Śmierć komórki związana z nieprawidłową mitozą obserwowana przez obrazowanie konfokalne w żywych komórkach rakowych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest obserwacja efektu cytotoksycznego pochodnej filantrany PJ 34 podczas mitozy w wielojądrzowych komórkach raka ludzkiego. Osiąga się to poprzez znakowanie centrosomów GFP gamma tubuliną oraz chromosomów H2B-RFP za pomocą transfekcji. Celem transfekcji jest umożliwienie śledzenia migracji i grupowania się centrosomów oraz rozmieszczenia chromosomów podczas mitozy w żywych wielojądrzowych komórkach raka.

W drugim kroku część transfekowanych komórek poddawano działaniu PJ 34, cząsteczki działającej jako czynnik usuwający nadmiar centrosomów. Następnie żywe transfekowane komórki nowotworowe skanowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zarejestrowania zdarzeń podczas mitozy związanych z migracją centrosomów i chromosomów. Przegrupowanie lub klastrowanie sekwencyjnych obrazów uzyskano, aby wykazać efekty oczyszczające i cytotoksyczne działania PJ 34 w komórkach nowotworowych podczas mitozy na podstawie obrazowania konfokalnego żywych komórek.

Zastosowania tej techniki zmierzają w stronę celowanej terapii nowotworowej, która wybiórczo eliminuje autosomalne komórki rakowe podczas mitozy. Technikę tę zaprezentują nasi współpracownicy: dr Asher Castillo z Centrum Badań nad Rakiem w Sheba Medical Center oraz dr Leonid Middleman z jednostki obrazowania Sacko School of Medicine na Uniwersytecie w Tel Awiwie. Aby przygotować komórki raka piersi MDA-MB-231 do żywego obrazowania konfokalnego, należy zasiać 2 × 10⁵ komórek w szalkach hodowlanych z dnem szklanym o średnicy 35 mm, pokrytych poli-D-lizyną, w 2 mL pełnej pożywki i inkubować w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.

Kultura komórkowa jest gotowa do transfekcji, gdy osiągnie konfluencję od 60 do 70%. Komórki zostaną poddane transfekcji dwoma plazmidami: jeden koduje gamma-tubulinę, GFP do fluorescencyjnej detekcji centrumsomów, a drugi koduje histonę czerwoną do fluorescencyjnej detekcji chromosomów. Transfekcję przeprowadza się przy użyciu liposomalnego odczynnika do transfekcji jet PE zgodnie z protokołem producenta. Przemyć komórki raz roztworem PBS, a następnie zastąpić pożywkę komórkową dwoma mililitrami ocieplonego DMEM bez dodatków. Ostrożnie dodać mieszaninę do transfekcji do komórek w DMEM, a następnie przenieść komórki do inkubatora na osiem godzin.

Zastąp DMEM dwiema mililitrami pożywki kompletnej i inkubuj komórki w inkubatorze przez 24 godziny. Po transfekcji wymień pożywkę na dwa mililitry pożywki kompletnej zawierającej 20 µM PGA 34.

Inkubować komórki przez kolejne 18 godzin przed obrazowaniem konfokalnym żywych komórek. Poniżej znajdują się parametry techniczne ustawień skanera do obrazowania konfokalnego żywych komórek. Tryb skanowania XYZT, pinhole, airy 1.00, powiększenie (zoom) 3.5, rozdzielczość osiem bitów, laser DPSS 561 nanometrów, widzialny laser argonowy 488 nanometrów, widzialny laser helowo-neonowy 633 nanometrów.

Obiektyw H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63x 1,40 Oil UV z aperturą numeryczną 1,4. Szybkość skanowania 700 Hz i współczynnik refrakcji 1,52. Poddać komórki obrazowaniu konfokalnemu w czasie rzeczywistym przez co najmniej 16 godzin w komorze obrazującej, utrzymując komórki w atmosferze 5% carbon dioxide i temperaturze 37 °C.

Wydajność transfekcji zostanie sprawdzona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Rozpocznij tę procedurę od wysiania 2 × 10⁵ komórek MDA MB 231 na płytkę 6-dołkową, zawierającą jedno szkiełko nakrywkowe na dołek, w 2 mL pożywki kompletnej. Przeprowadź transfekcję komórek w ten sam sposób co poprzednio, używając liposomalnego odczynnika do transfekcji Jet PE zgodnie z protokołem producenta.

36 godzin po transfekcji. Usunąć pożywkę z każdej studni po przemyciu PBS komórek transfektowanych osadzonych na szkiełku podstawnym. Utrwalić komórki poprzez inkubację w zimnym roztworze metanolu i acetonu w stosunku 1:1 przez siedem minut w temperaturze -20 °C.

Po siedmiu minutach odessać roztwór utrwalający i pozostawić szkiełko nakrywowe z zamocowanymi komórkami do wyschnięcia w wyciągu chemicznym przez 30 minut. Następnie nałożyć odczyn antyblaknący Prolonged Gold z DPI i pozostawić szkiełko nakrywowe do wyschnięcia w ciemności przez sześć godzin. Przebadać preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym i obliczyć odsetek transfektowanych komórek wykazujących sygnały czerwone i zielone.

Z całkowitej populacji komórek pożądany odsetek transfekcji wynosi około 20 do 40%, przy przeliczeniu 100 do 200 komórek. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wysiać 2 × 10⁵ komórek raka piersi MDA-MB-231 na szkiełkach nakrywkowych w płytce 6-dołkowej w 2 mL pełnej pożywki. Do pożywki dodać PJ 34 i inkubować komórki przez wymagany czas.

Po zakończeniu okresu inkubacji przemyj szkiełka podstawowe raz za pomocą PBS i utrwal komórki, inkubując je przez siedem minut w temperaturze -20 °C w roztworze lodowatego metanolu i acetonu w stosunku jeden do jednego. Następnie odessij roztwór utrwalający i pozostaw szkiełka do wyschnięcia w dygestorze przez 30 minut. Przemyj szkiełka raz za pomocą PBST, aby przeprowadzić permeabilizację błon komórkowych, a następnie zablokuj komórki, inkubując je w 10% normalnym surowicy osła w PBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Przygotować pierwszą mieszaninę przeciwciał, dodając przeciwciała pierwotne anty-alfa tubulina oraz anty-gamma tubulina do roztworu blokującego, a następnie mieszając na wortexie. Następnie nanieść 100 µl mieszaniny przeciwciał na każde szkiełko podstawowe na pokrywie płytki sześciodołkowej. Odwrócić szkiełko podstawowe i delikatnie położyć je na kropli przeciwciał, a następnie inkubować przez dwie godziny.

Dodaj w temperaturze pokojowej. Pozwoli to na zabarwienie wrzecion i centrosomów. Włóż szkiełka nakrywki z powrotem do dołków i przemyj komórki trzykrotnie roztworem PBST.

Następnie dodaj przeciwciała wtórne, LOR 488 i LOR 568, po jednej kropli na szkiełko podstawowe na pokrywie płytki sześciodołkowej. Następnie połóż szkiełka podstawowe stroną roboczą do dołu na kroplach przeciwciał i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po zakończeniu inkubacji z przeciwciałami wtórnymi przenieś szkiełka podstawowe z powrotem do dołków i przemyj komórki trzy razy roztworem PBST.

Na koniec należy zamocować szkiełka przykrywne, używając odczynnika antyblaknącego Prolong Gold, a następnie inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności do wyschnięcia, przed obrazowaniem utrwalonych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej. PJ 34 jest stabilną, rozpuszczalną w wodzie pochodną pantarodyny, w której wcześniej zaobserwowano, że wybiórczo eliminuje komórki nowotworowe z wieloma centrosomami, nie uszkadzając prawidłowych komórek przechodzących mitozę z dwoma centrosomami i wrzecionami dwubiegunowymi. W niniejszym badaniu aktywność cytotoksyczna PJ 34 została sprawdzona na żywych ludzkich komórkach raka piersi M-D-A-M-B 231, które charakteryzują się wysoką częstotliwością występowania dodatkowych centrosomów.

Komórki przetransfekowano gamma-tubuliną GFP w celu znakowania ognisk gamma-tubuliny oraz histoną H2B czerwoną w celu znakowania chromosomów. Skanowanie komórek MDAMB 231 przez co najmniej 16 godzin za pomocą obrazowania konfokalnego ujawniło bifokalne skupianie się centrosomów, reprezentujące dodatkowe bifokalne skupianie centrosomów w większości komórek w fazie mitozy, co zilustrowano w następujących klipach wideo. Pierwszy film przedstawia losowo wybraną żywą komórkę podczas mitozy, w której centrosomy zostały znakowane na zielono za pomocą gamma-tubuliny.

W drugim filmie GFP służy do wizualizacji przegrupowania chromosomów podczas mitozy w losowo wybranej komórce MDA-MB-231 przetransfekowanej histonem H2B red. Trzeci film przedstawia komórkę MDA-MB-231 przechodzącą mitozę, w której bifokalne skupiska ognisk ekstra-ryzomów są znakowane na zielono, a chromosomy na czerwono. W przeciwieństwie do tego, w żywych przetransfekowanych komórkach MDA-MB-231 inkubowanych z 20 µM PJ 34 wykryto nieskupione centrosomy oraz aberracyjną rozmieszczenie chromosomów, a mitoza w tych komórkach zakończyła się śmiercią komórki, co przedstawiono w tym filmie.

Niniejsza dokumentacja śmierci komórek podczas mitozy w czasie rzeczywistym silnie potwierdza wcześniej zdefiniowaną dodatnią korelację pomiędzy liczbą ludzkich komórek nowotwórczych z wrzecionami wielobiegunowymi w mitozie a odsetkiem śmierci komórek inkubowanych z PJ 34. Ponieważ PJ 34 działa jako silny inhibitor PARP 1, zbadano możliwość, że inhibicja PARP 1 wywołuje śmierć komórek związaną z niepowodzeniem mitozy. Aktywność cytotoksyczna rosnących stężeń PJ 34 została przetestowana w prawidłowych oraz niedoborowych pod względem PARP 1 zarodkowych fibroblastach mysich, a wyniki przedstawiono poniżej.

Wykres po lewej przedstawia odsetek wrzecion wielobiegunowych obliczony dla prawidłowych embrionalnych fibroblastów mysich (reprezentowanych przez czarną linię) oraz fibroblastów z niedoborem PARP1 (reprezentowanych przez szarą linię), inkubowanych przez 48 godzin z PJ 34 w zaznaczonych stężeniach. Procenty te obliczono na podstawie łącznie 20 wykrytych wrzecion w trzech różnych eksperymentach. Wykres po prawej przedstawia przeżywalność prawidłowych i niedoborowych w PARP1 embrionalnych fibroblastów mysich inkubowanych przez 72 godziny z 20 micromolar.

Przeżywalność komórek PJ 34 oceniano na podstawie produkcji ATP w komórkach. Przedstawiono średnie wartości z czterech pomiarów dla każdej linii komórkowej w trzech różnych eksperymentach. Wyniki te pokazują, że dawki PJ 34 w sposób zależny od dawki powodowały zniekształcenie wrzecion podziałowych oraz śmierć komórek w embrionalnych fibroblastach mysich z niedoborem PARP1, ale nie w normalnych fibroblastach.

Fakt, że PJ 34 wyeliminował komórki z niedoborem PARP1 pomimo ich deficytu PARP1, oraz korelacja między tworzeniem wieloogniskowych wrzecion a eliminacją komórek w zarodkowych fibroblastach mysich z niedoborem PARP1 inkubowanych z PJ 34 w stężeniach wyższych niż wymagane do inhibicji PARP1, nie są zgodne z przyczynowym powiązaniem między oczyszczaniem centrosomów w zarodkowych fibroblastach mysich z niedoborem PARP1 a inhibicją PARP1. Te obrazy konfokalne przedstawiają prawidłowe oraz wykazujące niedobór PARP1 zarodkowe fibroblasty mysie w fazie mitozy, utrwalone, permeabilizowane i oznakowane immunochemicznie przeciwciałami przeciwko alfa- i gamma-tubulinie, które odpowiednio zabarwiły wrzeciona na zielono, a centrosomy na czerwono. Chromosomy zostały zabarwione na niebiesko przy użyciu odczynnika DPI.

Komórki pozostawiono bez obróbki lub inkubowano z PJ 34 przez 48 godzin w określonych stężeniach. W embrionalnych fibroblastach mysich z niedoborem PARP 1 po podaniu PJ 34 zaobserwowano obecność niezagregowanych ognisk gamma tubuliny, zniekształcone wrzeciona oraz śmierć komórek, czego nie stwierdzono w prawidłowych embrionalnych fibroblastach mysich traktowanych PJ 34. Niektóre z badanych kultur komórkowych poddano działaniu dwóch silnych niearylowych inhibitorów PARP 1: BT 8 88 oraz G 0 1 4 6 9, które hamują aktywność enzymatyczną PARP 1.

Żaden z przetestowanych inhibitorów PARP1 nie upośledzał funkcji prawidłowych embrionalnych fibroblastów myszy w stężeniach hamujących aktywność PARP1. Inhibitory PARP1 nie wpływały również na skupianie centrosomów w embrionalnych fibroblastach myszy z niedoborem PARP1. Wyniki te wskazują, że cytotoksyczne działanie PJ 34 na komórki z wieloma centrosomami nie jest wspólne dla innych silnych inhibitorów PARP1.

Technikę tę można zastosować w innych typach żywych komórek w ramach różnorodnych projektów badawczych.