Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów
26 września 2013
W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.
Ogólnym celem tego zabiegu jest wyizolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z tłuszczu uzyskanego w postaci aspiratu lipo. Osiąga się to poprzez uprzednie usunięcie roztworu chirurgicznego i przemycie aspiratu z zanieczyszczających czerwonych krwinek. Drugim krokiem jest uwolnienie komórek macierzystych poprzez trawienie enzymatyczne przemytego aspiratu lipo z kolagenazą.
Następnie uwolnione komórki w postaci zrębowej frakcji naczyniowej lub SVF są zbierane przez odwirowanie. Ostatnim krokiem jest usunięcie supernatantu i płytki, komórek SVF do selekcji i hodowli przylegających ASC. Ostatecznie indukcja in vitro tych hodowanych ASC w kierunku kości, tłuszczu i chrząstek.
Linie genetyczne można wykorzystać do potwierdzenia obecności tych komórek w hodowli, a także do potwierdzenia ich wielopotencjałowości. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z powodu logistyki pracy z dużymi ilościami lipo aspiryny przed pobraniem komórek. Przygotować sterylny roztwór kolagenazy typu pierwszego i sterylne podłoże kontrolne.
Zbierz aspirat do ust w pojemniku do aspiracji. Ostrożnie zdekantować aspirat lippo do sterylnego szklanego głośnika o pojemności jednego litra. Gdy warstwy aspiratu lippo rozdzielą się grawitacyjnie, odessaj górną warstwę oleju, jeśli jest obecna.
Usuń również dolną inatę. Oceń objętość powstałej warstwy tkanki tłuszczowej. Dodać równą objętość sterylnego XPBS i wymieszać z pipetą używaną do aspiracji.
Gdy obie warstwy opadną, odessać inat za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej. Kontynuuj płukanie frakcji tkanki tłuszczowej PBS, aż warstwa tłuszczowa nabierze koloru żółtego złota. Odessać inat po raz ostatni, pozostawiając frakcję tkanki tłuszczowej.
W szklanym głośniku. Pozwól warstwom aspiratu lipidowego osiąść przez pięć minut po ostatnim myciu i przed ostateczną aspiracją. W jednostce filtrującej przygotuj sterylną kolagenazę jeden z roztworu.
Dodać objętość równą objętości frakcji tłuszczowej i sterylnego filtra. Następnie ostrożnie wlej umytą frakcję tłuszczową do roztworu kolagenazy i szczelnie zamknij butelkę. Następnie inkubuj mieszaninę tłuszczu kolagenazy w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, delikatnie mieszając co pięć do 10 minut, oceń warstwę tkanki tłuszczowej, aby uzyskać gładszy wygląd w miarę postępu trawienia i, jeśli to konieczne, wydłuż czas reakcji, aby rozpuścić wszelkie stałe kawałki tłuszczu.
Wysterylizuj jednostkę filtrującą zawierającą strawioną mieszaninę tłuszczu kolagenazy z 70% etanolem i umieść ją z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Teraz odpipetuj 25 mililitrów podwielokrotności inatu zawierającego frakcję naczyniową zrębu do sterylnych 50-mililitrowych probówek wirówkowych. Dodaj 25 mililitrów pożywki kontrolnej do każdej probówki i inkubuj temperaturę pokojową przez pięć minut, aby dezaktywować kolagenazę.
Następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 1 200 razy G, aby zebrać frakcję naczyniową zrębu w postaci osadu w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Odessać supernatant z każdej probówki. Upewnij się, że górna warstwa oleju i wszelkie pływające adipocyty są zasysane tym supernatantem.
Następnie połącz granulki SVF w jedną probówkę wirówkową za pomocą 30 mililitrów kondycjonowanej pożywki i podziel równo na dwie nowe 50-mililitrowe probówki wirówkowe po odwirowaniu zasysaj supernatanty z dwóch granulek. Jeśli pożądana jest liza RBC, te dwie granulki można ponownie zawiesić w 10 mililitrach buforu do lizy RBC i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu odessać supernatanty, aby uzyskać granulki zrębowej frakcji naczyniowej.
Połącz te dwa granulki w jedną nową probówkę wirówkową. Używając od pięciu do 10 mililitrów pożywki kontrolnej, duże cząstki tkanek można odfiltrować za pomocą filtra siatkowego o wielkości 100 mikronów umieszczonego na nowej 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Teraz podwielokrotność przefiltrowanej frakcji zawierającej tłuszczowe komórki macierzyste należy umieścić na szalkach do hodowli tkankowych.
Następnie uzupełnij każde danie odpowiednią objętością kontroli. Kultura medialna. Komórki przez trzy do czterech dni bez zmiany pożywki odsysają hodowlę, pożywkę i przemywają komórki raz sterylnym PBS w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających czerwonych krwinek, a następnie uzupełniają pożywkę i kontynuują hodowlę przy użyciu tego ręcznego enzymatyku do izolacji zrębu frakcji naczyniowej z próbki aspiratu lippo o dużej objętości.
Uzyskana w ten sposób hodowlana populacja SC A jest stosunkowo jednorodna pod względem wyglądu i składa się z komórek podobnych do fibroblastów, co jest najpopularniejszym sposobem walidacji. Indukcja in vitro populacji A SC przy użyciu określonych warunków hodowli, powoduje ich różnicowanie na linie mezodermalne, ektodermalne i endodermalne. Natomiast potencjał trójlistków zarodkowych in vitro doprowadził do zastosowania ASC w wielu różnych modelowych systemach regeneracyjnych.
Różnicowanie w komórki adipogenne, osteogenne i kongeniczne jest na ogół wystarczające do zidentyfikowania A SC i potwierdzenia jego wielomocnego działania. Ponadto ASC mogą być również różnicowane w szkieletowe komórki linii miogennych i gładkich linii miogennych linii ektodermalnej lub endodermalnej linii komórek wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować frakcję naczyniową zrębu z Lipos.
Na potrzeby Turinga jest to komponent SC.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje izolację mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego (ASCs) z aspiratów tłuszczowych przy użyciu manualnego protokołu trawienia enzymatycznego z wykorzystaniem kolagenazy. Proces obejmuje płukanie aspiratu, trawienie enzymatyczne oraz hodowlę komórek w celu dalszych badań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Medycyna regeneracyjna
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Komórki macierzyste pochodzenia tłuszczowego (ASCs) stanowią obiecujące źródło dla terapii regeneracyjnych.
- ASCs mogą różnicować się w różne typy komórek, w tym w tkankę kostną, tłuszczową i chrzęstną.
- Izolacja ASCs z tkanki tłuszczowej jest kluczowa dla ich zastosowania w badaniach i terapii.
- Wcześniejsze badania ustanowiły metody izolacji ASCs, jednak proces ich optymalizacji wciąż trwa.
Cel badania
- Aby przedstawić szczegółowy protokół izolacji ASC z aspiratów tłuszczowych.
- Aby zwiększyć efektywność izolacji ASC na potrzeby badawcze.
- Aby ułatwić badanie różnicowania ASC oraz ich potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Usunięcie roztworu chirurgicznego i płukanie lipoaspiratu.
- Trawienie enzymatyczne wypłukanego lipoaspiratu za pomocą kolagenazy.
- Wyodrębnienie frakcji naczyniowo-stromalnej (SVF) poprzez wirowanie.
- Wysiew komórek SVF w celu selekcji i hodowli przylegających ASCs.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja ASC z lipoaspiratów przy użyciu opisanego protokołu.
- Uzyskano żywe ASC, które poddano hodowli w celu przeprowadzenia dalszych badań nad różnicowaniem.
- Metoda wykazała skuteczność w usuwaniu zanieczyszczeń i maksymalizacji wydajności komórkowej.
- ASC wykazały potencjał do różnicowania w wiele linii komórkowych in vitro.
Wnioski
- Opisany protokół trawienia enzymatycznego jest skuteczny w izolacji ASC.
- Izolowane ASC mogą być wykorzystywane w różnych zastosowaniach w medycynie regeneracyjnej.
- Dalsze badania są konieczne, aby w pełni zgłębić potencjał ASC w kontekstach terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASCs) z aspiratów tłuszczowych dostarcza skalowalnego źródła komórek multipotencjalnych do wczesnych badań nad medycyną regeneracyjną. Niniejszy protokół umożliwia walidację celu i przesiew fenotypowy w systemach istotnych dla przebiegu choroby poprzez generowanie adherentnych populacji ASC zdolnych do różnicowania wieloliniowego. Metoda ta wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego i zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, dostarczając homogenicznych komórek pochodzących z frakcji naczyniowo-stromo (SVF) do dalszych zastosowań.
Strategiczne Zastosowania w Badaniach i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie heterogeniczności mezenchymalnych komórek macierzystych oraz funkcjonalną walidację multipotencji ASC poprzez zdefiniowane testy różnicowania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną metodę izolacji ASC z ludzkiej tkanki tłuszczowej, co ogranicza zmienność w pozyskiwaniu pierwotnych komórek do badań walidacyjnych celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie adhezyjnych populacji ASC odpowiednich do wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków modulujących szlaki adipogenne, osteogenne lub chondrogenne.
- Wartość operacyjna: Umożliwia otrzymanie osadów frakcji naczyniowo-stromalnej (SVF), które mogą być standaryzowane niezależnie od objętości lipoaspiratu, co wspiera skalowalność testów i powtarzalność wyników między laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Różnicowanie w kierunku linii adipogennej, osteogennej i chondrogennej potwierdza potencjał funkcjonalny, co umożliwia zastosowanie w przedklinicznych modelach regeneracji tkanek.
- Wartość operacyjna: Skalowalna izolacja z dużych objętości lipoaspiratów zapewnia stałe dostawy komórek do podłużnych badań przedklinicznych oraz prac przygotowawczych do wniosku o badanie nowego leku (IND).
Integracja potoku i przepływu pracy
Przepływ pracy izolacji ASC wpisuje się w kontinuum badawcze, od identyfikacji celu po optymalizację wiodących związków, zapewniając odnawialne źródło komórek do analiz mechanistycznych i przesiewów fenotypowych przed walidacją przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących funkcji komórek zrębowych i modulacji szlaków w populacjach mezenchymalnych pochodzenia ludzkiego.
- Przesiewanie: Umożliwia uzyskanie adhezyjnych monowarstw ASC o spójnej morfologii do przesiewania bibliotek związków oraz profilowania odpowiedzi na dawkę.
- Analityka: Umożliwia kwantyfikację wydajności różnicowania za pomocą barwień specyficznych dla linii komórkowych (np. Oil Red O, Alizarin Red) jako ilościowy odczyt efektów działania związków.
- Badania translacyjne: Zdolność do różnicowania w linie mezodermalne zapewnia ciągłość w przejściu do modeli przedklinicznych regeneracji kości, tłuszczu i chrząstki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Adaptacyjność protokołu do różnych objętości lipoaspiratu pozwala na ponowne wykorzystanie w wielu projektach i obszarach terapeutycznych bez konieczności ponownej optymalizacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukcja niejednoznaczności mechanistycznej poprzez zwalidowaną ocenę wielopotencjalności izolowanych ASC.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja trawienia enzymatycznego i etapów płukania minimalizuje zmienność między partiami w uzysku SVF.
- Wartość strategiczna: Świadome decyzje go/no-go oparte na potencjale różnicowania redukują liczbę niepowodzeń na późnych etapach programów regeneracyjnych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja terapii pochodnych z ASC z uwzględnieniem ryzyka, umożliwiona przez wiarygodne wskaźniki potencjalności z różnicowania in vitro.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli pierwotnych komórek oraz techniki sterylnej w celu zachowania żywotności ASC podczas izolacji.
- Metoda zależy od dostępu do sterylnej kolagenazy typu I, komór wyciągowych oraz wirówek chłodzących do przetwarzania SVF.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów płukania w celu uzyskania spójnego zabarwienia tkanki tłuszczowej i całkowitego usunięcia erytrocytów.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie stężenia kolagenazy oraz czasu inkubacji w zależności od gęstości lipoaspiratu i zmienności osobniczej dawców.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność wydajności komórkowej powiązaną z wiekiem dawcy, BMI oraz techniką liposukcji, zgodnie z treścią materiałów źródłowych.
