Izolacja ludzkich hepatocytów za pomocą dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy
3 września 2013
Opisana jest zmodyfikowana dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do izolacji ludzkich hepatocytów. Metodę tę można również zastosować do wątroby innych ssaków. Wyizolowane hepatocyty są dostępne w wysokiej wydajności i żywotności, co czyni je odpowiednim modelem do badań naukowych w takich dziedzinach jak regeneracja wątroby, farmakokinetyka i toksykologia.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie ludzkich hepatocytów za pomocą dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy. Osiąga się to poprzez najpierw kaniulację naczyń krwionośnych w kawałku wątroby za pomocą kaniuli irygacyjnej. Następnie następuje perfuzja i trawienie kawałka wątroby za pomocą kolagenazy.
Trzecim krokiem jest usunięcie błyszczącej torebki, która uwalnia zdysocjowane komórki wątroby. Ostatnim krokiem jest wirowanie z niską prędkością, które izoluje hepatocyty. Ostatecznie hepatocyty można zidentyfikować za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym lub barwienia albuminami przy użyciu chemii immunocytochemicznej z żywotnością i wydajnością hepatocytów określonymi za pomocą testu wykluczania błękitu triamowego.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy kaniulacji i trawienia są trudne do nauczenia. Dzieje się tak, ponieważ kaniulacja wymaga pewnej finezji, a zakończenie trawienia może być trudne do zidentyfikowania. Dla osób, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, procedurę zademonstruje Natalie Lun, technik z mojego laboratorium.
W tej demonstracji użyjemy kawałka wątroby lampy zamiast kawałka od człowieka, Ustaw sprzęt do perfuzji kawałka wątroby w następujący sposób, ustaw łaźnię wodną na odpowiednią temperaturę, tak aby roztwory miały 37 stopni Celsjusza, gdy dotrą do wątroby. Kawałek. 41 stopni Celsjusza jest dobre dla roztworów pierwszego, drugiego i trzeciego, a dla roztworu kondensatora szklanego z płaszczem cztery powinny mieć jednak 37 stopni Celsjusza, aby zmniejszyć utratę aktywności kolagenazy. Na krótko przed obfitością włącz regulator gazu W przypadku aparatu natleniającego od patologa należy uzyskać kawałek wątroby, który idealnie ma w większości lub całkowicie nienaruszoną błyszczącą kapsułkę i tylko jedno miejsce na powierzchni cięcia.
Ten fragment wątroby na lejku Buchnera, który zawiera perforowany dysk filtracyjny, system perfuzyjny musi być teraz zalany roztworem pierwszym za pomocą zakrzywionej kaniuli irygacyjnej o niskim natężeniu przepływu, z zakrzywionymi końcówkami w kształcie oliwek do większych naczyń krwionośnych na powierzchni przeciętej części wątroby. Gdy krew wypłukuje się z wątroby, tkanka staje się jaśniejsza w obszarach o dobrej perfuzji. Liczba używanych kaniul różni się w zależności od wielkości wątroby.
Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku wątroby należy stosować od czterech do ośmiu kaniuli o wadze od poniżej 20 gramów do ponad 80 gramów. Wybierz grubość kaniuli, aby zapewnić dokładne i bezpieczne dopasowanie. Pozostaw mniejsze naczynia krwionośne otwarte, aby bufor mógł spłynąć z tkanki.
Teraz zwiększ natężenie przepływu w pompie perystaltycznej do 110 do 460 mililitrów na minutę. Jest to dobra perfuzja, jeśli kawałek wątroby ma jaśniejszy kolor przy całym zastosowanym natężeniu przepływu. Zależy od wielkości wątroby z wyższymi szybkościami perfuzji stosowanymi w przypadku większych wątrób.
Ogólnie rzecz biorąc, średnia prędkość perfuzji wynosząca 44 mililitry na minutę na kaniulę jest idealna dla różnych mas wątroby. Wybrana szybkość przepływu powinna spowodować lekkie wypełnienie części wątroby. Utrzymuj kawałek wątroby wilgotny podczas perfuzji, przykrywając go kawałkiem gazy nasączonej solą fizjologiczną.
Po perfuzji tkanki jednym litrem roztworu, jeden, aby wypłukać pozostałą krew w kawałku wątroby. Zmień płyn perfuzyjny na roztwór drugi i perfuzuj przez 10 minut. Następnie zamień płyn perfuzyjny na roztwór trzeci i przelej pół litra.
Teraz zmień płyn perfuzyjny na roztwór czwarty, który zawiera kolagenazę. Przeprowadzaj tę perfuzję w sposób recyrkulacyjny przez dziewięć do 12 minut lub do momentu, gdy wątroba zostanie wystarczająco strawiona. Tkanka wątroby powinna wydawać się lekko rozszczepiona pod błyszczącą torebką.
Wątroba powinna być również zmiękczona, gdy jest badana stroną skalpela. Ważne jest, aby trawić wątrobę przez odpowiednią ilość czasu, ponieważ nadmierne trawienie może prowadzić do niskiej żywotności hepatocytów, a niedostateczne trawienie może prowadzić do niskiej wydajności hepatocytów. Zacznij od wyłączenia pompy perystaltycznej i usunięcia kaniuli z części wątroby.
Następnie umieść tkankę w naczyniu krystalizującym zawierającym od 100 do 200 mililitrów roztworu. Pięć. Ostrożnie wyjmij błyszczącą kapsułkę i delikatnie wytrząśnij komórki. Jeśli istnieją obszary, które nie są dobrze perfundowane, można użyć skalpela, aby przeciąć te obszary, aby uwolnić zawarte w nich komórki.
W razie potrzeby dodaj więcej roztworu pięć w trakcie procesu i ostatecznie doprowadź objętość roztworu do 500 mililitrów. Teraz przefiltruj zawiesinę komórek dwukrotnie. Najpierw przefiltruj komórki przez nylonową siatkę o grubości 210 mikronów do jednolitrowej stożkowej kolby.
Następnie przefiltruj komórki przez nylonową siatkę o grubości 70 mikronów do jednolitrowej stożkowej kolby. Wlej dwie równe objętości zawiesiny komórkowej do 200-mililitrowych probówek wirówkowych. Następnie odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową o stężeniu 72 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odessać snat i delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy w około 200 mililitrach roztworu. Pięć. Powtórz wirowanie i zawiesinę resus trzy razy po końcowym odwirowaniu, ponownie zawieś komórki w roztworze chłodniczym, aby uzyskać końcowe stężenie od dwóch do 5 milionów hepatocytów na mililitr. Test niebieskiego triama można użyć do dokładnego pomiaru liczby komórek za pomocą hemocytometru.
Pokazano tutaj triany barwione na niebiesko hepatocyty z 648 izolacji. Średnia żywotność izolowanych ludzkich hepatocytów wynosiła 77 plus minus 10%Średnia wydajność hepatocytów wynosiła 13 plus minus 11 milionów hepatocytów na gram wątroby za pomocą immunofluorescencji. Izolowane hepatocyty, które wybarwiały się dodatnio na obecność albuminy na zielono, miały czystość 94 plus minus 1% w celu określenia czystości hepatocytów.
Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono czterokrotnie z pięcioma powtórzeniami na badanie. Mikroskopia z kontrastem fazowym pokazuje cechy morfologiczne hepatocytów, takie jak ich duży rozmiar komórek i wielokątny kształt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować ludzkie hepatocyty za pomocą dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zmodyfikowaną dwuetapową procedurę perfuzji kolagenazą w celu izolacji ludzkich hepatocytów, która może być zastosowana również do wątrób innych ssaków. Metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej żywotności i liczby hepatocytów, co czyni je odpowiednimi do badań nad regeneracją wątroby, farmakokinetyką oraz toksykologią.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Hepatologia
- Farmakologia
Wstęp
- Ludzkie hepatocyty są kluczowe dla badania funkcji wątroby.
- Techniki izolacji wpływają na żywotność i wydajność otrzymywanych hepatocytów.
- Perfuzja kolagenazą jest powszechną metodą izolacji komórek.
- Wysokiej jakości hepatocyty są niezbędne do różnych zastosowań naukowych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji ludzkich hepatocytów.
- Zwiększenie wydajności i żywotności izolowanych komórek.
- Zapewnienie modelu do badań związanych z wątrobą.
Zastosowane metody
- Kaniulacja naczyń krwionośnych w tkance wątroby.
- Perfuzja i trawienie wątroby z użyciem kolagenazy.
- Usunięcie błyszczącej torebki w celu uwolnienia komórek wątroby.
- Wirowanie przy niskich obrotach w celu izolacji hepatocytów.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja żywych ludzkich hepatocytów.
- Wysoka wydajność uzyskiwania hepatocytów odpowiednich do badań.
- Identyfikacja hepatocytów z wykorzystaniem mikroskopii kontrastowej.
- Ocena żywotności za pomocą testu wykluczania trypan błękitnego.
Wnioski
- Zmodyfikowana procedura skutecznie izoluje hepatocyty.
- Izolowane komórki mogą być wykorzystywane w różnych zastosowaniach badawczych.
- Metodę tę można dostosować do wątrób innych ssaków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Hepatocyty ludzkie o wysokiej żywotności stanowią fundament dla predykcyjnej farmakokinetyki, toksykologii oraz modelowania chorób wątroby w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym.&D. Dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazą umożliwia niezawodny dostęp do pierwotnych ludzkich hepatocytów, wspierając wczesną fazę odkryć, redukcję ryzyka mechanistycznego oraz badania translacyjne. Możliwość ta zwiększa pewność co do potencjału portfolio poprzez zapewnienie fizjologicznie istotnych systemów komórkowych do oceny związków oraz opracowywania biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach nad biofarmaceutykami&D
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie metabolizmu i toksyczności leków w systemie reprezentatywnym dla organizmu człowieka.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez dostarczenie funkcjonalnych hepatocytów do analizy szlaków sygnałowych.
- Ułatwia walidację celu poprzez bezpośrednią ocenę odpowiedzi wątrobowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane hepatocyty o wysokiej żywotności do powtarzalnych testów in vitro.
- Umożliwia ilościową ocenę wpływu związków na specyficzne dla wątroby punkty końcowe.
- Wspiera skalowalność testów i ponowne wykorzystanie platformy w programach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza wyniki in vitro z biologią ludzkiej wątroby w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Łączy etap odkrywania z walidacją przedkliniczną, umożliwiając podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o ocenę ryzyka.
- Zmniejsza odsetek niepowodzeń w późnych fazach badań poprzez zwiększenie pewności predykcyjnej w zakresie bezpieczeństwa i skuteczności w obrębie wątroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda izolacji hepatocytów integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając solidne modelowanie in vitro oraz późniejsze badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w ludzkich komórkach wątroby.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Zapewnia wskaźniki żywotności, wydajności i czystości w celu oceny jakości eksperymentów.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i zapewnienie ciągłości między badaniami in vitro a in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia ustandaryzowany protokół, który można dostosować do różnych modeli wątroby i zespołów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach wątroby.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procedur opartych na hepatocytach.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów ukierunkowanych na wątrobę.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga specjalistycznej wiedzy technicznej w zakresie kaniulacji i perfuzji tkanki wątroby.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury perfuzyjnej i analitycznej.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności izolacji komórek i kontroli jakości.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych gatunków o porównywalnej wielkości wątroby lub naczyń, zgodnie z opisem w protokole.
- Wynik zależy od jakości tkanki oraz precyzyjnego czasu trawienia w celu optymalizacji wydajności i żywotności komórek.
