Name: Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Poznaj metodę lokalizacji i kwantyfikacji nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego. Ta technika umożliwia statystyczną analizę pobrania nanocząstek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04), przez Region Ile de France (umowa nr E539) oraz przez CNRS. Open Access został opłacony przez EMD Millipore.

1. Przygotowanie dyspergowanych w wodzie nanorurek węglowych (CNT)
<ol>
	<li>Najpierw zdyspergować CNT w wodzie do hodowli komórkowej, a następnie poddać je sonikacji przez 20 minut w sonikutorze do kąpieli w temperaturze 20 °C. Jeśli CNT są funkcjonalizowane za pomocą sondy fluorescencyjnej, należy je w miarę możliwości chronić przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
</ol>
2. Oznaczanie komórek za pomocą CNT
<ol>
	<li>Hodować ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) (na przykład) na płytkach o powierzchni 25 cm² w pożywce DMEM, zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% streptomycyny penicyliny.</li>
	<li>Przygotować roztwory CNT o stężeniu 0, 10, 20 i 50 μg/ml w kompletnym pożywce i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 20 godzin lub w temperaturze 4 °C przez 20 godzin (2 ml zawiesiny CNT na płytkę o powierzchni 25 cm²).</li>
</ol>
3. Utrwalenie komórek
<ol>
	<li>Następnie usunąć pożywkę inkubacyjną; przepłukać komórki PBS, trypsynizować i ponownie zawiesić komórki w kompletnym pożywce DMEM. Wirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min.</li>
	<li>Zastąp pożywkę najpierw paraformaldehydem 4% przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, a następnie PBS w celu ich konserwacji. W razie potrzeby komórki można przechowywać na tym etapie procesu w temperaturze 4 °C przez kilka dni, aż do analizy cytometrycznej.</li>
	<li>Każda próbka musi zawierać około 106 komórek skoncentrowanych w 50 μl PBS. Zawieś je prawidłowo, aby uniknąć zagięć podczas analizy i przefiltruj je przez siatkowy barwnik o grubości 50 μm. 
	Uwaga: Każdy krok musi być wykonany bardzo delikatnie, aby zachować komórki.</li>
</ol>
4. Akwizycja strumienia obrazu
Użyj cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego ImageStream, aby uzyskać obrazy komórek. 
Należy przestrzegać kilku punktów:
<ol>
	<li>Wybierz odpowiednie powiększenie (w tym przypadku używany jest obiektyw 40X).</li>
	<li>Jeśli stosowane są fluorochromy: 
	- przygotować próbkę kontrolną bez fluorochromu. 
	- Przygotuj komórki z jednokolorową kontrolą pozytywną dla każdego użytego fluorochromu w 
	dodatek do twoich próbek.</li>
	<li>Użyj lasera 488 nm do wzbudzenia FITC i kanału 02 do zebrania emisji fluorescencji (pasmo przepustowe 480-560 nm). Ponadto należy również użyć kanałów 01 i 06 odpowiednio dla jasnego pola (BF) i ciemnego pola (DF).</li>
</ol>
5. Przetwarzanie końcowe - Oprogramowanie do analizy IDEAS (wersja 4.0)
<ol>
	<li>Spośród wszystkich uzyskanych zdarzeń, analiza musi być najpierw ograniczona do populacji pojedynczych komórek: użyj biparametrycznego wykresu punktowego reprezentującego "współczynnik proporcji" (tj. szerokość/wysokość) w porównaniu z "powierzchnią komórki" (parametry zastosowane do komórek na BF) (rysunek 1). Pojedyncze komórki znajdujące się w obszarze zainteresowania o standardowym obszarze i współczynniku kształtu bliskim 1 są następnie odróżniane od zdarzeń wielokomórkowych (duży obszar i mały współczynnik proporcji) i szczątków (bardzo mały obszar).</li>
	<li>Aby zaznaczyć komórki w płaszczyźnie ostrości, należy użyć dwuparametrycznego wykresu punktowego dostosowanego do wysoce kontrastowych komórek oznaczonych CNT: narysuj "kontrast" w funkcji "gradientu RMS" (który mierzy jakość ostrości obrazu) na obrazie BF - pozwala to na wykluczenie nieostrych komórek wykazujących zarówno niski gradient skuteczny, jak i niski kontrast na swoich obrazach BF (rysunek 1).</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Określ parametr, który zapewnia najlepszą separację statystyczną między komórkami oznaczonymi i nieoznaczonymi, korzystając z funkcji "znajdź najlepszą". W naszym badaniu cecha obiektu o średniej liczbie pikseli jest parametrem, który jest najbardziej odpowiedni (rysunek 2).</li>
		<li>Prześledź histogram za pomocą tego parametru w porównaniu ze znormalizowaną częstotliwością, aby porównać ilość wychwytywanych CNT dla badanych stężeń (ryc. 3).</li>
		<li>Prześledź wykres dwuparametryczny "średni obiekt pikselowy na BF" (notacja: średnia Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) w porównaniu z "intensywnością na DF" (Intensity_MC_Ch06), aby zbadać korelację między tymi dwoma parametrami (rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocenę ilościową ocenia się również za pomocą masek:
	<ol>
		<li>Ponieważ CNT wydają się być silnie absorbującymi ciemnymi plamami na BF, najpierw utwórz maskę progową, która dokładnie je dopasuje, wybierając ograniczony zakres pikseli o niskiej intensywności mieszczący się w zakresie 0-533 w tym badaniu (Maska 1, notacja: Intensywność (M01, BF, 0-533)) (Rysunek 5). Wybór intensywności progowej jest dokonywany na znakowanych komórkach w porównaniu z komórkami kontrolnymi.</li>
		<li>I odwrotnie, utwórz również maskę dopasowaną do pikseli o dużej intensywności (w tym przypadku 150-4095) DF (Maska 2, notacja: Intensywność (M06, DF, 150-4095)) (Rysunek 6).</li>
		<li>Narysuj wykres przy użyciu obszaru maski (1 lub 2; (notacja: Area_Intensity(M01, BF, 0-533) dla maski 1): zapewni względną kwantyfikację internalizacji CNT przy różnych stężeniach (ryc. 7).</li>
		<li>Sprawdź stopień korelacji między tymi dwiema maskami (dzięki wykresowi biparametrycznemu "obszar maski 1" w porównaniu z "obszarem maski 2") (rysunek 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz inne maski, aby zlokalizować CNT w komórkach:
	<ol>
		<li>Maska pasująca do wnętrza komórki: Erode(M01, 7) - odpowiadająca masce całej komórki (M01) (Rysunek 8), która jest dodatkowo zerodowana o 7 pikseli (Rysunek 9).</li>
		<li>Maska pasująca do membrany tylko za pomocą równania Boole'a: M01 a nie Erode(M01,7) - maska całej komórki (M01) odjęta od wnętrza (Erode(M01,7)) (Rysunek 10).</li>
		<li>Aby uwzględnić ciemne piksele na membranie (odpowiadające CNT), utwórz maskę: Intensity(M01, a nie Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Rysunek 11).</li>
		<li>Wizualizuj różne maski zastosowane do zbioru komórek, aby sprawdzić ich trafność (Rysunek 12) dla komórek oznaczonych i nieoznaczonych.</li>
		<li>Zastosuj obszar cechy na masce, zaznaczając czarne piksele na membranie "Area_Intensity(M01, a nie Erode(M01, 7), BF, 0-533)" tzw. obszar. Pozwoli to na ilościowe określenie CNT na membranie. 
		 
		Aby ostatecznie odróżnić CNT, które zostały zinternalizowane, od tych zaadsorbowanych tylko na błonie, wykreśl obszar na błonie w porównaniu z czarnym obszarem na całej komórce (tj. "Area_ Intensity(M01, a nie Erode(M01, 7), BF, 0-533' kontra 'Area_ Intensity(M01, BF, 0-533)'). 
		 
		nuta: Ten sam rodzaj procedury jest stosowany w przypadku sygnału fluorescencyjnego FITC: porównaj wzrost intensywności fluorescencji FITC w porównaniu ze spadkiem średniego sygnału piksela na BF lub kolokalizację między ciemnymi plamami na BF i intensywności fluorescencji FITC. W naszym przypadku ten rodzaj analizy nie jest istotny, ponieważ sygnał fluorescencji nie pasuje prawidłowo do ciemnych plam na BF z jednej strony i do jasnego pola na DF z drugiej, co pokazuje, że wewnętrzne właściwości CNT (absorbancja i rozpraszanie światła) są bardziej odpowiednie niż sygnał związany z sondą fluorescencyjną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po utworzeniu wszystkich wykresów w jednym warunku eksperymentalnym utwórz "szablon raportu statystycznego", zapisz szablon jako plik .ast i zgrupuj wszystkie pliki danych.</li>
</ol>

<ol><li>Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promises%2C+facts+and+challenges+for+carbon+nanotubes+in+imaging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics.</a> Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).</li>
<li>De La Zerda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotubes+as+photoacoustic+molecular+imaging+agents+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice.</a> Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).</li>
<li>Zavaleta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Raman+Spectroscopy+in+Living+Mice+for+Evaluation+of+Tumor+Targeting+with+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+semiconducting+and+metallic+carbon+nanotubes+in+cells+and+mice+using+transient+absorption+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy.</a> Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).</li>
<li>Welsher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+route+to+brightly+fluorescent+carbon+nanotubes+for+near-infrared+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice.</a> Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).</li>
<li>Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+dependent+cellular+uptake+and+expusion+of+single-wall+carbon+nanotubes%3A+single+particle+tracking+and+a+generic+uptake+model+for+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles.</a> ACS Nano. 3, 149-158 (2009).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+mechanisms+of+functionalised+multi-walled+carbon+nanotubes+by+3D+electron+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging.</a> Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).</li>
<li>Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Carbon+Nanotubes+within+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells.</a> ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).</li>
<li>Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Cellular+Internalization+of+Nanoparticles+and+Bacteria+by+Multi-spectral+Imaging+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).</li>
<li>Qian, F., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Lineage-specific+Toll-like+Receptor-mediated+Signaling+in+Monocytes+and+Dendritic+Cells+from+Small+Samples+of+Human+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).</li>
<li>Marangon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Carbon+Nanotube+Translocation+Assessed+by+Flow+Cytometry+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging.</a> Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).</li>
<li>Lacerda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+mechanisms+of+chemically+functionalised+carbon+nanotubes+across+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes.</a> Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).</li>
<li>Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAl-Jamal%2C+KT+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+of+Transmembranal+Mechanism+and+Subcellular+Localization+of+Noncovalently+Modified+Single-Walled+Carbon+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes.</a> Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

1. Modyfikacja i rozwiązywanie problemów
W tym badaniu pierwszym celem była ocena ilości i lokalizacji CNT w komórkach. Mikroskopia konfokalna mogła być a priori złotą metodą oceny wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia CNT funkcjonalizowanego markerem fluorescencyjnym FITC8,14. Jednak główną wadą jest ograniczenie do obrazowania pojedynczych komórek, a co za tym idzie brak statystycznie istotnych danych. ImageStream umożliwia pracę poza tymi przeszkodami: Rzeczywiście, dzięki badaniu przesiewowemu dużej liczby komórek (5 000-10 000) w krótkim czasie (<min), daje statystycznie wiarygodne wyniki, wzmocnione również przez obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, które dostarcza obrazy dla każdej komórki z rozdzielczością subkomórkową (0,5 μm). Umożliwia to analizę dużej ilości danych w oparciu o analizę pojedynczego obrazu.
W porównaniu z konwencjonalną cytometrią przepływową, unikalną zaletą ImageStream jest dostarczanie wielospektralnych obrazów każdej komórki i porównanie intensywności sygnału piksel po pikselu. W ten sposób ImageStream łączy w sobie moc statystyczną wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej z zaletami analitycznymi obrazowania konfokalnego dla każdej analizowanej komórki. Ma to kluczowe znaczenie dla względnej kwantyfikacji i lokalizacji CNT w komórkach bez znaczników.
2. Kluczowe etapy w ramach protokołu
Krytyczny etap polega na wyborze parametrów najbardziej odpowiednich dla każdego badania. W naszym przypadku najlepszym sposobem było oparcie analizy na właściwościach absorpcyjnych i rozpraszających nanorurek: dobra korelacja między lokalizacją ciemnych plam na BF a jasnych plam na DF potwierdza, że opracowana metoda jest odpowiednia i wiarygodna - i mogłaby nie być możliwa bez obrazowania komórek.
3. Ograniczenia techniki
Należy podkreślić, że wizualizacja CNT w komórkach była możliwa tylko dlatego, że mają one tendencję do gromadzenia się w endosomalnych pęcherzykach wewnątrzkomórkowych, a następnie pojawiają się jako silne plamki absorpcyjne i rozpraszające. Pojedyncze nanorurki nie powinny być wykrywane w oparciu o tę metodę, podczas gdy ostatecznie można je wykryć za pomocą fluorescencji, co stanowi wyraźne ograniczenie. Po drugie, oznaczanie ilościowe nie jest "bezwzględne", lecz względne dla różnych stężeń znakowania i w porównaniu z kontrolnymi komórkami nieznakowanymi. Niektóre cechy ilościowe (średnia piksel, intensywność itp.) są parametrami bezwzględnymi, podczas gdy inne zależą od wyboru masek (maska progowa, maski lokalizacji).
4. Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Jeśli chodzi o fluorescencję, analiza ImageStream podkreśla słabą kolokalizację klastrów CNT między jasnym sygnałem FITC a plamami na innych kanałach. Dlatego wydaje się, że fluorescencja nie była wiarygodnym wskaźnikiem kwantyfikacji i lokalizacji CNT. Niemniej jednak, pokonując ograniczenia konwencjonalnej cytometrii przepływowej, która opiera się głównie na kwantyfikacji fluorescencji, wielospektralny ImageStream o wysokiej przepustowości toruje drogę do statystycznej kwantyfikacji bez znaczników , zapewniając jednocześnie lokalizację nanorurek węglowych wewnątrz komórek.
5. Przyszłe aplikacje
Tę wysokoprzepustową metodę statystycznej nanometrologii można uogólnić na dowolne nanomateriały, które wykazują wysoką absorpcję i rozpraszanie światła podczas interakcji z komórkami. W związku z tym może mieć ważne zastosowania w badaniach nad nano-biointerfejsem, nanotoksykologią i nanomedycyną.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci miejsce nanocząsteczek zyskało na znaczeniu w szerokim zakresie zastosowań. W szczególności nanorurki węglowe (CNT) są coraz częściej badane jako nanonarzędzia do różnych zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych; Dzięki swoim szczególnym właściwościom elektrycznym, termicznym i spektroskopowym, CNT mogą działać jako nośniki różnych leków lub środków kontrastowych, a także mogą być wykorzystywane w inżynierii tkankowej1.
Jednak obawy dotyczące potencjalnej toksyczności takich nanomateriałów są nadal przedmiotem dyskusji, głównie dlatego, że los CNT w organizmie pozostaje bardzo kontrowersyjny. Rzeczywiście brakuje odpowiednich metod ich wykrywania i ilościowego oznaczania w żywych komórkach i tkankach: na przykład zasugerowano techniki takie jak spektroskopia Ramana, obrazowanie fotoakustyczne i fotoluminescencyjne w bliskiej podczerwieni, ale każda metoda wykazuje ograniczenia w zależności od rodzaju nanorurek i/lub ich środowiska2-8.
Tutaj proponowana metoda może być stosowana do wykrywania i kwantyfikacji nanocząsteczek w komórkach. Było to możliwe dzięki zastosowaniu ImageStream, urządzenia łączącego w sobie zarówno cytometrię przepływową, jak i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Łączy w sobie zalety pozyskiwania dużej liczby komórek (do 5000 zdarzeń/s) oraz korzyści płynące z danych statystycznych i obrazów każdej komórki w wysokiej rozdzielczości w tym samym czasie (rozdzielczość przestrzenna 0,5 μm). Ogólnie rzecz biorąc, obrazy są zbierane za pomocą kamery CCD i są dwuwymiarową reprezentacją komórki w skali szarości. Światło jest oznaczane ilościowo dla każdego piksela na obrazie i identyfikuje zarówno intensywność, jak i lokalizację fluorescencji lub składników o rozmiarze subkomórkowym (na przykład w BF), co pozwala na potężną zdolność rozróżniania komórek na podstawie ich wyglądu9,10. 
Celem było zaprojektowanie metody nanometrologicznej, która umożliwiłaby ilościową ocenę rozkładu i zachowania CNT w komórkach. W szczególności metoda ta została opracowana w celu badania wychwytu, przetwarzania i egzocytozy CNT przez komórki. Udowodniliśmy, po pierwsze, złożony transport komórkowy CNT, a po drugie, transfer tych nanomateriałów między komórkami: zinternalizowane przez komórkę CNT uciekają z komórek gospodarza, gdy są zestresowane, rozprzestrzeniają się poza przestrzeń zewnątrzkomórkową i są reinternalizowane przez komórki naiwne, niezależnie od tego, czy są homotypowe, czy heterotypowe11
.
Poprzednie badanie wykazało, że różne mechanizmy pobierania komórek, zarówno aktywne, jak i pasywne, mogą występować w zależności od stanu funkcjonalizacji i agregacji CNT12. Tutaj wielościenne CNT funkcjonalizowano poprzez cykloaddycję i amidację 1,3-dipolarną, a następnie derywatyzowano za pomocą sondy fluorescencyjnej, fluoryzowano w izotiocyjanianach (FITC). W transmisyjnej mikroskopii elektronowej wydają się być internalizowane przez komórki albo pojedynczo z lokalizacją cytozolową, albo jako wiązki, najczęściej znajdujące się w przedziałach endosomalnych i lizosomalnych11. W ImageStream zgrupowane CNT pojawiają się z wysoką korelacją jako ciemne plamy na BF i jasne plamy na DF, co pozwala na wyraźne rozróżnienie między komórkami znakowanymi CNT a komórkami kontrolnymi. Z drugiej strony, rozkład sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez marker fluorescencyjny funkcjonalizowany CNT nie był tak dobrze kolokalizowany: w rzeczywistości, prawdopodobnie z powodu zjawiska wygaszania, zielone plamki fluorescencyjne niekoniecznie pasują do plamek na BF i DF. Wskazuje to, że po pierwsze, sonda fluorescencyjna nie jest obowiązkowa do wykrywania CNT za pomocą ImageStream, a po drugie - a fortiori - że nie jest w pełni reprezentatywna zarówno dla kwantyfikacji, jak i lokalizacji CNT.
Oprócz statystycznej względnej kwantyfikacji nanocząstek, ta metoda dostarcza również informacji na temat lokalizacji CNT w komórkach, co oznacza, że rozróżnia na przykład CNT we wnętrzu komórki od tych, które są związane z błoną plazmatyczną. Możliwość lokalizacji CNT na obrazach komórkowych wyraźnie przezwycięża ograniczenia konwencjonalnej analizy metodą cytometrii przepływowej13. Procedura została opracowana poprzez stworzenie masek dopasowanych do określonych obszarów komórki i wybranie również ciemnych punktów odpowiadających załadowanym CNT.
Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda może być stosowana do szerokiego zakresu eksperymentów wymagających wizualizacji lub kwantyfikacji w komórkach, pod warunkiem, że użyte nanocząstki są w stanie silnie absorbować (i/lub rozpraszać) światło.

<table><tbody><tr><td>ImageStream</td><td><a href="https://www.amnis.com/imagestream.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Amnis</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Nanomateriały na bazie węgla, takie jak nanorurki węglowe (CNT), należą do tego typu nanocząstek, które są bardzo trudne do odróżnienia od struktur komórkowych bogatych w węgiel i de facto nadal nie ma ilościowej metody oceny ich rozmieszczenia na poziomie komórek i tkanek. Proponujemy tu innowacyjną metodę pozwalającą na detekcję i kwantyfikację CNT w komórkach za pomocą cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego (ImageStream, Amnis). To nowo opracowane urządzenie łączy w sobie zarówno wysoką przepustowość komórek, jak i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, zapewniając w ten sposób obrazy dla każdej komórki bezpośrednio w przepływie, a tym samym statystycznie istotną analizę obrazu. Każdy obraz komórki jest rejestrowany w kanałach jasnego pola (BF), ciemnego pola (DF) i fluorescencyjnych, dając dostęp odpowiednio do poziomu i rozkładu absorpcji światła, rozproszenia światła i fluorescencji dla każdej komórki. Analiza polega następnie na porównaniu piksel po pikselu każdego obrazu z 7000-10 000 komórek pobranych dla każdego warunku eksperymentu. Lokalizacja i kwantyfikacja nanorurek węglowych jest możliwa dzięki pewnym szczególnym właściwościom swoistym: silnej absorbancji i rozpraszaniu światła; rzeczywiście CNT pojawiają się jako silnie wchłonięte ciemne plamy na BF i jasne plamy na DF z precyzyjną kolokalizacją.
Ta metodologia może mieć znaczący wpływ na badania nad interakcjami między nanomateriałami a komórkami, biorąc pod uwagę, że ten protokół ma zastosowanie do szerokiego zakresu nanomateriałów, o ile są one zdolne do wystarczająco silnego absorbowania (i/lub rozpraszania) światła.

Przegląd zasady działania urządzenia ImageStream przedstawiono na Rysunku 1. Urządzenie to generuje wiele obrazów o wysokiej rozdzielczości dla każdej komórki w przepływie, w tym w polu jasnym (BF), polu ciemnym (DF lub światło rozproszone bocznie) oraz w kanałach fluorescencji, co zilustrowano na Rysunku 2 na przykładzie trzech różnych komórek znakowanych CNTs. Przedstawiono również nałożenia tych kanałów, co na pierwszy rzut oka obrazuje występującą korelację.
Biorąc pod uwagę, że cała analiza postprocesowa opiera się na obrazowaniu komórek, wybór komórek w ostrości ma kluczowe znaczenie dla badania (Rysunek 3). W rzeczywistości obecność CNT indukuje zmiany zarówno w kontraście, jak i gradiencie w porównaniu z komórkami nieznakowanymi: komórki w ostrości, które zinternalizowały znaczną ilość CNT, mają tendencję do niskiego gradientu rms (który zazwyczaj jest jedynym parametrem używanym do rozróżniania komórek w ostrości versus komórek poza ostrością), ale także wysoki kontrast, co wyjaśnia, dlaczego niezbędny jest wykres biparametryczny. Na Rysunku 3 przedstawiono rozróżnienie między komórkami poza ostrością (obszar żółty) versus komórkami w ostrości (obszar niebieski).
CNT zinternalizowane w komórkach są wyraźnie rozróżnialne – szczególnie w BF, gdzie jawią się jako silnie absorbujące ciemne punkty (patrz wpływ różnych stężeń znakowania, Rycina 4). Ponadto przeanalizowano średni sygnał piksela w BF, co pozwoliło na względną kwantyfikację poboru: wykresy na Rycynie 5 wykazują jego znaczący wzrost wraz ze stężeniem znakowania CNT (wyniki dla około 7 000 komórek na warunek eksperymentalny).
Po drugie, ilościowe oznaczenie CNT jest możliwe również poprzez zastosowanie masek, nakładanych albo na ograniczony zakres ciemnych pikseli w obrazowaniu BF, albo na piksele o wysokiej intensywności w obrazowaniu DF (patrz przykłady na Rysunku 6), odpowiadające plamkom wynikającym z obecności CNT. W związku z tym, wykreślenie powierzchni tych masek pozwala na uwydatnienie oraz wykazanie wzrostu poboru (zilustrowane na Rysunku 7 za pomocą powierzchni maski w BF, z wyborem pikseli w zakresie 0-533).
Dodatkowo korelacja między plamkami w BF a DF może zostać oceniona poprzez wykreślenie intensywności DF w funkcji średniego sygnału piksela BF (jak na Rysunku 8) (analiza niezależna od maski) lub powierzchni maski w BF (Maska 1) w funkcji powierzchni w DF (Maska 2).
W odniesieniu do procedury opracowanej w celu lokalizacji CNT wewnątrz komórek, Rycina 9A przedstawia stworzone różne maski. Należy pamiętać, że poprawność masek lokalizacji (opartych na erozji domyślnej maski komórki) musi zostać sprawdzona wizualnie na zbiorze komórek znakowanych i nieznakowanych. Te same maski są stosowane dla wszystkich próbek.
Wykreślenie całkowitej powierzchni czarnych plamek na błonie komórkowej w stosunku do powierzchni na całej komórce pozwala określić stopień internalizacji dla komórek inkubowanych przez 20 hr w 37 °C w porównaniu z inkubacją przez 2 hr w 4 °C (patrz Rycina 9B); wskazuje to, że w 4 °C CNTs znajdują się głównie na błonie, natomiast w 37 °C CNTs ulegają internalizacji w ponad 90% komórek.
Wreszcie, w odniesieniu do fluorescencji, parametr ten nie został wykorzystany jako wskaźnik do ilościowego oznaczania CNT ze względu na zbyt niską korelację między plamkami fluorescencyjnymi a plamkami w BF (i DF). Rzeczywiście, korelacja między intensywnością FITC a średnią wartością piksela w polu jasnym wskazuje współczynnik korelacji Pearsona wynoszący -0,2. Na Rysunku 10 przedstawiono dwa przypadki, w których sygnał fluorescencji odpowiednio pokrywa się lub nie pokrywa z czarną plamką w polu jasnym.
<img alt="Układ optyczny ImageStream: schemat przedstawiający konfigurację cytometrii przepływowej z wzbudzeniem laserowym i detekcją." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd ogólnej zasady działania systemu ImageStream.Wielospektralny system obrazowania pozyskuje do 12 obrazów/komórki w trzech różnych trybach: w polu jasnym, polu ciemnym oraz fluorescencji. Układ składa się z 5 laserów wzbudzających, w tym 405, 488, 560 oraz 658 nm. Światło z komórek przepływających przez kuwetę jest zbierane za pomocą różnych obiektywów (w niniejszym badaniu użyto obiektywu 40X) i przekazywane do elementu dekompozycji spektralnej, który składa się z zestawu filtrów długoprzepustowych ułożonych w matrycy kątowej. Kamera CCD rejestrująca obrazy komórek pracuje w technice zwanej integracją z opóźnieniem czasowym (TDI), aby uniknąć smugowania obrazu. Opcjonalnie dostępna jest funkcja rozszerzonej głębi ostrości (EDF).
<img alt="Obrazowanie komórek, mikroskopia fluorescencyjna, znakowanie FITC, pole jasne, pole ciemne, skala 2 μm, analiza." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Galeria obrazów komórek znakowanych nanorurkami węglowymi (50 μg/mL) wykonana za pomocą systemu ImageStream w różnych kanałach (pole jasne (BF), pole ciemne (DF), fluorescencja (FITC) oraz ich nałożenia). CNTs uwięzione w wewnątrzkomórkowych lizosomach widoczne są jako duże czarne plamy na obrazach w polu jasnym. Z kolei na obrazach w polu ciemnym i fluorescencyjnych tworzą one jasne plamy.
<img alt="Analiza obrazowania komórek; wykresy rozrzutu gradientu RMS względem kontrastu; schemat z danymi morfologicznymi komórek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wybór komórek w ostrości. Bivariantny wykres punktowy przedstawiający pierwiastkową średnią kwadratową (rms) gradientu w zależności od kontrastu na obrazach BF umożliwia wykluczenie komórek nieostrych. Tutaj obszar żółty reprezentuje komórki nieostre, natomiast komórki ostre są reprezentowane w kolorze niebieskim. Komórki nieostre charakteryzują się zarówno niskim kontrastem, jak i niską wartością rms gradientu na obrazie w jasnym polu. Oprócz gradientu rms, cecha kontrastu jest wymagana do rozróżnienia komórek ostrych po ich oznakowaniu CNTs.
<img alt="Odpowiedź komórkowa na zwiększające się stężenia; obraz mikroskopowy; badanie zmian morfologii komórek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Zależne od dawki pobieranie CNT wizualizowane za pomocą systemu ImageStream. Liczba i powierzchnia czarnych punktów na obrazach w polu jasnym zwiększają się wraz z dawką CNT podczas inkubacji z komórkami (w zakresie od 0-50 µg/ml). Należy zauważyć, że komórki kontrolne są pozbawione czarnych punktów.
<img alt="Wykres średniej intensywności pikseli w stanie równowagi statycznej; znormalizowana częstotliwość; odpowiedź na dawkę; analiza danych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Względna kwantyfikacja poboru CNT na podstawie obrazów w polu jasnym. Histogramy średniej cechy pikseli zastosowanej do maski „obiekt” obejmującej całą komórkę wyraźnie wykazują zależność od dawki, co może być wykorzystane do kwantyfikacji. Zakres R9 obejmuje komórki pozytywne pod kątem CNT.
<img alt="Obrazy mikroskopowe w jasnym i ciemnym polu, analiza intensywności maski, różnicowanie struktur komórkowych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Tworzenie masek wybierających ciemne punkty na obrazach BF i jasne punkty na obrazach DF. Ponieważ CNT pojawiają się jako silnie absorbujące ciemne punkty na obrazie BF, utworzono maskę progową w celu wybrania ograniczonego zakresu pikseli o niskiej intensywności, mieszczącej się w tym badaniu w przedziale 0-533 (Maska 1, oznaczenie: Intensity(M01, BF, 0-533)). Z kolei maska dopasowana do pikseli o wysokiej intensywności (w tym przypadku 150-4095) na obrazie DF (Maska 2, oznaczenie: Intensity (M06, DF, 150-4095)) służy do wyboru jasnych punktów na obrazie DF, odpowiadających obszarom o wysokim rozproszeniu.
<img alt="Wykres rozkładu częstotliwości intensywności obszaru przy różnych stężeniach; od kontroli do 50 μg/mL." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Zależne od dawki pobieranie CNT wykazane przez kwantyfikację powierzchni czarnych plamek na obrazach BF. Dzięki zastosowaniu maski progowej (mask 1) na obrazach BF, powierzchnię czarnych plamek można skwantyfikować dla każdej komórki, co wykazuje rozkład zależny od dawki.
<img alt="Wykres rozrzutu przedstawiający analizę intensywności pikseli i powierzchni obiektów dla porównania danych obrazowych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Korelacja metod ilościowego oznaczania CNT w oparciu o obrazy BF (absorpcja) i DF (rozpraszanie). Po lewej stronie: średnia wartość piksela na obrazie BF w stosunku do intensywności na obrazie DF, wykazująca dobrą korelację dla komórek znakowanych CNTs (50 µg/ml) (współczynnik korelacji Pearsona r = -0,68). Po prawej stronie: powierzchnia maski dopasowanej do ciemnych punktów na BF w stosunku do powierzchni maski dopasowanej do jasnych punktów na DF dla komórek znakowanych CNTs (50 µg/ml). Współczynnik korelacji Pearsona wynosi r = -0,83. Wykreślono wartości z 7 000 komórek.
<img alt="Schemat analizy komórkowej z efektami temperatury, wykresy rozrzutu, ocena powierzchni błony w różnych warunkach." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Lokalizacja CNT w komórkach z wykorzystaniem specyficznych masek. (A) Maski zostały utworzone tak, aby dopasować do konkretnych obszarów komórki, mianowicie od lewej do prawej – całej komórki, samej błony oraz wnętrza komórki. Kolejna maska dopasowuje do czarnych plamek dzięki progowi intensywności (Maska 1, oznaczenie: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) Ocenę lokalizacji CNT można uzyskać poprzez pomiar powierzchni czarnych plamek w różnych lokalizacjach komórek przy użyciu masek lokalizacji opisanych w części A. Inkubację z CNT (50 µg/ml) przeprowadzono zarówno w 37 °C, jak i w 4 °C w celu zahamowania ścieżki internalizacji. Wykres przedstawiający czarną powierzchnię na błonie w stosunku do czarnej powierzchni całej komórki wskazuje na zależną od dawki absorpcję CNT na błonie w 4 °C, podczas gdy pełna internalizacja CNT jest efektywna w 37 °C.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, analiza komórek, barwienie FITC, nałożenie obrazu w polu jasnym i fluorescencyjnego." fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50566/50566fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10. Kolokalizacja czarnych punktów indukowanych przez CNT w polu jasnym (BF) z jasnymi punktami fluorescencyjnymi na obrazie FITC. Jasne punkty fluorescencyjne nie zawsze kolokalizują z czarnymi punktami w BF. Odpowiadają one prawidłowo dla dwóch pierwszych wyświetlonych komórek, ale nie dla dwóch ostatnich.

W tym badaniu, głównym celem było monitorowanie wychwytu komórkowego i ewentualnej egzocytozy nanorurek węglowych (CNT). Z tej perspektywy zaproponowaliśmy tutaj unikalną metodę wykorzystującą obrazowanie wielospektralne cytometrii przepływowej, pozwalającą na kwantyfikację i lokalizację CNT w statystycznie istotnej liczbie komórek.

Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie nanometrologicznej metody monitorowania i ilościowego określania poboru nanorurek węglowych przez komórki w statystycznie istotnej liczbie komórek. Osiąga się to poprzez wstępne potraktowanie komórek dyspergujejącymi się w wodzie nanorurkami węglowymi, które wnikają do komórek w sposób zależny od stężenia. Nanorurki węglowe te są następnie znakowane markerem fluorescencyjnym.Następnie po utrwaleniu każda komórka jest obrazowana w kanałach pola jasnego, pola ciemnego oraz fluorescencyjnych wielospektralnego cytometru przepływowego z funkcją obrazowania. Aby zwizualizować rozkład nanorurek węglowych oraz poziom absorpcji światła, rozproszenia światła i fluorescencji, znakowanie nanorurkami jest analizowane w każdej komórce w skali poszczególnych pikseli. Ostatecznie wewnętrzna absorpcja i rozproszenie światła wewnątrz komórek pozwalają na lokalizację i kwantyfikację nanorurek węglowych.Niniejsza metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na nowe pytania w dziedzinach nanotoksykologii i nanomedycyny, takie jak wpływ i losy materiałów na bazie węgla w żywych komórkach, a także potencjał nanorurek węglowych jako systemu dostarczania leków. Rozpocznij od dyspersji nanorurek węglowych, które docelowo zostaną sprzężone z etykietą fluorescencyjną, w wodzie do hodowli komórkowych. Następnie poddaj nanorurki sonikacji w kąpieli wodnej w temperaturze 20 °C przez 20 minut. Kolejnym krokiem jest rozcieńczenie nanorurek w pełnej pożywce do stężeń 0, 10, 20 i 50 µg/mL, a następnie inkubacja dwóch mililitrów każdego rozcieńczenia z badanymi komórkami w płytkach o powierzchni 25 cm² (jedna płytka na rozcieńczenie) w temperaturze 37 °C. Po 20 godzinach usuń pożywkę inkubacyjną z każdej płytki i wypłucz komórki znakowane nanorurkami węglowymi za pomocą PBS.Po przemyciu komórki na każdej płytce trawiono trypsyną, a następnie zawieszono ponownie w pełnej pożywce DMEM. Następnie każdą próbkę przeniesiono do osobnych probówek Falcon o pojemności 15 ml, po czym odwirowano komórki przez pięć minut przy 200 ×g w temperaturze pokojowej. Każdy osad zawieszono ponownie w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C na jedną godzinę.Po fiksacji ponownie odwiruj komórki i resuspenduj każdą próbkę w postaci osadu do stężenia 15 × 10⁵ komórek w 150 µL PBS. Następnie przefiltruj próbki przez oddzielne sita o oczkach 50 µm, aby uzyskać obrazy komórek za pomocą multispektralnego cytometru przepływowego z obrazowaniem ImageStream.W pierwszej kolejności należy dobrać odpowiednie powiększenie, a następnie obrazować wybrane próbki. Do obrazowania w ciemnym polu oraz konfiguracji cytometru przepływowego należy użyć lasera o długości fali 685 nanometrów. Kanał numer sześć należy ustawić tak, aby zbierać emisję w ciemnym polu przy pasmie przepustowym od 745 do 800 nanometrów.Wykonaj obrazowanie próbek w kanale jasnego pola numer jeden oraz kanale ciemnego pola numer sześć w celu analizy obrazów. Najpierw stwórz parametryczny wykres punktowy, przedstawiający stosunek szerokości do wysokości względem powierzchni komórki. Pozwala to na odróżnienie pojedynczych komórek, które mają standardową powierzchnię i stosunek szerokości do wysokości bliski jedności, od zdarzeń wielokomórkowych, które charakteryzują się dużą powierzchnią i małym stosunkiem szerokości do wysokości, oraz od zanieczyszczeń, które wykazują niezwykle małą powierzchnię.Po wykorzystaniu obrazów komórek do weryfikacji poprawności wyboru pojedynczych komórek, należy przygotować biparametryczny wykres kropkowy dla komórek znakowanych nanorurkami węglowymi o wysokim kontraście, nanosząc kontrast w funkcji średniej kwadratowej gradientu (root mean square gradient), aby umożliwić wykluczenie nieostrych komórek o niskim kontraście i niskim średnim kwadratowym gradiencie oraz wybór komórek znajdujących się w płaszczyźnie ostrości. Następnie należy użyć narzędzia „find best feature”, aby określić parametr zapewniający najlepszą separację statystyczną między komórkami znakowanymi a nieznakowanymi. Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie najbardziej odpowiednią cechą jest średnia wartość pikseli obiektu (mean pixel object feature).Następnie nanieś ten parametr na znormalizowaną częstotliwość, aby wykreślić histogram do ilościowego określenia nanorurek pobranych przez komórki przy każdym z badanym stężeń eksperymentalnych. Teraz sporządź wykres biparametryczny średniej wartości piksela obiektu w polu jasnym względem intensywności w polu ciemnym. Aby sprawdzić korelację między tymi dwoma parametrami, kwantyfikację nanorurek ocenia się również poprzez tworzenie masek na obrazach komórek, ponieważ nanorurki węglowe pojawiają się jako intensywne ciemne punkty w kanale pola jasnego; wybierz ograniczony zakres pikseli o niskiej intensywności, na przykład od 0 do 533, aby utworzyć maskę progową, która precyzyjnie pasuje do ciemnych nanorurek, a następnie utwórz drugą maskę, oznaczoną jako maska dwa, w celu wizualizacji nanorurek, które pojawiają się jako jasne w kanale pola ciemnego.Wybierz zakres pikseli o wysokiej intensywności. Na przykład w tym eksperymencie wybrano zakres od 150 do 4 095. Następnie, korzystając z obszaru z maski pola jasnego 1 lub maski pola ciemnego 2, utwórz wykres punktowy, aby określić ilościowo względną internalizację nanorurek.Na przykład należy nanieść na wykres obszar w kanale szóstym odpowiadający ciemnemu polu z maską dwa w funkcji obszaru w kanale pierwszym, odpowiadającego jasnemu polu z maską jeden. Po określeniu korelacji liniowej między maską jeden a maską dwa, należy zwizualizować nanorurki wewnątrz cytoplazmy, najpierw tworząc maskę całej komórki, a następnie poddając tę maskę erozji. Teraz oznaczona jako erode M 0 1 7 maska zostaje poddana erozji o siedem pikseli, aby umożliwić wgląd do wnętrza komórki.Aby zwizualizować nanorurki węglowe w obrębie błony komórkowej, należy użyć równania Boole'a M zero one and not erode M 0 1 7. Jest to maska całej komórki, z której odjęto wnętrze komórki, aby utworzyć maskę obejmującą wyłącznie błonę w celu oceny ciemnych pikseli znajdujących się na błonie. Następnie należy nałożyć maskę brightfield mask one na maskę błony.Zastosuj wszystkie te maski do wielu komórek jednocześnie, aby potwierdzić różnicę między próbkami znakowanymi a nieznakowanymi. Następnie za pomocą narzędzia obszaru cech (feature area tool) zaznacz czarne piksele na błonie, aby określić ilość nanorurek węglowych na błonie komórkowej. Na koniec odróżnij nanorurki węglowe, które zostały zinternalizowane, od tych, które zaabsorbowały się na błonie.Nanieś na wykres powierzchnię czarną błony w funkcji powierzchni czarnej całej komórki. Po utworzeniu wszystkich wykresów dla jednego warunku eksperymentalnego przygotuj szablon raportu statystycznego. Zapisz szablon jako plik A ST i przetwórz seryjnie wszystkie pliki danych.Urządzenie do strumieniowania obrazów generuje wiele obrazów o wysokiej rozdzielczości każdej komórki w cytometrze przepływowym, obejmując kanały w polu jasnym, polu ciemnym oraz kanały fluorescencyjne, co zademonstrowano tutaj na przykładzie trzech różnych komórek znakowanych nanorurkami. Przedstawiono również nakładki tych kanałów. Obecność nanorurek węglowych indukuje zmiany zarówno w kontraście, jak i gradiencie komórek znakowanych w porównaniu z komórkami nieznakowanymi.Zatem utworzenie dwuparametrycznego wykresu punktowego jest istotne dla wyboru komórek w ognisku. Nieostre komórki zaznaczone na żółto można odróżnić na podstawie niskiego kontrastu i niskiej wartości pierwiastka średniokwadratowego gradientu, niezależnie od obecności lub braku znakowania nanorurkami. Nieznakowane komórki w ognisku również wykazują niski kontrast, jednak w przypadku komórek w ognisku znakowanych nanorurkami obserwuje się wysoką wartość pierwiastka średniokwadratowego gradientu; natomiast komórki te wykazują profil o wysokim kontraście i niskiej wartości pierwiastka średniokwadratowego gradientu.Zinternalizowane nanorurki węglowe są łatwo rozróżnialne, szczególnie w kanale jasnego pola (Brightfield), gdzie występują jako intensywne ciemne punkty, których powierzchnia zwiększa się wraz z koncentracją nanorurek. Poprzez analizę średnich sygnałów pikseli z obrazów jasnego pola można określić względną ilość pobranych nanorurek. Przykładowo, przedstawione histogramy wykazują znaczący wzrost poboru nanorurek przy każdym zwiększeniu stężenia znaczników nanorurek; wykazano również, że kwantyfikacja nanorurek węglowych jest możliwa dzięki zastosowaniu masek nakładanych albo na ograniczony zakres ciemnych pikseli w obrazie jasnego pola, albo na piksele o wysokiej intensywności w ciemnym polu, odpowiadające obszarom, w których obecne są nanorurki.Wyznaczenie pola powierzchni tych masek umożliwia dalszą kwantyfikację wychwytu nanorurek węglowych. Ponadto korelację między punktami na obrazach w jasnym i ciemnym polu można ocenić, wykreślając intensywność ciemnego pola w funkcji średniego sygnału piksela w jasnym polu lub wykreślając pole maski w jasnym polu w funkcji pola w ciemnym polu. Na dwóch kolejnych rysunkach przedstawiono analizy nanorurek węglowych zlokalizowanych wewnątrz komórki.Pierwsze obrazy prezentują stworzone różne maski. Należy pamiętać, że poprawność masek lokalizacji opartych na erozji domyślnej maski komórki musi zostać zweryfikowana wizualnie na zbiorze komórek oznakowanych i nieoznakowanych. Jak właśnie pokazano na tych wykresach punktowych, w celu wyznaczenia wyniku internalizacji wykreślono całkowitą powierzchnię czarnych punktów na błonie komórkowej w stosunku do powierzchni całej komórki.W przypadku komórek inkubowanych przez 20 godzin w temperaturze 37°C, w porównaniu do komórek inkubowanych przez dwie godziny w temperaturze 4°C, nanorurki węglowe znajdują się głównie na błonie, natomiast w 37°C nanorurki węglowe są internalizowane w ponad 90% komórek. Fluorescencja nanorurek węglowych nie jest dobrym wskaźnikiem ich internalizacji ze względu na zbyt niską korelację między plamkami fluorescencyjnymi a plamkami w kanałach jasnego i ciemnego pola. Rzeczywiście, korelacja między intensywnością a średnią wartością piksela w jasnym polu wskazuje współczynnik korelacji Pearsona wynoszący -0,2.Jak pokazano na tych obrazach, sygnał fluorescencyjny nie pokrywa się w sposób wiarygodny z czarnymi punktami w polu jasnym; nanorurki węglowe, uwięzienie i agregacja wewnątrz wewnątrzkomórkowych lizosomów częściowo wygasiły sygnał fluorescencyjny. W przeciwieństwie do tego, rozproszone nanorurki mogą dawać bardziej wiarygodny sygnał fluorescencyjny po opracowaniu metody. Technika ta otwiera badaczom w dziedzinie nanotechnologii i nanomedycyny drogę do badania interakcji żywych komórek z nanomateriałami na bazie węgla lub wszelkimi nanomateriałami o wysokiej zdolności absorpcji i rozpraszania światła, z wykorzystaniem statystycznej metody cytometrii wysokoprzepustowej.

localization-relative-quantification-carbon-nanotubes-cells-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Lokalizacja i względna ilość nanorurek węglowych w komórkach przy użyciu wielospektralnej cytometrii przepływowej z obrazem

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Ten film pokazuje znakowanie komórek neuronalnych przeciwciałami dla mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego, białka związanego z mitochondrialnym DNA i mitochondrialnego białka błony zewnętrznej, a następnie cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia ich poziomów.

Pomiar wielu parametrów mitochondrialnych w neuronach za pomocą cytometrii przepływowej

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Anodowe wyładowanie łukowe jest jedną z najbardziej praktycznych i wydajnych metod syntezy różnorodnych nanostruktur węglowych. W celu zwiększenia sterowalności i elastyczności łuku wprowadzono niejednorodne pole magnetyczne, aby przeprowadzić jednoczynnikową syntezę wielkoskalowych płatków grafenu oraz wysokiej czystości jednościennych nanorurek węglowych.

Symultaniczna synteza jednościnnych nanorurek węglowych i grafenu w plazmie łukowej wzmocnionej magnetycznie

Poznaj metodę lokalizacji i kwantyfikacji nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego. Ta technika umożliwia statystyczną analizę pobrania nanocząstek.

Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego (Wideo) | JoVE Journal

Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Przeglądaj więcej filmów