Pasywacja powierzchniowa w badaniach białek jednocząsteczkowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie wysokiej jakości aktywowanej powierzchni szkiełka kwarcowego. Osiąga się to poprzez wstępne oczyszczenie nawierconych szkiełek kwarcowych i szkiełek zakrywkowych wodą oraz acetonem. Następnie szkiełko poddaje się trawieniu wodorotlenkiem potasu oraz roztworem piranha w celu poprawy jakości powierzchni.

Następnie preparaty i szkiełka nakrywkowe są funkcjonalizowane grupami aminowymi, po czym przeprowadzane są dwie rundy pasywacji powierzchni za pomocą polimeru w celu nadania powierzchni szkła właściwości obojętnych. Ostatnim krokiem jest zmontowanie komory mikroprzepływowej z preparatu i szkiełka nakrywkowego w taki sposób, aby powierzchnie pokryte glikolem polietylenowym lub pegylowane były skierowane ku sobie. W rezultacie nowa strategia traktowania powierzchni cząsteczkami PEG w dwóch rundach znacząco poprawia jakość pasywacji, co potwierdzono w badaniach z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii pojedynczych cząsteczek.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak powlekanie polimerem po trawieniu tlenkiem potasu, jest gwarancja wyższej jakości. Osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ konieczne jest przeprowadzenie wielokrotnych zabiegów serwisowych. Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować płytki kwarcowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Oczyść szkiełka, umieszczając je w szklanym słoiku do barwienia. Zazwyczaj w jednym słoiku można umieścić od pięciu do 15 szkiełek. Następnie wypłucz szkiełka wodą UE, powtarzając płukanie trzykrotnie, poddaj szkiełka sonikacji w wodzie UE przez pięć minut w celu usunięcia zanieczyszczeń, wylej wodę i wypłucz szkiełka dodatkowe trzy razy wodą UE.

Następnie należy zastąpić wodę UE acetonem i poddać szkiełka sonikacji w acetonie przez 20 minut lub dłużej, po czym odlać aceton i wypłukać szkiełka wodą Milli Q, aby usunąć wszelkie pozostałości acetonu. Następnie wodę należy zastąpić jednomolowym wodorotlenkiem potasu i poddać szkiełka sonikacji przez 20 minut lub dłużej. Nadmierne trawienie poprawi jakość powierzchni, ale spowoduje powstanie zarysowań, które mogą zakłócać obrazowanie fluorescencyjne.

Opłucz preparaty trzy razy wodą Milli Q, aby usunąć ślady wodorotlenku potasu przed trawieniem w roztworze piranha. Przenieś preparaty do uchwytu Duran lub specjalnie wykonanego uchwytu teflonowego i umieść je w zlewce o pojemności jednego litra, znajdującej się w dygestorium. Napełnij zlewkę 450 mililitrami kwasu siarkowego.

Następnie dodaj 150 ml nadtlenku wodoru, aby uzyskać stosunek kwasu siarkowego do nadtlenku wodoru wynoszący trzy do jednego. Zamieszaj roztwór w celu dokładnego wymieszania i pozostaw zlewkę w spokoju na 20 minut. Wyjmij preparaty z roztworu piranha i umieść je w uchwycie na szkiełka zawierającym wodę Millieu.

W międzyczasie należy wylać roztwór piranha do wyznaczonej butelki na odpady. Po osiągnięciu temperatury pokojowej wypłukać szkiełka trzykrotnie wodą UE, postępując zgodnie z procedurą czyszczenia szkiełek zakrywkowych. Wymienić wodę UE w kuwetach do barwienia na metanol. Przechowywać szkiełka i szkiełka zakrywkowe w metanolu.

W międzyczasie przygotuj roztwór do silanizacji aminowej, wlewając 100 mililitrów metanolu do kolby. Następnie dodaj pięć mililitrów kwasu octowego oraz trzy mililitry 3-aminopropylotrimetoksysilanu i delikatnie wymieszaj poprzez potrząsanie. Zastąp metanol w kuwetach do barwienia zawierających szkiełka i szkiełka nakrywkowe mieszaniną reakcyjną do silanizacji aminowej.

Inkubować przez 20 do 30 minut, wykonując w trakcie inkubacji jedną minutową sonikację. Następnie zastąpić mieszaninę reakcyjną do izolacji aminowej metanolem. Po tym odlać metanol i dodać świeży roztwór metanolu.

Powtórz tę procedurę trzy razy dla pierwszej serii funkcjonalizacji powierzchni. Osusz szkiełka i szkiełka nakrywkowe za pomocą gazu azotowego, stosując najpierw polimer. Następnie umieść je w czystych pudełkach do pipet, częściowo wypełnionych wodą Milli-Q, w taki sposób, aby strona wymagająca pegylacji była skierowana do góry. Następnie dodaj 64 µL świeżo przygotowanego buforu reakcyjnego do przygotowanego roztworu PEG.

Pipetuj mieszaninę w górę i w dół, aby całkowicie ją rozpuścić. Następnie wiruj z prędkością 16 100 G przez jedną minutę. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, nanieś 70 µL mieszaniny do pegylacji na wysuszone szkiełko kwarcowe.

Ostrożnie nałóż wysuszone szkiełko nakrywkę na roztwór, a następnie inkubuj preparaty w ciemnym i wilgotnym środowisku od dwóch godzin do całej nocy, aby przechowywać pegylowane szkiełka przedmiotowe i nakrywki. Ostrożnie rozdziel szkiełko przedmiotowe i nakrywkę, przesuwając nakrywkę na bok i płucząc je wodą UE przed wysuszeniem prądem gazu azotowego. Umieść parę szkiełka przedmiotowego i nakrywki w probówce o pojemności 50 mililitrów w taki sposób, aby pegylowane powierzchnie były skierowane od siebie.

Częściowo zamknij probówkę i poddaj ją próżniowaniu, a następnie napełnij ją azotem i szczelnie zakręć pokrywkę. Przechowuj w temperaturze -20 °C. Kroki te pomagają zachować powierzchnię pegylowaną przez długi czas.

Przeprowadź drugą rundę pegylacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym bezpośrednio przed użyciem szkiełka do montażu komory mikrofluidycznej. Połóż szkiełko kwarcowe na płaskiej powierzchni stroną pegylowaną do góry. Utwórz kanał po przekątnej na powierzchni pegylowanej, naklejając na szkiełko dwustronną taśmę klejącą.

Upewnij się, że otwory znajdują się w centrum kanału. Następnie delikatnie umieść na górze pegylowane szkiełko nakrywki, aby zamknąć komorę, tak aby strona pegylowana była skierowana w dół.

Uszczelnij komorę, dociskając szkiełko nakrywkę do obszarów, w których umieszczono dwustronną taśmę. Zrób to delikatnie, ale dokładnie, aby komora została szczelnie zamknięta i nie przepuszczała wody. Na koniec zabezpiecz krawędzie komory klejem epoksydowym.

Należy przystąpić do unieruchomienia streptawidyny lub neutravainu i dodać biotynilowane cząsteczki biologiczne do obrazowania pojedynczych cząsteczek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym; jeśli funkcjonalizacja powierzchni przebiegła pomyślnie, liczba nieswoistく absorbowanych białek na obserwowany obszar obrazowania wynosi mniej niż 10. Po dodaniu do komory białka znakowanego fluorescencyjnie w stężeniu od 1 do 10 nM, w przypadku niewłaściwego przeprowadzenia któregokolwiek z etapów czyszczenia lub reakcji, liczba nieswoiście absorbowanych białek znacznie wzrasta. Na przykład, w przypadku pominięcia trawienia roztworem piranha, obserwuje się 100-krotny wzrost nieswoistej absorpcji.

Wyższość podwójnej pegylacji jest tutaj wyraźnie widoczna. Zaobserwowano, że sygnały tła pochodzące od cząsteczek fluorescencyjnych i roztworu były znacznie słabsze w przypadku zastosowania podwójnej pegylacji, co przedstawiono na lewym panelu. Wskazuje to, że białka są skuteczniej odpychane przez warstwę podwójnie pegylowaną.

Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura może zająć cztery godziny. Należy pamiętać, że praca z AYA może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich rękawic, gogli i fartucha.