Name: Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM w zakończeniach nerwowych. Protokół ten umożliwia badanie zarówno wywołanych, jak i spontanicznych aktywności synaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom laboratorium Harata za pomocne dyskusje podczas wykonywania tej pracy. Praca ta została sfinansowana z grantów American Heart Association, Dystonia Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, National Science Foundation i Whitehall Foundation dla NCH.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisaliśmy protokoły barwienia i odbarwiania pęcherzyków synaptycznych w odpowiedzi na wywołaną, spontaniczną i miniaturową aktywność synaptyczną oraz obrazowania w fazie odbarwiania. Oprócz istniejących protokołów dołączyliśmy nowy protokół obserwacji odbarwienia FM w oparciu o miniaturową aktywność synaptyczną. Korzystając z tych protokołów, wcześniej zidentyfikowaliśmy nieprawidłowości w hodowanych neuronach z mysiego modelu dystonii zaburzenia ruchowego. W porównaniu z ich odpowiednikami u myszy typu dzikiego, neuron...

Funkcjonalność pęcherzyków synaptycznych jest ważnym wyznacznikiem transmisji synaptycznej. Pęcherzyki te uwalniają neuroprzekaźniki, gdy łączą się z presynaptyczną błoną plazmatyczną (egzocytoza) i stają się gotowe do kolejnego cyklu uwalniania po zregenerowaniu z błony plazmatycznej (endocytoza) i ponownym załadowaniu neuroprzekaźnikiem. Badania nad dynamiką i mechanizmami leżącymi u podstaw recyklingu pęcherzyków synaptycznych zostały znacznie przyspieszone przez wprowadzenie styrylowych barwników FM1. Te amfipatyczne cząsteczki, które mają dodatnio naładowane hydrofilowe grupy głów i hydrofobowe ogony (wiele barwników na rysunku 1A, stereoview FM1-43 na rysunku 1B), mogą odwracalnie wchodzić i wychodzić z błon lipidowych bez ich przenikania. Grupy barwników FM mają podobne cechy, które wpływają na zakres emitowanego przez nie światła. Na przykład FM2-10, FM1-43 i FM1-84 mają jedno podwójne wiązanie między dwoma cyklicznymi związkami i wykazują zieloną emisję. Różnica między nimi polega na długości ogona hydrofobowego, co decyduje o jego hydrofobowości, a tym samym o szybkości wychodzenia z membrany (departycjonowania). W przypadku FM5-95 i FM4-64 związki cykliczne łączą trzy wiązania podwójne, które wykazują czerwoną emisję. Barwniki te różnią się między sobą pod względem części hydrofilowych. We wszystkich barwnikach FM intensywność fluorescencji wzrasta po wprowadzeniu ich do błon biologicznych, ze względu na wzrost wydajności kwantowej w środowisku hydrofobowym w stosunku do środowiska hydrofilowego. Zatem zmiany intensywności FM reprezentują zmiany w obrocie membrany. Różne kolory (widma emisyjne) i hydrofobowość sprawiają, że barwniki FM są wszechstronnym narzędziem badawczym w recyklingu pęcherzyków synaptycznych.

Bazując na tych cechach, barwniki FM są najczęściej używane zgodnie z następującym schematem podczas analizy recyklingu pęcherzyków synaptycznych (Rysunek 2). Neurony są skąpane w roztworze zewnątrzkomórkowym zawierającym barwnik FM, umożliwiając jego pobieranie do pęcherzyków synaptycznych (SV), gdy tworzą się one poprzez endocytozę (barwienie). Barwnik jest następnie wypłukiwany przez nałożenie bezbarwnikowego roztworu zewnątrzkomórkowego; ujawnia to funkcjonalne zakończenia nerwowe, tj. tylko te aktywnie poddawane endocytozie będą zawierały skupisko pęcherzyków synaptycznych, które są naładowane barwnikiem (ryc. 2 na dole). Późniejsza egzocytoza prowadzi do utraty barwnika FM do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i jednoczesnej utraty fluorescencji (odbarwienia; zarówno z powodu departycji do środowiska hydrofilowego, jak i dyfuzji z dala od miejsca egzocytozy). Dlatego zmiany intensywności fluorescencji FM są wskaźnikami egzo- i endocytozy pęcherzyków synaptycznych.

Barwniki FM były używane do barwienia i odbarwiania pęcherzyków synaptycznych w różnych organizmach i preparatach2,3. Przykłady obejmują hodowle neuronów ssaków4-9, wycinki mózgu ssaków10,11, połączenia nerwowo-mięśniowe12,13, dwubiegunowe neurony siatkówki14,15 i komórki rzęsate ślimaka16.

Zazwyczaj w takich eksperymentach, zarówno barwienie, jak i odbarwienie są wywoływane przez intensywną stymulację neuronów (aktywność wywołana). Ostatnio jednak przeanalizowano również recykling pęcherzyków synaptycznych w odpowiedzi na słabą stymulację, podobnie jak recykling w przypadku braku bodźca zewnętrznego (spontaniczna i miniaturowa aktywność synaptyczna)9,17-19. Spontaniczne i miniaturowe aktywności synaptyczne definiuje się jako te, które zachodzą przy braku bodźców zewnętrznych, przy czym te pierwsze obejmują spontaniczne wystrzeliwanie potencjałów czynnościowych (ryc. 3). Te słabe aktywności synaptyczne są związane z mniejszymi zmianami w sygnałach FM niż te wywołane przez rozległą stymulację. Pomiar wymaga, aby zmiany intensywności fluorescencji FM dokładnie odzwierciedlały egzocytozę pęcherzyków synaptycznych lub endocytozę, ale nie sztuczne zmiany intensywności. Jedną z przyczyn artefaktu jest obecność niespecyficznego zabarwienia błony plazmatycznej przez barwniki FM. Stopniowe wypłukiwanie tego składnika doprowadzi do stopniowej zmiany mierzonej intensywności fluorescencji, która zostanie błędnie przypisana aktywnościom synaptycznym. Współczynnik ten można zmniejszyć za pomocą odpowiednich metod (patrz Protokół). Najbardziej godną uwagi przyczyną artefaktu jest fotowybielanie barwnika FM zatrzymanego w pęcherzykach synaptycznych. Zmiany intensywności FM związane z fotowybielaniem muszą być małe w porównaniu ze zmianami biologicznymi (synaptycznymi), które są mierzone. Niedawny rozwój czułych kamer, np. kamery EMCCD (EMCCD) z urządzeniem do zwielokrotniania ładunku, umożliwia zminimalizowanie fotowybielania poprzez skrócenie czasu naświetlania i osłabienie intensywności światła używanego do wzbudzania fluoroforu. Inną przyczyną artefaktu jest dryf w poziomie skupienia mikroskopu świetlnego. Dryft ostrości podczas sesji obrazowania może być spowodowany efektami mechanicznymi lub termicznymi i błędnie doprowadzi do zmiany zmierzonej intensywności fluorescencji.

Tutaj opisujemy protokoły i sprzęt, które umożliwiają użycie barwników FM do analizy recyklingu pęcherzyków synaptycznych nawet w kontekście słabej stymulacji lub jej braku, w szczególności miniaturowej aktywności synaptycznej. Pokazujemy przykłady barwienia i odbarwiania pęcherzyków podczas wywołanych i spontanicznych zdarzeń synaptycznych, wykorzystując hodowane neurony hipokampa gryzoni i obrazując fazę odbarwiania. Pokazujemy również, jak ocenić stopień fotowybielania barwnikiem FM, przy braku jakiejkolwiek utraty barwnika FM z powodu aktywności synaptycznej.

<table><tbody><tr><td>Generator impulsów</td><td>AMPI</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/" target="_blank"&gt;Izolacyjny stymulator&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Digitimer</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds3-isolated-constant-current-stimulatorstimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS3&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Służy do oceny morfologii komórek przy małym powiększeniu.</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TiE</td><td>Służy do wysokorozdzielczego obrazowania fluorescencyjnego i w świetle przechodzącym, z minimalnym dryftem ostrości.</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Nikon</td><td></td><td>Zaleca się stosowanie obiektywu imersyjnego wodnego. Obiektyw imersyjny olejowy można stosować, chyba że obrazowana struktura znajduje się głęboko pod powierzchnią szkiełka nakrywkowe (&lt;i&gt;np.&lt;/i&gt; &gt;10 &amp;mu;m).</td></tr><tr><td>Kostka filtracyjna</td><td>Nikon</td><td>77032509</td><td>ex 490/20-nm, dclp 510-nm, em 520-nm-LP dla FM1-43</td></tr><tr><td>Kostka filtracyjna</td><td>Nikon</td><td>77032809</td><td>ex 490/420 nm, dclp 510 nm, em 650 nm LP dla FM4-64.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor Technology</td><td>iXon EM+ DU-860</td><td>Ta kamera EMCCD służy do detekcji fluorescencji o wysokiej czułości.</td></tr><tr><td>Ciekły chiller recyrkulacyjny</td><td>Solid State Cooling Systems</td><td>Oasis 160</td><td>Służy do ciągłego chłodzenia kamery wodą w celu utrzymania temperatury -80&amp;deg;C, co pozwala na redukcję szumów.</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED-Custom Interconnect</td><td>490 nm</td><td>To źródło światła służy do szybkiego sterowania włączaniem/wyłączaniem wzbudzenia fluorescencji.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td><td>Andor Technology</td><td>Solis</td><td></td></tr><tr><td>Komora obrazowania</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-21BRFS</td><td></td></tr><tr><td>System szybkiej perfuzji</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-77B</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>D,L-AP5</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0106</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoksyna</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1069</td><td>Uwaga: odczynnik toksyczny. Stosować ostrożnie.</td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Invitrogen</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43 utrwalany aldehydem (FM1-43FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64 utrwalany aldehydem (FM4-64FX)</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>Minimalne medium niezbędne (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td>Ten roztwór nie zawiera czerwieni fenolowej, która zakłócałaby obrazowanie fluorescencyjne.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Uwaga: odczynnik toksyczny. Stosować ostrożnie.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników fm podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Pęcherzyki synaptyczne w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych ulegają egzocytozie i endocytozie. Ten recykling pęcherzyków synaptycznych można skutecznie analizować za pomocą styrylowych barwników FM, które ujawniają obrót błony. Konwencjonalne protokoły stosowania barwników FM zostały zaprojektowane do analizy neuronów po stymulowanej (wywołanej) aktywności synaptycznej. Ostatnio dostępne stały się protokoły do analizy sygnałów FM, które towarzyszą słabszym aktywnościom synaptycznym, takim jak spontaniczne lub miniaturowe zdarzenia synaptyczne. Analiza tych małych zmian w sygnałach FM wymaga, aby system obrazowania był wystarczająco czuły, aby wykryć niewielkie zmiany intensywności, a jednocześnie aby sztuczne zmiany o dużej amplitudzie były tłumione. Tutaj opisujemy protokół, który można zastosować do wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych i używamy hodowanych neuronów hipokampa jako przykładu. Protokół ten obejmuje również sposób oceny szybkości fotowybielania barwników FM, ponieważ jest to znaczące źródło artefaktów podczas obrazowania niewielkich zmian intensywności.

Jako przykład przedstawiamy reprezentatywne wyniki przebiegu czasowego odbarwiania pęcherzyków synaptycznych (Rysunek 4). Hodowlane neurony hipokampa zostały zabarwione barwnikiem FM4-64 przy wykorzystaniu spontanicznej aktywności synaptycznej (krok 2.3) i przemyte roztworem bezbarwnym (roztwór płuczący 2). Obrazowanie przedstawia początkowy przebieg czasowy odbarwiania z wykorzystaniem aktywności spontanicznej (krok 5.3) (początkowy odcinek linii ciągłej, Rysunek 4A). Następnie przedsta...

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

examination-synaptic-vesicle-recycling-using-fm-dyes-during-evoked

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanej, spontanicznej i miniaturowej aktywności synaptycznej

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.

Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

Barwniki FM okazały się nieocenioną pomocą w zrozumieniu dynamiki synaptycznej. Barwniki FM są zazwyczaj śledzone pod mikroskopem fluorescencyjnym w różnych warunkach stymulacji. Jednakże fotokonwersja barwników FM w połączeniu z mikroskopią elektronową umożliwia wizualizację odrębnych pul pęcherzyków synaptycznych, a także innych komponentów ultrastruktury, w pączkach synaptycznych.

Badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych

Opisano technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Monitorowane są dwie rundy recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną.

Ilościowa analiza uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowlanych neuronach ziarnistych móżdżku z wykorzystaniem barwników FM

Ten film demonstruje protokół badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila wykazujących ekspresję rodopsyny kanałowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Niebieskie światło aktywuje rodopsyny kanałowe, powodując napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Barwnik integruje się z błonami neuronalnymi i jest internalizowany podczas endocytozy, co powoduje zwiększoną fluorescencję. Dalsza stymulacja światłem niebieskim indukuje...

Analiza recyklingu pęcherzyków synaptycznych i wychwytu barwnika fluorescencyjnego przez larwy Drosophila

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Cykl pęcherzyków synaptycznych (SV) jest podstawowym mechanizmem komunikacji międzykomórkowej w synapsach neuronalnych. Wychwyt i uwalnianie barwnika FM są podstawowymi sposobami ilościowego oznaczania endo- i egzocytozy SV. Tutaj porównujemy wszystkie metody stymulacji w celu napędzania cyklu FM1-43 w synapsie modelu połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM w zakończeniach nerwowych. Protokół ten umożliwia badanie zarówno wywołanych, jak i spontanicznych aktywności synaptycznych.

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych (Wideo) | JoVE Journal

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Przeglądaj więcej filmów