Name: Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu komórek osłonki węchowej w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego zwrotnego. Technika ta umożliwia ocenę regeneracji włókien nerwowych i powrotu sprawności fałdów głosowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants Respiratoires) i Fondation de l'Avenir za wsparcie finansowe, a dr Fanie Barnabé-Heider za redakcję rękopisu.

1. Pierwotne kultury błony śluzowej węchu i opuszki węchowej
<ol>
	<li>Przed sekcją
	<ol>
		<li>Przygotować podłoże na 50 ml, dodając 44 ml bezwapniowej pożywki F12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco's Modified Eagle's/Ham's Substrate, uzupełnionej 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1 ml penicyliny/streptomycyny.</li>
		<li>Pokryć 75 cm2 kolby poli-L-lizyną (50 μg/ml, 1,5 μg/cm2) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłukać kolby PBS 1x.</li>
		<li>Kolby z powłoką przechowywać w lodówce do 1 tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie
	<ol>
		<li>Każda metoda eutanazji musi być wcześniej zatwierdzona przez komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania w instytucji i przeprowadzana przez wykwalifikowany personel.</li>
		<li>Wybierz szczury wsobne, takie jak szczury Fischer.</li>
		<li>Po potwierdzeniu, że szczur wszedł w głębokie znieczulenie pentobarbitalem sodu lub innymi wstrzykiwalnymi formami znieczulenia, takimi jak ketamina/ksylazyna, odetnij mu głowę i usuń skórę.</li>
		<li>Otwórz czaszkę od przedniej do tylnej części.</li>
		<li>Usuń OB, uważając, aby uniknąć opon mózgowych.</li>
		<li>U tego samego szczura otwórz jamę nosową strzałkowo.</li>
		<li>Usuń OM, uważając, aby uniknąć błony śluzowej dróg oddechowych. Należy pamiętać, że nabłonek OM można łatwo zidentyfikować po jego żółtawym kolorze.</li>
		<li>Dalsze szczegółowe protokoły dotyczące sekcji OM można znaleźć w poprzedniej publikacji <a href="https://www.jove.com/video/2762/isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans">J. Vis. Exp</a>. publikacja13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>kultura
	<ol>
		<li>Umieścić OB w buforowanym roztworze soli Hanka (HBSS) zawierającym 0,1% trypsyny na 45 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Umieścić OM w HBSS zawierającym 0,05% kolagenazy A na 45 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 2 ml ciepłej pożywki.</li>
		<li>Umyj komórki pożywką i odwiruj je przy 300 x g przez 3 min.</li>
		<li>Próbki z 2 ml pożywki należy rozcierać za pomocą pipety P1000 aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek.</li>
		<li>Umieścić komórki w kolbach wstępnie powlekanych (5-10 x 10,6 komórek/kolbę) 25 ml ciepłego podłoża.</li>
		<li>Inkubować i hodować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Zmieniaj połowę podłoża co 2 dni.</li>
		<li>Po 6-8 dniach in vitro sprawdzić proporcję komórek p75 dodatnich w próbkach małych komórek, przy założeniu, że są to OEC u gryzoni, za pomocą cytometrii przepływowej lub immunocytochemii. Na potrzeby tych analiz można badać inne markery, takie jak GFAP i S100β.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Pobrać komórki zgodnie z opisem w "Przeszczepianiu komórek" (punkt 2.2 poniżej).</li>
		<li>Inkubować je z przeciwciałem pierwszorzędowym p75 (1:100) przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki 2 ml PBS-EDTA i odwirować je przy 300 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym przeciw mysim sprzężonym z PE przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności (1:200).</li>
		<li>Przemyć komórki 2 ml PBS-EDTA i odwirować je przy 300 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 500 μl PBS-EDTA.</li>
		<li>Przeanalizuj 10-30 x 103 komórki za pomocą cytometru przepływowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza immunocytochemiczna
	<ol>
		<li>Umieścić komórki w płytkach 6-dołkowych wstępnie powlekanych przez 48 godzin, jak opisano w "hodowli" (sekcja 1.1.2 poniżej).</li>
		<li>Umyj komórki PBS.</li>
		<li>Napraw komórki za pomocą PFA 4% przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj komórki PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki za pomocą PBS/Triton X100 (0,1%) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj komórki PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami (1:200): p75, S100β i GFAP przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyj komórki PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi (1:500) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Umyj komórki PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki za pomocą Hoechst 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Umyj komórki PBS.</li>
		<li>Przeanalizuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki do znakowania GFP
	<ol>
		<li>Pięć dni przed przeszczepem należy zainfekować posiewy OB i OM przez noc wektorem lentiwirusowym zawierającym zwiększoną GFP (mnogość zakażenia: 20).</li>
		<li>Przed przeszczepieniem należy sprawdzić na małych próbkach odsetek komórek dodatnich metodą GFP za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej w sekcji "hodowla" (sekcja 1.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Chirurgia i transplantacja
<ol>
	<li>Zespolenie nerwu nawrotowego
	<ol>
		<li>Wszystkie eksperymenty na zwierzętach muszą być uprzednio zatwierdzone przez komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania oraz przeprowadzane przez wykwalifikowany personel.</li>
		<li>Przed zabiegiem należy autoklawować wszystkie narzędzia i utrzymywać sterylność przez cały czas trwania zabiegów chirurgicznych.</li>
		<li>Znieczulić szczura przez dootrzewnowe wstrzyknięcie chlorowodorku ketaminy (12,5 mg/kg) i chlorowodorku chloropromazyny (0,625 mg/kg). Oceń adekwatność znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi przed operacją.</li>
		<li>Umieść szczura w odleżynie grzbietowej.</li>
		<li>Wykonać 2 cm pionowe średnie nacięcie skóry szyjki macicy za pomocą skalpela.</li>
		<li>Wykonaj pionowe nacięcie mięśni podgnykowych wzdłuż białej linii przyśrodkowej.</li>
		<li>Odsłoń krtań za pomocą retraktora autostatycznego między mięśniami podgnykowymi.</li>
		<li>Uwidocznij RLN.</li>
		<li>Pod kontrolą mikroskopową całkowicie przeciąć nerw mikronożyczkami na poziomie siódmego pierścienia tchawicy.</li>
		<li>Wykonać zespolenie za pomocą jednego punktu szwu 11,0 pod kontrolą mikroskopową. Operacja ta prowadzi do specyficznego odnerwienia ruchowego krtani.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszczep komórkowy
	<ol>
		<li>Tuż przed przeszczepem należy usunąć komórki z szalek za pomocą 0,05% trypsyny EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 2 ml ciepłej pożywki.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 3 min.</li>
		<li>Pod mikroskopem policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórkowe zgodnie z określonym protokołem. W tym modelu pożądane stężenia wynosiły od 1,2 do 6 x 106 komórek w 30 μl DMEM/F12.</li>
		<li>Przed szczepieniem przygotować komórkę z mieszanką 1:2 (30 i 60 μl w tym doświadczeniu) DMEM/F12-Matrige l w probówce o pojemności 1,5 ml i umieścić ją na lodzie. Aby uniknąć niespecyficznych efektów, użyj Matrigelu o obniżonym współczynniku wzrostu.</li>
		<li>Tuż przed przeszczepem trzymaj probówkę w dłoni przez kilka sekund, aby rozgrzać mieszankę Matrigel-medium.</li>
		<li>Umieść mieszaninę w miejscu zespolenia za pomocą pipety i poczekaj, aż mieszanina samoczynnie zbierze się na uszkodzonym nerwie.</li>
		<li>Zamknij mięśnie i skórę szwem 4.0.</li>
		<li>Trzymaj szczury pojedynczo i trzymaj pod lampą grzewczą przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena
<ol>
	<li>Laryngoskopia
	<ol>
		<li>Znieczulenie szczurów należy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie chlorowodorku ketaminy (12,5 mg/kg) i chlorowodorku chloropromazyny (0,625 mg/kg). Upewnij się, że szczury są znieczulone szczyptą palca u nogi przed przystąpieniem do protokołu.</li>
		<li>Umieść szczura w odleżynie grzbietowej.</li>
		<li>Włóż wideolaryngoskop 30° ustawiony tak, aby zapewnić najlepszy widok krtani. Określ anatomiczne punkty orientacyjne, aby odtworzyć ten sam widok dla każdego nagrania.</li>
		<li>Rejestruj ruchy strun głosowych za pomocą wideolaryngoskopu (5-10 sekwencji/zwierzę). Dla każdego zwierzęcia wybierz trzy sekwencje następujących po sobie maksymalnego przywodzenia i maksymalnego uwodzenia.</li>
		<li>Analizuj funkcję krtani za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Określ bezwzględny ruch kątowy, mierząc różnicę między ruchem maksymalnego odwodzenia a maksymalnym przywodzeniem strun głosowych. Określ wynik dynamiczny, mierząc amplitudę ruchu. Określ wynik funkcjonalny, mierząc synkinezę i ruchy paradoksalne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektromiografia (EMG)
	<ol>
		<li>Umieść elektrodę na mięśniach ścięgien podkolanowych szczura w celu izolacji elektrycznej.</li>
		<li>Odsłonić krtań i tchawicę, otwierając skórę i mięśnie, jak opisano wcześniej w "nawrotowym zespoleniu nerwowym" (punkt 2.1).</li>
		<li>Odsłoń chrząstkę tarczycy.</li>
		<li>Otwórz chrząstkę tarczycy, aby odsłonić mięsień tylny cricoarytenoid (PCA) za pomocą mikronożyczek.</li>
		<li>Wprowadzić monopolarną elektrodę igłową (38 x 0,45 mm) do mięśnia PCA.</li>
		<li>Rejestruj elektryczną aktywność mięśniową mięśnia PCA za pomocą systemu akwizycji podczas spontanicznej wentylacji.</li>
		<li>Analizuj aktywność mięśni pod kątem bogactwa i synchronizacji z oddechem. Aby przeanalizować EMG, przypisz wynik jakościowy od 0 do 3 za pomocą następującej skali: 0: śledzenie nierymowane, bez wzrostu podczas wdechu, 1: śledzenie rymowane ze wzrostem wdechu, ale słabe śledzenie (neurogen), 2: śledzenie rymowane z bogatszą aktywnością, 3: śledzenie rymowane, bardzo bogate, stanowiące wzór interferencyjny, podobny do maksymalnej aktywności intencjonalnej.</li>
		<li>Odsłoń nerw błędny, aby zmierzyć opóźnienie i potencjalny czas trwania. Nerw błędny jest wybierany jako miejsce stymulacji, ponieważ RLN może zostać uszkodzony podczas stymulacji ze względu na swój mały rozmiar.</li>
		<li>Stymuluj nerw błędny za pomocą elektrody.</li>
		<li>Rejestruj sygnały elektryczne w mięśniu PCA. Mierz opóźnienie i potencjalny czas trwania. Jeśli to możliwe, użyj modułu akwizycji do rejestrowania aktywności mięśni, opóźnień i potencjalnego czasu trwania, takiego jak system Powerlab.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>histologia
	<ol>
		<li>Poddać zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania pentobarbitalu.</li>
		<li>Usuń dystalny kikut RLN pod kontrolą mikroskopową. Część dystalną RLN definiuje się jako część między zespoleniem a krtanią. Należy pamiętać, że możliwe jest znalezienie miejsca zespolenia kilka tygodni po zabiegu, ponieważ szew 11.0 jest szwem niewchłanialnym.</li>
		<li>Umieścić dystalną część RLN w 2% aldehydzie glutarowym z 0,1 M fosforanem (pH = 7,3) na 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie ustaw próbki tak, aby zrealizować przekroje koronalne.</li>
		<li>Przemyć próbki w buforze fosforanowym.</li>
		<li>Pokrój na mniejsze segmenty (3-4 mm długości) i postfix przez 60 minut w temperaturze pokojowej w 1% buforowanym kakodylanem OsO4 i odwodnionym etanolem.</li>
		<li>Próbki orientować w formach silikonowych i zatopionych w żywicach składających się z POLYBED 812, DDSA i MNA, do których dodano 2% akceleratora BDMA.</li>
		<li>Wykonać półcienkie przekroje poprzeczne (o grubości 1 μm) za pomocą systemu ultramikrotomii Pyramitome.</li>
		<li>Zabarwić 0,1% błękitem toluidynowym w 1% tetraboranie sodu przez 75 sekund w temperaturze 70 °C.</li>
		<li>Analizuj próbki RLN za pomocą systemu analizy zliczającej. Policz liczbę włókien i zmierz zmielinizowane profile włókien nerwowych, określając zewnętrzną i wewnętrzną granicę osłonki mielinowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>transplantacja
	<ol>
		<li>Przygotować komórki do przeszczepienia i przesadzić je zgodnie z wcześniejszym opisem w "przeszczepianiu komórek" (punkt 2.2).</li>
		<li>analiza</li>
		<li>Poddać zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania pentobarbitalu. Należy pamiętać, że unieruchomienie zwierząt można wykonać za pomocą iniekcji dosercowej PFA 4%.</li>
		<li>Usuń około 2 cm RLN. Użyj bliższej i dalszej części RLN.</li>
		<li>Utrwalić próbkę RLN w ciekłym azocie.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Próbki należy ciąć wzdłużnie za pomocą kriostatu (o grubości 10-20 μm).</li>
		<li>Analizuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby wykryć komórki GFP dodatnie. Należy pamiętać, że przeciwciało anty-GFP może być stosowane w celu zwiększenia emisji fluorescencji i wykonywania kobarwień.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).</li>
<li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiling+of+olfactory+ensheathing+cells+from+olfactory+bulb+and+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa.</a> Glia. 58, 1570-1580 (1002).</li>
<li>Honore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+genetic+profiling+of+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+from+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb.</a> Glia. 60, 404-413 (2012).</li>
<li>Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+glia%3A+their+contribution+to+primary+olfactory+nervous+system+regeneration+and+their+regenerative+potential+following+transplantation+into+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.</a> Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+olfactory+ensheathing+cells+express+nerve+growth+factor%2C+brain-derived+neurotrophic+factor%2C+glia+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Mol.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).</li>
<li>Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+nodal+formation+of+regenerated+peripheral+nerve+fibers+following+transplantation+of+acutely+prepared+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells.</a> Brain Res. 1125, 1-8 (2006).</li>
<li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+promotes+axonal+regeneration+and+functional+recovery+of+peripheral+nerve+lesion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats.</a> Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).</li>
<li>Guntinas-Lichius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+stimulates+the+collateral+sprouting+from+axotomized+adult+rat+facial+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons.</a> Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).</li>
<li>Makoukji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+enhances+remyelination+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lithium enhances remyelination of peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).</li>
<li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+mucosa+and+bulb+origin+enhances+functional+recovery+after+peripheral+nerve+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion.</a> PloS one. 6, 22816 (2011).</li>
<li>Paviot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+laryngeal+motor+nerve+repair+is+greater+with+bulbar+than+with+mucosal+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells.</a> Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).</li>
<li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nasal+olfactory+stem+cells+from+rodents+or+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration%2C+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section%2Fresection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione tutaj techniki sprawiają, że OEC są użytecznym modelem do badania przeszczepów komórkowych w modelach uszkodzeń nerwów obwodowych. Protokół hodowli komórkowej jest stosunkowo prosty i można go łatwo przeprowadzić. Z kolei zabiegi chirurgiczne, w szczególności wycinki/zespolenia RLN, wymagają doświadczenia i muszą być wykonywane przez wykwalifikowany personel.
Procedury opisane w tym protokole podkreślają ważne czynniki, na których należy się skupić, aby uzyskać jak najlepsze wyni...

Główny układ węchowy składa się z dwóch odrębnych części; błony śluzowej węchu (OM) w obwodowym układzie nerwowym i opuszki węchowej (OB) w ośrodkowym układzie nerwowym. Pierwotny układ węchowy charakteryzuje się zdolnością pierwotnych neuronów węchowych (PON) do samoodnawiania się przez całe życie u gatunków ssaków. Zdolność ta jest możliwa dzięki obecności nerwowych komórek macierzystych w OM. Wzrost i odrost PON od OM do OB jest ułatwiony przez wyspecjalizowane komórki glejowe zwane komórkami otoczki węchowej (OEC). OEC to komórki grzebienia nerwowego, które tworzą korzystne mikrośrodowisko dla neurogenezy PON od OM do OB1. W związku z tym OEC można znaleźć w OM i w OB stanowiących różne subpopulacje komórek2,3. Różne właściwości OEC skłoniły naukowców do wykorzystania ich do przeszczepów komórkowych w kilku paradygmatach zmian układu nerwowego4. Rzeczywiście, OEC wytwarzają czynniki wzrostu, zmniejszają bliznowacenie glejowe, promują odrastanie aksonów i mogą swobodnie mieszać się z astrocytami5,6. Jednak zdecydowana większość tych badań opiera się na urazie rdzenia kręgowego (SCI); niewielu z nich stosowało OEC po uszkodzeniu nerwów obwodowych (PNI)7,8.
Chociaż obwodowy układ nerwowy ma dużą zdolność do regeneracji po uszkodzeniu nerwów, całe sekcje wywołują nieprawidłowy odrost aksonów. Rzeczywiście, po całkowitym przecięciu nerwu twarzowego lub nawrotnego nerwu krtaniowego (RLN) nieprawidłowo przekierowane aksony powodują współskurcze mięśni zwane synkinezą. Dlatego tak ważne jest zaproponowanie modelu PNI nie tylko w celu ilościowego określenia odrostu aksonów, ale także w celu oceny skuteczności skurczów mięśni. W piśmiennictwie najczęściej opisywanym modelem jest uszkodzenie nerwu twarzowego9,10. W tym modelu oceny funkcjonalne opierają się na odzyskiwaniu ruchów wąsów10. Skomplikowane jest jednak wykazanie efektywności ruchów i rozróżnienie zjawisk współskurczów mięśniowych. Proponujemy tutaj model oparty na zmianie RLN. Model ten pozwala na ocenę nie tylko odrastania aksonów i ruchów strun głosowych, ale także sprawności i funkcjonalności tych ruchów po przeszczepach komórkowych11,12. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do hodowli i przeszczepu OEC z OM i OB w modelu przekroju/zespolenia RLN oraz do oceny zwierząt po operacji.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>E3521T</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>E3387M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>1152-8876</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>M3467Y</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>M3513P</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan</td><td>Merck</td><td>1.03256.0100</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Biovalley</td><td>00563-450</td><td></td></tr><tr><td>MNA</td><td>Biovalley</td><td>00886-450</td><td></td></tr><tr><td>BDMA</td><td>Biovalley</td><td>00141-100</td><td></td></tr><tr><td>Polybed 812</td><td>Biovalley</td><td>08791-500</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Mouse&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>550589</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>BD Bioscience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty P75</td><td>Chemicon</td><td>MAB 365</td><td></td></tr><tr><td>11.0 Drut</td><td>Ethicon</td><td>FG 2881</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy&nbsp;</td><td>Ral Diagnostics</td><td>361590-0025</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Inkubator Sigma</td><td>Sigma 2-16PK</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Szybszy</td><td>BH-EN 2003 S</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wideolaryngoskop</td><td>Karl Storz Endoskop</td><td>Telecam SL NLSC 20212120</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji</td> AD <td>Instruments</td><td>System</td><td></td> Powerlab</tr><tr><td>System ultramikrotomii pyramitomowego&nbsp;</td><td>Leica</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr><tr><td>System do analizy obrazu</td><td>Explora Nova</td><td>Mercator</td><td></td></tr></tbody></table>

przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Komórki otoczki węchowej (OEC) to komórki grzebienia nerwowego, które umożliwiają wzrost i odrost pierwotnych neuronów węchowych. Rzeczywiście, pierwotny układ węchowy charakteryzuje się zdolnością do powstawania nowych neuronów nawet u dorosłych zwierząt. Ta szczególna zdolność jest częściowo spowodowana obecnością OEC, które tworzą korzystne mikrośrodowisko dla neurogenezy. Ta właściwość OEC została wykorzystana do przeszczepów komórkowych, takich jak modele urazów rdzenia kręgowego. Chociaż obwodowy układ nerwowy ma większą zdolność do regeneracji po uszkodzeniu nerwu niż ośrodkowy układ nerwowy, całe odcinki wywołują nieprawidłowe prowadzenie podczas odrastania aksonów, w szczególności po przecięciu nerwu twarzowego lub krtaniowego. W szczególności pełne przecięcie nerwu krtaniowego wstecznego (RLN) indukuje nieprawidłowy odrost aksonów, co prowadzi do synchronizacji strun głosowych. W tym konkretnym modelu wykazaliśmy, że przeszczep OEC skutecznie zwiększa odrost aksonów.
OEC składają się z kilku subpopulacji obecnych zarówno w błonie śluzowej węchu (OM-OECs), jak i w opuszkach węchowych (OB-OECs). Przedstawiamy tutaj model przeszczepu komórkowego oparty na wykorzystaniu tych różnych subpopulacji OEC w modelu uszkodzenia RLN. Korzystając z tego paradygmatu, pierwotne kultury OB-OEC i OM-OEC przeszczepiono w Matrigel po przekroju i zespoleniu RLN. Dwa miesiące po operacji oceniliśmy przeszczepione zwierzęta za pomocą analiz uzupełniających opartych na wideolaryngoskopii, elektromiografii (EMG) i badaniach histologicznych. Po pierwsze, wideolaryngoskopia pozwoliła nam ocenić funkcje krtani, w szczególności zjawiska współskurczów mięśni. Następnie analizy EMG wykazały bogactwo i synchronizację czynności mięśniowych. Wreszcie, badania histologiczne oparte na barwieniu błękitem toluidynowym pozwoliły na ilościowe określenie liczby i profilu włókien mielinowych.
Wszyscy razem, opisujemy tutaj, jak izolować, hodować, identyfikować i przeszczepiać OEC z OM i OB po zespoleniu wycinkowym RLN oraz jak ocenić i przeanalizować skuteczność tych przeszczepionych komórek na odrastanie aksonów i funkcje krtani.

Wybrano ilustracje z udziałem zwierząt kontrolnych oraz reinerwowanych (przeciętych/anastomozyjnych), ponieważ wyniki mogą różnić się w zależności od przeprowadzonych transplantacji komórkowych (OM, OB lub OM+OB).
Hodowla komórkowa 
	Komórki szybko przylegają do plastikowej powierzchni i dzielą się na równoległe pasma komórek, które są wydłużone lub zwężające się, trójkątne, wielobiegunowe lub wrzecionowate (Rycina 1A i 1B). Po 8 dniach in vitro<...

Komórki otoczki węchowej (OEC) to komórki grzebienia nerwowego, które umożliwiają wzrost pierwotnych neuronów węchowych. Ta specyficzna właściwość może być wykorzystana do przeszczepu komórkowego. Przedstawiamy w niniejszej pracy model transplantacji komórkowej oparty na zastosowaniu OEC w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego.

Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie modelu transplantacji komórkowej opartego na wykorzystaniu komórek węchowych i komórek osłonowych w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności przecięcia i anastomozy nerwu krtaniowego wstecznego. Następnie transplantowane są komórki węchowe i osłonowe uzyskane z błony śluzowej węchowej lub opuszki węchowej.Następnie, od dwóch do trzech miesięcy po operacji, zwierzęta są oceniane za pomocą laryngoskopii i elektromiografii. Na koniec izoluje się nerw krtaniowy powrotny do badań histologicznych. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że komórki węchowe i komórki osłonkowe poprawiają odrastanie aksonów nerwu krtaniowego powrotnego oraz funkcjonalny powrót fałdów głosowych, co potwierdzają pomiary laryngoskopowe, elektromiograficzne i histologiczne.Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie uszkodzeń nerwów obwodowych, dotyczące pomiaru wzrostu aksonów oraz możliwości ilościowego określenia funkcjonalności regeneracji. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ wielokrotna anastomoza nerwów wymaga umiejętności mik

transplantation-olfactory-ensheathing-cells-to-evaluate-functional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przeszczep komórek osłaniających nerw węchowy w celu oceny odzyskania funkcji po urazie nerwu obwodowego

Uraz rdzenia kręgowego zaburza komunikację z mózgiem. Aby przywrócić utraconą łączność, wykorzystujemy przeszczep nerwu obwodowego, który stanowi podłoże dla regenerujących się włókien, w połączeniu z czynnikami neurotroficznymi i enzymami modyfikującymi macierz, które usuwają cząsteczki hamujące w celu promowania wzrostu na duże odległości.

Połączenie przeszczepu nerwu obwodowego i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura

Opisujemy tutaj metodę pobierania biopsji błony śluzowej węchowej z jam nosowych szczura i człowieka. Biopsje te mogą być wykorzystane do identyfikacji anomalii molekularnych w chorobach mózgu lub do izolacji wielopotencjalnych dorosłych komórek macierzystych, które mogą zostać użyte do transplantacji komórkowej w zwierzęcych modelach urazów i chorób mózgu.

Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Ten film pokazuje procedurę izolacji neuronów zwojowych siatkówki (RGN) z siatkówki szczura i kohodowli ich z komórkami glejowymi otoczki węchowej (OEG). Metoda ta pozwala na badanie potencjału neuroregeneracyjnego OEG po uszkodzeniu neuronalnym.

Hodowla neuronów zwojowych siatkówki z glejem osłonki węchowej

Źródło: Portela-Lomba, M., et. al. Kokultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem osłonki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych. J. Vis. Exp. (2020). Ten film przedstawia obrazowanie i kwantyfikację regeneracji aksonów w aksotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura (RGN) współhodowanych z unieśmiertelnionymi ludzkimi komórkami glejowymi otaczającymi węch. RGN są znakowane immunologicznie, z czerwonymi somi i zielonymi aksonami. Obrazy...

Obrazowanie i kwantyfikacja regeneracji aksonów w akskotomizowanych neuronach zwojowych siatkówki szczura

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Ten protokół przedstawia solidny, powtarzalny model unaczynionego kompozytowego allotransplantu (VCA) nastawiony na jednoczesne badanie immunologii i funkcjonalnego odzyskiwania. Czas zainwestowany w skrupulatną technikę przeszczepu ortotopowego prawej kończyny tylnej w połowie uda z ręcznie szytymi zespoleniami naczyniowymi i koaaptacją neuronalną daje możliwość badania funkcjonalnej regeneracji.

Kolejny krok: ortotopowy model przeszczepu kończyn tylnych z koaaptacją neuronalną w celu maksymalizacji powrotu do sprawności u szczura

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

W tym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę generowania i utrzymywania długoterminowych wycinków organotypowych rdzenia kręgowego przeszczepionych z nerwowymi komórkami macierzystymi jako model ex vivo do testowania komórkowych terapii zastępczych.

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to struktury zawierające neurony czuciowe obwodowego układu nerwowego. Po dysocjacji mogą być hodowane wspólnie z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ASC) podobnymi do SC, stanowiąc cenny model do badania regeneracji i mielinizacji nerwów in vitro, naśladując środowisko in vivo w miejscu urazu.

Neurony zwojów korzenia grzbietowego i zróżnicowane komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej: model wspólnej hodowli in vitro do badania regeneracji nerwów obwodowych

Poznaj metodę przeszczepu komórek osłonki węchowej w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego zwrotnego. Technika ta umożliwia ocenę regeneracji włókien nerwowych i powrotu sprawności fałdów głosowych.

Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Przeglądaj więcej filmów