Przygotowanie próbki proteomicznej z tkanki utrwalonej formaliną i zatopionej w parafinie

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie i wstępne frakcjonowanie peptydów z materiału formalnego i utrwalonego oraz zatopionego w parafinie lub FFPE do analizy proteomicznej. Osiąga się to poprzez izolację pożądanej tkanki za pomocą mikrodysekcji, a następnie lizę komórek. Drugim krokiem jest wygenerowanie peptydów poprzez przetwarzanie próbki.

Za pomocą filtra do trawienia wieloenzymatycznego wspomagane było przygotowanie próbki. Peptydy są następnie oznaczane ilościowo, mierząc ich fluorescencję trytofanu. Ostatnim etapem jest frakcjonowanie peptydów przy użyciu techniki separacji opartej na silnym anionowym wymieniaczu do frakcjonowania peptydów.

Ostatecznie przygotowane próbki pozwalają na analizę proteomów od niewielkich ilości materiału do głębokości 10 000 białek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak trawienie w żelu lub roztworze, jest to, że można ją zastosować do niewielkich ilości próbek klinicznych, takich jak laserowe mikrodysektowanie komórek. Metoda zapewnia próbki zawierające doskonałość i czyste peptydy.

Co ułatwia proteomiczną eksplorację ludzkich tkanek i chorób? Cały protokół składa się z technik opracowanych i opublikowanych w przeszłości. Obejmują one fasp o wysokim odzysku, końcówkę pipety i oznaczanie zawartości peptydów na podstawie fluorescencji tryptofanu, wykazując, że procedura będzie Pani

Catina zasiądź technikiem z naszego laboratorium Aby rozpocząć przygotowanie wycinków tkanek do mikrowycinania skrawków za pomocą mikrotomu. Grubość plastrów zależy od próbki. Zwykle mikrodysekcja działa dobrze w przypadku plastrów o wielkości od siedmiu do 10 mikrometrów.

Po naświetlaniu szkiełek membranowych światłem UV przez 45 minut, zamontuj na nich sekcje przed suszeniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Zmontowane sekcje należy rozdrobnić przez dwie kolejne inkubacje w kolejnych słoikach z ksylenem przez dwie i pół minuty oraz półtorej minuty. Następnie ponownie nawodnij sekcje kolejno.

Jednominutowe inkubacje w absolutnym etanolu, 70% etanolu. I wreszcie woda. Po barwieniu skrawków hematyną Meyera przez 20 sekund.

Płucz wodą przez minutę i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Zbierz badaną populację komórek za pomocą systemu mikrodysekcji wychwytu laserowego. Podczas korzystania z instrumentu dłoniowego należy zebrać próbki w nasadkach samoprzylepnych za pomocą trzech mikrolitrów buforu do lizy tkanek na 10 nanolitrów tkanki mikrodysekcyjnej.

Nałóż bufor na mikro rozcięty materiał w nasadce i zamknij tubkę. Zebrać zawiesinę po krótkim odwirowaniu. Następnie z mikros wypreparowanej tkanki w temperaturze 99 stopni Celsjusza w bloku grzewczym z mieszaniem przez godzinę.

Klarować surowy ekstrakt przez odwirowanie w temperaturze 16 000 g i 18 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wymieszać do 50 mikrolitrów oczyszczonego lizatu z 200 mikrolitrami roztworu UA w jednostce ultrafiltracji. Następnie odwirować przy 14 000 GS, aż w filtrze pozostanie mniej niż 10 mikrolitrów roztworu.

Zwykle ten krok wymaga od 10 do 15 minut wirowania. Następnie odpipetować 200 mikrolitrów roztworu UA do jednostki ultrafiltracji i wirówki. Tak jak poprzednio, opróżnij probówkę zbiorczą przed odpipetowaniem 50 mikrolitrów roztworu I A A do jednostki ultrafiltracji.

Mieszać z prędkością 600 obr./min w termomikserze w temperaturze pokojowej przez jedną minutę i odwirować. Tak jak poprzednio, kontynuuj etapy ultrafiltracji i wirowania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym dołączonym do tego filmu. Następnie przenieś jednostki filtracyjne do nowych probówek zbiorczych.

Odpipetować 40 mikrolitrów buforu wytrawiającego z proteinazą endo lic C przed mieszaniem z prędkością 600 obr./min w termomikserze przez jedną minutę. Inkubować jednostki w mokrej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Po odwirowaniu jednostek filtrujących, jak to miało miejsce wcześniej, odpipetować 160 mikrolitrów bufora DB i odwirować.

Jednostki filtrujące, przez które przepływa zbiorczo, zawierają peptydy uwalniane przez proteazę endo lic C. Następnie zbierz peptydy tryptykowe, jak opisano w protokole tekstowym. Pomiar zawartości peptydów w trawienkach białkowych można przeprowadzić w rozcieńczonym buforze, ponieważ reszty tryptofanu są dobrze dostępne dla rozpuszczalnika. Aby określić ilościowo peptydy, najpierw odpipetuj 0,2 mililitra buforu testowego DB do kwarcu Q weterynarza.

Następnie umieść Q vet w uchwycie instrumentów qve i zapisz widmo emisji dla ślepej próby. Przygotować krzywą kalibracyjną z krokami co 0,1 mikrograma, dodając jedną mikrolitrową porcję roztworu wzorcowego tryptofanu do weterynarza Q i delikatnie mieszając z buforem db. Po oczyszczeniu weterynarza Q odpipetuj próbkę i zapisz widmo próbki.

Przed frakcjonowaniem należy przystąpić do obliczania stężenia białka i peptydów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotuj kolumnę końcówki SAX, układając sześć warstw EM. Importuj membranę jonową w zwykłej końcówce do pipety o pojemności 0,2 mililitra. Wykonaj dwie kolumny końcówek SAX na próbkę.

Następnie przygotuj końcówkę sceny, układając trzy warstwy M four C 18. W końcówce do pipety o pojemności 0,2 mililitra przygotuj sześć końcówek stopniowych dla każdej próbki. Zaczynać.

Frakcjonowanie rozcieńczyć roztwory peptydów otrzymane przez mineralizację z ly C z 0,2 mililitra uniwersalnego buforu BRI i Robinsona. pH 11 podobnie rozcieńczyć roztwory peptydów otrzymane przez trawienie trypsyną z 0,2 mililitra buforu brytyjskiego i Robinson Universal. pH pięć Zmontuj kolumnę końcówki SAX w pokrywie adaptera rurki odśrodkowej przed umyciem i wyrównaj kolumnę końcówki końcówki SAX i końcówki stopnia C 18, jak opisano w protokole tekstowym.

Następnie zamontuj kolumnę końcówki SAX w C 18 stage końcówka. Załaduj roztwory próbek do kolumn z końcówką Equilibrated SAX i odwiruj kolumny przy 5 000 Gs przez trzy minuty. Przemyć kolumny końcówek pipet 0,1 mililitra rozcieńczonych próbek.

Ułatw przepływ poprzez odwirowanie w temperaturze 5 000 Gs. Przenieś kolumnę końcówki SAX do następnej końcówki C 18 stage i kontynuuj elucję peptydów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po umyciu końcówek stopnia C 18 0,05 mililitra buforu A wymyj frakcje 0,05 mililitra buforu B do fiolek, które następnie służą do wstrzykiwania próbek do układu chromatografii cieczowej zmontowanego z przedstawicielem spektrometru masowego. Wyniki ekstrakcji i trawienia białka są pokazane tutaj.

Liza 250 nanolitrów tkanki, co odpowiada mikro wyciętej powierzchni 25 milimetrów kwadratowych z wycinka o grubości 10 mikrometrów, daje około 45 mikrogramów białka całkowitego po dwuetapowym kolejnym trawieniu w formacie postów z proteazą endo plasterkiem C i trypsyną, co daje plony ponad 50% całkowitego białka. Pokazano tutaj reprezentatywny pomiar fluorescencji zawartości peptydów, widma wzorca trytofanu i próbki wykazują maksima przy 350 do 360 nanometrach. Intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do zawartości trytofanu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki z tkanek o wysokiej zawartości do analizy proteomicznej przy użyciu techniki mikrodysekcji, przetwarzania próbek i frakcjonowania peptydów Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu trzech do czterech godzin plus czas potrzebny na niestrawność białka. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o użyciu świeżo przygotowanych plastrów tkanki po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się proteomiką w dziedzinie proteomiki do zbadania proteomów tkanek i komórek oraz nieprawidłowości u ludzi przy użyciu arval for w materiale osadzonym w stałym i paren.