Name: Ilościowa i czasowa kontrola mikrośrodowiska tlenu na poziomie pojedynczej wyspy trzustkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj technikę mikrofluidyczną do precyzyjnej kontroli tlenu w wyspach trzustkowych. Ta metoda umożliwia badanie wpływu hipoksji na odpowiedź glukozową w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE) oraz Chicago Diabetes Project.

1. Przygotowanie mysich wysepek
<ol>
	<li>Rozwiń myszy C57BL / 6 i wyizoluj wysepki przez trawienie kolagenazy i separację gradientu gęstości Ficoll. (Patrz artykuły JOVE, o których mowa w2,3).</li>
	<li>Inkubować wysepki w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 20 mM HEPES na szalkach Petriego (37 °C, 5% CO2 ). Po izolacji, hoduj wysepki przez 24 godziny przed użyciem w eksperymentach. Użyj wysepek w ciągu 1-2 dni, aby zapewnić spójne rezultaty.</li>
</ol>
2. Tworzenie platformy mikroprzepływowej
<ol>
	<li>Wygeneruj geometrie mikrostruktury na przezroczystych fotomaskach dla każdej warstwy urządzenia: 1) wlot i wylot, 2) warstwa mikroprzepływowa glukozy z komorą peryfuzyjną (średnica 8 mm x 3 mm, 150 μl), 3) membrana 200 μm z mikrostudzienkami (średnica 500 μm, głębokość 100 μm) oraz 4) warstwy mikroprzepływowe gazu.</li>
	<li>Aby wytworzyć warstwę wlotową i wylotową, należy wlać odgazowany, wstępnie wymieszany PDMS na wysokość 1,5 mm do ślepej szalki Petriego i utwardzić w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Przebić porty wejścia/wyjścia o średnicy 2 mm.</li>
	<li>Aby wytworzyć warstwę mikroprzepływową glukozy, odwiruj dwie warstwy SU8-2150 o grubości 350 μm, aby utworzyć pojedynczą warstwę o grubości 700 μm na 4-calowej płytce krzemowej.
	<ol>
		<li>Wystaw światło UV przez odpowiednią fotomaskę, aby przenieść wzór mikrokanałów na SU8 po wywołaniu, tworząc wzorzec o wysokości 700 μm.</li>
		<li>Wlej odgazowany, wstępnie wymieszany PDMS na ten wzorzec na wysokość 3 mm i utwardź w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Przytnij ten PDMS do kształtu za pomocą żyletki.</li>
		<li>Przebić porty wejścia/wyjścia o średnicy 2 mm oraz komorę o średnicy 8 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wytworzyć membranę 200 μm z mikrostudzienkami, należy obrócić SU8-2100 do 100 μm. Zastosuj tę samą litografię UV, aby przenieść wzory mikrostudzienek na ten wzorzec o wysokości 100 μm.
	<ol>
		<li>Odgazowany, wstępnie wymieszany PDMS należy odwirować na tym urządzeniu wzorcowym z prędkością 900 obr./min przez 30 sekund i utwardzić w temperaturze 80 °C przez 10 minut. Odwirować drugą warstwę na pierwszej w tych samych warunkach, w wyniku czego powstanie membrana PDMS o średnicy 200 μm zawierająca wzory mikrostudzienek.</li>
		<li>Przebij porty wejścia/wyjścia o średnicy 2 mm przez tę membranę</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wytworzyć gazową warstwę mikroprzepływową, należy obrócić SU8-2100 do 100 μm. Zastosuj tę samą litografię UV, aby przenieść gazowe wzory mikroprzepływowe na ten wzorzec o wysokości 100 μm.
	<ol>
		<li>Wlej odgazowany, wstępnie wymieszany PDMS na ten wzorzec na wysokość 1,5 mm i utwardź w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Przytnij PDMS do kształtu za pomocą żyletki.</li>
		<li>Przebij porty wejścia/wyjścia o średnicy 2 mm przez tę warstwę</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby skleić wiele warstw, przygotuj je, czyszcząc taśmą klejącą, wystawiając na działanie łuku koronowego, a następnie wyrównując ręcznie w następującej kolejności.
	<ol>
		<li>Przymocuj membranę do dolnej warstwy gazu za pomocą mikrostudzienek skierowanych do góry.</li>
		<li>Zwiąż mikroprzepływowy glukozę na błonie mikrostudzienki.</li>
		<li>Sklej warstwę wlotową i wylotową na samej górze, otaczając cały zespół.</li>
		<li>Wzmocnij wiązanie, dodając 1 kg masy na wierzch i piecz w temperaturze 100 °C przez 3 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetestuj szczelność gotowego urządzenia, ładując wodę do warstwy wodnej, a następnie zanurzając całe urządzenie pod wodą. Następnie przepuść powietrze przez warstwę gazu za pomocą pustej strzykawki.</li>
	<li>Wysterylizuj urządzenia szczelne 70% etanolem przez warstwę wodną, a następnie przepłucz buforem PBS, w którym urządzenie jest przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Konfiguracja mikrodozownika
<ol>
	<li>Zaopatrz się w 2 mikrodozowniki, zasilacze 5 V i 20 V DC oraz cyfrową płytkę I/O do skonstruowania konfiguracji mieszania i dostarczania tlenu.
	<ol>
		<li>Podłącz przewody sterujące mikrodozowników do dołączonych sterowników.</li>
		<li>Podłącz sterowniki do cyfrowej karty I/O na portach odpowiadających kontrolkom Labview.</li>
		<li>Podłącz zasilacze 5 V i 20 V do odpowiednich styków na jednostkach napędowych.</li>
		<li>Podłącz cyfrowe wejście/wyjście do laptopa, aby wykonać kody Labview do sterowania gazem (Dodatek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz jeden mikrodozownik do azotu, a drugi do sprężonego powietrza, oba z 5% CO2 . Ustaw oba gazy na 2 psi. Podłącz wyjścia dozowników w trójnik przed wejściem do urządzenia mikroprzepływowego.</li>
	<li>Za pomocą urządzenia przetestowanego pod kątem szczelności scharakteryzuj przejściową reakcję modulacji tlenu poprzez cykliczne przełączanie mikrodozowników między 5-21% tlenu, jednocześnie mierząc tlen rozpuszczony w wodzie za pomocą światłowodowego czujnika tlenu (patrz lista wyposażenia i reprezentatywne wyniki).</li>
</ol>
4. Ustawianie przy mikroskopii
<ol>
	<li>Zamontuj urządzenie na podgrzewanym stage na odwróconym mikroskopie.</li>
	<li>Podłącz gazy 0% i 21%O2 do urządzenia i skalibruj za pomocą sondy lambda.</li>
	<li>Podłącz port wyjściowy mikrofluidyki glukozy do kolektora frakcji.</li>
	<li>Przygotuj bufor wodorowęglanowy Krebsa Ringera (KRB): 129 mM NaCl, 5 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1 mM CaCl2·2H2O, 1,2 mM MgSO,4·7H2O, 10 mM HEPES pH 7,35-7,40, 2 mM glukozy podstawowej i 5% FBS.</li>
	<li>Przygotować dwa roztwory buforowe zawierające odpowiednio 2 mM i 14 mM glukozy w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml skąpanych w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Podłączyć pompę perystaltyczną, aby pobrać bufor z prędkością 250 μl/min do rurki. Przełóż rurkę przez płytę grzejną o temperaturze 37 °C przed wejściem do urządzenia mikroprzepływowego.</li>
	<li>Aby zabarwić wysepki, dodaj Fura-2 AM w DMSO i Rh123 w 100% etanolu do 2 ml KRB, aby osiągnąć końcowe stężenie barwnika odpowiednio 5 μM i 2,5 μM.</li>
	<li>Pobrać wysepki za pomocą pipety o pojemności 10 μl i inkubować w barwnikach przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Załaduj około 20 wysepek do urządzenia przez wlot mikrokanału glukozy. Skierować wysepki do komory, zalewając bufor z wylotu z powrotem do wlotu.</li>
	<li>Płucz wysepki w buforze przez 10 minut, aby zmyć nadmiar barwników.</li>
</ol>
5. Prowadzenie jednoczesnej stymulacji tlenem i glukozą
<ol>
	<li>Dostarcz impuls stymulacji glukozy z 5-minutową wartością bazową ustaloną przez KRB2, a następnie 15-minutową stymulację 14 mM, a następnie myj przez 15 minut w KRB2.</li>
	<li>Zapis długości fali wzbudzenia 340/380 nm dla Fura-2 i emisji 534 dla Rh123.</li>
	<li>Wykonuj pomiary normalnego impulsu (14 mM normoksycznego) przed każdym eksperymentem.</li>
	<li>W przypadku modulacji tlenu (niedotlenienie/przerywane niedotlenienie) należy stosować przepływ buforowy tylko podczas etapów stymulacji i płukania, a nie przepływ na innych etapach, aby zminimalizować zakłócenia konwekcyjne.</li>
	<li>Zbieraj ścieki z ujścia glukozy w odstępach 1-minutowych do testu insulinowego ELISA.</li>
</ol>

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wiele modalności zintegrowanych z tą techniką niedotlenienia wysp trzustkowych przedstawia kilka punktów wymienionych tutaj do rozwiązywania problemów. Po pierwsze, izolowane wysepki nadal ulegają degradacji i rozpadają się w hodowli z powodu enzymów trawiennych z komórek groniastych. Standaryzacja eksperymentów do 1-2 dni po izolacji wysp trzustkowych ma zatem kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnych wyników. Po drugie, przepływ wodny został zatrzymany podczas niedotlenienia i przerywanego niedotlenienia, aby zapobiec ...

Dynamiczne niedotlenienie jest ważne w biologii, szczególnie w przypadku przeszczepów wysp trzustkowych.
Dynamiczne niedotlenienie jest ważnym parametrem fizjologicznym i patofizjologicznym w wielu tkankach biologicznych. Na przykład zmiana tlenu jest silnym sygnałem rozwojowym w angiogenezie. Co więcej, wzorce przestrzenne i czasowe w niedotlenieniu modulują HIF1-alfa i odgrywają rolę w chorobach takich jak rak trzustki. Niedotlenienie jest również czynnikiem zakłócającym wpływającym na wyniki przeszczepu wysp trzustkowych. Ostatnio czasowe oscylacje hipoksji lub przerywanego niedotlenienia (IH) wykazały korzyści w "wstępnym kondycjonowaniu" wysp trzustkowych1. Jednak zarówno statyczny, jak i przejściowy wpływ niedotlenienia na fizjologię wysp trzustkowych nie został jeszcze dobrze poznany ani zbadany, głównie ze względu na brak odpowiednich narzędzi do kontrolowania mikrośrodowiska wysp trzustkowych.
Wysepki są dobrze unaczynione in vivo.
Wysepki trzustkowe to sferoidalne agregaty komórek endokrynnych o wielkości 50-400 μm, w tym komórek beta i alfa, które są odpowiedzialne za homeostazę glukozy. Kiedy wyspy trzustkowe są wystawione na stymulujący poziom glukozy we krwi, wychwyt i glikoliza prowadzą do produkcji ATP, która otwiera wrażliwe na ATP kanały potasu (KATP) i powoduje napływ wapnia, który wyzwala egzocytozę granulek insuliny. Tlen jest ważny dla napędzania tego silnie metabolicznego procesu, a na wydzielanie insuliny znaczący wpływ ma dynamika przepływu krwi i dopływu tlenu, a także gradienty glukozy. Wyspy trzustkowe z łatwością wykonują tę odpowiedź glukozowo-insulinową in vivo, ponieważ są silnie perfundowane w trzustce, a każda z nich znajduje się w odległości jednej komórki od naczynia włosowatego. Jednak gęsta sieć naczyń włosowatych wewnątrz wysp jest usuwana przez kolagenazę podczas izolacji wysp trzustkowych2,3. W związku z tym zarówno dopływ tlenu, jak i składników odżywczych jest ograniczony do obwodu 100 μm ze względu na ograniczenia dyfuzji.
Obecne techniki mają ograniczone sukcesy w odtwarzaniu mikrośrodowiska wysepek.
Odtworzenie natywnej dynamiki tlenu i glukozy wysepek, kluczowej do modelowania warunków fizjologicznych i patofizjologicznych, jest trudne do osiągnięcia przy użyciu standardowych komór hipoksyjnych, które wymagają skomplikowanego przepływu i nie mają ciągłego monitorowania funkcji wysp. Co więcej, terapie transplantacyjne cukrzycy typu I narażają izolowane wyspy trzustkowe na niedotlenienie w układzie wrotnym wątroby4, który ma znacznie niższe pO2 (<2%, 5-15 mmHg) w porównaniu z fizjologiczną trzustką (5,6%, 40 mmHg). Po przeszczepie przeszczepy wysp trzustkowych potrzebują dwóch tygodni lub dłużej, aby zostać ponownie unaczynione. Wykazano, że ekspozycja na niedotlenienie upośledza mechanizm sprzężenia glukozy i insuliny w wyspach trzustkowych. Wśród czynników sprzęgających bodziec-wydzielanie, sygnalizacja wapniowa, potencjały mitochondrialne i kinetyka insuliny mogą być łatwo monitorowane za pomocą mikrofluidyki. Nasza poprzednia technika mikroprzepływowa demonstrowała to monitorowanie w czasie rzeczywistym z precyzyjną modulacją mikrośrodowiska wodnego wokół pojedynczej wysepki5,6. Jednak kwantyfikacja upośledzenia niedotlenienia wysp trzustkowych jest utrudniona ze względu na brak jednoczesnych technik stymulacji i monitorowania. Dlatego połączenie mikroprzepływowej kontroli tlenu i monitorowania wysp trzustkowych może poprawić badania nad niedotlenieniem wysp trzustkowych.
Mikrofluidyka może odtwarzać i modulować mikrośrodowisko wodne i tlenowe.
Standardowa technika badań niedotlenienia tkanek i hodowli opiera się na komorach hipoksyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, komory hipoksyjne zapewniają pojedyncze stężenia tlenu z czasami równowagi w ~10-30 minutach, niezgodne z dynamicznym hipoksją w skali minutowej. W dwóch ostatnich badaniach wykorzystano małe niestandardowe komory do przerywanej ekspozycji na hipoksję na całych myszach, z sprzecznymi wynikami dotyczącymi odpowiedzi insulinowej wywołanej glukozą7,8. Należy pamiętać, że na poziomie całego zwierzęcia wdychany tlen nie jest bezpośrednio przekształcany do naczyń włosowatych wysp trzustkowychpO 2, ze względu na kontrole w układzie oddechowym. Co więcej, badania te nie mają znormalizowanych poziomów tlenu ani nie zapewniają pomiarów w czasie rzeczywistym na poziomie tkanek wysp trzustkowych.
Z drugiej strony, mikrofluidyka tlenowa może przekroczyć te ograniczenia, kontrolując tlen za pomocą sieci kanałów gazowych. Co więcej, mikrofluidyka jest kompatybilna z obrazowaniem na żywo podczas modulacji tlenu, co obecnie nie jest możliwe w przypadku standardowych komór hipoksyjnych. Wiele z tych nowatorskich podejść mikroprzepływowych wykorzystuje przepuszczalność gazu polidimetylosiloksanu do rozpuszczania stężeń tlenu w mikrokanałach, które przepływają media przez komórki docelowe9-14. Urządzenia te mają również zintegrowane wiele dyskretnych stężeń tlenu, czujniki tlenu oparte na fluorescencji, a nawet chemiczne wytwarzanie tlenu w układzie scalonym.
Mikrofluidyka oparta na solwatacji cieczy ma trudności z utrzymaniem stabilnych, ciągłych gradientów, ponieważ zależy to od mieszania konwekcyjnego, które jest wrażliwe na warunki przepływu. Dla porównania, technika, którą tutaj stosujemy, koncentruje się na zmniejszeniu ścieżki dyfuzji dostarczania tlenu. Solwatacja gazu i przepływ ścinający są eliminowane przez bezpośrednią dyfuzję tlenu przez błonę obsianą komórkami lub tkankami wysp trzustkowych. Usuwa to dodatkowe mikrofluidyki wymagane do kontrolowania solwatacji i zapobiega niepotrzebnemu naprężeniu ścinającemu wysp trzustkowych, które samo w sobie może wywołać uwalnianie insuliny. Platforma ta została wykorzystana do wykazania regulacji w górę reaktywnych form tlenu (ROS) zarówno w skrajnych warunkach hiperoksycznych, jak i hipoksyjnych (2-97% O2) w hodowli komórkowej1,15. Ze względu na bezpośrednie dostarczanie tlenu i usuwanie przepływu ścinającego, nasza platforma oparta na dyfuzji zapewnia optymalne rozwiązanie mikroprzepływowe do badania niedotlenienia wysp trzustkowych.
Stymulacja i monitorowanie multimodalne
Mikrofluidyka oparta na dyfuzji przynosi również dodatkowe korzyści, gdy jest dostosowana do badania mikrofizjologii wysp trzustkowych. Dzięki zastosowaniu membrany jako bariery dyfuzyjnej, ciecz może być odizolowana od modulacji tlenu, umożliwiając kontrolę stymulacji glukozy w wodzie niezależnie od stymulacji hipoksyjnej. Tworzy to jednoczesną stymulację przypominającą kanapkę, która przestrzennie wskazuje dostawę do wysepek. Ponadto, ponieważ gaz jest czasowo modulowany za pomocą skomputeryzowanych mikrowtryskiwaczy, możemy cyfrowo modulować stężenie tlenu od 21-0% z czasem przejściowym krótszym niż 60 sekund. Dynamiczna kontrola mikrośrodowiska tlenu i glukozy pod mikroskopem pozwala na multimodalny protokół w czasie rzeczywistym, który nie byłby możliwy lub niezwykle kłopotliwy przy użyciu standardowych komór hipoksyjnych. Za pomocą tego urządzenia monitorowano sygnalizację wapniową (Fura-AM), potencjały mitochondrialne (rodamina 123) i kinetykę insuliny (ELISA), aby uzyskać pełny obraz dynamicznej odpowiedzi glukozowo-insulinowej w warunkach niedotlenienia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150/SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa płyta grzejna</td><td>PMC Tabliczka znamionowa</td><td>722A Lampa</td><td></td></tr><tr><td>utwardzająca UV</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>Dow Chemical</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Corona Wand</td><td>ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>Komora próżniowa</td><td>Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodozowniki</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr>5<td>V i 20 V DC</td><td>Power Radio Shack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>National Instrument</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>Termometr</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik tlenu</td><td>Ocean Optics</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor frakcji</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Pippette</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurki stożkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 Sondy molekularne z barwnikiem fluorescencyjnym</td><td>, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>z barwnikiem fluorescencyjnym Rhodamine 123</td>, Life Technologies <td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywki hodowlane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 w silikonowych rurkach</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 cala x 1/8</td></tr><tr><td>cala 1,5 ml Probówki Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-connectors</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Złącza strzykawkowe 1/16 cala i 4 mm</td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>żeńskie Wtyk Luer 1/16 cala</td></tr><tr><td>Złącza proste</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 cala</td></tr><tr><td>Złącze kolankowe</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 cala</td></tr></tbody></table>

ilościowa i czasowa kontrola mikrośrodowiska tlenu na poziomie pojedynczej wyspy trzustkowej

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Jednoczesne natlenianie i monitorowanie czynników sprzęgających bodziec-wydzielanie glukozy w jednej technice jest kluczowe dla modelowania patofizjologicznych stanów niedotlenienia wysp trzustkowych, zwłaszcza w środowiskach po przeszczepach. Standardowe techniki komory hipoksyjnej nie są w stanie modulować obu stymulacji w tym samym czasie ani zapewniać monitorowania w czasie rzeczywistym czynników sprzężenia bodziec i wydzielanie glukozy. Aby rozwiązać te trudności, zastosowaliśmy wielowarstwową technikę mikroprzepływową, aby zintegrować modulacje zarówno fazy wodnej, jak i gazowej za pomocą membrany dyfuzyjnej. W ten sposób tworzy się warstwa stymulująca wokół mikroskalowanych wysepek w przezroczystym urządzeniu z polidimetylosiloksanu (PDMS), umożliwiając monitorowanie wyżej wymienionych czynników sprzęgających za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo dopływ gazu jest kontrolowany przez parę mikrodozowników, zapewniających ilościowe, subminutowe modulacje tlenu w zakresie 0-21%. To przerywane niedotlenienie jest stosowane do badania nowego zjawiska wstępnego kondycjonowania wysp trzustkowych. Co więcej, uzbrojeni w mikroskopię multimodalną, byliśmy w stanie przyjrzeć się szczegółowej dynamice kanału wapnia i KATP podczas tych zdarzeń hipoksyjnych. Przewidujemy, że niedotlenienie mikroprzepływowe, zwłaszcza ta jednoczesna technika dwufazowa, będzie cennym narzędziem w badaniu wysp trzustkowych, a także wielu tkanek ex vivo.

Kluczowym elementem tej techniki hipoksji wysepek jest możliwość modulowania stymulacji w fazie wodnej i gazowej w tej samej komorze mikrofluidycznej z przejściami w skali minutowej. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny wynik a) podwójnej stymulacji oraz b) szybkich modulacji zmierzonych w komorze z wysepkami. Modulacja wodna, zobrazowana poprzez wprowadzenie fluoresceiny do komory, osiąga stan równowagi w ciągu trzech do czterech minut mieszania. Ponadto poziom tlenu może być zmieniany skokowo w zakres...

Mikroprzepływowa kontrola tlenu zapewnia więcej niż tylko wygodę i szybkość w porównaniu z komorami hipoksyjnymi do eksperymentów biologicznych. Zwłaszcza, gdy jest wdrażany poprzez dyfuzję przez membranę, tlen mikroprzepływowy może zapewnić jednoczesną modulację fazy ciekłej i gazowej na poziomie mikroskali. Technika ta umożliwia dynamiczne eksperymenty wieloparametryczne, które mają kluczowe znaczenie dla badania patofizjologii wysp trzustkowych.

Ilościowa i czasowa kontrola mikrośrodowiska tlenu na poziomie pojedynczej wyspy trzustkowej

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zastosowanie krótkotrwałej, przerywanej hipoksji w skali minutowej do mikroskalowych wysepek trzustkowych w celu zbadania efektów prekondycjonowania. Jest to realizowane poprzez najpierw wykonanie multimodalnego urządzenia mikrofluidycznego z cienką membraną przepuszczalną dla gazów. Drugim krokiem jest stworzenie zautomatyzowanego systemu modulacji tlenu.Następnie oczka są ostrożnie umieszczane w urządzeniu, a następnie podłączane są mikroprzepływy cieczy i tlenu. Ostatnim krokiem jest skoordynowanie mikroskopii z multimodalnymi mikroprzepływami w celu wizualizacji parametrów oczka, które zmieniają się podczas modulacji poziomu tlenu. Ostatecznie zastosowano technikę przerywanego niedotlenienia oczka, aby wykazać, że odpowiedź glikemiczna jest wyraźnie upośledzona w warunkach hipoksji.Podczas gdy czasowe modulacje hipoksji mogą trenować organy eyelids, aby reagowały z mniejszym upośledzeniem, główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pomiar tlenu rozpuszczonego czy stosowanie komory hipoksycznej, jest możliwość precyzyjnego dostarczania określonego stężenia tlenu do powiek w szybkich, minimalnych odstępach c

quantitative-temporal-control-oxygen-microenvironment-at-single-islet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ilościowa i czasowa kontrola mikrośrodowiska tlenu na poziomie pojedynczej wysepki trzustkowej

Opracowano mikrofluidyczne urządzenie do perifuzji wysepek trzustkowych w celu oceny dynamicznego wydzielania insuliny przez wiele wysepek oraz jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego napływu jonów wapnia i zmian potencjału mitochondrialnego.

Wieloparametryczny system perfuzji wysepek w mikroprzepływowym urządzeniu perfuzyjnym

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Celem tego protokołu jest zmierzenie wpływu zmian w oddychaniu mitochondrialnym za pośrednictwem glukozy w obecności naturalnych związków na nienaruszone komórki beta 832/13 za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomu pojedynczych komórek z izolowanych ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach.

Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych

Ten protokół demonstruje dokładny i powtarzalny pomiar zużycia tlenu w wyspach trzustkowych naczelnych innych niż ludzie. Techniki ładowania wysepek i powlekania mikropłytki zapewniają ramy dla skutecznego pomiaru oddychania w innych typach sferoid hodowlanych.

Analiza zużycia tlenu przez wyspy trzustkowe naczelnych

Celem tego protokołu jest ciągłe monitorowanie dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych oraz komórek gospodarza i dawcy. Osiąga się to poprzez przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka (ACE) NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mysz, a następnie wielokrotne obrazowanie 2-fotonowe.

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

Ten protokół opisuje metodę synchronicznego pozyskiwania i korejestracji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych oraz wydzielania insuliny i glukagonu przez pierwotne ludzkie pseudowyspy za pomocą adenowirusowego dostarczania cyklicznego biosensora monofosforanu adenozyny (cAMP), detektora różnic cAMP in situ (cADDis) oraz systemu mikroperyfuzji.

Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką jako dodatkową technikę oceny funkcji endokrynnej trzustki z redukcją możliwych czynników zakłócających.

Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny poprzez perfuzję przez naczynia krwionośne myszy z nienaruszoną trzustką

Protokół ten przedstawia metodę wytwarzania dwuwarstwowego chipa mikroprzepływowego i analizy wzrostu drobnoustrojów pod wpływem gwałtownych oscylacji tlenu. Wydajność urządzenia została potwierdzona za pomocą wykrywania tlenu w kanałach płynów i hodowli mikroorganizmów.

Tworzenie szybkich oscylacji tlenu w analizie wzrostu pojedynczych komórek drobnoustrojów przy użyciu dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj technikę mikrofluidyczną do precyzyjnej kontroli tlenu w wyspach trzustkowych. Ta metoda umożliwia badanie wpływu hipoksji na odpowiedź glukozową w czasie rzeczywistym.

Ilościowa i czasowa kontrola mikrośrodowiska tlenu na poziomie pojedynczej wyspy trzustkowej

Przeglądaj więcej filmów