Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest opracowanie nanometrologicznej metody monitorowania i ilościowego określania wychwytu komórkowego nanorurek węglowych w statystycznie istotnej liczbie komórek. Osiąga się to poprzez uprzednie potraktowanie komórek dyspergowalnymi w wodzie nanorurkami węglowymi, które dostają się do komórek w sposób zależny od stężenia. Te nanorurki węglowe są ostatecznie znakowane markerem fluorescencyjnym.

Następnie, po utrwaleniu, każda komórka jest obrazowana w jasnym polu, ciemnym polu i kanałach fluorescencyjnych przepływu obrazowania wielospektralnego. Cytometr. Aby zobrazować rozkład nanorurek węglowych i poziom absorpcji światła, światła rozproszonego i fluorescencji, znakowanie nanorurkami indukuje każdą komórkę piksel po pikselu. Ostatecznie wewnętrzna absorbancja i rozpraszanie światła w komórkach pozwala na lokalizację i kwantyfikację nanorurek węglowych.

Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na nowe pytania w dziedzinie nanotoksykologii i nanomedycyny, takie jak wpływ i los materiałów opartych na węglu w żywych komórkach, a także potencjał doniczkowy nanorurek węglowych jako systemu dostarczania leków Zacznij od dyspersji nanorurek węglowych, które ostatecznie zostaną sprzężone z etykietą fluorescencyjną w wodzie do hodowli komórek. Następnie sonikować nanorurki w kąpieli, sonikować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie rozcieńczyć nanorurki w stężeniach 0, 10, 20 i 50 mikrogramów na mililitr w kompletnym pożywce, a następnie inkubować dwa mililitry każdego rozcieńczenia z interesującymi komórkami na 1 25 centymetrów kwadratowych płytki na rozcieńczenie w temperaturze 37 stopni Celsjusza po 20 godzinach, usunąć pożywkę inkubacyjną z każdej płytki i przepłukać komórki oznaczone nanorurkami węglowymi PBS.

Po umyciu trypsyna obserwuje komórki na każdej płytce, a następnie ponownie zawiesza je w kompletnym podłożu DMEM. Następnie przenieś każdą próbkę do pojedynczych 15-mililitrowych probówek Falcon Einor, a następnie wiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 200 razy G i temperaturze pokojowej. Zawiesić każdą osadkę w 4% para formaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza na jedną godzinę.

Po utrwaleniu ponownie odwiruj komórki w dół i ponownie zawieś każdą granulowaną próbkę w ilości 15 razy 10 do piątej komórki w 150 mikrolitrach PBS. Następnie przefiltruj próbki przez indywidualne sitka o siatce 50 mikronów, aby uzyskać obrazy komórek za pomocą strumienia obrazu. Cytometr przepływowy do obrazowania wielospektralnego.

Najpierw wybierz dostosowane powiększenie, a następnie próbki obrazów, które Cię interesują. Użyj lasera o długości fali 685 nm, aby zobrazować ciemne pole i ustawić cytometr przepływowy. Kanał numer sześć do zbierania emisji ciemnego pola w paśmie przepustowym od 745 do 800 nanometrów.

Zobrazuj próbki w kanałach numer jeden w jasnym polu i w kanałach ciemnego pola numer sześć w celu analizy obrazu. Najpierw utwórz parametryczny wykres punktowy ze stosunkiem proporcji szerokości do wysokości w stosunku do obszaru komórki. Pozwala to na odróżnienie pojedynczych komórek, które mają standardową powierzchnię i współczynnik kształtu zbliżony do jednego, od zdarzeń wielokomórkowych, które mają dużą powierzchnię i mały współczynnik kształtu, oraz szczątków, które wykazują bardzo mały obszar.

Po użyciu obrazów komórek w celu sprawdzenia, czy pojedyncze komórki zostały prawidłowo wybrane, skonfiguruj dwuparametryczny wykres punktowy dla komórek oznaczonych nanorurkami węglowymi o wysokim kontraście, wykreślając kontrast w stosunku do średniego gradientu kwadratowego, aby umożliwić wykluczenie niskiego pierwiastka, średniego gradientu kwadratowego, nieostrych komórek o niskim kontraście i wyboru komórek w płaszczyźnie skupionej. Następnie użyj narzędzia Znajdź najlepszą funkcję, aby określić parametr, który zapewnia najlepszą separację statystyczną między komórkami oznaczonymi i nieoznaczonymi. Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie najbardziej odpowiednia jest funkcja obiektu o średniej liczbie pikseli.

Następnie wykreśl ten parametr w stosunku do znormalizowanej częstotliwości, aby prześledzić histogram do kwantyfikacji nanorurek pobranych przez komórki przy każdym stężeniu eksperymentalnym. Teraz narysuj wykres dwuparametryczny dla średniej wielkości piksela obiektu na jasnym polu w porównaniu z intensywnością na ciemnym polu. Aby sprawdzić korelację między tymi dwoma parametrami, ocenia się również kwantyfikację nanorurek poprzez tworzenie na komórkach obrazów, w których nanorurki węglowe pojawiają się jako intensywne ciemne plamy W kanale Brightfield wybierz ograniczony zakres pikseli o niskiej intensywności, na przykład od zera do 533, aby utworzyć maskę progową, Jedna, która precyzyjnie pasuje do ciemnych nanorurek, aby stworzyć drugą maskę, oznaczoną jako Maska Druga do wizualizacji nanorurek, które wydają się jasne w kanale ciemnego pola.

Wybierz zakres pikseli o dużej intensywności. Na przykład do tego eksperymentu wybrano zakres od 150 do 4 095. Następnie, używając obszaru z maski jasnego pola pierwszej lub maski ciemnego pola drugiej, ustaw wykres kropkowy, aby określić ilościowo względną internalizację nanorurek.

Na przykład wykreśl obszar na kanale szóstym odpowiadający ciemnemu polu z maską drugą na obszarze kanału pierwszego, odpowiadający jasnemu polu z maską pierwszą. Po określeniu liniowej korelacji między maską pierwszą a maską drugą, wizualizuj nanorurki w cytoplazmie, najpierw tworząc maskę całej komórki, a następnie erodując maskę. Teraz oznaczone jako erozja M 0 1 7 o siedem pikseli, aby zobaczyć wnętrze komórki.

Aby zobrazować nanorurki węglowe w błonie komórkowej, użyj równania Boole'a M zero jeden, a nie erodować M 0 1 7. Jest to maska całej komórki, odjęta od wnętrza komórki, aby utworzyć maskę błony tylko po to, aby ocenić ciemne piksele na błonie. Nałóż maskę jasnego pola na maskę membranową.

Zastosuj wszystkie te maski do wielu komórek jednocześnie, aby potwierdzić rozróżnienie między próbkami oznakowanymi i nieoznakowanymi. Następnie wybierz czarne piksele na membranie za pomocą narzędzia obszaru cech, aby określić ilościowo nanorurki węglowe na błonie komórkowej. Wreszcie, aby odróżnić nanorurki węglowe, które zostały zinternalizowane, od tych, które zostały wchłonięte przez membranę.

Wykres, obszar błony w stosunku do czarnego obszaru całej komórki. Po utworzeniu wszystkich wykresów dla jednego warunku eksperymentalnego utwórz szablon raportu statystycznego. Zapisz szablon jako plik A ST i wsaduj wszystkie pliki danych.

Urządzenie do strumienia obrazu wytwarza wiele obrazów o wysokiej rozdzielczości każdej komórki w cytometrze przepływowym, w tym kanałów jasnego pola, ciemnego pola i fluorescencji, jak pokazano tutaj na przykładzie trzech różnych komórek oznaczonych nanorurkami. Pokazane są również nakładki tych kanałów. Obecność nanorurek węglowych wywołuje zmiany zarówno w kontraście, jak i gradiencie znakowanych komórek w porównaniu z komórkami nieznakowanymi.

W związku z tym utworzenie biparametrycznego wykresu punktowego jest ważne dla wyboru komórek fokusu. Nieostre komórki w kolorze żółtym można odróżnić na podstawie ich niskiego kontrastu i niskiego gradientu średniokwadratowego, niezależnie od obecności lub braku znakowania nanorurkami. Nieznakowane komórki ostrości również wykazują niski kontrast, ale wykazują wysoki pierwiastek, średni gradient kwadratowy, gdy komórki ostrości są znakowane nanorurkami, jednak komórki wykazują wysoki kontrast, niski pierwiastek, średni kwadratowy profil gradientu.

Zinternalizowane nanorurki węglowe są łatwe do odróżnienia, szczególnie w kanale Brightfield, gdzie pojawiają się jako intensywne ciemne plamy, których obszary zwiększają się wraz z zagęszczeniem nanorurek. Po przeanalizowaniu średnich sygnałów pikselowych obrazów w jasnym polu można określić względną kwantyfikację wychwytu nanorurek. Na przykład histogramy te pokazują znaczny wzrost absorpcji nanorurek, który następuje wraz ze wzrostem stężenia znakowania nanorurek, jak wykazano, kwantyfikacja nanorurek węglowych jest również możliwa dzięki zastosowaniu masek nakładanych albo na ograniczony zakres ciemnych pikseli w obrazie jasnego pola, albo na piksele o wysokiej intensywności w ciemnym polu, odpowiadające obszarom, w których obecne są nanorurki.

Wykreślenie obszaru tych masek pozwala następnie na dalsze ilościowe określenie absorpcji nanorurek węglowych. Ponadto korelację między plamami na obrazach jasnego i ciemnego pola można ocenić, wykreślając intensywność ciemnego pola w stosunku do średniego sygnału pikseli jasnego pola lub wykreślając obszar maski w jasnym polu w porównaniu z obszarem w ciemnym polu. Na kolejnych dwóch rysunkach przedstawiono analizy nanorurek węglowych zlokalizowanych we wnętrzu komórki.

Te pierwsze obrazy pokazują różne maski, które zostały utworzone. Należy zauważyć, że niezawodność masek lokalizacji na podstawie erozji domyślnej maski komórki musi być sprawdzana wizualnie w kolekcji komórek oznaczonych i nieoznaczonych. Jak właśnie wykazano na tych wykresach kropkowych, całkowity obszar czarnych plam na błonie komórkowej w porównaniu z obszarem całej komórki został wykreślony w celu określenia wyniku internalizacji.

W przypadku komórek, które były inkubowane przez 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w porównaniu z komórkami, które były inkubowane przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza i czterech stopni Celsjusza, nanorurki węglowe znajdują się głównie na membranie, podczas gdy w temperaturze 37 stopni Celsjusza nanorurki węglowe są internalizowane w ponad 90% komórek. Fluorescencja nanorurek węglowych nie jest dobrym wskaźnikiem internalizacji nanorurek węglowych ze względu na zbyt niską korelację między plamkami fluorescencyjnymi a plamkami w kanałach jasnego i ciemnego pola. Rzeczywiście, korelacja między intensywnością natężenia a średnim pikselem jasnego pola wskazuje na współczynnik korelacji Pearsona wynoszący minus 0,2.

Jak pokazano na tych obrazach, sygnał fluorescencyjny nie pasuje niezawodnie do czarnych plam w jasnym polu, nanorurek węglowych, uwięzienia i agregacji w lizosomach wewnątrzkomórkowych częściowo wygasionych sygnał fluorescencyjny. W przeciwieństwie do tego, rozproszone nanorurki mogą dawać bardziej wiarygodny sygnał fluorescencyjny po jego opracowaniu. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się nanotechnologią i nanomedycyną do badania interakcji żywych komórek z nanomateriałami na bazie węgla lub dowolnymi nanomateriałami o wysokiej zdolności absorpcji i rozpraszania życia przy użyciu statystycznej metody cytometrii wysokoprzepustowej.