Name: Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-13T16:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: Poznaj metodę wprowadzania niestandardowych aminokwasów do receptorów GPCR w celu badań strukturalnych. Technika fotokrościcowania i biortogonalnego etykietowania umożliwia identyfikację miejsc wiązania ligandów oraz fluorescencyjną analizę receptorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za hojne wsparcie kilku fundacji i darczyńców filantropijnych (zobacz SakmarLab.org).

1. Specyficzne dla danego miejsca genetyczne włączenie nienaturalnych aminokwasów do GPCR
<ol>
	<li>Utrzymuj HEK293T komórki w DMEM (4,5 g/L glukozy, 2 mM glutaminy) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .</li>
	<li>Transfekcję komórek wyhodowanych do 60-80% zbiegu na 10-centymetrowej płytce za pomocą odczynnika Lipofectamine Plus.
	<ol>
		<li>Do 750 μl DMEM dodać 10 μl Plus odczynnika, 3,5 μg gDNA GPCR (pMT4. Rho lub pcDNA 3.1. CCR5) zawierające bursztynowy kodon stop w pożądanej pozycji, 3,5 μg supresorowego cDNA tRNA (pSVB.Yam) i 0,35 μg zmutowanego cDNA syntetazy amino-acylowej tRNA dla p-azydo-L-fenyloalaniny (pcDNA.RS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Wykonaj również podobną transfekcję przy użyciu wt GPCR cDNA (niezawierającego bursztynowego kodonu stop), aby służyć jako kontrola. Dodać tę mieszaninę do 750 μl DMEM z 17 μl lipofektaminy. Po zrównoważeniu przez 15 minut w temperaturze pokojowej doprowadzić całkowitą objętość do 4 ml.</li>
		<li>Odessać pożywkę na 10-centymetrową płytkę, nanieść mieszaninę transfekcji na komórki i powrócić do 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Po 4-6 godzinach uzupełnij komórki 4 ml DMEM zawierającym 20% FBS i 1 mM azF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia zastąp pożywkę wzrostową DMEM zawierającym 10% FBS i 0,5 mM azF.</li>
	<li>Zbierz komórki 48 godzin po transfekcji, aby przeanalizować ekspresję lub przejść do procedur fotosieciowania lub etykietowania opisanych w poniższych sekcjach.
	<ol>
		<li>Potwierdzić ekspresję mutanta bursztynu GPCR w obecności użytków rolnych w pożywce wzrostowej. Robimy to za pomocą zachodniej detekcji immunoblotów. Lizować osad komórkowy w 1% (w/v) dodecylo-β-D-maltozydzie (DDM) w 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Odwirować lizat przy 16 000 x g i rozpuścić supernatant w warunkach redukujących za pomocą SDS-PAGE. Przenieś do membrany PVDF i przeprowadź analizę immunoblot w celu wykrycia ekspresji receptora na całej długości za pomocą 1D4 mAb (National Cell Culture Center), który rozpoznaje zmodyfikowany epitop na C-końcu receptora. Rozdział 31</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mapowanie miejsca wiązania liganda za pomocą ukierunkowanego fotolinkowania
<ol>
	<li>48 godzin po transfekcji, odessać pożywkę z komórek i zastąpić 4 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Powrót do temperatury 37 °C na 15 minut.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki za pomocą 1x PBS i przenieś do probówki Falcon. Wirować z prędkością 1 500 obr./min przez 2 minuty w celu osadzenia komórek i zasysania supernatantu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1x buforowanym roztworze soli Hanka zawierającym 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA i trytytowany ligand w nasycającym stężeniu wiązania przez wymagany czas i temperaturę, aby zapewnić tworzenie kompleksu receptor-ligand.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek na płytkę 24- lub 96-dołkową w celu fotoaktywacji azF przy długości fali 365 nm (np. użyć lampy UV-A) przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Utrzymać płytkę na lodzie, aby uniknąć podgrzewania próbki i lizy komórek.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki Eppendorfa, odwirować w celu osadzenia komórek, usunąć supernatant i przystąpić do analizy. Granulki można przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Zawiesić osady komórkowe w buforze do lizy zawierającym 1% (w/v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 i inhibitory proteazy. Po 1-godzinnej inkubacji w temperaturze 4 °C odwirować lizat komórkowy przez 10 minut przy 16 000 x g i przenieść supernatant do nowej probówki.</li>
	<li>Dodać żywicę 1D4 mAb-sefarozy 2B do supernatantu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w celu immunooczyszczania GPCR przy użyciu zmodyfikowanego epitopu C-końca 1D4 mAb. Następnego dnia przemyj kulki kilka razy buforem do lizy. Eluować próbki za pomocą 1% SDS w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z wytrząsaniem.</li>
	<li>Przenieść porcję eluentu do 15 ml fiolki zawierającej płyn scyntylacyjny i policzyć licznik scyntylacji beta w celu ilościowego określenia ilości specyficznego wiązania trytyowanego liganda z receptorem.</li>
	<li>Rozpuść pozostały 1D4 mAb oczyszczony eluent za pomocą standardowej elektroforezy żelowej. Używamy 4-12% żelu SDS-PAGE, a następnie półsucho przenosimy do membrany PVDF w celu immunoblottingu. Dołączamy również tor ze standardową drabinką białkową, aby pomóc w wizualnym przybliżeniu masy cząsteczkowej.
	<ol>
		<li>Zablokować membranę PVDF 5% mlekiem w buforze TBS zawierającym 0,05% Tween-20. Zbadaj błonę, aby potwierdzić ekspresję receptora na całej długości za pomocą 1D4 mAb, a następnie sprzężonego z HRP przeciwciała anty-mysiego IgG.</li>
		<li>Traktuj odczynnikiem o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i wystaw membranę na film autoradiograficzny, aby uwidocznić pasma.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeciąć membranę żyletką, aby oddzielić każdą linię próbki, a następnie przeciąć na określonych znacznikach masy cząsteczkowej. Przenieść segmenty membrany do fiolek zawierających płyn scyntylacyjny. Określ ilościowo ilość trytu w każdym segmencie błony, licząc na liczniku beta-scyntylacji.</li>
	<li>Zidentyfikuj dodatnie fotowiązanie krzyżowe z detekcją trytu o pozornej masie cząsteczkowej równej sumie GPCR i liganda.</li>
</ol>
3. Celowane oznaczanie epitopów i test immunoenzymatyczny na powierzchni komórki (ELISA)
<ol>
	<li>24 godziny po transfekcji, umyj komórki 1 ml 1x PBS i trypsynizuj 1 ml 0,25% trypsyny przez 3 min. Uzupełnij 9 ml DMEM zawierającym 10% FBS i 0,5 mM azF. Ponownie zawieś komórki i policz gęstość komórek. Używamy standardowego hemocytometru.</li>
	<li>Na 96-dołkowej płytce o wysokim poziomie wiązania i przezroczystym dnie należy wstępnie potraktować 100 ml 0,01 mg/ml poli-D-lizyny na dołek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, kilkakrotnie przemyć 1x PBS i wysuszyć na powietrzu.</li>
	<li>Na płytkę 96-dołkową przelać 200 μl transfekowanych komórek o gęstości 6 x 104 - 8 x 104 komórek/basenik i powrócić do temperatury 37 °C w atmosferze 5%CO2</li>.
	<li>Następnego dnia przygotuj komórki do etykietowania. Delikatnie przemyć trzy razy 100 μl/studzienkę 1x PBS, aby usunąć wszelkie podłoża wzrostowe zawierające azF. Upewnij się, że komórki pozostają przylegające, na przykład używając PBS zawierającego Ca2+ i Mg2+.</li>
	<li>Przygotować 50-200 μM odczynnika do znakowania triarylofosfiny FLAG-w 1x HBSS/PBS z zapasu utrzymywanego na poziomie 5-20 mM w PBS. Nałożyć 60 ml na każdą studzienkę (w trzech egzemplarzach dla każdego mutanta bursztynu) i powrócić do temperatury 37 °C na 30 minut do 4 godzin. Utrzymuj zestaw studzienek bez obróbki etykietowej w 1x HBSS / PBS. Dołącz również kontrolkę wt GPCR do porównania z wariantami azF-GPCR.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy 100 μl/studzienkę buforu blokującego, BB (1x PBS, 0,5% BSA), aby całkowicie usunąć nieprzereagowaną etykietę.</li>
	<li>Nałóż 100 μl/studzienkę 4% paraformaldehydu (przygotowanego z 16% bulionu w 1x PBS) na komórki. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy BB.</li>
	<li>Wykonaj standardowy protokół ELISA na powierzchni komórki, aby wykryć znakowany receptor i ekspresję receptora. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 1,5 godziny na lodzie, a następnie inkubować przeciwciała wtórne w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl przeciwciała anty-FLAG M2 (np. 1:2 000 rozcieńczenie przeciwciała wytworzonego w BB) w celu wykrycia epitopu peptydu FLAG odczynnika znakującego triarylofosfinę. Sonduj również studnie nieoznakowane traktowane jako kontrola negatywna. Dodaj przeciwciało anty-CCR5 2D7 (używamy rozcieńczenia 1:500) do oddzielnego zestawu studzienek, aby określić ekspresję powierzchni komórek wt lub azF-GPCR.</li>
		<li>Przemyć komórki trzykrotnie BB i inkubować ze 100 μl sprzężonego z HRP przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego IgG (rozcieńczenie 1:2,000).</li>
		<li>Ostrożnie umyj komórki pięć razy BB. Dodać 50 μl bufora detekcyjnego: Amplex Red, 20 mM H2O2, 1x PBS (stosunek 1:10:90) i inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej. Zbierz dane spektralne na fluorescencyjnym czytniku płytek wielodołkowych przy λex=530 i λem=590.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Bioortogonalne oznakowanie fluorescencyjne GPCR
<ol>
	<li>Lizować 107 pobranych komórek wykazujących ekspresję wariantów wt lub azF-rodopsyny w 1 ml buforu solubilizacyjnego zawierającego 1% (w/v) DM, 50 mM HEPES lub Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2 i inhibitory proteazy przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Odwirować lizat komórkowy przy 15 000 x g przez 10 minut i zebrać frakcję supernatantu.</li>
	<li>Dodaj 100 μl żywicy sefarozy 1D4-mAb 2B, aby wychwycić receptor za pomocą zaprojektowanego epitopu końca C 1D4. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 4 °C. Przemyć żywicę trzykrotnie 0,1% (m/v) DDM w 0,1 M buforze fosforanu sodu, pH 7,3.</li>
	<li>Dodać 0,1 mM fluoresceiny-fosfiny w całkowitej objętości 0,3 - 0,5 ml do znakowania receptora unieruchomionego na matrycy powinowactwa immunologicznego (1D4-mAb sefaroza 2B). Inkubować przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Odwirować i usunąć supernatant. Umyj żywicę, aby usunąć nieprzereagowaną etykietę.</li>
	<li>Eluować znakowany receptor za pomocą 100 ml buforu elucyjnego zawierającego 0,1% (w/v) DDM i 0,33 mg/ml nonapeptydu (peptyd C9 przeciwko epitopowi 1D4) w 2 mM buforze fosforanowym o pH 6,0 przez inkubację na lodzie przez 1 godzinę.</li>
	<li>Rozdziel oznakowane próbki za pomocą SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych. Umyj żele krótko w PBS, a następnie zwizualizuj znakowanie azF-GPCR za pomocą fluorescencji w żelu. Na przykład użyj konfokalnego skanera fluorescencyjnego z laserem o długości fali 488 nm, aby wykryć receptor zmodyfikowany fluoresceiną.</li>
</ol>

<ol><li>Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+ligand+binding+and+specificity+in+adrenergic+receptors%3A+Implications+for+GPCR-targeted+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery.</a> Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).</li>
<li>Steyaert, J., Kobilka, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+stabilization+of+G+protein-coupled+receptor+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states.</a> Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+CXCR4+chemokine+GPCR+with+small-molecule+and+cyclic+peptide+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists.</a> Science. 330, 1066-1071 (2010).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+eukaryotic+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded eukaryotic genetic code.</a> Science. 301, 964-967 (2003).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+keto+amino+acids+into+functional+G+protein-coupled+receptors+using+unnatural+amino+acid+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).</li>
<li>Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FTIR+analysis+of+GPCR+activation+using+azido+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">FTIR analysis of GPCR activation using azido probes.</a> Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).</li>
<li>Ye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+G-protein-coupled+receptor+activation+using+genetically+encoded+infrared+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes.</a> Nature. 464, 1386-1389 (2010).</li>
<li>Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photolysis+of+diazoacetylchymotrypsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The photolysis of diazoacetylchymotrypsin.</a> The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).</li>
<li>Nakayama, T. A., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bovine+rhodopsin+determined+by+cross-linking+using+a+photoactivatable+analog+of+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).</li>
<li>Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+glucagon-like+peptide+1+docking+to+its+intact+receptor+studied+with+carboxyl-terminal+photolabile+probes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).</li>
<li>Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+retinal+in+bacteriorhodopsin+as+studied+by+cross-linking+using+a+photosensitive+analog+of+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal.</a> The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).</li>
<li>Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+fluorescent+and+photoactivatable+MIP-1alpha+ligands+and+interactions+with+chemokine+receptors+CCR1+and+CCR5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5.</a> Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).</li>
<li>Janz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+between+an+allosteric+agonist+pepducin+and+the+chemokine+receptor+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichiacoli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nature. 2, 201-206 (2005).</li>
<li>Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+ligand-binding+site+on+a+G+protein-coupled+receptor+%28GPCR%29+using+genetically+encoded+photocrosslinkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers.</a> Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).</li>
<li>Grunbeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+photo-cross-linkers+map+the+binding+site+of+an+allosteric+drug+on+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor.</a> ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).</li>
<li>Dunham, T. D., Farrens, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+rhodopsin.+Movement+of+helix+f+detected+by+site-specific+chemical+labeling+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).</li>
<li>Maurel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+protein-protein+interaction+analysis+with+time-resolved+FRET+and+snap-tag+technologies%3A+application+to+GPCR+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization.</a> Nature. 5, 561-567 (2008).</li>
<li>Huber, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escaping+the+flatlands%3A+new+approaches+for+studying+the+dynamic+assembly+and+activation+of+GPCR+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+pharmacological+sciences%22%5BJournal%5D)">Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes.</a> Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+azides+into+recombinant+proteins+for+chemoselective+modification+by+the+Staudinger+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).</li>
<li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strain-promoted+%5B3+%2B+2%5D+azide-alkyne+cycloaddition+for+covalent+modification+of+biomolecules+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems.</a> Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).</li>
<li>Kolb, H. C., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+click+chemistry+on+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today%22%5BJournal%5D)">The growing impact of click chemistry on drug discovery.</a> Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).</li>
<li>Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Model+for+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin%3A+Hydrophobic+Interface+and+Dynamical+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure.</a> Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+conformation+and+its+environment+in+rhodopsin+in+light+of+a+new+2.2+%C3%85+crystal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure.</a> J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).</li>
<li>Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+labeling+of+functional+G+protein-coupled+receptors+at+genetically+encoded+azido+groups%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups.</a> , submitted (2013).</li>
<li>Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+epitope+tagging+of+GPCRs+by+bioorthogonal+modification+of+a+genetically-encoded+unnatural+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Molday, R. S., MacKenzie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+rhodopsin%3A+characterization%2C+cross-reactivity%2C+and+application+as+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes.</a> Biochemistry. 22, 653-660 (1983).</li>
<li>Gether, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonists+induce+conformational+changes+in+transmembrane+domains+III+and+VI+of+the+beta2+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor.</a> The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).</li>
<li>Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+structure%2C+dynamics%2C+and+activation%3A+A+perspective+from+crystallography%2C+site-directed+spin+labeling%2C+sulfhydryl+reactivity%2C+and+disulfide+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%3B+Membrane+Proteins%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking.</a> Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).</li>
<li>Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+contact+sites+in+complex+formation+between+transducin+and+light-activated+rhodopsin+by+covalent+crosslinking%3A+use+of+a+photoactivatable+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).</li>
<li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzophenone+photophores+in+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Benzophenone photophores in biochemistry.</a> Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleophilic+catalysis+of+oxime+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Nucleophilic catalysis of oxime ligation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).</li>
<li>Yanagisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+engineering+of+pyrrolysyl-tRNA+synthetase+to+genetically+encode+N%28epsilon%29-%28o-azidobenzyloxycarbonyl%29+lysine+for+site-specific+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification.</a> Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy tutaj solidną metodologię specyficznego dla danego miejsca włączenia sondy reaktywnej azF do GPCR i demonstrujemy trzy użyteczne zastosowania tego narzędzia do badania struktury i dynamiki GPCR. Nasza metoda specyficznego dla danego miejsca włączenia UAA omija podstawowy problem dzięki alternatywnej strategii opartej na chemicznym znakowaniu32, 33 lub dołączaniu fotocrosslinkerów34 do pojedynczego dostępnego mutanta cysteiny. Chociaż substancje chemiczne, które celują w grupy tiolowe cyste...

Heptahelical G-coupled protein-coupled receptors (GPCRs) to nadrodzina wysoce dynamicznych białek błonowych, które pośredniczą w ważnych i różnorodnych sygnałach zewnątrzkomórkowych. W klasycznym paradygmacie aktywacja receptora jest sprzężona ze zmianami konformacyjnymi wywołanymi przez ligand. 1, 2 Niedawne postępy w biologii strukturalnej GPCR dostarczyły istotnych informacji na temat mechanizmów molekularnych sygnalizacji transbłonowej. 3-5 Jednak, aby zrozumieć z większą precyzją chemiczną mechanizm funkcjonalny i dynamikę strukturalną sygnalizacji GPCR, potrzebny jest zestaw podejść do włączenia informacyjnych sond molekularnych i chemicznych do badania aktywnych kompleksów sygnalizacyjnych.
W tym celu dostosowaliśmy metodę wprowadzania do receptorów ekspresji sond niezakłócających lub minimalnie zakłócających w oparciu o mutagenezę nienaturalnych aminokwasów (UAA) przy użyciu technologii tłumienia kodonów bursztynowych, wcześniej zapoczątkowanej przez Schultza i współpracowników. 6 Zoptymalizowaliśmy metodologię mutagenezy UAA, aby osiągnąć wysokowydajny system ekspresji i mutagenezy dla białek takich jak GPCR, które są trudne do ekspresji w większości systemów heterologicznych innych niż komórki ssaków. Używając ortogonalnie zmodyfikowanego supresorowego tRNA i wyewoluowanej pary syntetazy aminoacylo-tRNA dla określonego UAA, wprowadziliśmy UAA w miejscu specyficznym dla wyrażonych docelowych GPCR. Pomyślne włączenie UAA, p-acetylo-L-fenyloalaniny (AcF), p-benzoilo-L-fenyloalaniny (BzF) i p-azydo-L-fenyloalaniny (azF) wykazano w naszym modelu GPCR - rodopsyny i ludzkiego receptora chemokiny C-C, CCR5. 7, 8
Zasadniczo, UAA może być genetycznie kodowany w dowolnym miejscu w sekwencji białka, a ta właściwość jest nieocenionym narzędziem biochemicznym, ponieważ umożliwia skanowanie za pomocą pojedynczego kodonu docelowego GPCR. Skupiamy się tutaj w szczególności na wszechstronności UAA, azF, który ma reaktywne ugrupowanie azydologiczne. Oprócz tego, że służy jako unikalna sonda podczerwieni (IR), 9 azF może również służyć jako fotoaktywowany środek sieciujący poprzez reakcję z sąsiednimi aminami pierwszorzędowymi lub wodorami alifatycznymi. Dodatkowo, biologicznie obojętna grupa azydologiczna może uczestniczyć jako selektywny uchwyt chemiczny w bioortogonalnych reakcjach znakowania. W tym miejscu przedstawiamy przykłady ilustrujące użyteczne zastosowania specyficznego dla miejsca włączania azF do GPCR, takie jak celowane fotosieciowanie w celu wychwytywania kompleksu receptor-ligand oraz modyfikacja GPCR za pomocą bioortogonalnego znakowania epitopów i strategii znakowania fluorescencyjnego.
Odczynniki fotoaktywowane były używane do badania systemów biologicznych od lat 60.10 W tym okresie odnotowano obfitość eksperymentów z sieciowaniem receptor-ligand w celu zbadania kompleksów GPCR, z których większość obejmowała użycie ligandów fotopowinowactwa. 11, 12 Zastosowania te są jednak ograniczone technicznie, ponieważ wymagają syntezy ligandów posiadających grupę sieciującą. 13-15 Ponadto, ze względu na ugrupowanie sieciujące w ligandzie, trudno jest określić położenie usieciowania na GPCR. Wprowadzenie grup fotosieciujących jako UAA do białek przy użyciu technologii supresji kodonów bursztynowych jest cennym postępem. 16, 17 Opracowaliśmy technikę fotosieciowania w celu identyfikacji interfejsu wiązania na receptorze, który bierze udział w tworzeniu kompleksu receptor-ligand w żywych komórkach poprzez wprowadzenie grup fotolabilnych do GPCR.18, 19 Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół i metodę analizy danych w celu zastosowania tej ukierunkowanej technologii fotosieciowania w celu identyfikacji miejsca wiązania liganda drobnocząsteczkowego, trityowany marawirok, na CCR5. Metoda ta wykorzystuje precyzyjną kwantyfikację radioaktywnego uchwytu na ligandzie, a także zachowuje natywną strukturę chemiczną ligandu.
Techniki oparte na fluorescencji pomagają w precyzyjnym zrozumieniu strukturalnych podstaw aktywacji receptora poprzez bezpośrednie badanie stanu konformacyjnego receptora. 20, 21 Jednak techniki pozwalające na elastyczne wprowadzanie znaczników fluorescencyjnych do GPCR w zależności od miejsca są ograniczone. Jesteśmy zainteresowani zastosowaniem bioortogonalnych strategii modyfikacji chemicznej w celu ułatwienia wykrywania pojedynczych cząsteczek (SMD) kompleksów sygnałowych GPCR. 22 Grupa azydologiczna może uczestniczyć w bioortogonalnych chemiach, takich jak ligacja Staudingera-Bertozziego,23, 24 cykloaddycja azydkowo-alkinowa bez miedzi (SpAAC)25 i katalizowana miedzią cykloaddycja azydkowo-alkinowa (CuAAC). 26 Skupimy się tutaj na reakcji ligacji Staudingera-Bertozziego, która obejmuje specyficzną reakcję między azydkiem a fosfiną. Demonstrujemy zastosowanie dwóch różnych pochodnych fosfiny, sprzężonych z epitopem peptydu (peptyd FLAG) lub znacznikiem fluorescencyjnym (fluoresceina) w celu uzyskania specyficznej dla miejsca modyfikacji GPCR.
Wcześniej optymalizowaliśmy warunki do specyficznego dla miejsca oznaczania wariantów rodopsyny azF, korzystając ze struktury krystalicznej promieniowania rentgenowskiego i symulacji dynamicznych, aby wybrać miejsca docelowe, które są narażone na działanie rozpuszczalnika. 27, 28 Zilustrowaliśmy również możliwość uzyskania etykietowania bez tła za pomocą ligacji Staudingera-Bertozziego. 29 Demonstrujemy tutaj ogólną procedurę zastosowaną w celu uzyskania fluorescencyjnego znakowania receptora rozpuszczonego w detergentach, który jest unieruchomiony na matrycy powinowactwa immunologicznego, a następnie wizualizowany przez fluorescencję w żelu. Dodatkowo demonstrujemy użyteczne rozszerzenie tej strategii znakowania w celu zidentyfikowania pozycji podatnych na znakowanie na receptorze o nieznanej strukturze, CCR5. Odbywa się to przy użyciu ukierunkowanej strategii znakowania peptydów i epitopów, która opiera się na bioortogonalnej modyfikacji wariantów azF-GPCR w formacie o niskiej przepustowości opartej na komórkach. 30 Metoda ta wykorzystuje wieloetapowe właściwości wykrywania testu ELISA na powierzchni komórki do monitorowania zdarzeń etykietowania.
Metodologie, które tutaj omawiamy, są ogólne i w zasadzie mogą być stosowane do każdego GPCR włączonego do azF przy użyciu technologii tłumienia bursztynowych kodonów. W przedstawionych tutaj protokołach szczegółowo opisujemy etapy związane z ekspresją receptorów przyłączonych do UAA w komórkach ssaków, takich jak azF, przy użyciu metody nienaturalnej mutagenezy aminokwasów i ich późniejszych zastosowań w celu ułatwienia strukturalnych i dynamicznych badań GPCR.

<table><tbody><tr><td>Plazmid pSVB. Yam</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2008)</td></tr><tr><td>Plazmid pcDNA.RS dla azF</td><td></td><td></td><td>(Ye et al., 2009)</td></tr><tr><td>Plazmidy pMT4.Rho i pcDNA 3.1.CCR5</td><td></td><td></td><td>Opcjonalnie zawierają bursztynowy kodon stop (TAG) w żądanej pozycji</td></tr><tr><td>Komórki</td><td></td><td></td> HEK 293T <td>Komórki adherentne</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Orła firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Numer katalogowy: 10566</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine Plus</td><td>Invitrogen</td><td>Lipofectamina: 18324-012 Plus: 11514-015</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenyloalanina</td><td>Chem-Impex International</td><td>6162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabela 1. Specyficzna dla miejsca genetyczna inkorporacja nienaturalnych aminokwasów do materiałów GPCR</td></tr><tr><td>Lampa UV-A Maxima ML-3500S</td><td>Spectronics Corporation</td><td></td><td>azF jest aktywowana przez 365-nm</td></tr><tr><td>światło Buforowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Ligand <td></td><td></td><td>znakowany trytem</td><td>Od współpracownika (Grunbeck et al., 2012)</td></tr><tr><td>1% (w/v) n-dodecyl-&beta;-D-maltozyd</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1D4-sefaroza żywica</td><td></td><td></td><td>1D4 mAb unieruchomiona na sefarozie aktywowanej CNBr żywica 2B</td></tr><tr><td>1% (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% żele SDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE wykonywane na aparacie NuPAGE</td></tr><tr><td>Aparat Trans-Blot SD</td><td>Biorad</td><td></td><td>Aparat do transferu półsuchego</td></tr><tr><td>Immobilon membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mleko beztłuszczowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9934262</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Aldrich</td><td>274348</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ecoscint A</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-273</td><td>Płyn scyntylacyjny</td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>333726</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LKB Wallac 1209 Rackbeta Licznik scyntylacyjny do płynów</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Licznik beta-scyntylacyjny</td></tr><tr><td>Anty-rodopsyna 1D4 mAb</td><td>Narodowe Centrum Hodowli Komórkowych</td><td>custom</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-mysia peroksydaza chrzanowa (HRP) sprzężona z IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1806</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Folia Hyblot CL AR</td><td>Denville</td><td>E3018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabela 2. Ukierunkowane materiały fotosieciujące</td></tr><tr><td>0,25% Trypsin</td><td>Invitrogen</td><td>15050065</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FLAGA-triarylofosfina</td><td>Sigma</td><td>GPHOS1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>M2 FLAGA mAb</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anty-CCR5 2D7 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555990</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Costar</td><td>3601</td><td>Przezroczyste dno, wysoko wiążące</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami EIA/RIA (wapń, magnez)</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>28908</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sprzężona z HRP</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anty-królicze IgG</td><td>KPL, Inc.</td><td>474-1516</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Invitrogen</td><td>A12222</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>DE Produkty zdrowotne</td><td>97-93399</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny czytnik płytek wielodołkowych CytoFluor II</td><td>Perseptive Biosystems</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabela 3. Ukierunkowane znakowanie peptydowo-epitopowe i materiały ELISA na powierzchni komórki</td></tr><tr><td>Fluoresceina-fosfina</td><td></td><td></td><td>(Huber et al., przedłożone w 2012 r.)</td></tr><tr><td>Nonapeptide (peptyd C9)</td><td>AnaSpec</td><td>62190</td><td>Peptyd naśladujący 1D4-epitop NH2-TETSQVAPA-COOH</td></tr><tr><td>1% (w/v) n-dodecyl-&beta;-D-maltozyd</td><td>Anatrace</td><td>D310LA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Żywica 1D4-sefarozy</td><td></td><td></td><td>1D4 mAb unieruchomiona na sefarozie aktywowanej CNBr Żywica 2B</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% żele SDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>SDS-PAGE wykonywane na aparacie NuPAGE</td></tr><tr><td>Skaner fluorescencyjny Confocal Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare</td><td>wycofany z produkcji</td><td>Skaner z laserem o długości fali 488 nm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tabela 4. Fluorescencyjne materiały do etykietowania</td></tr></tbody></table>

genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem g

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Aby ułatwić strukturalne i dynamiczne badania kompleksów sygnalizacyjnych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), potrzebne są nowe podejścia do wprowadzania do receptorów informacyjnych sond lub etykiet, które nie zaburzają funkcji receptora. Użyliśmy technologii supresji kodonów bursztynowych do genetycznego kodowania nienaturalnego aminokwasu, p-azydo-L-fenyloalaniny (azF) w różnych docelowych pozycjach w GPCR heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków. Wszechstronność grupy azydologicznej jest zilustrowana tutaj w różnych zastosowaniach do badania GPCR w ich naturalnym środowisku komórkowym lub w warunkach rozpuszczalnych w detergentach. Po pierwsze, demonstrujemy opartą na komórkach technologię celowanego fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR, w której małocząsteczkowy ligand znakowany trytem jest sieciowany z genetycznie kodowanym aminokwasem azydo. Następnie demonstrujemy specyficzną dla miejsca modyfikację GPCR przez bioortogonalną reakcję ligacji Staudingera-Bertozziego, która jest ukierunkowana na grupę azydonową przy użyciu pochodnych fosfiny. Omawiamy ogólną strategię celowanego znakowania peptydowo-epitopowego ekspresji białek błonowych w hodowli i jej wykrywania przy użyciu podejścia ELISA opartego na całej komórce. Na koniec pokazujemy, że azF-GPCR można selektywnie znakować za pomocą sond fluorescencyjnych. Omawiane metodologie są ogólne, w tym sensie, że w zasadzie można je zastosować do dowolnej pozycji aminokwasu w dowolnym wyrażonym GPCR w celu zbadania aktywnych kompleksów sygnałowych.

Zastosowaliśmy metodologię mutagenezy z użyciem nienaturalnych aminokwasów w celu specyficznego dla miejsca wprowadzenia sond molekularnych do GPCR, wykorzystując technologię supresji kodonu bursztynowego. Schemat na Rysunku 1 przedstawia kluczowe etapy tej metodologii oraz różnorodne zastosowania włączania wszechstronnego UAA, p-azydofenyloalaniny (azF), do GPCR. Ekspresja azF-GPCR w komórkach ssaków umożliwia ukierunkowane fotousieciowanie z ligandami, a także celowane znakowanie epitopami pep...

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wprowadzenie pojedynczej informatywnej sondy do docelowych receptorów sprzężonych z białkiem G, aby ułatwić badania strukturalne i dynamiczne kompleksów sygnalizacyjnych. Osiąga się to poprzez transfekcję komórek plazmidami niezbędnymi do ekspresji aparatu translacyjnego wymaganego do wbudowania nienaturalnego aminokwasu zeto, fenyloalaniny lub zeto fee do ekspresowanego GPCR. Wariant GPCR zeto fee można następnie zastosować na trzy różne sposoby w celu zbadania struktury i funkcji receptora.W pierwszej kolejności zeto fee jest wykorzystywane jako fotoaktywacyjny czynnik sieciujący w GPCR, co umożliwia identyfikację miejsca wiązania ligandu trytowanego. Następnie zeto fee może służyć jako reaktywny uchwyt chemiczny w celu przyłączenia koniugatu peptydowego lub sondy fluorescencyjnej do GPCR za pomocą bioortogonalnych metod znakowania chemicznego. Uzyskane wyniki wykazują zastosowanie sondy molekularnej zeto fee w ukierunkowanym fotousieciowaniu, ukierunkowanym znakowaniu epitopów oraz znakowaniu fluorescencyjnym GPCR w oparciu o metody biochemiczne i badania na żywych komórkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie ligandów fotoafinitywnych lub znakowanie cysteiną, jest możliwość specyficznego wprowadzenia w konkretne miejsce biologicznie obojętnego i reaktywnego nienaturalnego aminokwasu P zeto fenyloalaniny w znanej pozycji w receptorze docelowym.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji GPCR, w tym w mapowaniu miejsc oddziaływań w kompleksie receptor-ligand w naturalnym środowisku błonowym oraz w ułatwieniu badań fluorescencyjnych pojedynczych cząsteczek poprzez identyfikację pozycji w GPCR podatnych na znakowanie bioortogonalne. Po trzecie, metoda ta może dostarczyć wglądu w molekularny mechanizm receptorów sprzężonych z białkiem G i może być również stosowana w innych systemach, takich jak różnorodne białka komórkowe i błonowe. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy hodować komórki HEK 293T w zmodyfikowanym podłożu Eagle'a (KO's), uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej, w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.Przeprowadź transfekcję komórek przy 60–80% konfluencji w płytce 10 cm za pomocą G pcr, r CD, NA, używając odczynnika lipectomy plus zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnego dnia zastąp medium wzrostowe DMEM zawierającym 10% FBS i 0,5 mM fee. 48 godzin po transfekcji przeanalizuj ekspresję zgodnie z opisem w tekście.Przejdź do procedur fotografowania, sieciowania lub znakowania, zgodnie z opisem w dalszej części tego filmu. Po 48 godzinach od transfekcji odessaj pożywkę z komórek i zastąp ją czterema mililitrami 1x fosforanu buforu soli lub PBS; inkubuj w 37 °C przez 15 minut, aby komórki oddzieliły się od płytki. Następnie resuspenduj komórki w 1x PBS i przenieś do probówki typu Falcon, a następnie wiruj przy 1500 RPM przez dwie minuty.Aby zebrać komórki w osad, odessaj nadsącz, a następnie resuspenduj osad komórkowy w jednokrotnym roztworze soli Hanksa zawierającym znakowany trytem ligand w nasycającym stężeniu wiązania, przygotowanym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Inkubuj osad w temperaturze 37 °C przez wymagający czas, aby zapewnić utworzenie kompleksu receptor-ligand, co jest zależne od konkretnego receptora i ligandu. Następnie przenieś zawiesinę komórkową na płytkę 24- lub 96-dołkową.Następnie przeprowadź fotoaktywację zeto fee za pomocą lampy ultrafioletowej o długości fali 365 nanometrów przez 15 minut w temperaturze 4 °C, utrzymując płytkę w lodzie, aby zapobiec nagrzaniu próbki i lizie komórek. Po fotoaktywacji przenieś komórki do probówki typu einor i odwiruj, aby uzyskać osad komórkowy. Usuń nadsącz i przystąp do analizy.Resuspenduj osad komórkowy w buforze lizującym i inkubuj komórki przez jedną godzinę w temperaturze 4°C. Następnie odwiruj lizat komórkowy przez 10 minut przy 16 000 ×g. Przed przeniesieniem nadsączu do nowej probówki, dodaj do niego żywicę 1D4 monoclonal antibody modified SROs 2B i inkubuj przez noc w temperaturze 4°C, aby przeprowadzić immunopuryfikację GPCR z wykorzystaniem zmodyfikowanego epitopu przeciwciała monoklonalnego 1D4 na koniecu C. Następnego dnia przemyj kuleczki kilkakrotnie buforem lizującym. Eluuj próbki za pomocą 1% SDS w temperaturze 37°C przez jedną godzinę przy jednoczesnym wytrząsaniu.Przenieś część EENT do fiolki o pojemności 15 mililitrów zawierającej płyn scyntylacyjny i zmierz na liczniku scyntylacyjnym do detekcji promieniowania beta, aby określić ilość swoistego wiązania znakowanego trytem ligandu z receptorem. Pozostałą oczyszczoną frakcję EENT rozdziel za pomocą standardowej elektroforezy w żelu, wykorzystując żel SDS o stężeniu od 4 do 12% oraz standardową drabinę białkową. Następnie wykonaj półsuchy transfer na membranę A-P-V-D-F w celu przeprowadzenia immuno-blottingu.Zablokuj membranę PVDF, używając 5% mleka w buforze TBS zawierającym 0,05% Tween 20. Przebadaj membranę, aby potwierdzić ekspresję receptora o pełnej długości za pomocą przeciwciała monoklonalnego 1D, a następnie zastosuj przeciwciało wtórne anty-US IgG sprzężone z HRP. Następnie potraktuj membranę odczynnikiem do wzmocnionej chemiluminescencji.Naświetlaj membranę na filmie do autoradiografii, aby zwizualizować prążki. Następnie przetnij membranę żyletką, aby oddzielić ścieżki poszczególnych próbek, a potem wykonaj cięcia na poziomie konkretnych markerów masy cząsteczkowej. Przenieś segmenty membrany do probówek zawierających płyn scyntylacyjny, a następnie określ ilość trytu w każdym segmencie membrany za pomocą licznika scyntylacyjnego beta.Pozytywne sieciowanie fotochemiczne identyfikuje się poprzez detekcję trytu w pozornej masie cząsteczkowej równej sumie mas GPCR i liganda. Po przemyciu i przeliczeniu komórek, przygotować 96-dołkową płytkę o wysokim wiązaniu z przezroczystym dnem, dodając 100 µL poli-D-lizyny o stężeniu 10 µg/mL do każdego dołka; inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie kilkakrotnie przemyj 1xPBS, a po wysuszeniu na powietrzu wysiej transfektowane komórki w 200 µL przy gęstości od 60 do 80 000 komórek na studzienkę w płytce 96-dołkowej i inkubuj w 37 °C w atmosferze 5% CO2. Następnego dnia.Przygotuj komórki do znakowania. Delikatnie przemyj komórki trzy razy, używając 100 µL XPBS na dołek, aby usunąć pożywkę wzrostową zawierającą surowicę. Przygotuj bufor zawierający od 50 do 200 µM odczynnika znakującego flag Tri AAL PHOSPHINE zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Nanieś 60 µL do każdego dołka. Zachowaj zestaw dołków bez obróbki etykietą i buforu. Uwzględnij również kontrolę GPCR typu dzikiego w celu porównania z wariantem GPCR zeto feed.Po inkubacji pozostaw płytkę w temperaturze 37°C na okres od 30 minut do czterech godzin. Przemyj komórki trzykrotnie, używając 100 µL buforu blokującego na dołek, aby całkowicie usunąć nieprzereagowaną znacznik. Następnie nałóż na komórki 100 µL 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Komórki przemyć trzykrotnie buforem blokującym. Przeprowadzić standardowy protokół badania EISA powierzchni komórkowej w celu wykrycia znakowanego receptora oraz ekspresji receptora, rozpoczynając od inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 1,5 godziny w lodzie. Następnie przeprowadzić inkubację z przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Następnie dodaj 100 µL rozcieńczonego przeciwciała Anti-Flag M two w celu wykrycia epitopu peptydowego flagi. Odczynnik do znakowania fosfiną flag. Tri AAL. Przebadaj również studzienki niepoddane znakowaniu jako kontrolę negatywną.Następnie do oddzielnych zestawów dołków należy dodać rozcieńczone przeciwciało anty-CCR5 2D7, aby określić ekspresję powierzchniową GPCR w komórkach typu dzikiego lub zeto fee. Komórki należy przemyć trzykrotnie buforem blokującym, a następnie inkubować z 100 µL rozcieńczonego przeciwciała anty-US IgG sprzężonego z HRP.Po dokładnym pięciokrotnym przemyciu komórek buforem blokującym, należy dodać 50 µL buforu detekcyjnego i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec należy zebrać dane spektralne przy użyciu wielodołkowego czytnika płytek fluorescencyjnych przy długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 590 nm. Procedurę znakowania rozpoczyna się od lizy 10 milionów zebranych komórek wykazujących ekspresję typu dzikiego lub zeto fee.Inkubować opsynę pręcikową w jednym mililitrze buforu do solubilizacji przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać frakcję nadsączu po wirowaniu lizatu komórkowego z prędkością 15 000 ×g przez 10 minut. Następnie dodać 100 µL żywicy 1D4 monoclonal antibody modified spheros 2B w celu wychwycenia receptora za pomocą zmodyfikowanego epitopu 1D4 na C-końcu.Po inkubowaniu przez 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wypłucz żywicę trzy razy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie oznakuj receptor unieruchomiony na macierzy immunofinicyjnej, dodając 0,1 millimol fluoresceiny fosfinowej do całkowitej objętości od 0,3 do 0,5 mililitrów; inkubuj przez 12 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj i usuń nadsącz. Wypłucz żywicę, aby usunąć nieprzereagowany znacznik, a następnie eluj oznakowany receptor 100 mikrolitrów buforu Elian poprzez inkubację na lodzie przez jedną godzinę.Rozdziel próbki znakowane za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w warunkach redukujących. Krótko przemyj żele w PBS przed znakowaniem receptorów GPCR fluorescencją za pomocą skanera konfokalnego z laserem o długości fali 488 nanometrów w celu wykrycia receptorów zmodyfikowanych fluoresceiną.W celu specyficznego wprowadzenia sond molekularnych do A-G-P-C-R wykorzystano metodologię mutagenezy z użyciem nienaturalnych aminokwasów, opierając się na technologii supresji kodonu bursztynowego. Następnie zastosowano technikę fotousieciowania, aby zbadać aspekty strukturalne kompleksów ligand-GPCR w żywych komórkach, używając małocząsteczkowego liganda znakowanego radioaktywnie trytem. Do identyfikacji miejsca wiązania na G-P-C-R-C-C-R five wykorzystano Ravi Rock.W tym przykładzie naświetlanie UV komórek wykazujących ekspresję zeto fee. CCR pięciu wariantów, które wcześniej inkubowano z trytowanymi Ravi. Rock, prowadzi do powstania kowalencyjnie sieciowanych kompleksów, które można zidentyfikować dzięki czułemu znacznikowi radioaktywnemu na ligandzie.Spośród kilku pozycji w CCR5, przetestowane lucyna 28 zeto fee oraz tryptofan 86 zeto fee były w stanie ulec fotousieciowaniu z trytowanym Ravi Rock, co objawiło się znacznie wyższą liczbą zliczeń scyntylacyjnych. Receptor typu dzikiego nie wykazał sieciowania z radioaktywnym ligandem. Chemia znakowania bioortogonalnego może być wykorzystana do specyficznej modyfikacji zeto feed w konkretnym miejscu.Jedna ze strategii badania wariancji GPCR polega na ukierunkowanym znakowaniu epitopów A-G-P-C-R w żywych komórkach przy użyciu znacznika koniugowanego z peptydem, jakim jest peptyd flag. Odczynnik znakujący Tri AAL PHOSPHINE jest stosowany w celu specyficznej i selektywnej modyfikacji zeto fee. Przedstawiona tutaj wariancja CCR five stanowi reprezentatywne dane z czułej, wieloetapowej strategii detekcji EISA, wykorzystywanej do identyfikacji pozycji znakowanych peptydem flag.Wśród pozycji w CCR5 zbadano wszystkie zeto fees. Warianty CCR5 wyeksprymowano na powierzchni komórek i około połowa z nich została pomyślnie poddana ukierunkowanemu znakowaniu epitopowym; dziki typ CCR5 służył jako kontrola negatywna dla znakowania epitopowego, co objawiało się brakiem sygnału Anti-Flag. W alternatywnej strategii zsolubilizowane detergentem zeto feed G PCRs unieruchomione na matrycy immunoafinicyjnej, takiej jak przeciwciało monoklonalne anti 1D four sprzężone z żywicą Spheros two B, zostały znakowane znacznikiem fluoro four.Obraz fluorescencyjny Ingel demonstruje pomyślne znakowanie fluorescencyjne opsyny GPCR w trzech różnych pozycjach, zgodnie z oczekiwaniami; opsyna typu dzikiego nie wykazała znakowania tła, co potwierdza brak prążka fluorescencyjnego przy oczekiwanej masie cząsteczkowej receptora. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o potwierdzeniu pełnej ekspresji soczewkowej docelowego GPCR za pomocą specyficznie wprowadzonej kwasu AOL Alaniny po jego opracowaniu.Technika ta utoruje drogę badaczom w dziedzinie biologii receptorów do badania dowolnego kompleksu receptor-ligand lub znakowania receptora docelowego, wykorzystując specyficznie wprowadzony w dane miejsce nienaturalny aminokwas, p-zetofenaloalaninę, jako sondę reaktywną. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania neogenezy nienaturalnych aminokwasów do wprowadzenia sondy molekularnej do GPCR, aby ułatwić badania strukturalne i dynamiczne kompleksów sygnalizacyjnych GPCR z wykorzystaniem ukierunkowanego fotokroslinkowania oraz technik znakowania bioortogonalnego.

genetically-encoded-molecular-probes-to-study-g-protein-coupled

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zakodowane genetycznie sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkami G

Opisany tutaj test mobilizacji wapnia oparty na fluorescencji jest średnioprzepustowym systemem badań przesiewowych farmakologii odwrotnej do identyfikacji funkcjonalnie aktywujących ligandów sierocych receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR).

Charakterystyka receptorów sprzężonych z białkiem G za pomocą testu mobilizacji wapnia opartego na fluorescencji

Proste metody wykrywania selektywnej aktywacji białek G przez receptory sprzężone z białkiem G pozostają wyjątkowym wyzwaniem w sygnalizacji komórkowej. W tym przypadku biosensory rezonansowego transferu energii (FRET) Fӧrster zostały opracowane poprzez parowanie peptydów GPCR z białkiem G w celu zbadania zmian konformacyjnych w kontrolowanych stężeniach w żywych komórkach.

Selektywne dla białka G konformacje GPCR mierzone za pomocą czujników FRET w teście fluorometrycznym zawiesiny żywych komórek

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Poznaj metodę wprowadzania niestandardowych aminokwasów do receptorów GPCR w celu badań strukturalnych. Technika fotokrościcowania i biortogonalnego etykietowania umożliwia identyfikację miejsc wiązania ligandów oraz fluorescencyjną analizę receptorów.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Przeglądaj więcej filmów