Pasywacja powierzchniowa w badaniach białek jednocząsteczkowych
April 24th, 2014
Opisujemy metodę pasywacji powierzchni szkła za pomocą glikolu polietylenowego (PEG). Protokół ten obejmuje czyszczenie powierzchni, funkcjonalizację powierzchni i powlekanie PEG. Wprowadzamy nową strategię obróbki powierzchni cząsteczkami PEG w dwóch rundach, co zapewnia lepszą jakość pasywacji w porównaniu z istniejącymi metodami.
Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie najwyższej jakości powierzchni zjeżdżalni kwarcowej. Osiąga się to poprzez uprzednie oczyszczenie wierconych szkiełek kwarcowych i szkiełek nakrywkowych wodą i acetonem. Następnie szkiełko jest wytrawiane wodorotlenkiem potasu i roztworem piranii w celu poprawy jakości powierzchni.
Następnie szkiełka i szkiełka nakrywkowe są funkcjonalizowane grupami aminowymi, po których następują dwie rundy powlekania powierzchni za pomocą polimeru, aby powierzchnia szkła była obojętna. Ostatnim krokiem jest zmontowanie komory mikroprzepływowej ze szkiełka i szkiełka nakrywkowego z powierzchniami pokrytymi glikolem polietylenowym lub pegylowanymi naprzeciwko siebie. Ostatecznie, nowa strategia obróbki powierzchni cząsteczkami peg w dwóch rundach znacznie poprawia jakość pasywacji obserwowaną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek.
Główną zaletą tej techniki lub istniejących technik, takich jak powlekanie polimerem po trawieniu tlenkiem potasu, jest to, że technika ta gwarantuje najwyższą jakość. Osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, będą miały trudności, ponieważ konieczne jest wykonanie wielu zabiegów serwisowych. Aby rozpocząć wiercenie, kwarc ślizga się zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Wyczyść szkiełka, umieszczając je w szklanym słoiku do barwienia. Zazwyczaj w jednym słoiku można umieścić od pięciu do 15 szkiełek. Następnie spłukać szkiełka wodą UE po trzykrotnym powtórzeniu płukania, sonikować szkiełka wodą UE przez pięć minut w celu usunięcia brudu, wylać wodę i spłukać szkiełka jeszcze trzy razy wodą UE.
Następnie zastąp wodę UE acetonem i poddaj szkiełka sonikacji acetonem przez 20 minut lub dłużej, wyrzuć aceton i spłucz szkiełka wodą Milli Q, aby usunąć wszelkie pozostałości acetonu. Następnie zastąp wodę jednym molowym wodorotlenkiem potasu i sonikuj szkiełka przez 20 minut lub dłużej. Nadmierne trawienie poprawi jakość powierzchni, ale wprowadzi rysy, które mogą zakłócać obrazowanie fluorescencyjne.
Przepłucz szkiełka trzykrotnie wodą Milli Q, aby usunąć ślady wodorotlenku potasu i wykonać trawienie piranii. Przenieś szkiełka do uchwytu na szkiełka Duran lub wykonanego na zamówienie uchwytu teflonowego i umieść je w jednolitrowej zlewce, która znajduje się w kapturze chemicznym. Napełnij zlewkę 450 mililitrami kwasu siarkowego.
Następnie dodaj 150 mililitrów nadtlenku wodoru, aby uzyskać stosunek trzy do jednego między kwasem siarkowym a nadtlenkiem wodoru. Wymieszaj roztwór w celu prawidłowego wymieszania i pozostaw zlewkę w spokoju na 20 minut. Wyjąć szkiełka z roztworu piranii i umieścić je w uchwycie na szkiełko zawierającym wodę z płynu.
W międzyczasie wyrzuć roztwór piranii do przeznaczonej do tego butelki na odpady Gdy osiągnie temperaturę pokojową, po oczyszczeniu szkiełek nakrywkowych spłucz je trzykrotnie wodą z UE. Zastąp wodę UE w naczyniach barwiących metanolem. Szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w metanolu.
W międzyczasie przygotuj roztwór wyspizacji aminowej, wlewając 100 mililitrów metanolu do kolby. Następnie dodaj pięć mililitrów kwasu octowego i trzy mililitry trzech aminokwasów, trimetylu i delikatnie wymieszaj, wstrząsając. Zastąpić metanol w naczyniach barwiących zawierających szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe mieszaniną reakcji amino silosowania.
Inkubować przez 20 do 30 minut podczas inkubacji, sonikować raz przez jedną minutę. Następnie zastąp reakcję wyspizacji aminowej metanolem. Następnie wyrzuć metanol i dodaj świeży roztwór metanolu.
Powtórz tę procedurę trzy razy dla pierwszej rundy powierzchni Używając najpierw polimeru, osusz szkiełka i szkiełka nakrywkowe za pomocą gazowego azotu. Następnie umieść je w czystych pudełkach na pipety, częściowo wypełnionych wodą mili Q w taki sposób, aby strona, która ma być pegylowana, była skierowana do góry. Następnie dodać 64 mikrolitry świeżo przygotowanego buforu reakcyjnego do przygotowanego roztworu peg.
Pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby całkowicie się rozpuściła. Następnie odwirować w temperaturze 16, 100 G przez jedną minutę. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, upuść 70 mikrolitrów mieszaniny pegylacji na wysuszone szkiełko kwarcowe.
Delikatnie umieścić wysuszone szkiełko nakrywkowe na roztworze, inkubować szkiełka w ciemnym i wilgotnym środowisku przez dwie godziny do nocy, aby przechowywać pegylowane szkiełka i szkiełka nakrywkowe. Ostrożnie zdemontuj szkiełko i szkiełko nakrywkowe, przesuwając szkiełko nakrywkowe na bok i spłukując je wodą UE przed wysuszeniem gazowym azotem. Umieść parę szkiełek podstawowych i szkiełka nakrywkowego w 50-mililitrowej tubie tak, aby pegylowane powierzchnie były skierowane od siebie.
Częściowo zamknij rurkę i odkurz ją przed napełnieniem ją gazowym azotem i szczelnym przykręceniem pokrywki. Przechowuj go w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Te kroki pomagają zachować pegylowaną powierzchnię przez długi czas.
Wykonaj drugą rundę pegylacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym bezpośrednio przed użyciem szkiełka do złożenia komory mikroprzepływowej. Umieść szkiełko kwarcowe na płaskiej powierzchni pegylowaną stroną skierowaną do góry. Wykonaj kanał po przekątnej na pegylowanej powierzchni, nakładając dwustronną taśmę klejącą na szkiełko.
Upewnij się, że otwory są umieszczone na środku kanału. Następnie delikatnie umieść pegylowane szkiełko nakrywkowe na wierzchu, aby uzupełnić komorę. Z pegylowaną stroną skierowaną w dół.
Uszczelnij komorę, dociskając szkiełko nakrywkowe do miejsc, w których umieszczona jest taśma dwustronna. Zrób to delikatnie, ale dokładnie, aby komora stała się szczelna. Na koniec zamknij krawędzie komory klejem epoksydowym.
Przystąp do immobilizacji streptawidyny lub neut travainy i dodaj biotynylowane cząsteczki biologiczne do obrazowania pojedynczej cząsteczki, jak opisano w protokole tekstowym, jeśli powierzchnia została wykonana pomyślnie, obserwuje się mniej niż 10 niespecyficznie wchłoniętych białek na obszar obrazowania. Gdy do komory dodaje się od jednego do 10 nanomolowych białek znakowanych fluorescencyjnie, gdy którykolwiek z etapów czyszczenia lub reakcji nie został prawidłowo przeprowadzony, liczba niespecyficznie wchłoniętych białek znacznie wzrasta. Na przykład, jeśli trawienie piranii zostanie pominięte, obserwuje się 100 razy więcej absorpcji niespecyficznej.
Nadrzędny charakter podwójnej pegylacji jest tutaj wyraźnie pokazany. Zaobserwowano, że sygnały tła z cząsteczek fluorescencyjnych i roztworu są znacznie słabsze, gdy zastosowano podwójną pegilację, jak pokazano na lewym panelu. Oznacza to, że białka są skuteczniej odpychane przez podwójnie pegylowaną warstwę.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Nie zapominaj, że praca z AYA może być bardzo niebezpieczna, podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zadbać o odpowiednie rękawice, okulary i fartuch.
Przegląd
W tym artykule opisano nową metodę pasywacji powierzchni szklanych przy użyciu polietylenoglikolu (PEG). Protokół obejmuje czyszczenie powierzchni, funkcjonalizację oraz strategię dwuetapowego pokrywania PEG, która poprawia jakość pasywacji.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina Nauki
- Pasywacja powierzchni
- Mikrofluidyka
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wprowadzenie
- Pasywacja jest kluczowa dla redukcji niespecyficznego wiązania w obrazowaniu fluorescencyjnym.
- Tradycyjne metody mogą nie zapewniać optymalnej jakości powierzchni.
- PEG jest znany ze swoich obojętnych właściwości, co czyni go odpowiednim do tej aplikacji.
- Ulepszone metody obróbki powierzchni mogą poprawić wyniki eksperymentalne.
Cel Badania
- Opracowanie niezawodnej metody czyszczenia i pasywacji powierzchni szklanych.
- Wykażanie skuteczności dwuetapowego zabiegu PEG.
- Udostępnienie szczegółowego protokołu do naśladowania przez badaczy.
Metody Użyte
- Czyszczenie szkiełek kwarcowych wodą i acetonem.
- Trawienie wodorotlenkiem potasu i roztworem piranha.
- Funkcjonalizacja powierzchni grupami aminowymi.
- Nakładanie PEG w dwóch rundach, aby zapewnić wysokiej jakości pasywację.
Główne Wyniki
- Dwuetapowe obciążenie PEG znacznie poprawia pasywację powierzchni.
- Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek wykazuje zmniejszone niespecyficzne wiązanie.
- Prawidłowe wykonanie protokołu daje optymalne wyniki.
- Niezastosowanie się do kroków może prowadzić do zwiększonego wchłaniania niespecyficznego białka.
Wnioski
- Opisana metoda zapewnia lepszą alternatywę dla pasywacji powierzchni szklanych.
- Badacze mogą osiągnąć lepsze wyniki obrazowania dzięki temu protokołowi.
- Dbałość o szczegóły w procesie czyszczenia i obróbki jest niezbędna.
Najczęściej Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Surface passivation is a critical enabler for reliable single-molecule protein studies, directly impacting data quality in target interaction assays. Inadequate surface treatment introduces confounding non-specific binding, undermining mechanistic interpretation and increasing false-positive rates in early discovery. This protocol addresses a key technical bottleneck by delivering a robust, reproducible method to generate inert surfaces, thereby improving predictive confidence in downstream screening and validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables specific observation of protein-protein and protein-nucleic acid interactions by minimizing surface-induced artifacts.
- Operational Value: Provides a standardized surface preparation method that reduces variability across experiments and laboratories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports assay readiness by ensuring low background (<10 non-specifically absorbed proteins per imaging area) for accurate ligand binding measurements.
- Operational Value: The two-round PEGylation strategy improves coating consistency, enhancing reproducibility in high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by allowing precise quantification of binding kinetics and affinities in disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables long-term storage of passivated slides at -20°C, supporting batch preparation and workflow continuity.
Pipeline & Workflow Integration
This surface passivation method fits within the early discovery continuum, specifically supporting target validation and assay development stages by providing a reliable foundation for single-molecule imaging.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through clean visualization of specific biomolecular interactions without surface interference.
- Screening: Enables quantitative, reproducible readouts essential for comparing compound effects in primary and secondary screens.
- Analytics: Generates low-background fluorescence data that improves signal-to-noise ratio, facilitating accurate statistical analysis of binding events.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by ensuring that observed interactions reflect true biology rather than assay artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized surface preparation platform applicable across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing false positives from non-specific surface interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through a well-defined, step-by-step protocol with clear quality benchmarks.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by improving data reliability in early-stage target assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing higher-quality mechanistic data for lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy to execute multi-step treatments correctly.
- Dependent on access to piranha solution handling equipment and nitrogen gas for drying and storage.
- Necessitates standardized training to ensure consistent amine functionalization and double PEGylation across users.
- Must be adapted to different slide materials (e.g., quartz vs. standard glass) while maintaining PEG density and passivation quality.
- Limited by the hazardous nature of piranha solution, requiring strict safety protocols and waste management procedures.
