5 do 15 szkiełek nakrywkowych. Spłucz szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą MilliQ H2O.</li>
	<li>Czyszczenie za pomocą KOH. Zastąp wodę 1M KOH i sonikuj szkiełka nakrywkowe przez 20 minut lub dłużej.</li>
	<li>Płukanie za pomocąH2O. Spłukać szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą MilliQH2O, aby usunąć ślady KOH. Przejdź do kroku 3.</li>
</ol>
3. Amino-silanizacja szkiełek i szkiełek nakrywkowych
Funkcjonalizacja powierzchni szkiełek kwarcowych i szkiełek nakrywkowych grupą aminową za pomocą chemii amino-silanizacyjnej. Metanol jest stosowany jako rozpuszczalnik, a kwas octowy jako katalizator reakcji aminosilanizacji.
<ol>
	<li>Płukanie metanolem. Zastąp MilliQ H2O w naczyniach do barwienia (z kroków 1 i 2) metanolem. Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w metanolu do kroku 3.3. Nie należy przechowywać szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych w metanolu przez niepotrzebnie długi okres czasu (np. kilka godzin), ponieważ zanieczyszczenia zawarte w metanolu będą adsorbować się na powierzchni.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu aminosilanizacy.
	<ol>
		<li>Przepłukać kilkakrotnie kolbę Pyrexu metanolem. Sonikować kolbę metanolem przez 5 minut lub dłużej. Zaleca się posiadanie dedykowanej kolby, która jest utrzymywana w czystości.</li>
		<li>Wlać 100 ml metanolu do kolby.</li>
		<li>Dodać 5 ml kwasu octowego.</li>
		<li>Dodać 3 ml APTES (3-aminopropylotrimetoksysilanu) i delikatnie wymieszać, wstrząsając.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amino-silanizacja. Zastąp metanol w naczyniach barwiących, które zawierają szkiełka i szkiełka nakrywkowe, mieszaniną reakcji aminozylanizacji.
	<ol>
		<li>Inkubować przez 20-30 min. Podczas inkubacji sonikować raz przez 1 minutę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płukanie metanolem. Zastąp reakcję aminozylanizacji metanolem. Wyrzuć metanol i dodaj świeży roztwór metanolu. Powtórz tę procedurę trzy razy.</li>
</ol>
4. Pasywacja powierzchni za pomocą polimeru (pierwsza runda)
Pasywacja pokrytej aminą powierzchni szkiełek kwarcowych i nakrywkowych poprzez sprzężenie estru polietylenu (PEG) z NHS. Reakcję tę przeprowadza się przy nasycającym stężeniu roztworu PEG o pH 8,5 przez noc.
<ol>
	<li>Suszenie szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych. Osuszyć szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe za pomocą gazuN2 i umieścić je w czystych pudełkach na pipety w taki sposób, aby strona, która ma być PEGylowana, była skierowana do góry. Pudełko z pipetami jest częściowo wypełnione MilliQ H2O. To wilgotne środowisko zapobiega wysychaniu roztworu PEGylacji podczas nocnej inkubacji.</li>
	<li>Przygotowanie buforu reakcyjnego. Przygotować 0,1 M świeżego buforu wodorowęglanowego sodu (pH 8,5), rozpuszczając 84 mg wodorowęglanu sodu w 10 ml MilliQH 2O. Nie ma potrzeby dostosowywania pH. Roztwór ten może być przechowywany w stanie zamrożonym do następnego użycia (np. Krok 6.1).</li>
	<li>Przygotowanie roztworu PEGylacji.
	<ol>
		<li>Przygotuj mieszaninę PEG składającą się z 0,2 mg biotynylowanego estru NHS PEG (5 000 Da) 13 i 8 mg estru NHS mPEG (5 000 Da) w probówce o pojemności 1,5 ml. Przygotowując N liczbę szkiełek, należy przygotować N razy większą ilość mieszanki PEG w jednej tubce.</li>
		<li>Dodać 64 μl (lub N razy 64 μl dla N liczby szkiełek) świeżo przygotowanego buforu (krok 4.2). Pipetuj w górę i w dół, aby całkowicie je rozpuścić.</li>
		<li>Wirować z 16 100 x g przez 1 minutę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Nie należy pipetować pipetowania. W przeciwnym razie utworzą się pęcherzyki powietrza, które zakłócają pegylację w kroku 4.4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PEGylacja.
	<ol>
		<li>Upuść 70 μl mieszaniny PEGylacji do wysuszonego szkiełka kwarcowego z kroku 4.1. Użyć 90 μl w przypadku szkiełka nakrywkowego 24 x 50mm2.</li>
		<li>Delikatnie umieść wysuszone szkiełko nakrywkowe z kroku 4.1 na roztworze.</li>
		<li>Aby uzyskać jednolitą i wysoką jakość pegylacji, należy uważać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza. Ze względu na napięcie powierzchniowe większość pęcherzyków powietrza może spontanicznie opuścić objętość reakcji w ciągu pięciu minut z powodu napięcia powierzchniowego.</li>
		<li>Inkubuj szkiełka w ciemnym i wilgotnym środowisku. Okres półtrwania NHS-ester PEG, którego używamy przy pH 8, wynosi około jednej godziny. Inkubuj je co najmniej przez 2 godziny. Inkubacja przez noc prowadzi do wyższej jakości PEGylacji (dane nie pokazane).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Długoterminowe przechowywanie
Przechowywanie preparatów PEGylowanych i nakrywek w N2 w temperaturze -20 ºC.
<ol>
	<li>Suszenie szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych. Ostrożnie zdemontować szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe, przesuwając je na bok, przepłukać preparatem MilliQ H2O i osuszyć preparatem N2.</li>
	<li>Przechowywanie szkiełek podstawowych i nakrywek. W celu natychmiastowego użycia postępuj zgodnie z procedurą dla drugiej rundy PEGylacji (Krok 6). Aby przechowywać dane przez dłuższy czas, należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Umieścić parę szkiełek podstawowych i szkiełko nakrywkowe w probówce o pojemności 50 ml w taki sposób, aby powierzchnie pegylowane były skierowane od siebie.</li>
		<li>Częściowo zamknij probówkę, odkurz probówkę, a następnie napełnij jąN2. Te kroki pomagają zachować powierzchnię PEGylowaną przez długi czas. Mocno przykręcić rurkę i przechowywać ją w temperaturze -20 °C. Jakość preparatów utrzymuje się na dobrym poziomie przez okres do 3 miesięcy (Rysunek 3a, po prawej).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Pasywacja powierzchni za pomocą polimeru (druga runda)
Dodatkowa runda pegylacji, aby zagęścić warstwę PEG, a także wygasić wszelkie pozostałe grupy aminowe na powierzchni. Zastosowanie krótkich cząsteczek estrowych PEG NHS (333 Da) może być skuteczne w przenikaniu do istniejącej warstwy PEG. Zaleca się wykonanie drugiej rundy PEGylacji tuż przed użyciem szkiełka.
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu reakcyjnego. Przygotować 0,1 M świeżego buforu wodorowęglanu sodu (pH 8,5). Można również użyć zamrożonego roztworu z kroku 4.2.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu PEGylacji. Rozpuścić 7 μl 250 mM MS4-PEG w 63 μl buforu wodorowęglanowego sodu.</li>
	<li>PEGylacja. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 4.4. Inkubować przez 30 minut do nocy.</li>
	<li>Suszenie szkiełek podstawowych i szkiełek nakrywkowych. Zdemontować parę szkiełek podstawowych i szkiełko nakrywkowe, przepłukać je roztworem MilliQ H2O, wysuszyć roztworem N2 i przechowywać w czystym pudełku na pipety. Przystąp do montażu komory mikroprzepływowej w kroku 7.</li>
</ol>
7. Montaż komory mikroprzepływowej
Montaż komory mikroprzepływowej za pomocą pary szkiełka kwarcowego PEGylowanego i szkiełka nakrywkowego. Dwustronna taśma klejąca służy jako przekładka. Komora jest uszczelniona klejem epoksydowym, a roztwory są wprowadzane przez otwory w zjeżdżalni kwarcowej.
<ol>
	<li>Umieść szkiełko kwarcowe na płaskiej powierzchni stroną z PEGylacją skierowaną do góry.</li>
	<li>Wykonaj kanał (szerokość od 5 do 7 mm) po przekątnej na powierzchni PEGylowanej, nakładając dwustronne taśmy klejące na szkiełko. Upewnij się, że otwory są umieszczone na środku kanału. Uważaj, aby nie uszkodzić PEGylowanej powierzchni podczas procesu tworzenia komory. Możliwe jest wykonanie slajdu wielokanałowego poprzez umieszczenie i przyklejenie dwustronnych taśm klejących w inny sposób (patrz rysunek 2).</li>
	<li>Delikatnie umieść pegylowane szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby uzupełnić komorę. Strona PEGylowana powinna być skierowana w dół.</li>
	<li>Uszczelnij komorę, dociskając szkiełko nakrywkowe do obszaru, w którym umieszczane są taśmy dwustronne. Zrób to delikatnie, ale dokładnie, aby komora stała się wodoszczelna.</li>
	<li>Zamknij krawędzie komory klejem epoksydowym.</li>
	<li>Unieruchomić streptawidynę lub neutrawidynę na biotynylowanej warstwie PEG, dodając 50 μl 0,1 mg/ml roztworu streptawidyny lub neutrawidyny w T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM bufor NaCl) za pomocą pipety p200. Po 1 minucie inkubacji przepłukać 100 μl buforu T50.</li>
	<li>Dodaj biotynylowane cząsteczki biologiczne do obrazowania pojedynczych cząsteczek.</li>
</ol>
8. Recykling slajdów
Recykling zjeżdżalni kwarcowych. Zużyte szkiełka są poddawane recyklingowi poprzez usunięcie szkiełek nakrywkowych i dwustronnych taśm klejących.
<ol>
	<li>Po użyciu przechowuj komory w wodzie z kranu. Długotrwała inkubacja w wodzie ułatwia demontaż komór.</li>
	<li>Zagotuj komory w wodzie z kranu za pomocą kuchenki mikrofalowej. Użyj zlewki Pyrex. Gotować przez 10 minut lub dłużej.</li>
	<li>Usuń szkiełka nakrywkowe i dwustronne taśmy klejące za pomocą żyletki. Nie naciskaj szkiełka kwarcowego prostopadle do jego płaszczyzny. W przeciwnym razie się zepsuje. Trzymaj żyletkę z dala od kanału. W przeciwnym razie wprowadza rysy na kanale.</li>
	<li>Opłucz szkiełka domowym detergentem, pocierając je palcami.</li>
	<li>Umieść szkiełka w szklanym słoiku do barwienia. Zazwyczaj w jednym słoiku można umieścić od 5 do 15 szkiełek. Dodaj 10% domowego detergentu i sonikuj szkiełka przez 20 minut lub dłużej. Przepłukać szkiełka dużą ilością wody w tabletkach.</li>
	<li>Przejdź do kroku 1.2.</li>
</ol>

<ol><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfaces+and+orientations%3A+much+to+FRET+about%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Surfaces and orientations: much to FRET about.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).</li>
<li>Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein-nucleic+acid+and+protein-protein+complexes%3A+surface+passivation+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization.</a> Methods. 52 (2), 192-200 (2010).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+system+for+single+molecule+fluorescence+measurements+of+surface-immobilized+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules.</a> J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).</li>
<li>Kingshott, P., Griesser, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+that+resist+biodegradation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Solid+St+M%22%5BJournal%5D)">Surface that resist biodegradation.</a> Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).</li>
<li>Elbert, D. L., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+treatments+of+polymers+for+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Mater+Sci%22%5BJournal%5D)">Surface treatments of polymers for biocompatibility.</a> Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).</li>
<li>Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSelvin%2C+PR+%22Single-Molecule+Techniques%3A+A+Laboratory+Manual%22">Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+lipid+bilayers+and+DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies.</a> Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).</li>
<li>Kenausis, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28L-lysine%29-g-Poly%28ethylene+glycol%29+layers+on+metal+oxide+surfaces%3A+attachment+mechanism+and+effects+of+polymer+architecture+on+resistance+to+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption.</a> J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).</li>
<li>Groll, J., Star Moeller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((polymer+surface+passivation+for+single-molecule+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">polymer surface passivation for single-molecule detection.</a> Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).</li>
<li>Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyethylene+glycol+coatings+of+uptake+of+indocyanine+green+loaded+nanocapsules+by+human+spleen+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro.</a> J Biomed Opt. 16 (5), (2011).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> J Vis Exp. (37), e1689(2010).</li>
<li>Upadhyayula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coatings+of+polyethylene+glycol+for+suppressing+adhesion+between+solid+microspheres+and+flat+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces.</a> Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).</li>
<li>Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+genomic+processes+at+the+single-molecule+level%3A+introducing+the+tools+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications.</a> Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).</li>
<li>Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+single-molecule+spectroscopy+to+macromolecular+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes.</a> Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318, 426-430 (2007).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Krytyczne kroki w ramach tego protokołu
Konieczne jest, aby powierzchnia była hydrofilowa przed reakcją aminosilanizacji. Udało się to osiągnąć poprzez wytrawianie piranii, które generuje wolne grupy hydroksylowe na powierzchni szkła/kwarcu. Zaleca się, aby nie wystawiać powierzchni wytrawionej piranią na działanieH2Olub powietrza przez długi czas, ponieważ hydrofilowość powierzchni stopniowo spada.
Cząsteczki NHS-ester PEG są reaktywne. Zaleca się wykonanie podwielokrotności i przechowywanie ich w atmosferze azotu w temperaturze -20 ºC. Okres trwałości substancji chemicznej APTES w temperaturze pokojowej jest krótki. Zaleca się wymianę go na nowy co miesiąc.
Modyfikacje tego protokołu
Jeśli z jakiegokolwiek praktycznego powodu nie możesz użyć trawienia piranii, możesz wytrawiać za pomocą KOH przez długi czas (np. przez noc), co również spowoduje odsłonięcie grup hydroksylowych. Pułapka tego alternatywnego podejścia polega na tym, że zjeżdżalnia staje się bezużyteczna po kilku recyklingach z powodu poważnych zadrapań.
Często praktykuje się spalanie powierzchni szklanej/kwarcowej za pomocą palnika propanowego, który skutecznie eliminuje fluorescencyjne materiały organiczne 7. Procedura ta nie została uwzględniona w tym protokole, ponieważ jest zbędna do trawienia piranii. Należy pamiętać, że ta procedura potencjalnie doprowadzi do utlenienia grup hydroksylowych. Dlatego tej procedury nie należy przeprowadzać, gdy powierzchnia została wytrawiona za pomocą KOH lub roztworu piranii.
Gdy do obrazowania pojedynczych cząsteczek stosuje się bufor o pH niższym niż 7, konformacja PEG zmienia się z "grzyba" na "szczotkę", co zmniejsza stopień pasywacji. Dlatego, gdy stosuje się pH niższe niż 7,0, zaleca się dalszą pasywację powierzchni za pomocą wintaranu disuccinimidylu 7.
Perspektywy
Prace te dostarczyły solidnego protokołu umożliwiającego osiągnięcie wysokiej jakości pasywacji powierzchni. Protokół ten będzie przydatny w badaniach fluorescencji pojedynczych cząsteczek, które są zaangażowane w białka 14 , a także kompleksy białkowe w ekstraktach komórkowych i immunoprecypitatach 15. Będzie szeroko stosowany w innych technikach jednocząsteczkowych, takich jak spektroskopia sił i spektroskopia momentu obrotowego 16. Będzie również przydatny do zapobiegania adsorpcji komórek na powierzchni 17.
Protokół przedstawiony w tej pracy jest wymagający ze względu na wieloetapowe procedury. Pasywacja powierzchni przy użyciu lipid-PEG 8 i polilizyny PEG 9 jest dostępna jako alternatywne podejście. Ponieważ nie wymagają żadnych reakcji chemicznych, są łatwe do wdrożenia. Jednak stopień pasywacji nie jest tak wysoki, jak ten osiągany w wyniku chemicznej modyfikacji powierzchni.

Podczas badania białka jednocząsteczkowego ważne jest osiągnięcie wysokiej jakości pasywacji powierzchniowej, tak aby eksperyment był wolny od jakichkolwiek indukowanych powierzchniowo nieprawidłowości białkowych lub denaturacji 1,2. Podczas gdy szklana powierzchnia poddana działaniu środków powierzchniowo czynnych, takich jak albumina surowicy bydlęcej, jest powszechnie stosowana do badań pojedynczych cząsteczek kwasów nukleinowych 3, stopień jej pasywacji nie jest wystarczająco wysoki do badań białek. Szklana powierzchnia pokryta polimerem (glikol polietylenowy, PEG) jest lepsza pod względem pasywacji 4-6. W związku z tym stał się powszechnie stosowany do badań białek jednocząsteczkowych, odkąd został wprowadzony do badania fluorescencji pojedynczych cząsteczek 7-10. Procedura powlekania polimerowego wymaga wielu zabiegów powierzchniowych 7,11,12. Dlatego trudno jest prześledzić całą procedurę bez szczegółowych instrukcji. Często stopień pasywacji powierzchni różni się w zależności od przestrzeganego protokołu. W tym miejscu przedstawiamy solidny protokół z instrukcjami krok po kroku, który usunie jedno z głównych wąskich gardeł w badaniach nad białkami jednocząsteczkowymi. Zobacz rysunek 1, aby zapoznać się z przeglądem.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>1. Przygotowanie i czyszczenie szkiełek ślizgowych</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>631-0136 631-0144 631-0147</td><td>24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 &nbsp;( No.1&frac12;, Prostokątny)</td></tr><tr><td>Wiertła diamentowe</td><td>MTN-Giethoorn, Holandia</td><td>LA-0564-00DB</td><td>3/4 mm</td></tr><tr><td>Uchwyt do prowadnic Duran</td><td>LGS, Holandia</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>Witraże szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>300101</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Boom</td><td>6233905</td><td>1 L, nadtlenek wodoru 30%. Otwarte butelki należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Boom</td><td>80900627.9010</td><td>Kwas siarkowy 95-98%</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Wodorotlenek potasu</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>Myjka ultradźwiękowa stołowa, 3510</td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie kwarcowe</td><td>Finkenbeiner</td><td></td><td>1" x 3", 1 mm gruby</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Duran uchwyt do szkiełek</td><td>ślizgowych LGS, Holandia</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Sonicator wodorotlenku potasu</td></tr><tr><td></td><td>Branson</td><td></td><td>Myjka ultradźwiękowa stołowa, 3510</td></tr><tr><td colspan="4">3. Aminosilanizacja szkiełek i szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>320099-500ML</td><td>Kwas octowy, lodowaty</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-100ML</td><td>3-aminopropylotrimetoksysilan. Przechowywać w temperaturze pokojowej pod N2. Wymieniaj raz w miesiącu.</td></tr><tr><td>Kolba (200 ml)</td>Kolba <td>VWR</td><td>(200 ml)</td><td>Kolba Pyrex. Należy mieć jedną kolbę przeznaczoną do aminozylanizacji.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>Myjka ultradźwiękowa stołowa, 3510</td></tr><tr><td colspan="4">4. Pasywacja powierzchni za pomocą polimeru (pierwsza runda)</td></tr><tr><td>Biotin-mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5,000&nbsp;Da. Przechowywać porcje 1-2 mg (wystarczają na 10 szkiełek) w temperaturze -20 &deg; C pod N2.</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td>mPEG-walerianian sukcynimidylu (SVA), MW 5,000 Da. Przechowywać podwielokrotności 80 mg (wystarcza na 10 szkiełek) w temperaturze -20 &deg; C pod N2.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5. Pasywacja powierzchniowa (druga runda)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Bioodczynnik do biologii molekularnej, &ge; 99,9%</td></tr><tr><td>DST</td><td>Pierce</td><td>20589</td><td>Wintaran disuccinimidylu</td></tr><tr><td>MS4-PEG</td><td>Pierce</td><td>22341</td><td>Krótki NHS-ester PEG, MW 333 Da. Rozpuść 100 mg MS4-PEG w 1,1 ml DMSO. Sklep 20 &mikro; l podwielokrotności w temperaturze -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">6. Montaż komory mikroprzepływowej</td></tr><tr><td>Podwójna taśma klejąca</td><td>Scotch</td><td></td><td>o szerokości 10 mm</td></tr><tr><td>Epoksydowa</td><td>Thorlabs</td><td>G14250</td><td>Devcon 5 minutowa żywica epoksydowa</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1 KG</td><td>Chlorek sodu</td></tr><tr><td>Neutrawidyna</td><td>Pierce</td><td>31000</td><td>ImmunoPure NeutrAvidin Białko wiążące biotynę. Zapas w 5 mg/ml w H2O w 4 stopniach C.</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>S-888</td><td>Stock 5 mg/ml w H2O lub T50 w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Podstawa Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1 KG</td><td>Tris</td></tr></tbody></table>

pasywacja powierzchniowa w badaniach białek jednocząsteczkowych

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Spektroskopia fluorescencji pojedynczych cząsteczek okazała się pomocna w zrozumieniu szerokiego zakresu zjawisk biologicznych w nanoskali. Ważnymi przykładami tego, co ta technika może przynieść naukom biologicznym, są mechanistyczne spostrzeżenia na temat interakcji białko-białko i białko-kwas nukleinowy. Gdy oddziaływania białek są badane na poziomie pojedynczej cząsteczki, białka lub ich substraty są często unieruchomione na szklanej powierzchni, co pozwala na długotrwałą obserwację. Ten schemat unieruchomienia może wprowadzić niepożądane artefakty powierzchniowe. Dlatego konieczne jest pasywowanie powierzchni szkła, aby była obojętna. Powlekanie powierzchni za pomocą glikolu polietylenowego (PEG) wyróżnia się wysoką wydajnością w zapobieganiu niespecyficznej interakcji białek z powierzchnią szklaną. Jednak procedura powlekania polimerami jest trudna ze względu na komplikacje wynikające z serii obróbki powierzchni i rygorystyczny wymóg, aby powierzchnia była wolna od jakichkolwiek cząsteczek fluorescencyjnych pod koniec procedury. Tutaj zapewniamy solidny protokół z instrukcjami krok po kroku. Obejmuje czyszczenie powierzchni, w tym trawienie piranii, funkcjonalizację powierzchni grupami aminowymi i wreszcie powlekanie PEG. Aby uzyskać wysoką gęstość warstwy PEG, wprowadzamy nową strategię obróbki powierzchni cząsteczkami PEG w dwóch cyklach, co znacznie poprawia jakość pasywacji. Zapewniamy reprezentatywne wyniki, a także praktyczne porady dla każdego krytycznego etapu, aby każdy mógł osiągnąć wysoką jakość pasywacji powierzchni.

Po zmontowaniu komory mikrofluidycznej (Kroki 7.1 - 7.6) i przed przystąpieniem do Kroku 7.7, zaleca się przeprowadzenie kontroli jakości powierzchni pegylowanej.
Jeśli pasywacja powierzchni przebiegła pomyślnie, po dodaniu do komory białka znakowanego fluorescencyjnie w stężeniu 1-10 nM zaobserwuje się mniej niż 10 niespecyficznie zaadsorbowanych białek na obszar obrazowania (25 mm x 25 mm) (Rysunek 3a, lewo).
W przypadku nieprawidłowego przeprowadzenia któregokolwiek z etapów czyszczenia lub reakcji, liczba nieswoiście zaadsorbowanych białek znacznie wzrasta, co może prowadzić do nasycenia ekranu CCD sygnałami fluorescencji. Na przykład, pominięcie trawienia roztworem piranha powoduje 100-krotny wzrost zaobserwowanej adsorpcji nieswoistej (Rycina 3a; porównanie lewej z środkową częścią). W przypadku pominięcia drugiego etapu PEGylacji zaobserwowano około 3-krotnie większą ilość adsorpcji nieswoistej (Rycina 3b). Niski stopień PEGylacji występuje przy użyciu przeterminowanych odczynników (np. APTES przechowywanego w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy) (dane nie pokazane). Jakość powierzchni ulega również pogorszeniu, gdy od momentu PEGylacji upłynęła znaczna ilość czasu (Rycina 3a; porównanie lewej z prawą częścią).
Z naszej najlepszej wiedzy jest to pierwszy przypadek wprowadzenia dwóch rund PEGylacji w badaniach pojedynczych cząsteczek. Dwie rundy PEGylacji gwarantują najwyższą jakość formowania warstwy PEG (Rysunek 3b). Przewaga podwójnej PEGylacji jest wyraźnie widoczna na filmach (porównaj Film 1a z Filmem 1b). Na filmach tych zaobserwowano, że sygnały tła pochodzące od cząsteczek fluorescencyjnych w roztworze są znacznie słabsze w przypadku zastosowania podwójnej PEGylacji, co wskazuje, że białka są skuteczniej odpychane przez podwójnie PEGylowaną warstwę. Choć ten dwuetapowy proces jest zdecydowanie zalecany, drugi etap PEGylacji można pominąć, jeśli eksperyment dopuszcza nieoptymalną pasywację.
<img alt="Schemat procesu przygotowania powierzchni z etapami trawienia chemicznego, aminosylanizacji i PEGylacji." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat modyfikacji powierzchni. (a) Szkiełko mikroskopowe jest czyszczone acetonem, KOH i roztworem piranha. Następnie jest funkcjonalizowane APTES i poddawane PEGylacji za pomocą PEG-estru NHS. (b) Łącznik (coverslip) jest czyszczony KOH, a w razie potrzeby również roztworem piranha. Jest on funkcjonalizowany APTES i poddawany PEGylacji za pomocą PEG-estru NHS. 
 
<img alt="Schemat montażu PEGylowanej komory mikrofluidycznej: etapy procesu, szkiełka szklane/kwarcowe, wiązanie epoksydowe." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Komora mikrofluidyczna. (a) Komora jednokanałowa. W szkiełku przedmiotowym wywiercono dwa otwory. Jest ona montowana z szkiełkiem nakrywkowym za pomocą dwóch kawałków dwustronnej taśmy klejącej. (b) Komora trójkanałowa. W szkiełku przedmiotowym wywiercono sześć otworów. Jest ona montowana z szkiełkiem nakrywkowym za pomocą czterech kawałków dwustronnej taśmy klejącej.
<img alt="Obraz mikroskopowy obróbek powierzchniowych: trawienie w roztworze Piranha, efekty PEGylacji, analiza starzenia próbek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Obrazy CCD uzyskane z białkami znakowanymi barwnikiem w roztworze. (a) Obrazy CCD wykonano za pomocą pryzmatycznej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, używając obiektywu 60X i 10 nM Rep znakowanego Cy3 w roztworze. (Lewo) Powierzchnia została przygotowana zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym artykule. (Środek) Powierzchnia została przygotowana zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym artykule, ale pominięto trawienie w roztworze Piranha. (Prawo) Powierzchnia została przygotowana zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym artykule i przechowywana przez 3 miesiące w temperaturze -20 ºC w atmosferze azotu. (b) Obrazy CCD wykonane z użyciem 10 nM Rep znakowanego Cy3 w roztworze. (Lewo) Powierzchnia została przygotowana zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym artykule. (Prawo) Powierzchnia została przygotowana zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym artykule, ale pominięto drugą rundę PEGylacji. Pasek skali = 5 µm.
Film 1: Nagrania CCD wykonane z białkami znakowanymi barwnikiem w roztworze. Nagrania CCD wykonano za pomocą pryzmowej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem, używając obiektywu 60X i roztworu 10 nM Rep znakowanego Cy3. Rozdzielczość czasowa wynosi 100 msec. (a) Powierzchnię przygotowano zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym artykule. (b) Powierzchnię przygotowano zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym artykule, jednak pominięto drugą rundę PEGylacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">Kliknij tutaj</a>, aby wyświetlić Film 1a i <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank"> kliknij tutaj</a>, aby wyświetlić Film 1b.

Opisujemy metodę pasywacji powierzchni szkła za pomocą glikolu polietylenowego (PEG). Protokół ten obejmuje czyszczenie powierzchni, funkcjonalizację powierzchni i powlekanie PEG. Wprowadzamy nową strategię obróbki powierzchni cząsteczkami PEG w dwóch rundach, co zapewnia lepszą jakość pasywacji w porównaniu z istniejącymi metodami.

Pasywacja powierzchniowa w badaniach białek jednocząsteczkowych

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wysokiej jakości aktywowanej powierzchni szkiełka kwarcowego. Osiąga się to poprzez wstępne oczyszczenie nawierconych szkiełek kwarcowych i szkiełek zakrywkowych wodą oraz acetonem. Następnie szkiełko poddaje się trawieniu wodorotlenkiem potasu oraz roztworem piranha w celu poprawy jakości powierzchni.Następnie preparaty i szkiełka nakrywkowe są funkcjonalizowane grupami aminowymi, po czym przeprowadzane są dwie rundy pasywacji powierzchni za pomocą polimeru w celu nadania powierzchni szkła właściwości obojętnych. Ostatnim krokiem jest zmontowanie komory mikroprzepływowej z preparatu i szkiełka nakrywkowego w taki sposób, aby powierzchnie pokryte glikolem polietylenowym lub pegylowane były skierowane ku sobie. W rezultacie nowa strategia traktowania powierzchni cząsteczkami PEG w dwóch rundach znacząco poprawia jakość pasywacji, co potwierdzono w badaniach z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii pojedynczych cząsteczek.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak powlekanie polimerem po trawieniu tlenkiem potasu, jest gwarancja wyższej jakości. Osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ konieczne jest przeprowadzenie wielokrotnych zabiegów serwisowych. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować płytki kwarcowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Oczyść szkiełka, umieszczając je w szklanym słoiku do barwienia. Zazwyczaj w jednym słoiku można umieścić od pięciu do 15 szkiełek. Następnie wypłucz szkiełka wodą UE, powtarzając płukanie trzykrotnie, poddaj szkiełka sonikacji w wodzie UE przez pięć minut w celu usunięcia zanieczyszczeń, wylej wodę i wypłucz szkiełka dodatkowe trzy razy wodą UE.Następnie należy zastąpić wodę UE acetonem i poddać szkiełka sonikacji w acetonie przez 20 minut lub dłużej, po czym odlać aceton i wypłukać szkiełka wodą Milli Q, aby usunąć wszelkie pozostałości acetonu. Następnie wodę należy zastąpić jednomolowym wodorotlenkiem potasu i poddać szkiełka sonikacji przez 20 minut lub dłużej. Nadmierne trawienie poprawi jakość powierzchni, ale spowoduje powstanie zarysowań, które mogą zakłócać obrazowanie fluorescencyjne.Opłucz preparaty trzy razy wodą Milli Q, aby usunąć ślady wodorotlenku potasu przed trawieniem w roztworze piranha. Przenieś preparaty do uchwytu Duran lub specjalnie wykonanego uchwytu teflonowego i umieść je w zlewce o pojemności jednego litra, znajdującej się w dygestorium. Napełnij zlewkę 450 mililitrami kwasu siarkowego.Następnie dodaj 150 ml nadtlenku wodoru, aby uzyskać stosunek kwasu siarkowego do nadtlenku wodoru wynoszący trzy do jednego. Zamieszaj roztwór w celu dokładnego wymieszania i pozostaw zlewkę w spokoju na 20 minut. Wyjmij preparaty z roztworu piranha i umieść je w uchwycie na szkiełka zawierającym wodę Millieu.W międzyczasie należy wylać roztwór piranha do wyznaczonej butelki na odpady. Po osiągnięciu temperatury pokojowej wypłukać szkiełka trzykrotnie wodą UE, postępując zgodnie z procedurą czyszczenia szkiełek zakrywkowych. Wymienić wodę UE w kuwetach do barwienia na metanol. Przechowywać szkiełka i szkiełka zakrywkowe w metanolu.W międzyczasie przygotuj roztwór do silanizacji aminowej, wlewając 100 mililitrów metanolu do kolby. Następnie dodaj pięć mililitrów kwasu octowego oraz trzy mililitry 3-aminopropylotrimetoksysilanu i delikatnie wymieszaj poprzez potrząsanie. Zastąp metanol w kuwetach do barwienia zawierających szkiełka i szkiełka nakrywkowe mieszaniną reakcyjną do silanizacji aminowej.Inkubować przez 20 do 30 minut, wykonując w trakcie inkubacji jedną minutową sonikację. Następnie zastąpić mieszaninę reakcyjną do izolacji aminowej metanolem. Po tym odlać metanol i dodać świeży roztwór metanolu.Powtórz tę procedurę trzy razy dla pierwszej serii funkcjonalizacji powierzchni. Osusz szkiełka i szkiełka nakrywkowe za pomocą gazu azotowego, stosując najpierw polimer. Następnie umieść je w czystych pudełkach do pipet, częściowo wypełnionych wodą Milli-Q, w taki sposób, aby strona wymagająca pegylacji była skierowana do góry. Następnie dodaj 64 µL świeżo przygotowanego buforu reakcyjnego do przygotowanego roztworu PEG.Pipetuj mieszaninę w górę i w dół, aby całkowicie ją rozpuścić. Następnie wiruj z prędkością 16 100 G przez jedną minutę. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, nanieś 70 µL mieszaniny do pegylacji na wysuszone szkiełko kwarcowe.Ostrożnie nałóż wysuszone szkiełko nakrywkę na roztwór, a następnie inkubuj preparaty w ciemnym i wilgotnym środowisku od dwóch godzin do całej nocy, aby przechowywać pegylowane szkiełka przedmiotowe i nakrywki. Ostrożnie rozdziel szkiełko przedmiotowe i nakrywkę, przesuwając nakrywkę na bok i płucząc je wodą UE przed wysuszeniem prądem gazu azotowego. Umieść parę szkiełka przedmiotowego i nakrywki w probówce o pojemności 50 mililitrów w taki sposób, aby pegylowane powierzchnie były skierowane od siebie. Częściowo zamknij probówkę i poddaj ją próżniowaniu, a następnie napełnij ją azotem i szczelnie zakręć pokrywkę. Przechowuj w temperaturze -20 °C. Kroki te pomagają zachować powierzchnię pegylowaną przez długi czas.Przeprowadź drugą rundę pegylacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym bezpośrednio przed użyciem szkiełka do montażu komory mikrofluidycznej. Połóż szkiełko kwarcowe na płaskiej powierzchni stroną pegylowaną do góry. Utwórz kanał po przekątnej na powierzchni pegylowanej, naklejając na szkiełko dwustronną taśmę klejącą.Upewnij się, że otwory znajdują się w centrum kanału. Następnie delikatnie umieść na górze pegylowane szkiełko nakrywki, aby zamknąć komorę, tak aby strona pegylowana była skierowana w dół.Uszczelnij komorę, dociskając szkiełko nakrywkę do obszarów, w których umieszczono dwustronną taśmę. Zrób to delikatnie, ale dokładnie, aby komora została szczelnie zamknięta i nie przepuszczała wody. Na koniec zabezpiecz krawędzie komory klejem epoksydowym.Należy przystąpić do unieruchomienia streptawidyny lub neutravainu i dodać biotynilowane cząsteczki biologiczne do obrazowania pojedynczych cząsteczek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym; jeśli funkcjonalizacja powierzchni przebiegła pomyślnie, liczba nieswoistく absorbowanych białek na obserwowany obszar obrazowania wynosi mniej niż 10. Po dodaniu do komory białka znakowanego fluorescencyjnie w stężeniu od 1 do 10 nM, w przypadku niewłaściwego przeprowadzenia któregokolwiek z etapów czyszczenia lub reakcji, liczba nieswoiście absorbowanych białek znacznie wzrasta. Na przykład, w przypadku pominięcia trawienia roztworem piranha, obserwuje się 100-krotny wzrost nieswoistej absorpcji.Wyższość podwójnej pegylacji jest tutaj wyraźnie widoczna. Zaobserwowano, że sygnały tła pochodzące od cząsteczek fluorescencyjnych i roztworu były znacznie słabsze w przypadku zastosowania podwójnej pegylacji, co przedstawiono na lewym panelu. Wskazuje to, że białka są skuteczniej odpychane przez warstwę podwójnie pegylowaną.Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura może zająć cztery godziny. Należy pamiętać, że praca z AYA może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich rękawic, gogli i fartucha.

surface-passivation-for-single-molecule-protein-studies

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Pasywacja powierzchni dla badań białek pojedynczych cząsteczek

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Opisano metodę wykorzystania nanoporów w stanie stałym do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda ta opiera się na zasadzie impulsu rezystywnego, co pozwala na badanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek zachodzi daleko od stanu równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych macierzy syntetycznych nanoporów, co umożliwia ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości...

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Ten protokół demonstruje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania jednowymiarowej (1D) dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę pasywacji powierzchni szkła za pomocą dwuetapowego pokrycia PEG, która zmniejsza niespecyficzne wiązanie białek w mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek.

Pasywacja powierzchniowa w badaniach białek jednocząsteczkowych

Przeglądaj więcej filmów