Name: Śmierć komórki związana z nieprawidłową mitozą obserwowana przez obrazowanie konfokalne w żywych komórkach rakowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Poznaj obserwację śmierci komórek rakowych podczas nieprawidłowej mitozy przy użyciu obrazowania konfokalnego w żywych komórkach. Ta metoda pozwala analizować dynamikę centrosomów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Źródła finansowania tych badań: wspólny fundusz firmy zajmującej się transferem technologii Uniwersytetu w Tel Awiwie, RAMOT i Centrum Medycznego Sheba (M. C-A. i S.I.), ICRF - Izraelska Fundacja Badań nad Rakiem (M. C-A.) i Izraelska Fundacja Naukowa (S.I.).

1. Przygotowanie hodowli komórkowej
Komórki MDA-MB-231 zostały zakupione w ATCC (American Type Culture Collection) i przechowywane w ciekłym azocie.
<ol>
	<li>Wysiew 106 komórek MDA-MB-231 na szalce Petriego o średnicy 92 mm w 10 ml kompletnej pożywki zawierającej Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% surowicy końskiej, 1% L-glutaminy i 1% Penstrep-Amfoterycyny B. Pozwól komórkom namnażać się do około 80-100% konfluencji.</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną z naczynia i wyrzuć.</li>
	<li>Umyj krótko warstwę komórkową 0,25% (w/v) roztworem trypsyny-EDTA, aby usunąć wszelkie ślady surowicy.</li>
	<li>Dodać 2,0 ml roztworu trypsyny-EDTA do naczynia i obserwować komórki pod odwróconym mikroskopem, aż warstwa komórkowa zostanie zdyspersjonowana (zwykle w ciągu 5 do 15 minut).</li>
	<li>Dodać 18 ml kompletnej pożywki wzrostowej i delikatnie odessać komórki pipetą. Przełóż do tuby.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek z prędkością 1 200 obr./min.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 24 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Dodać 2 ml zawiesiny komórkowej do naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (około 25% konfluencji) i umieścić w inkubatorze (5%CO2, 37 °C).</li>
	<li>Rozwiązania:
	<ol>
		<li>Kompletna pożywka do proliferacji komórek: DMEM z 10% FBS, 1% antybiotykami (100 jednostek/ml penicyliny G, 100 μg/ml streptomycyny, roztwór Pen-Strep-Ampho) i 2 mM L-glutaminy.</li>
		<li>Roztwór trypsyny-EDTA, zawierający 0,25% trypsyny-EDTA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dania: 
	Szalki Petriego o średnicy 92 mm. 
	Naczynia hodowlane ze szkła o średnicy 35 mm pokryte poli-D-lizyną.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do obrazowania konfokalnego na żywo
<ol>
	<li>Nasiona 2 x 105 komórek MDA-MB-231 w szalkach hodowlanych ze szklanym dnem w 2 ml kompletnej pożywki, jak wspomniano w sekcji 1. Gdy hodowla komórkowa osiągnie zbieg 60-70% (około 3-4 x 105 komórek na talerzu), przystąp do transfekcji.</li>
	<li>Transfekcję komórek dwoma plazmidami kodującymi białka fuzyjne γ-tubulina-GFP (do fluorescencyjnego wykrywania centrosomów) i histon-RED (H2b-RED, do fluorescencyjnego wykrywania chromosomów) przy użyciu odczynnika do transfekcji liposomalnej Jet-PI, zgodnie z protokołem wytwarzania. Krótko wymieszaj 2 μg z każdego plazmidu w probówce ze 100 μl NaCl (150 mM). Zmieszać odczynnik do transfekcji (100 μl) ze 100 μl NaCl (150 mM) w drugiej probówce i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Następnie połącz oba roztwory, wymieszaj (używając łagodnego wiru) i odwiruj. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podczas inkubacji mieszaniny do transfekcji przemyć komórki raz PBS i zastąpić pożywkę komórkową 2 ml ciepłego DMEM bez dodatków (37 °C).</li>
	<li>Delikatnie dodać mieszaninę transfekcji do komórek w DMEM, a następnie umieścić komórki z powrotem w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 8 godzin.</li>
	<li>Po 8 godzinach inkubacji zastąpić DMEM 2 ml kompletnej pożywki i inkubować komórki w inkubatorze przez 24 godziny.</li>
	<li>24 godziny po transfekcji zastąpić pożywkę komórek 2 ml kompletnej pożywki zawierającej 20 μM PJ-34.</li>
	<li>Inkubować komórki przez dodatkowe 18 godzin (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Poddać komórki obrazowaniu konfokalnemu na żywo przez co najmniej 16 godzin w komorze obrazowania, utrzymując komórki w temperaturze 5% CO2 i 37 °C.</li>
	<li>Równolegle zbadaj skuteczność transfekcji 36 godzin po transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wysiew 2 x 105 komórek MDA-MB-231 na płytce 6-dołkowej zawierającej 1 szkiełko nakrywkowe na basenik w 2 ml kompletnego podłoża.</li>
		<li>Przetransfekować komórki, jak wspomniano w punktach 2.2-2.5.</li>
		<li>36 godzin po transfekcji utrwalić transfekowane komórki zamontowane na szkiełku nakrywkowym przez inkubację w zimnym roztworze metanolu: acetonu (1:1), 7 min, -20 °C.</li>
		<li>Zassać roztwór utrwalający i pozostawić szkiełko nakrywkowe z zamontowanymi komórkami do wyschnięcia w kapturze chemicznym.</li>
		<li>Nałóż odczynnik zapobiegający blaknięciu ProLong Gold z DAPI i pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia w ciemności przez 6 godzin.</li>
		<li>Zbadaj szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym i oblicz procent transfekowanych komórek (sygnały czerwone i zielone) w całkowitej populacji komórek (barwienie DNA przez DAPI). Pożądany procent transfekcji wynosi około 20-40%, gdy zlicza się 100-200 komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Parametry techniczne ustawień skanera obrazowania konfokalnego na żywo
<ol>
 <li>Tryb skanowania XYZT; Otworek [airy] 1.00; Powiększenie 3,5; Rozdzielczość: 8 bitów; Laser DPSS 561 nm; Argon, laser widzialny 488 nm; Laser He/Ne widzialny 633 nm; Obiektyw HCX PL APO CS 63X 1.40 OIL UV; Przysłona numeryczna 1,4; Prędkość skanowania 700 Hz; Współczynnik załamania światła 1,52.</li>
 <li> Prezentacja obrazu 3D została przygotowana przez oprogramowanie IMARIS Imaging Software 7.0.</li>
</ol>
4. Konfokalne obrazowanie mitozy w komórkach stałych
<ol>
	<li>Nasiona 2 x 105 komórek raka piersi MDA-MB-231 (ATCC), normalnych mysich fibroblastów zarodkowych (MEF) lub MEF z niedoborem PARP1 (PARP-/-, przygotowane przez dr Francoise Dantzer) na szklanych szkiełkach nakrywkowych na płytce 6-dołkowej w 2 ml kompletnego podłoża. Szkiełka nakrywkowe przemyto 96% etanolem, a następnie przemyto sterylną wodą DD, suszono przez 2 godziny i umieszczano w każdej studzience 6-dołkowego naczynia.</li>
	<li>Dodaj PJ-34 (10-30 μM) do pożywki i inkubuj komórki przez wymagany okres (zwykle do 96 godzin).</li>
	<li>Jednorazowo przemyć szkiełka nakrywkowe PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) i utrwalić komórki za pomocą inkubacji w lodowatym roztworze metanolu: acetonu (1:1), 7 min, -20 °C.</li>
	<li>Zassać roztwór utrwalający i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w kapturze chemicznym (na tym etapie szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni).</li>
	<li>Przemyj szkiełka nakrywkowe raz PBST (PBS uzupełniony 0,1% Tween-20) w celu przepuszczalności błon komórkowych i zablokuj komórki 10% NDS (normalna surowica osła) w PBST ("roztwór blokujący") przez 1 godzinę w RT.</li>
	<li>Inkubować permeabilizowane utrwalone komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (do barwienia wrzecion i centrosomów). Przeciwciała rozcieńcza się w roztworze blokującym w następujący sposób: tubulina anty-α (rozcieńczenie 1:250) i tubulina anty-γ (rozcieńczenie 1:200). Przeciwciała pierwszorzędowe nakłada się w następujący sposób: nanieść 100 μl (w kropli) mieszaniny przeciwciał w roztworze blokującym na każde szkiełko nakrywkowe na pokrywie płytki 6-dołkowej (osłonka jest odwrócona do góry nogami). Delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na kropli przeciwciał, komórki nasienne skierowane w stronę kropli. Inkubować szkiełka nakrywkowe skierowane w stronę przeciwciał przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w studzienkach i umyj komórki 3 razy PBST. Następnie należy zastosować tę samą procedurę, opisaną w ppkt 4.6, do znakowania komórek na szkiełkach nakrywkowych fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi. Inkubować komórki na szkiełkach nakrywkowych z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę RT w ciemności. Przeciwciała rozcieńcza się w roztworze blokującym w następujący sposób: Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:1,000; zielony) i Alexa Fluor 568 (rozcieńczenie 1:1,000; czerwony).</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu ProLong Gold z DAPI (do barwienia chromosomów) i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności do wyschnięcia.</li>
	<li>Zbadaj szkiełka nakrywkowe za pomocą mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>
5. Żywotność komórek mierzona produkcją ATP
Produkcja ATP jest mierzona za pomocą zestawu do wykrywania luminescencyjnego ATP.
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki na 96-dołkowej płytce, około 20 000 komórek w pożywce 800 μl w każdym dołku. Do wyznaczenia luminescencji tła podłoża należy użyć trzech ślepych studzienek.</li>
	<li>Przygotować serię rozcieńczeń wzorca ATP od około 10 μM do 100 μM i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 50 μl detergentu i potrząsać płytką przez 5 minut w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 700 obr./min.</li>
	<li>Rozpuścić rozpuszczenie zawartości każdej fiolki "liofilizowanego substratu" w 5 ml znajdującego się w zestawie "buforu substratowego".</li>
	<li>Dodać 50 μl odtworzonego roztworu substratu do studzienek i wstrząsać płytką przez 5 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 700 obr./min.</li>
	<li>Trzymaj talerz w ciemności przez 10 minut.</li>
	<li>Zmierz luminescencję każdej studzienki za pomocą czytnika mikropłytek ELISA.</li>
</ol>

<ol><li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly%28adenosine+5%27-diphosphate-ribose%29+synthetase%3A+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li>
<li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells%3A+Extra-centrosomes+de-clustering+agent%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412(2011).</li>
<li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78(2009).</li>
<li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+centrosomes%3A+together+they+stand%2C+divided+they+fall%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li>
<li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes+and+cancer%3A+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Canc.+Met.+Rev%22%5BJournal%5D)">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).</li>
<li>Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+centrosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating centrosome function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).</li>
<li>Walczak, C. E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitotic+spindle+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22International+Rev.+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitotic spindle assembly and function.</a> International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).</li>
<li>Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let%27s+huddle+to+prevent+a+muddle%3A+centrosome+declustering+as+an+attractive+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy.</a> Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).</li>
<li>Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKramer%2C+A+%22The+Centrosome%3A+Cell+and+Molecular+mechanisms+of+functions+and+disfunctions+in+disease%22">The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease</a>. Schatten, E. , Humana Press Springer. 255-277 (2012).</li>
<li>Galimberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+Catastrophe+Is+a+Target+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy.</a> Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploinsufficiency+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase-1-mediated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+for+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).</li>
<li>Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitors%3A+a+novel+drug+class+with+a+promising+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li>
<li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li>
<li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibition%3A+PARP1+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li>
<li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li>
<li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarczyło dokumentacji cytotoksycznego działania PJ-34 w żywych komórkach wielocentrosomalnych podczas mitozy (ryc. 3 i informacje dodatkowe). Była to pierwsza żywa dokumentacja przypisująca cytotoksyczność PJ-34 w ludzkich komórkach nowotworowych dodatkowym centrosomom degrupowaniu i śmierci komórki, co sugeruje indukcję mitotycznej śmierci komórki katastrofy przez PJ-345-9. W przeciwieństwie do tego, dwuogniskowe grupowanie nadliczbowych centrosomów zaobserwo...

Inhibitory PARP1 pochodzące z fenantrenu, w tym PJ-34, zostały zaprojektowane w celu ochrony komórek w stanie spoczynku przed apoptotyczną śmiercią komórek indukowaną przez energochłonną naprawę DNA za pośrednictwem PARP1 w warunkach stresu (udar lub zawał mięśnia sercowego)1. Jednak ostatnio odkryliśmy, że PJ-34, w stężeniu dwukrotnie wyższym niż ten, który indukuje hamowanie PARP1, może powodować śmierć komórek wyłącznie w ludzkich komórkach rakowych2,3. Im szybsza była proliferacja komórki, tym skuteczniejsza była eliminacja komórek. Aktywność cytotoksyczną PJ-34 przypisano degrupowaniu ekstracentrosomów w mitozie2. Wiele ludzkich komórek nowotworowych zawiera multicentrosomy4,5. Inkubacja ludzkich komórek raka piersi MDA-MB-231, które zawierają nadliczbowe centrosomy, z 20 μM PJ-34 skutecznie wyeliminowała te komórki w ciągu 72-96 godzin bez uszczerbku dla komórek w stanie spoczynku lub niektórych łagodnych komórek proliferujących zawierających dwa centrosomy w mitozie2,3. Łagodne komórki obejmowały ludzkie komórki nabłonka sutka MCF-10, ludzkie komórki śródbłonka (huvec) oraz pierwotne komórki mezenchymalne przygotowane z ludzkiej grasicy. Komórki te były oporne na cytotoksyczne działanie PJ-34. PJ-34 nie zakłócał ich cyklu komórkowego podczas 96-godzinnej inkubacji ani nie wpływał na ich centrosomy i tworzenie dwuogniskowego wrzeciona2,3.
Dwubiegunowy montaż centrosomów jest kluczowy dla tworzenia dwubiegunowego wrzeciona w mitozie4,5. Dlatego komórki z więcej niż dwoma centrosomami rozwinęły słabo poznany mechanizm molekularny, grupując swoje dodatkowe centrosomy na dwóch biegunach 4-9. Niepowodzenie dwubiegunowego składania ich centrosomów może powodować wielobiegunowe zniekształcone wrzeciona i nieprawidłową segregację chromosomów, która zatrzymuje cykl komórkowy w zatrzymaniu G2 / M i prowadzi do śmierci komórki przypisywanej niewydolności mitotycznej4,5. Mechanizmy molekularne leżące u podstaw deklastracji ekstracentrosomów są intensywnie badane10. Zrozumienie tego mechanizmu śmierci umożliwi wyłączną eliminację komórek nowotworowych przy jednoczesnym oszczędzaniu zdrowych tkanek 5,10.
Tak więc, związki, które aktywują mitotyczną katastroficzną śmierć komórki, oferują nowy tryb selektywnej terapii przeciwnowotworowej, która może być skuteczna w szerokim zakresie ludzkich nowotworów litych. Nasze wyniki sugerują, że obrazowanie konfokalne może być wykorzystane do identyfikacji cząsteczek wpływających na grupowanie się pozacentrosomów w mitozie2,3, co sprawia, że związki te są kandydatami na leki ukierunkowane na raka.
Udokumentowaliśmy cytotoksyczną aktywność fenantrydyny PJ-34 poprzez skanowanie stałych i żywych ludzkich komórek rakowych (z dużym udziałem ekstracentrosomów w mitozie) w porównaniu z normalnymi komórkami. Poniżej znajduje się opis krok po kroku procedur obrazowania stosowanych do identyfikacji aktywności cytotoksycznej PJ-34 w ludzkich komórkach nowotworowych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI </td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>41965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS (Surowica bydlęca płodu)</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>12657</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór Pen-Strep-Ampho</td><td>Biological Industries, Izrael</td><td>03-033-1B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>25030-024</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,25% Tripsin-EDTA</td><td>Invitrogen (GIBCO)</td><td>25200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>92 mm szalki Petriego</td><td>Nunc,Thermo scientific</td><td>150350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm naczynia do hodowli ze szkła powlekanego poli-D-lizyną</td><td>MatTek Corporation, USA</td><td>P35GC-0-14-C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do detekcji luminescencyjnej ATP</td><td>Abcam</td><td>ab113849</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NDS (Normalna surowica osła)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty &alfa;-tubulinowe</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>rozcieńczenie 1:250 (IF)</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty &gamma;-tubulinowe</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>rozcieńczenie 1:200 (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td>1:1,000 rozcieńczenie (IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-10042</td><td>1:1,000 rozcieńczenie (IF)</td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcie ProLong Gold z DAPI (mocowanie)</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>JetPEI (odczynnik do transfekcji liposomalnej )</td><td>Polyplus</td><td>101-10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica (Mannheim, Niemcy)</td><td>TCS SP5II</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

Śmierć komórki związana z nieprawidłową mitozą obserwowana przez obrazowanie konfokalne w żywych komórkach rakowych

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Pochodne fenantrenu działające jako silne inhibitory PARP1 zapobiegały dwuogniskowemu grupowaniu nadliczbowych centrosomów w wielocentrosomalnych ludzkich komórkach nowotworowych w mitozie. Fenantrydyna PJ-34 była najsilniejszą cząsteczką. Deklasteryzacja ekstracentrosomów powoduje awarię mitotyczną i śmierć komórki w komórkach wielocentrosomalnych. Większość litych nowotworów u ludzi ma wysokie występowanie ekstracentrosomów. Aktywność PJ-34 została udokumentowana w czasie rzeczywistym poprzez obrazowanie konfokalne żywych ludzkich komórek raka piersi MDA-MB-231 transfekowanych wektorami kodującymi fluorescencyjną γ-tubulinę, która jest bardzo obfita w centrosomach oraz fluorescencyjny histon H2b obecny w chromosomach. W transfekowanych komórkach MDA-MB-231 po leczeniu PJ-34 wykryto nieprawidłowe układy chromosomów i zdegrupowane ogniska γ-tubuliny reprezentujące zdegrupowane centrosomy. Nieskupione extracentrosomy w dwóch biegunach wrzeciona poprzedzały śmierć komórki. Wyniki te po raz pierwszy powiązały niedawno wykrytą wyłączną aktywność cytotoksyczną PJ-34 w ludzkich komórkach nowotworowych z deklasowaniem pozacentrosomów w mitozie i niewydolnością mitotyczną prowadzącą do śmierci komórki. Zgodnie z wcześniejszymi odkryciami zaobserwowanymi przez obrazowanie konfokalne komórek stałych, PJ-34 eliminował wyłącznie komórki rakowe za pomocą wielu centrosomów bez uszczerbku dla normalnych komórek przechodzących mitozę za pomocą dwóch centrosomów i wrzecion dwuogniskowych. Ta cytotoksyczna aktywność PJ-34 nie była wspólna dla innych silnych inhibitorów PARP1 i była obserwowana w MEF z niedoborem PARP1 zawierającym ekstracentrosomy, co sugeruje jego niezależność od hamowania PARP1. Obrazowanie konfokalne na żywo dostarczyło użytecznego narzędzia do identyfikacji nowych cząsteczek eliminujących komórki podczas mitozy.

PJ-34 jest stabilną, rozpuszczalną w wodzie fenantrydyną1 (Rysunek 1). Nasze wcześniejsze wyniki wykazały śmierć komórek oraz rozproszenie dodatkowych centrosomów w kilku typach utrwalonych wielocentrosomalnych komórek nowotworowych traktowanych PJ-34. Z kolei normalne komórki proliferujące nie uległy uszkodzeniu2,3. Centrosomy w utrwalonych komórkach z dodatkowymi centrosomami zidentyfikowano poprzez podwójne znakowanie przeciwciałami skierowanymi przeciwko centrine1 i γ-tubulinie<...

Cytotoksyczna aktywność fenantrydyny PJ-34 w komórkach nowotworowych przechodzących mitozę została udokumentowana w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania konfokalnego na żywo. PJ-34 zlikwidował ludzkiego raka piersi Komórki MDA-MB-231 zawierające extracentrosomy w mitozie. W przeciwieństwie do normalnej dwuogniskowej mitozy, pozacentrosomy nie były skupione w dwóch biegunach wrzeciona w obecności PJ-34.

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest obserwacja efektu cytotoksycznego pochodnej filantrany PJ 34 podczas mitozy w wielojądrzowych komórkach raka ludzkiego. Osiąga się to poprzez znakowanie centrosomów GFP gamma tubuliną oraz chromosomów H2B-RFP za pomocą transfekcji. Celem transfekcji jest umożliwienie śledzenia migracji i grupowania się centrosomów oraz rozmieszczenia chromosomów podczas mitozy w żywych wielojądrzowych komórkach raka.W drugim kroku część transfekowanych komórek poddawano działaniu PJ 34, cząsteczki działającej jako czynnik usuwający nadmiar centrosomów. Następnie żywe transfekowane komórki nowotworowe skanowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zarejestrowania zdarzeń podczas mitozy związanych z migracją centrosomów i chromosomów. Przegrupowanie lub klastrowanie sekwencyjnych obrazów uzyskano, aby wykazać efekty oczyszczające i cytotoksyczne działania PJ 34 w komórkach nowotworowych podczas mitozy na podstawie obrazowania konfokalnego żywych komórek.Zastosowania tej techniki zmierzają w stronę celowanej terapii nowotworowej, która wybiórczo eliminuje autosomalne komórki rakowe podczas mitozy. Technikę tę zaprezentują nasi współpracownicy: dr Asher

cell-death-associated-with-abnormal-mitosis-observed-confocal-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Śmierć komórki związana z nieprawidłowym podziałem obserwowana za pomocą obrazowania konfokalnego w żywych komórkach rakowych

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Używając transgenicznych myszy reporterowych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych, długoterminowa mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem umożliwia bezpośrednią wizualizację zachowania komórek szpikowych w gruczolaku jelitowym w modelu raka jelita grubego ApcMin/+.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki komórek szpikowych w guzach jelita ApcMin/+ za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Ten protokół skutecznie bada podział komórek ssaków w matrycach kolagenowych 3D poprzez integrację synchronizacji podziału komórek, monitorowanie zdarzeń podziału w matrycach 3D za pomocą techniki obrazowania żywych komórek, czasowo-rozdzielczą konfokalną mikroskopię refleksyjną i ilościową analizę obrazowania.

Podział komórek ssaków w matrycach 3D za pomocą ilościowej konfokalnej mikroskopii refleksyjnej

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Obrazowanie żywych komórek dostarcza bogactwa informacji o pojedynczych komórkach lub całych populacjach, które są nieosiągalne przez samo obrazowanie komórek stałych. W tym miejscu opisano protokoły obrazowania żywych komórek w celu oceny decyzji dotyczących losu komórek po leczeniu lekiem antymitotycznym paklitakselem.

Długoterminowe obrazowanie żywych komórek w celu oceny losu komórek w odpowiedzi na paklitaksel

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Tutaj prezentujemy protokół do badania szybkości inicjacji programowanej śmierci komórki poprzez ciągłe obrazowanie zaszczepionych liści po indukcji śmierci komórki.

Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego

Poznaj obserwację śmierci komórek rakowych podczas nieprawidłowej mitozy przy użyciu obrazowania konfokalnego w żywych komórkach. Ta metoda pozwala analizować dynamikę centrosomów w czasie rzeczywistym.

Śmierć komórki związana z nieprawidłową mitozą obserwowana przez obrazowanie konfokalne w żywych komórkach rakowych

Przeglądaj więcej filmów