Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wprowadzenie pojedynczej informatywnej sondy do docelowych receptorów sprzężonych z białkiem G, aby ułatwić badania strukturalne i dynamiczne kompleksów sygnalizacyjnych. Osiąga się to poprzez transfekcję komórek plazmidami niezbędnymi do ekspresji aparatu translacyjnego wymaganego do wbudowania nienaturalnego aminokwasu zeto, fenyloalaniny lub zeto fee do ekspresowanego GPCR. Wariant GPCR zeto fee można następnie zastosować na trzy różne sposoby w celu zbadania struktury i funkcji receptora.

W pierwszej kolejności zeto fee jest wykorzystywane jako fotoaktywacyjny czynnik sieciujący w GPCR, co umożliwia identyfikację miejsca wiązania ligandu trytowanego. Następnie zeto fee może służyć jako reaktywny uchwyt chemiczny w celu przyłączenia koniugatu peptydowego lub sondy fluorescencyjnej do GPCR za pomocą bioortogonalnych metod znakowania chemicznego. Uzyskane wyniki wykazują zastosowanie sondy molekularnej zeto fee w ukierunkowanym fotousieciowaniu, ukierunkowanym znakowaniu epitopów oraz znakowaniu fluorescencyjnym GPCR w oparciu o metody biochemiczne i badania na żywych komórkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie ligandów fotoafinitywnych lub znakowanie cysteiną, jest możliwość specyficznego wprowadzenia w konkretne miejsce biologicznie obojętnego i reaktywnego nienaturalnego aminokwasu P zeto fenyloalaniny w znanej pozycji w receptorze docelowym.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji GPCR, w tym w mapowaniu miejsc oddziaływań w kompleksie receptor-ligand w naturalnym środowisku błonowym oraz w ułatwieniu badań fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek poprzez identyfikację pozycji w GPCR podatnych na znakowanie bioortogonalne. Po trzecie, metoda ta może dostarczyć wglądu w molekularny mechanizm receptorów sprzężonych z białkiem G i może być również stosowana w innych systemach, takich jak różnorodne białka komórkowe i błonowe. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy hodować komórki HEK 293T w zmodyfikowanym podłożu Eagle'a (KO's), uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej, w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.

Przeprowadź transfekcję komórek przy 60–80% konfluencji w płytce 10 cm za pomocą G pcr, r CD, NA, używając odczynnika lipectomy plus zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnego dnia zastąp medium wzrostowe DMEM zawierającym 10% FBS i 0,5 mM fee. 48 godzin po transfekcji przeanalizuj ekspresję zgodnie z opisem w tekście.

Przejdź do procedur fotografowania, sieciowania lub znakowania, zgodnie z opisem w dalszej części tego filmu. Po 48 godzinach od transfekcji odessaj pożywkę z komórek i zastąp ją czterema mililitrami 1x fosforanu buforu soli lub PBS; inkubuj w 37 °C przez 15 minut, aby komórki oddzieliły się od płytki. Następnie resuspenduj komórki w 1x PBS i przenieś do probówki typu Falcon, a następnie wiruj przy 1500 RPM przez dwie minuty.

Aby zebrać komórki w osad, odessaj nadsącz, a następnie resuspenduj osad komórkowy w jednokrotnym roztworze soli Hanksa zawierającym znakowany trytem ligand w nasycającym stężeniu wiązania, przygotowanym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Inkubuj osad w temperaturze 37 °C przez wymagający czas, aby zapewnić utworzenie kompleksu receptor-ligand, co jest zależne od konkretnego receptora i ligandu. Następnie przenieś zawiesinę komórkową na płytkę 24- lub 96-dołkową.

Następnie przeprowadź fotoaktywację zeto fee za pomocą lampy ultrafioletowej o długości fali 365 nanometrów przez 15 minut w temperaturze 4 °C, utrzymując płytkę w lodzie, aby zapobiec nagrzaniu próbki i lizie komórek. Po fotoaktywacji przenieś komórki do probówki typu einor i odwiruj, aby uzyskać osad komórkowy. Usuń nadsącz i przystąp do analizy.

Resuspenduj osad komórkowy w buforze lizującym i inkubuj komórki przez jedną godzinę w temperaturze 4°C. Następnie odwiruj lizat komórkowy przez 10 minut przy 16 000 ×g. Przed przeniesieniem nadsączu do nowej probówki, dodaj do niego żywicę 1D4 monoclonal antibody modified SROs 2B i inkubuj przez noc w temperaturze 4°C, aby przeprowadzić immunopuryfikację GPCR z wykorzystaniem zmodyfikowanego epitopu przeciwciała monoklonalnego 1D4 na koniecu C. Następnego dnia przemyj kuleczki kilkakrotnie buforem lizującym. Eluuj próbki za pomocą 1% SDS w temperaturze 37°C przez jedną godzinę przy jednoczesnym wytrząsaniu.

Przenieś część EENT do fiolki o pojemności 15 mililitrów zawierającej płyn scyntylacyjny i zmierz na liczniku scyntylacyjnym do detekcji promieniowania beta, aby określić ilość swoistego wiązania znakowanego trytem ligandu z receptorem. Pozostałą oczyszczoną frakcję EENT rozdziel za pomocą standardowej elektroforezy w żelu, wykorzystując żel SDS o stężeniu od 4 do 12% oraz standardową drabinę białkową. Następnie wykonaj półsuchy transfer na membranę A-P-V-D-F w celu przeprowadzenia immuno-blottingu.

Zablokuj membranę PVDF, używając 5% mleka w buforze TBS zawierającym 0,05% Tween 20. Przebadaj membranę, aby potwierdzić ekspresję receptora o pełnej długości za pomocą przeciwciała monoklonalnego 1D, a następnie zastosuj przeciwciało wtórne anty-US IgG sprzężone z HRP. Następnie potraktuj membranę odczynnikiem do wzmocnionej chemiluminescencji.

Naświetlaj membranę na filmie do autoradiografii, aby zwizualizować prążki. Następnie przetnij membranę żyletką, aby oddzielić ścieżki poszczególnych próbek, a potem wykonaj cięcia na poziomie konkretnych markerów masy cząsteczkowej. Przenieś segmenty membrany do probówek zawierających płyn scyntylacyjny, a następnie określ ilość trytu w każdym segmencie membrany za pomocą licznika scyntylacyjnego beta.

Pozytywne sieciowanie fotochemiczne identyfikuje się poprzez detekcję trytu w pozornej masie cząsteczkowej równej sumie mas GPCR i liganda. Po przemyciu i przeliczeniu komórek, przygotować 96-dołkową płytkę o wysokim wiązaniu z przezroczystym dnem, dodając 100 µL poli-D-lizyny o stężeniu 10 µg/mL do każdego dołka; inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie kilkakrotnie przemyj 1xPBS, a po wysuszeniu na powietrzu wysiej transfektowane komórki w 200 µL przy gęstości od 60 do 80 000 komórek na studzienkę w płytce 96-dołkowej i inkubuj w 37 °C w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia.

Przygotuj komórki do znakowania. Delikatnie przemyj komórki trzy razy, używając 100 µL XPBS na dołek, aby usunąć pożywkę wzrostową zawierającą surowicę. Przygotuj bufor zawierający od 50 do 200 µM odczynnika znakującego flag Tri AAL PHOSPHINE zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Nanieś 60 µL do każdego dołka. Zachowaj zestaw dołków bez obróbki etykietą i buforu. Uwzględnij również kontrolę GPCR typu dzikiego w celu porównania z wariantem GPCR zeto feed.

Po inkubacji pozostaw płytkę w temperaturze 37°C na okres od 30 minut do czterech godzin. Przemyj komórki trzykrotnie, używając 100 µL buforu blokującego na dołek, aby całkowicie usunąć nieprzereagowaną znacznik. Następnie nałóż na komórki 100 µL 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Komórki przemyć trzykrotnie buforem blokującym. Przeprowadzić standardowy protokół badania EISA powierzchni komórkowej w celu wykrycia znakowanego receptora oraz ekspresji receptora, rozpoczynając od inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 1,5 godziny w lodzie. Następnie przeprowadzić inkubację z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Następnie dodaj 100 µL rozcieńczonego przeciwciała Anti-Flag M two w celu wykrycia epitopu peptydowego flagi. Odczynnik do znakowania fosfiną flag. Tri AAL. Przebadaj również studzienki niepoddane znakowaniu jako kontrolę negatywną.

Następnie do oddzielnych zestawów dołków należy dodać rozcieńczone przeciwciało anty-CCR5 2D7, aby określić ekspresję powierzchniową GPCR w komórkach typu dzikiego lub zeto fee. Komórki należy przemyć trzykrotnie buforem blokującym, a następnie inkubować z 100 µL rozcieńczonego przeciwciała anty-US IgG sprzężonego z HRP.

Po dokładnym pięciokrotnym przemyciu komórek buforem blokującym, należy dodać 50 µL buforu detekcyjnego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec należy zebrać dane spektralne przy użyciu wielodołkowego czytnika płytek fluorescencyjnych przy długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 590 nm. Procedurę znakowania rozpoczyna się od lizy 10 milionów zebranych komórek wykazujących ekspresję typu dzikiego lub zeto fee.

Inkubować opsynę pręcikową w jednym mililitrze buforu do solubilizacji przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać frakcję nadsączu po wirowaniu lizatu komórkowego z prędkością 15 000 ×g przez 10 minut. Następnie dodać 100 µL żywicy 1D4 monoclonal antibody modified spheros 2B w celu wychwycenia receptora za pomocą zmodyfikowanego epitopu 1D4 na C-końcu.

Po inkubowaniu przez 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wypłucz żywicę trzy razy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie oznakuj receptor unieruchomiony na macierzy immunofinicyjnej, dodając 0,1 millimol fluoresceiny fosfinowej do całkowitej objętości od 0,3 do 0,5 mililitrów; inkubuj przez 12 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj i usuń nadsącz. Wypłucz żywicę, aby usunąć nieprzereagowany znacznik, a następnie eluj oznakowany receptor 100 mikrolitrów buforu Elian poprzez inkubację na lodzie przez jedną godzinę.

Rozdziel próbki znakowane za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w warunkach redukujących. Krótko przemyj żele w PBS przed znakowaniem receptorów GPCR fluorescencją za pomocą skanera konfokalnego z laserem o długości fali 488 nanometrów w celu wykrycia receptorów zmodyfikowanych fluoresceiną.

W celu specyficznego wprowadzenia sond molekularnych do A-G-P-C-R wykorzystano metodologię mutagenezy z użyciem nienaturalnych aminokwasów, opierając się na technologii supresji kodonu bursztynowego. Następnie zastosowano technikę fotousieciowania, aby zbadać aspekty strukturalne kompleksów ligand-GPCR w żywych komórkach, używając małocząsteczkowego liganda znakowanego radioaktywnie trytem. Do identyfikacji miejsca wiązania na G-P-C-R-C-C-R five wykorzystano Ravi Rock.

W tym przykładzie naświetlanie UV komórek wykazujących ekspresję zeto fee. CCR pięciu wariantów, które wcześniej inkubowano z trytowanymi Ravi. Rock, prowadzi do powstania kowalencyjnie sieciowanych kompleksów, które można zidentyfikować dzięki czułemu znacznikowi radioaktywnemu na ligandzie.

Spośród kilku pozycji w CCR5, przetestowane lucyna 28 zeto fee oraz tryptofan 86 zeto fee były w stanie ulec fotousieciowaniu z trytowanym Ravi Rock, co objawiło się znacznie wyższą liczbą zliczeń scyntylacyjnych. Receptor typu dzikiego nie wykazał sieciowania z radioaktywnym ligandem. Chemia znakowania bioortogonalnego może być wykorzystana do specyficznej modyfikacji zeto feed w konkretnym miejscu.

Jedna ze strategii badania wariancji GPCR polega na ukierunkowanym znakowaniu epitopów A-G-P-C-R w żywych komórkach przy użyciu znacznika koniugowanego z peptydem, jakim jest peptyd flag. Odczynnik znakujący Tri AAL PHOSPHINE jest stosowany w celu specyficznej i selektywnej modyfikacji zeto fee. Przedstawiona tutaj wariancja CCR five stanowi reprezentatywne dane z czułej, wieloetapowej strategii detekcji EISA, wykorzystywanej do identyfikacji pozycji znakowanych peptydem flag.

Wśród pozycji w CCR5 zbadano wszystkie zeto fees. Warianty CCR5 wyeksprymowano na powierzchni komórek i około połowa z nich została pomyślnie poddana ukierunkowanemu znakowaniu epitopowym; dziki typ CCR5 służył jako kontrola negatywna dla znakowania epitopowego, co objawiało się brakiem sygnału Anti-Flag. W alternatywnej strategii zsolubilizowane detergentem zeto feed G PCRs unieruchomione na matrycy immunoafinicyjnej, takiej jak przeciwciało monoklonalne anti 1D four sprzężone z żywicą Spheros two B, zostały znakowane znacznikiem fluoro four.

Obraz fluorescencyjny Ingel demonstruje pomyślne znakowanie fluorescencyjne opsyny GPCR w trzech różnych pozycjach, zgodnie z oczekiwaniami; opsyna typu dzikiego nie wykazała znakowania tła, co potwierdza brak prążka fluorescencyjnego przy oczekiwanej masie cząsteczkowej receptora. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o potwierdzeniu pełnej ekspresji soczewkowej docelowego GPCR za pomocą specyficznie wprowadzonej kwasu AOL Alaniny po jego opracowaniu.

Technika ta utoruje drogę badaczom w dziedzinie biologii receptorów do badania dowolnego kompleksu receptor-ligand lub znakowania receptora docelowego, wykorzystując specyficznie wprowadzony w dane miejsce nienaturalny aminokwas, p-zetofenaloalaninę, jako sondę reaktywną. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania neogenezy nienaturalnych aminokwasów do wprowadzenia sondy molekularnej do GPCR, aby ułatwić badania strukturalne i dynamiczne kompleksów sygnalizacyjnych GPCR z wykorzystaniem ukierunkowanego fotokroslinkowania oraz technik znakowania bioortogonalnego.