Izolacja, oczyszczanie i znakowanie neutrofili szpiku kostnego myszy do badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i znakowanie neutrofili z szpiku kostnego myszy do późniejszych badań funkcjonalnych oraz eksperymentów z transferem adopcyjnym. Jest to realizowane poprzez wstępne pobranie komórek szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych myszy. W drugim etapie erytrocyty są poddawane lizie osmotycznej poprzez sekwencyjne zawieszenie ich odpowiednio w 0.2% i 1.6% roztworach chlorku sodu.

Następnie neutrofile są izolowane za pomocą centryfugacji w gradiencie gęstości. W ostatnim kroku neutrofile są znakowane barwnikami cell tracker. Ostatecznie można wykorzystać cytometrię przepływową do określenia liczby adoptywnie przeniesionych neutrofili zrekrutowanych do różnych tkanek myszy.

Główną zaletą izolowania neutrofili mysich z szpiku kostnego w porównaniu do krwi lub otrzewnej jest możliwość uzyskania dużej liczby komórek, wystarczającej do dalszych badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adopcyjnym, zarówno w stanie spoczynku, jak i po infekcji. Przewagą zastosowania techniki wirowania w gradiencie do izolacji neutrofili mysich nad immunomagnetyczną selekcją lub sortowaniem komórek aktywowanych fluorescencją jest szybkość, ekonomiczność oraz uniknięcie znakowania neutrofili przeciwciałami, które mogłyby wywołać ich aktywację. Procedurę zaprezentuje muca swami, technik z mojego laboratorium, po spryskaniu uśpionej myszy 70% ethanol.

Wykonaj nacięcie skóry zwierzęcia w okolicy środkowej brzucha, a następnie usuń tkankę skórną z dystalnej części ciała, obejmując kończyny dolne. Następnie za pomocą nożyczek odetnij mięśnie z kończyn tylnych zwierzęcia i ostrożnie zwichnij kość udową w stawie biodrowym, unikając złamania głowy kości udowej. Następnie użyj nożyczek oraz skalpela, aby usunąć pozostałe mięśnie z kości udowej i piszczelowej.

Oddziel kości kończyn w stawie kolanowym, dbając o to, aby nie uszkodzić końców kości, a następnie umieść kości w szalce Petriego zawierającej lodowate pożywkę RPMI 1 6 4 oh. Uzupełnij o FBS i antybiotyki. Przenieś szalkę do komory z laminarnym przepływem powietrza, a następnie wysterylizuj zewnętrzną powierzchnię każdej kości za pomocą 70% etanolu w nowej szalce Petriego.

Po około 10 do 15 sekundach wypłucz etanol z powierzchni każdej kości, wykonując trzy kolejne płukania w lodowatym, sterylnym PBS. Następnie odetnij nasadę każdej z kości i umieść ją w nowej sterylnej szalce Petriego. W następnej kolejności przymocuj igłę o rozmiarze 25 G do strzykawki o pojemności 12 cc wypełnionej 10 mililitrami RPMI.

Uzupełnić o FBS i EDTA. Następnie wypłukać komórki szpiku kostnego z obu końców trzonu każdej pary kości udowej i piszczelowej do probówki Falcon o pojemności 50 ml z nakrętką, wyposażonej w filtr 100 µm w celu usunięcia wszystkich komórek. Zeskrobać wewnętrzne powierzchnie kości końcówką igły.

Gdy kości będą miały wybielony wygląd, oznacza to, że komórki zostały w wystarczającym stopniu usunięte. Teraz należy użyć skalpela, aby pociąć nasady kości na małe kawałki o wielkości od 0,5 do 1 mm, a następnie za pomocą tylnego końca końcówki BioPure do pipety o pojemności 2,5 ml rozgnieść je przez filtr 100 µm. Po odwirowaniu zebranych komórek przez 7 minut przy 427 ×g w temperaturze 4°C, należy przepłukać erytrocyty w 20 ml 0,2% NaCl przez około 20 sekund.

Następnie należy przerwać lizę, dodając 20 ml 1,6% chlorku sodu, odwirować komórki, a następnie resuspendować osad w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o FBS i EDTA. Należy policzyć komórki, a po ponownym odwirowaniu resuspendować wypłukany osad w stężeniu nieprzekraczającym 100 × 10⁶ komórek na 1 ml lodowatego, sterylnego PBS. Teraz należy odmierzyć 3 ml buforu HEPES 1119 o temperaturze od 18 do 26 °C do probówki stożkowej o pojemności 15 ml, a następnie powoli nanieść 3 ml cieczy o temperaturze od 18 do 26 °C.

Histopaque 1077. Aby uniknąć wymieszania obu gęstości bezpośrednio po przygotowaniu, ostrożnie nanieś zawiesinę komórek szpiku kostnego na wierzch warstwy Histopaque 1077. Odwiruj gradient gęstości przez 30 minut przy 834 ×g i 25 °C bez hamowania, a następnie zbierz neutrofile z granicy warstw Histopaque 1119 i 1077. Po dwukrotnym przemyciu zebranych neutrofili w medium RPMI 1640 z FBS i antybiotykami, resuspenduj komórki w stężeniu 5 × 10⁶ komórek/mL w PBS wstępnie ogrzanym do 37 °C.

Po policzeniu komórek należy odstawić małą alikwot każdą próbkę eksperymentalną w celu oznaczenia czystości i żywotności za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie pozostałe neutrofile znakować barwnikiem Cell Tracker w stężeniu końcowym 5 µM przez 10 minut w 37 °C w wytrząsanej łaźni wodnej w ciemności. Na koniec komórki należy przemyć dwukrotnie lodowatym medium RPMI 1640 uzupełnionym o FBS i antybiotyki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego barwnikiem przed zmieszaniem różnie znakowanych populacji neutrofili do dalszych badań nad konkurencyjną repopulacją; w tym panelu przedstawiono reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej dla neutrofili wyizolowanych z szpiku kostnego metodą gradientu gęstości od niezakażonej myszy C57BL/6. Początkowe bramkowanie zastosowano dla komórek szpiku kostnego zebranych z granicy faz Histopaque 1119 i Histopaque 1077.

Z wykorzystaniem rozproszenia przedniego i bocznego wykazano, że neutrophils oddzielone metodą gradientu gęstości charakteryzują się czystością powyżej 90% i żywotnością powyżej 95% przez co najmniej cztery godziny po transferze adopcyjnym. Neutrophils znakowane barwnikiem CellTracker DIA można śledzić metodą cytometrii przepływowej w różnych tkankach mysich. Na przykład w krwi, szpiku kostnym i nerkach myszy C 57 black six zakażonej Candida, użytej w tym eksperymencie, poprzez bramkowanie żywych komórek CD 45 LY six G CD 11 B, te reprezentatywne, przeniesione adopcyjnie neutrophils znakowane C-M-T-M-R można odróżnić od natywnych neutrophils myszy biorcy, które są negatywne pod kątem C-M-T-M-R i PE, na podstawie ekspresji PE.

Po opanowaniu techniki izolacja i znakowanie neutrofili z szpiku kostnego myszy mogą zostać przeprowadzone w ciągu trzech godzin.