Name: Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-26T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj ręczną izolację komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów przy użyciu trawienia enzymatycznego kolagenazą. Ta metoda umożliwia uzyskanie żywych ASC do badań w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dodatkowemu personelowi badawczemu, który przyczynił się do opracowania opisanego protokołu i jego izolacji ASC, w tym: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD, Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, MD, Dr Zeni Alfonso i dr John Fraser Zaprezentowane wyniki zostały częściowo sfinansowane z grantów badawczych z National Institutes of Health, w tym z instytutów NIAMS i NIDCR.

<ol><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-lineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).</li>
<li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+isolated+fat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolism of isolated fat cells.</a> J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fat+cell+precursors.+Morphologic+and+metabolic+differentiation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture.</a> Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).</li>
<li>Zuk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+Stem+Cells+in+Tissue+Regeneration%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review.</a> ISRN Stem Cells. , in press (2012).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
<li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).</li>
<li>Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypical+and+functional+characterization+of+freshly+isolated+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells.</a> Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+derived+from+the+fatty+and+fluid+portions+of+liposuction+aspirates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates.</a> J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).</li>
<li>Zannettino, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+human+adipose-derived+stromal+stem+cells+exhibit+a+perivascular+phenotype+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo.</a> J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+potential+of+adipose+stem+cell+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations.</a> Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).</li>
<li>Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stem+cells+subpopulations+isolated+from+human+adipose+tissue+exhibit+different+chondrogenic+and+osteogenic+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential.</a> Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).</li>
<li>Heydarkhan-Hagvall, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Adipose+Stem+Cells%3A+A+Potential+Cell+Source+for+Cardiovascular+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering.</a> Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).</li>
<li>Jack, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processed+lipoaspirate+cells+for+tissue+engineering+of+the+lower+urinary+tract%3A+implications+for+the+treatment+of+stress+urinary+incontinence+and+bladder+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction.</a> J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).</li>
<li>Banas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+hepatic+fate+specification+of+adipose-derived+stem+cells+and+their+therapeutic+potential+for+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure.</a> J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).</li>
<li>Schreml, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+human+adipose+tissue-derived+adult+stem+cells%3A+resection+versus+liposuction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction.</a> Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).</li>
<li>Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+yield+and+growth+characteristics+are+affected+by+the+tissue-harvesting+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure.</a> Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).</li>
<li>Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+American+Society+for+Aesthetic+Plastic+Surgery+%28ASAPS%29+survey%3A+current+trends+in+liposuction%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthet+Surg+J%22%5BJournal%5D)">The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction.</a> Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).</li>
<li>Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+tumescent+and+laser-assisted+liposuction%3A+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drugs+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature.</a> J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).</li>
<li>Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+negative+pressure+when+harvesting+adipose+tissue+on+cell+yield+of+the+stromal-vascular+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater+Eng%22%5BJournal%5D)">Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction.</a> Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).</li>
<li>Matsumoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+preservation+at+various+temperatures+on+liposuction+aspirates%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates.</a> Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).</li>
<li>Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+from+lipoaspirate+blood+and+saline+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction.</a> Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).</li>
<li>Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stromal+stem+cells+from+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue.</a> Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).</li>
<li>Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
<li>Dubois, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+adipose-derived+stem+cells+from+biopsies+and+liposuction+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens.</a> Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).</li>
<li>Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow+and+adipose+tissue+mesenchymal+stem+cells%3A+a+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide.</a> Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).</li>
<li>Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+growth+of+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells.</a> Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).</li>
<li>Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+lot+selection+and+purification+for+adipose+tissue+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion.</a> Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).</li>
<li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li>
<li>Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+highly+defined+proteases+for+the+isolation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells.</a> Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+centrifugation+on+cells+and+tissues+in+liposuction+aspirates%3A+optimized+centrifugation+for+lipotransfer+and+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation.</a> Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).</li>
<li>Poloni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dedifferentiated+adipocytes+show+similar+properties+to+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).</li>
<li>D'Andrea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+production+of+human+adipose+tissue+from+stem+cells%3A+a+new+tool+for+regenerative+medicine+and+tissue+banking%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking.</a> Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).</li>
<li>Tallone, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+adipose+tissue+contains+several+types+of+multipotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells.</a> J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).</li>
<li>De Francesco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD34%2FCD90+ASCs+are+capable+of+growing+as+sphere+clusters%2C+producing+high+levels+of+VEGF+and+forming+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries.</a> PLoS One. 4 (8), e6537(2009).</li>
<li>Haasters, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+immunocytochemical+characteristics+indicate+the+yield+of+early+progenitors+and+represent+a+quality+control+for+human+mesenchymal+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing.</a> J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).</li>
</ol>

Autorzy tego manuskryptu są współwynalazcami patentu należącego do Regentów Uniwersytetu Kalifornijskiego i licencjonowanego przez Cytori Therapeutics.

Tkanka tłuszczowa do izolacji ASC może występować w wielu formach: od stałych kawałków tkanki uzyskanych w wyniku resekcji lub lipoplastyki do mniejszych fragmentów uzyskanych w wyniku ekstrakcji strzykawką lub lipoplastyki wspomaganej ssaniem (tj. liposukcji ). To, czy można uzyskać więcej komórek SVF (a tym samym ASC) z wyciętych lub odessanych próbek tłuszczu, jest niejasne, ponieważ przedstawiono sprzeczne badania 16, 17. Możliwe, że każda forma tkanki tłuszczowej jest więcej niż odpowiednia do iz...

W 2001 roku, przypuszczalna populacja multipotencjalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej została opisana w czasopiśmie Tissue Engineering 1. Komórkom tym nadano nazwę Przetworzone komórki lipoaspiratu lub komórki PLA ze względu na ich pochodzenie z przetworzonej tkanki lipoaspiratu uzyskanej za pomocą chirurgii plastycznej. Opisana w artykule metoda izolacji została oparta na istniejących strategiach enzymatycznych izolacji frakcji zrębowej naczyniowej (SVF) z tkanki tłuszczowej 2. SVF został zdefiniowany jako minimalnie przetworzona populacja czerwonych krwinek, fibroblastów, komórek śródbłonka, komórek mięśni gładkich, perycytów i preadipocytów, które nie przylgnęły jeszcze do substratu do hodowli tkankowej 2, 3. Proponuje się hodowlę tego SVF w czasie w celu wyeliminowania wielu z tych zanieczyszczających populacji komórek i uzyskania przylegającej populacji fibroblastów. Te fibroblasty zostały zidentyfikowane w literaturze w ciągu ostatnich 40 lat jako preadipocyty. Jednak nasza grupa badawcza wykazała, że komórki te posiadały mezodermalną multipotencję i przemianowała przylegającą populację SVF na komórki PLA. Późniejsze badania przeprowadzone przez wiele innych grup badawczych zwiększyły ten potencjał, sugerując zarówno potencjał endodermalny, jak i ektodermalny (przegląd patrz 4). Od tego czasu w literaturze pojawiło się wiele dodatkowych określeń na te komórki. Aby zapewnić pewien rodzaj konsensusu, termin komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ang. Tłuszczowe Komórki Macierzyste) został przyjęty nadrugiej dorocznej konferencji IFATS. W związku z tym termin ASC będzie używany w tym artykule. 
Protokół opisany w tym artykule jest stosunkowo prostą procedurą, która wymaga standardowego sprzętu laboratoryjnego i wykorzystuje proste odczynniki, takie jak sól fizjologiczna buforowana fosfo, standardowe odczynniki do hodowli tkankowych i kolagenaza. Może wytwarzać dużą liczbę ASC w zależności od ilości wyjściowej objętości tkanki tłuszczowej i późniejszego czasu hodowli. Jednak przetwarzanie tak dużej ilości tkanki tłuszczowej może stwarzać pewne problemy fizyczne, które można w pewnym stopniu złagodzić za pomocą tego protokołu. Ponadto protokół ten wymaga sterylnych urządzeń do hodowli tkankowych i zatwierdzonych kapturów bezpieczeństwa biologicznego, co wymaga korzystania z zatwierdzonego zakładu hodowli tkankowej. Wymóg ten może również zmniejszyć użyteczność populacji ASC w zastosowaniach klinicznych, chyba że są one izolowane w obiektach zatwierdzonych przez Dobrą Praktykę Wytwarzania (GMP) przeznaczonych do izolacji i rozszerzania materiałów do użytku klinicznego. Alternatywnie, zautomatyzowane systemy, które mogą izolować ASC w systemie zamkniętym na sali operacyjnej, pozwoliłyby uniknąć tego kluczowego problemu i pozwoliłyby na natychmiastowe użycie ASC bez konieczności późniejszej ekspansji in vitro. Do tej pory na rynku dostępnych jest sześć zautomatyzowanych systemów do izolacji komórek z tkanek ludzkich. Systemy te mogą umożliwić wyizolowanie znacznej liczby ASCs z dużych ilości tkanki tłuszczowej bezpośrednio po jej pobraniu. Te ASC mogą być następnie ponownie wprowadzone do pacjenta w różnych celach regeneracyjnych bez konieczności opuszczania przez pacjenta sali operacyjnej. Oprócz tego protokołu opisującego ręczną izolację ASC, w artykule towarzyszącym podano również protokół automatycznej izolacji ASC za pomocą Systemu Celution.

<table><tbody><tr><td colspan="4">odczynnik</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#8217; s Modyfikacja Eagle&#8217; s Medium)</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>z 4,5 g/ml glukozy, L-glutaminą, pirogronianem sodu</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>10 000 j.m./ml penicyliny/10 000 &#956; g/ml streptomycyny</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>30-003-CF</td><td>250 &#956; g/ml amfoterycyny B</td></tr><tr><td>10X PBS (sól fizjologiczna buforowana fosfo</td>)<td>Mediatech Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>bez wapnia, bez magnezu</td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Mediatech Cellgro</td><td>20-031-CV</td><td>0,25 % trypsyna/2,21 mM EDTA</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IA (z Clostridium histolyticum)</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>preparat surowy; < 125 jednostek trawienia kolagenu/mg stałe</td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca) inaktywowane termicznie</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100106</td><td>źródło USDA, inaktywowane termicznie </td></tr><tr><td>10 ml pipety serologiczne</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 25 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowe probówki</td> wirówkowe <td>Genesee Scientific</td><td>21-106</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowych 100 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowych 150 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Jednostki filtrujące Stericup</td><td>Membrana Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>PES, 0,22 i #956; m pore</td></tr><tr><td>Sitka komórkowe</td><td>FisherBrand</td><td>22-363-549</td><td>100 &#956; m siatka nylonowa</td></tr><tr><td>deksametazon - rozpuszczalna w wodzie</td><td>Sigma</td><td>D-2915</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbinowy kwas 2 fosforan</td><td>Sigma</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-glicerofosforan sól disodowa </td><td>Sigma</td><td>G-9422</td><td>znana również jako glicerofosforan</td></tr><tr><td>insuliny</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td>wytwarzana z trzustki bydlęcej</td></tr><tr><td>indometacyna</td><td>Sigma</td><td>I-7378</td><td></td></tr><tr><td>apo-transferyna</td><td>Sigma</td><td>T-4382</td><td></td></tr><tr><td>TGF&#946; 1</td><td>R& D Systems</td><td>240-B-002</td><td>rekombinowany olej ludzki</td></tr><tr><td>Red O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Sigma</td><td>A-5268</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>Sigma</td><td>S-0319</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>dostarczany jako zapas</td></tr> <tr>16%<td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Potrzebny sprzęt</silny> </td></tr><tr><td>Kaptur bezpieczeństwa biologicznego klasy II A/B</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>zapewnia, że okap posiada przewody próżniowe do aspiracji</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Hermle Labnet</td><td>Z383</td><td>Wymagany odchylany rotor do probówek 50 ml, zdolny do kąpieli wodnej 1200xg</td></tr><tr><td>Fisher </td><td>Scientific Isotemp</td><td>S52602Q</td><td>pojemności 5-10L, o pojemności 37C</td></tr><tr><td>Automatyczne pomoce do pipet</td><td>Drummond Pipette Aid XL</td><td>4-000-105</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Forma 310</td><td>z bezpośrednim ciepłem lub płaszczem wodnym</td></tr></tbody></table>

ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

W 2001 roku naukowcy z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles opisali izolację nowej populacji dorosłych komórek macierzystych z liposukcyjnej tkanki tłuszczowej, którą początkowo nazwali Przetworzonymi Komórkami Lipoaspiratu lub komórkami PLA. Od tego czasu te komórki macierzyste zostały przemianowane na komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC i stały się jedną z najpopularniejszych populacji dorosłych komórek macierzystych w dziedzinie badań nad komórkami macierzystymi i medycyny regeneracyjnej. Tysiące artykułów opisuje zastosowanie ASC w różnych regeneracyjnych modelach zwierzęcych, w tym w regeneracji kości, naprawie nerwów obwodowych i inżynierii sercowo-naczyniowej. Ostatnie artykuły zaczęły opisywać niezliczone zastosowania ASC w klinice. Protokół przedstawiony w tym artykule przedstawia podstawową procedurę ręcznego i enzymatycznego izolowania ASC z dużych ilości lipoaspiratów uzyskanych z zabiegów kosmetycznych. Protokół ten można łatwo skalować w górę lub w dół, aby dostosować się do objętości lipoaspiratu i można go dostosować do izolacji ASC z tkanki tłuszczowej uzyskanej w wyniku plastyki brzucha i innych podobnych procedur.

Powyższy zarys protokołu opisuje manualną, enzymatyczną metodę izolacji SVF z dużej objętości próbki lipoaspiratu. W obrębie SVF znajduje się liczne populacje komórek, w tym ASC. Wiele badań sugeruje, że hodowla SVF w standardowych warunkach hodowli tkankowych pozwoli na wyselekcjonowanie adherentnej populacji fibroblastów, która prawdopodobnie składa się głównie z komórek typu ASC. Zgodnie z tym wykazaliśmy, stosując cytometrię przepływową i immunofluorescencję, że hodowane granulaty SVF stają się w zasadzie wolne od ...

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z tłuszczu uzyskanego w formie aspiratu z liposukcji. Osiąga się to najpierw poprzez usunięcie roztworu chirurgicznego i wypłukanie z aspiratu zanieczyszczających go erytrocytów. Drugim krokiem jest uwolnienie komórek macierzystych poprzez trawienie enzymatyczne wypłukanego aspiratu z liposukcji za pomocą kolagenazy.Następnie uwolnione komórki w postaci frakcji naczyniowo-stromalnej (SVF) są zbierane poprzez wirowanie. Ostatnim krokiem jest usunięcie supernatantu i wysianie komórek SVF w celu wyselekcjonowania i hodowli przylegających ASC. Ostatecznie przeprowadza się indukcję in vitro tych hodowlanych ASC w kierunku tkanki kostnej, tłuszczowej i chrzestnej.Linie komórkowe mogą być wykorzystane do potwierdzenia obecności tych komórek w hodowli, a także do potwierdzenia ich wielopotencjalności. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na kwestie logistyczne związane z operowaniem dużymi objętościami aspiratu tłuszczowego przed zbiorem komórek. Należy przygotować sterylny roztwór kolagenazy typu I oraz sterylne medium kontrolne.Zebrać aspirat tłuszczowy do pojemnika do aspiracji. Ostrożnie przelać aspirat tłuszczowy do sterylnego, jednolitrowego szklanego naczynia. Po rozdzieleniu się warstw aspiratu tłuszczowego pod wpływem grawitacji, odessać górną warstwę tłuszczu, jeśli jest obecna.Następnie usuń dolny osad. Oceń objętość powstałej warstwy tkanki tłuszczowej. Dodaj taką samą objętość sterylnego 1x PBS i wymieszaj za pomocą pipety użytej do aspiracji.Po rozdzieleniu się obu warstw, odessać nadsącz za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Kontynuować płukanie frakcji tkanki tłuszczowej w PBS, aż warstwa tłuszczowa uzyska żółtozłoty kolor. Odessać nadsącz po raz ostatni, pozostawiając frakcję tkanki tłuszczowej.W szklanym kolbie. Pozostaw warstwy aspiratu tłuszczowego na pięć minut po ostatnim płukaniu i przed końcowym odessaniem. W jednostce filtrującej przygotuj sterylny roztwór kolagenazy typu I.Dodać objętość równą objętości frakcji tłuszczowej i przefiltrować sterylnie. Następnie ostrożnie przelać wypłukaną frakcję tłuszczową do roztworu kolagenazy i szczelnie zamknąć butelkę. Następnie inkubować mieszaninę kolagenazy i tkanki tłuszczowej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut, delikatnie mieszając co 5 do 10 minut; w miarę postępu trawienia oceniać warstwę tkanki tłuszczowej pod kątem uzyskania bardziej jednorodnego wyglądu i w razie potrzeby wydłużyć czas reakcji, aby rozpuścić wszelkie stałe fragmenty tłuszczu.Zdezynfekuj jednostkę filtrującą zawierającą trawioną mieszaninę tkanki tłuszczowej z kolagenazą 70% ethanol i umieść ją z powrotem w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie pipetuj 25 mililitrowe alikwoty zawiesiny zawierającej frakcję naczyniowo-stromalną do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 50 mililitrów. Do każdej probówki dodaj 25 mililitrów pożywki kontrolnej i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby dezaktywować kolagenazę.Następnie odwiruj próbki przez 10 minut przy 1 200 ×g w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zebrać frakcję naczyniowo-stromalną w formie osadu. Odessaj nadsącz z każdej probówki. Upewnij się, że górna warstwa tłuszczu oraz wszelkie pływające adipocyty zostały odessane wraz z nadsączem.Następnie połącz osady SVF w jednej probówce do wirowania, używając 30 ml pożywki kondycjonowanej, i podziel je równo pomiędzy dwie nowe probówki do wirowania o pojemności 50 ml; po odwirowaniu odessij nadsącz z obu osadów. Jeśli wymagana jest liza RBC, oba osady można zawiesić w 10 ml buforu do lizy RBC i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu odessij nadsącz, aby otrzymać osady frakcji naczyniowo-stromalnej.Połącz te dwa osady w jednej nowej probówce do wirowania. Wykorzystując od 5 do 10 mililitrów medium kontrolnego, duże cząstki tkanek można odfiltrować, używając filtra siatkowego o rozmiarze 100 mikronów umieszczonego na nowej probówce do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Następnie podziel przefiltrowaną frakcję zawierającą mezenchymalne komórki macierzyste z tkanki tłuszczowej na naczynia hodowlane.Następnie uzupełnij każdą szalkę odpowiednią objętością pożywki kontrolnej. Hoduj komórki przez trzy do czterech dni bez wymiany pożywki, po czym odessij pożywkę hodowlaną i przemyj komórki raz sterylnym PBS, aby usunąć zanieczyszczające je erytrocyty, a następnie uzupełnij pożywkę i kontynuuj hodowlę, stosując tę metodę enzymatyczną do izolacji frakcji naczyniowo-stromalnej z dużej objętości próbki lipoaspiratu.Otrzymana populacja hodowlana A SC jest stosunkowo jednorodna pod względem wyglądu i składa się z komórek przypominających fibroblasty, co stanowi najpowszechniejszy sposób walidacji. Indukcja in vitro populacji A SC przy użyciu określonych warunków hodowlanych prowadzi do ich różnicowania w linie mezo- dermalne, ektodermalne i endodermalne. Potencjał tworzenia trzech listek zarodkowych in vitro sprawił, że ASC są wykorzystywane w szerokiej gamie regeneracyjnych systemów modelowych.Różnicowanie w kierunku adipogennego, osteogennego i chondrogennego jest zazwyczaj wystarczające do zidentyfikowania ASC i potwierdzenia ich wielopotencjalności. Ponadto ASC mogą być różnicowane w kierunku linii miogennych szkieletowych i gładkich, komórek linii ektodermalnej lub linii komórek wątrobowych endodermalnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować frakcję naczyniowo-stromalną z liposukcjatów.Z punktu widzenia Turinga jest to komponent SC.

manual-isolation-adipose-derived-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja ręczna komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego z ludzkich lipoaspirów

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania frakcji naczyniowej zrębu z tkanki tłuszczowej poprzez szereg procesów mechanicznych, które obejmują emulgację i wielokrotne wirowanie.

Mikronizacja mechaniczna lipoaspiratów w terapii regeneracyjnej

Precyzyjne ujawnienie metod i protokołów jest kluczowe dla powszechnego stosowania terapii komórkami macierzystymi. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji komórek regeneracyjnych pochodzących z tkanki tłuszczowej, stosowany do pojedynczego wstrzyknięcia do ciał jamistych w leczeniu zaburzeń erekcji (ED) po radykalnej prostatektomii (RP).

Izolacja komórek regeneracyjnych pochodzących z tkanki tłuszczowej w leczeniu zaburzeń erekcji po radykalnej prostatektomii

Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.

Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Tutaj prezentujemy mikrofragmentację ludzkiej tkanki tłuszczowej bez enzymów przy użyciu urządzenia systemu zamkniętego. Ta nowa metoda pozwala na uzyskanie submilimetrowych skupisk tkanki tłuszczowej nadających się do przeszczepu in vivo, hodowli in vitro oraz dalszej izolacji i charakterystyki komórek.

Mikrofragmentacja ludzkiej tkanki tłuszczowej do fenotypowania komórek i charakterystyki sekretomu

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj ręczną izolację komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów przy użyciu trawienia enzymatycznego kolagenazą. Ta metoda umożliwia uzyskanie żywych ASC do badań w medycynie regeneracyjnej.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Przeglądaj więcej filmów