Izolacja, oczyszczanie i znakowanie neutrofili szpiku kostnego myszy do badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i znakowanie neutrofili ze szpiku kostnego myszy w celu przeprowadzenia dalszych badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw komórek szpiku kostnego od myszy, kości udowych i piszczeli. W drugim etapie czerwone krwinki są osmotycznie splecione poprzez sekwencyjne zawieszenie ich odpowiednio w 0,2% i 1,6% roztworach chlorku sodu.

Następnie neutrofile są izolowane przez wirowanie w gradiencie gęstości. W ostatnim etapie neutrofile są znakowane barwnikami śledzącymi komórki. Ostatecznie cytometria przepływowa może być wykorzystana do określenia liczby adoptywnie przenoszonych neutrofili rekrutowanych do różnych tkanek myszy.

Główną zaletą izolowania mysich neutrofili ze szpiku kostnego nad krwią lub otrzewną jest to, że ze szpiku kostnego można uzyskać dużą liczbę komórek wystarczającą do dalszych badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym zarówno w stanie stacjonarnym, jak i po zakażeniu. Zaletą stosowania techniki wirowania gradientowego do izolowania neutrofili myszy w porównaniu z immunomagnetyczną selekcją sortowania komórek aktywowanego fluorescencją jest to, że jest ona szybka, ekonomiczna i pozwala uniknąć znakowania neutrofili przeciwciałami, które mogą indukować aktywację neutrofili. Procedurę zademonstruje muca swami us, technik z mojego laboratorium po spryskaniu uśpionej myszy 70% etanolem.

Wykonać nacięcie w środkowej części brzucha skóry zwierzęcia, a następnie usunąć tkankę skórną z dystalnej części zwierzęcia, w tym z kończyn dolnych. Następnie za pomocą nożyczek odetnij mięśnie tylnych kończyn zwierzęcia, a następnie ostrożnie zwichnij ACE beum ze stawu biodrowego, unikając złamania głowy kości udowej. Następnie użyj nożyczek w skalpelu, aby usunąć pozostały mięsień z kości udowej i piszczelowej.

Oddziel kości nóg w stawie kolanowym, uważając, aby nie złamać końców kości, a następnie umieść kości na szalce Petriego zawierającej lodowaty RPMI 1 6 4 oh. Suplement z FBS i antybiotykami. Przenieś naczynie do okapu do hodowli tkankowej, a następnie wysterylizuj zewnętrzną stronę każdej kości za pomocą 70% etanolu na nowej szalce Petriego.

Po około 10 do 15 sekundach spłucz etanol z powierzchni każdej kości, trzykrotnie przemywając ją w lodowato, sterylnym PBS. Następnie odetnij i umieść nasadę z każdej z kości na nowej sterylnej szalce Petriego. Następnie podłącz igłę o rozmiarze 25 do strzykawki o pojemności 12 cm3 wypełnionej 10 mililitrami RPMI.

Uzupełnienie z FBS i EDTA. Następnie przepłucz komórki szpiku kostnego z obu końców trzonu każdej pary kości piszczelowej kości udowej na 50-mililitrową rurkę Falcona z zakręcaną górną rurką Falcona wyblakłą z filtrem 100 mikrometrów, aby usunąć wszystkie komórki. Zeskrobać wewnętrzne powierzchnie kości końcówką igły.

Kiedy kości wydają się zblanszowane, oznacza to, że komórki zostały wystarczająco usunięte. Teraz użyj skalpela, aby pociąć nasady kości na małe kawałki Q o wielkości od 0,5 do jednego milimetra, a następnie użyj tylnego końca 2,5-mililitrowej końcówki grzebienia einor i końcówki pipety BioPure, aby przebić je przez filtr o średnicy 100 mikrometrów. Po odwirowaniu pobranych komórek przez siedem minut w temperaturze 427 razy G i czterech stopniach Celsjusza, czerwone krwinki w 20 mililitrach 0,2% chlorku sodu przez około 20 sekund.

Następnie przerwij lizę za pomocą 20 mililitrów 1,6% chlorku sodu, odwiruj komórki, a następnie ponownie zawieś osad w suplemencie RPMI 1 6 4 oh z FBS i EDTA. Policz komórki, a następnie po ponownym ich odwirowaniu, ponownie zawieś umytą osadkę w ilości nie większej niż 100 razy 10 do sześciu komórek na jeden mililitr lodu. Zimny sterylny PBS Teraz dozuj trzy mililitry od 18 do 26 stopni Celsjusza, jego nieprzezroczyste 1 1 1 9 do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów, a następnie powoli nakładaj trzy mililitry od 18 do 26 stopni Celsjusza.

Jego nieprzezroczysty 1 0 7 7. Unikając mieszania dwóch gęstości natychmiast po przygotowaniu jego nieprzezroczystego, ostrożnie ułóż zawiesinę komórek szpiku kostnego na wierzchu jego nieprzezroczystej wirówki 1 0 7 7, gradient gęstości przez 30 minut w temperaturze 834 razy G i 25 stopni Celsjusza bez przerwy, a następnie zbierz neutrofile na granicy nieprzezroczystych warstw 1 1 1 9 i 1 0 7 7. Po dwukrotnym umyciu zebranych neutrofili w RPMI 1, 6, 4 oh FBS i antybiotykach, Resus zawiesił komórki na pięć razy od 10 do sześciu komórek na mililitr w PBS Rozgrzej do 37 stopni Celsjusza.

Po zliczeniu komórek należy zarezerwować małą porcję każdej próbki doświadczalnej w celu określenia czystości i żywotności za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie oznaczyć pozostałe neutrofile barwnikiem śledzącym komórki o końcowym stężeniu pięciu mikromolowców przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsającej łaźni wodnej w ciemności. Na koniec umyj komórki dwukrotnie lodowatym suplementem RPMI 1 6 4 oh z FBS i antybiotykami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego barwnikiem przed zmieszaniem różnicowo znakowanych populacji neutrofili do dalszych konkurencyjnych badań populacyjnych Tutaj pokazano reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej izolowanego gradientu gęstości szpiku kostnego oddzielonych neutrofilami od niezakażonej myszy C 57 Black Six. Początkowe bramkowanie stosowane dla komórek szpiku kostnego pobranych z granicy faz histopatii 1 1 1 9 i histopaty 1 0 7 7.

Za pomocą rozproszenia do przodu i z boku wykazano, że neutrofile oddzielone gradientem gęstości mają czystość większą niż 90% i większą niż 95% żywotność przez co najmniej cztery godziny po adoptywnym śledzeniu komórek transferowych. Neutrofile oznaczone znakiem DIA mogą być śledzone za pomocą cytometrii przepływowej w różnych problemach u myszy. Na przykład, we krwi, szpiku kostnym i nerkach biorcy zakażonej Candida czarnej myszy C 57 Black Six pokazanej w tym eksperymencie przez bramkowanie na żywych komórkach B CD 45 LY sześciu G CD 11, te reprezentatywne, adoptywnie przeniesione neutrofile znakowane C-M-T-M-R można odróżnić od natywnych neutrofili C-M-T-M-R i PE-ujemnych myszy biorcy na podstawie ich ekspresji PE.

Po opanowaniu izolacji i znakowania neutrofili w szpiku kostnym myszy można zakończyć w ciągu trzech godzin.