Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie modelu transplantacji komórkowej opartego na wykorzystaniu komórek węchowych i komórek osłonowych w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności przecięcia i anastomozy nerwu krtaniowego wstecznego. Następnie transplantowane są komórki węchowe i osłonowe uzyskane z błony śluzowej węchowej lub opuszki węchowej.

Następnie, od dwóch do trzech miesięcy po operacji, zwierzęta są oceniane za pomocą laryngoskopii i elektromiografii. Na koniec izoluje się nerw krtaniowy powrotny do badań histologicznych. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że komórki węchowe i komórki osłonkowe poprawiają odrastanie aksonów nerwu krtaniowego powrotnego oraz funkcjonalny powrót fałdów głosowych, co potwierdzają pomiary laryngoskopowe, elektromiograficzne i histologiczne.

Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie uszkodzeń nerwów obwodowych, dotyczące pomiaru wzrostu aksonów oraz możliwości ilościowego określenia funkcjonalności regeneracji. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ wielokrotna anastomoza nerwów wymaga umiejętności mikrochirurgicznych. Po przygotowaniu pierwotnych kultur cebulek węchowych (OB) oraz błony śluzowej nosa (OM) znakowanych GFP, zgodnie z opisem w protokole pisemnym, należy przygotować się do operacji, sterylizując wszystkie instrumenty w autoklawie.

Po znieczuleniu szczura poprzez dostarczenie ketaminy i chlorpromazyny drogą dosytroniczną, należy zweryfikować poziom sedacji, wykonując test uszczypnięcia palca. Następnie należy ogolić pole operacyjne, ułożyć szczura w pozycji na plecach i zdezynfekować skórę, stosując naprzemienne przemywanie alkoholem oraz roztworem Betadinu. Po tym kroku należy przygotować sterylne środowisko chirurgiczne i zachować procedury sterylności przez cały czas trwania operacji.

Za pomocą skalpela wykonaj dwucentymetrowe przyśrodkowe cięcie skóry szyi. Następnie, prowadząc się wzdłuż przyśrodkowej białej linii, wykonaj pionowe cięcie mięśni podhyzaloidalnych, stosując retraktor ortostatyczny pomiędzy tymi mięśniami. Obnaż krtani, a następnie powracający nerw krtaniowy (RLN).

Następnie pod mikroskopem chirurgicznym, używając mikronozyczek, całkowicie przetnij nerw na poziomie siódmego pierścienia tchawicy, stosując jeden szew 11 T. Wykonaj anastomozę, aby odnerwić krtań bezpośrednio przed transplantacją. Użyj 0,05% trypsyny EDTA, aby usunąć komórki OB i OM z naczyń hodowlanych.

Następnie, aby przerwać trawienie, dodaj pięć mililitrów ciepłej pożywki po odwirowaniu komórek przy 432 G przez pięć minut. Użyj komory countingowej (hemocytometru) do policzenia komórek i dostosuj ich stężenie w tym modelu; w probówce typu microfuge wykorzystano od 1,2 do 6 × 10⁶ komórek w 30 µL DMEM/F12. Przygotuj mieszaninę komórek i zredukowanego matrigelu w stosunku 1:2, a następnie umieść ją na lodzie bezpośrednio przed transplantacją.

Wyjmij probówkę z lodu i potrzymaj ją w dłoni, aby ogrzać mieszaninę. Za pomocą pipety nanieś roztwór matrigelu komórkowego na miejsce anastomozy i poczekaj, aż mieszanina utrwali się i samoistnie zorganizuje na uszkodzonym nerwie. Użyj szwów rozmiaru 4-0 do zamknięcia mięśni i skóry.

Umieść szczura w oddzielnej klatce i trzymaj go pod lampą grzewczą przez 24 godziny. Podawaj środki przeciwbólowe przez kolejne pięć dni, około dwa miesiące po operacji, po uprzednim znieczuleniu. W przypadku szczurów opisanych wcześniej w tym filmie, zastosuj ucisk palca stopy w celu potwierdzenia sedacji.

Umieść szczura w pozycji na plecach przed wprowadzeniem wideolaryngoskopu pod kątem 30 stopni. Dostosuj laryngoskop tak, aby zapewnić najlepszy widok krtani w celu uzyskania powtarzalnego obrazu dla każdego nagrania. Wyznacz punkty orientacyjne, takie jak komisura tylna, prawa struna głosowa w miejscu jej przyczepu do wyrostka głosowego chrząstki tarczcowatej oraz lewa struna głosowa w miejscu jej przyczepu do wyrostka głosowego chrząstki tarczcowatej.

Nagraj ruchy strun głosowych, wybierając trzy sekwencje następujących po sobie maksymalnych odwodzeń i maksymalnych przywodzeń. Aby przeanalizować funkcję krtani, określ bezwzględny ruch kątowy, mierząc różnicę między maksymalnym odwodzeniem a maksymalnym przywodzeniem strun głosowych. Wyznacz wynik dynamiczny poprzez pomiar amplitudy ruchu oraz wynik funkcjonalny poprzez pomiar synkinezy i ruchów paradoksalnych w celu przeprowadzenia elektromiografii.

Umieść elektrodę na mięśniu kulszowo-goleniowym szczura po odsłonięciu krtani i tchawicy, zgodnie z procedurą zaprezentowaną dla anastomozy nerwu powrotnego. Odsłoń chrząstkę tarczowo-pierścieniową. Następnie, używając mikronożyczek, rozetnij chrząstkę tarczowo-pierścieniową, aby odsłonić tylny mięsień pierścieniowo-tarczowy (PCA).

Wprowadź monopolarną elektrodę igłową do mięśnia, gdy zwierzę znajduje się pod spontaniczną wentylacją. Użyj systemu akwizycji do zapisu aktywności elektrycznej mięśnia PCA. Przeanalizuj aktywność mięśniową pod kątem intensywności i synchronizacji z oddychaniem, przypisując jakościową ocenę od zera do trzech zgodnie z następującą skalą.

Zero oznacza zapis bez widocznego wzrostu podczas wdechu. Jeden oznacza zapis rytmiczny z narastającym wdechem, natomiast dwa oznacza zapis rytmiczny o słabszej aktywności, a dwa oznacza zapis rytmiczny z bogatszą aktywnością i trzy oznacza zapis rytmiczny. Jest on bardzo intensywny, tworząc wzór interferencyjny podobny do maksymalnej aktywności intencjonalnej.

Następnie, aby uniknąć uszkodzenia RLN ze względu na jego niewielki rozmiar, odsłoń nerw błędny, a następnie przymocuj elektrodę i przeprowadź stymulację w tym miejscu. Zarejestruj latencję oraz czas trwania potencjału w mięśniu PCA. Na koniec, po uśpieniu zwierzęcia za pomocą przedawkowania pentobarbitalu, zlokalizuj anastomozę pod mikroskopem, a następnie zszyj i usuń dystalny odcinek RLN pomiędzy anastomozą a krtanią.

Przeprowadź analizę histologiczną zgodnie z protokołem tekstowym przedstawionym tutaj po transplantacji komórek z kultur pierwotnych węchu, błony śluzowej i cebulek węchowych; przykłady zapisów EMG uzyskane z mięśnia PCA podczas oddychania. Zwierzęta z grupy kontrolnej wykazywały bogatą aktywność elektryczną mięśni ze wzrostem podczas wdechu, co nie wystąpiło w grupie Rerated. Na tej rycinie analizy histologiczne RLN z użyciem barwienia błękitem toluidynowym ukazują typowe profile włókien od zwierząt prawidłowych, reinnerwowanych i po transplantacji.

Pomiar ten umożliwia określenie liczby włókien mielinizowanych, średniej wielkości włókien oraz średniej grubości mieliny, jak pokazano tutaj. Aby dokończyć analizy histologiczne, przeprowadzono śledzenie komórek GFP-dodatnich po przeszczepieniu do wewnątrznerwowym do nerwu kulszowego.

Wybrano to miejsce zamiast RLN, ponieważ niewielki rozmiar RLN uniemożliwia transplantację wewnątrzknerwową. Po rozwinięciu odpowiedniej wprawy, anastomoza nerwu powrotnego można być wykonana w 15 minut, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Techniki te utorowały drogę badaczom z dziedziny uszkodzeń nerwów obwodowych do zbadania zastosowania transplantacji komórkowej w modelu szczura.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeszczepiać komórki w modelu nawracającego uszkodzenia nerwu oraz jak oceniać powrót funkcji strun głosowych za pomocą elektromiografii, endoskopii laboratoryjnej i pomiarów histologicznych.