Ilościowa i czasowa kontrola mikrośrodowiska tlenu na poziomie pojedynczej wyspy trzustkowej

Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie przerywanego niedotlenienia w skali minutowej do mikroskalowanych oczek trzustki w celu zbadania efektów kondycjonowania wstępnego. Osiąga się to poprzez wyprodukowanie najpierw multimodalnego urządzenia mikroprzepływowego z cienką membraną przepuszczającą gaz. Drugim krokiem jest stworzenie skomputeryzowanego systemu modulacji tlenu.

Następnie oczka są ostrożnie ładowane do urządzenia, a następnie podłączane są mikroprzepływy cieczy i tlenu. Ostatnim krokiem jest skoordynacja mikroskopii z mikrofluidyką multimodalną w celu wizualizacji parametrów oczek, które zmieniają się podczas modulacji tlenu. Ostatecznie stosuje się technikę przerywanego niedotlenienia oczkowego, aby pokazać, że odpowiedź glukozy jest wyraźnie upośledzona w hipoksji.

Podczas gdy czasowe modulacje niedotlenienia mogą trenować oczka, aby reagować z mniejszym upośledzeniem. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak rozpuszczony tlen lub użycie komory hipoksyjnej, jest to, że jest dokładna. Stężenie tlenu może być dostarczane do powiek w szybkich, niewielkich odstępach czasu bez zwykłego stresu związanego ze skomplikowanymi przepływami.

Umożliwia również monitorowanie w czasie rzeczywistym za pomocą podłogi i mikroskopii. Ten mistrz może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transplantacji Alli, takie jak definiowanie zaburzeń hipoksyjności w miejscach przeszczepów lub schematy kondycjonowania wstępnego w celu poprawy wyników przeszczepu. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w niedotlenienie Alli.

Może być również stosowany do innych tkanek i układów, takich jak ośrodkowy układ nerwowy, tkanki serca, nerki i inne narządy do przeszczepów. Demonstracja wideo tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wiele elementów związanych z produkcją urządzenia i uchwytem oczkowym. Kroki są trudne do nauczenia się ze względu na nowatorski interdyscyplinarny charakter techniki, ale nieodłącznie związane są z wyzwaniem lub zapoznaniem się z Rozpocznij od wytworzenia warstwy wierzchniej urządzenia mikroprzepływowego.

Aby to osiągnąć, należy wlać DGMS wstępnie wymieszany na wysokość 1,5 milimetra do czystej szalki Petriego i utwardzić ją w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie wytwórz warstwę mikroprzepływową glukozy z mistrzem komory obfitości, pokrywając wirowo dwie warstwy SU 8 21 50 o grubości 350 mikronów, aby utworzyć pojedynczą warstwę o grubości 700 mikronów na czterocalowej płytce silikonowej. Następnie wystaw go na działanie światła UV za pomocą maski fotograficznej z warstwą mikroprzepływową glukozy, aby przenieść wzór mikrokanałów na ósmą warstwę SU.

Spłucz nienaświetlony obszar za pomocą wywoływacza SU eight. Następnie wlej wstępnie zmieszane PDMS DGA na MA do wysokości trzech milimetrów i utwardź w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po utwardzeniu przytnij warstwę mikroprzepływową glukozy do kształtu i użyj dwumilimetrowego stempla, aby uformować porty wlotowe i wylotowe, a także stempel o średnicy ośmiu milimetrów do komory głównej.

Następnie wyprodukuj mikro studnię do unieruchomienia powiek, pokrywając wirowo warstwę SU 8 2100 o grubości 100 mikronów na czystej czterocalowej płytce krzemowej, a następnie użyj litografii UV, aby przenieść wzór mikrostudzienki na tę warstwę. Spłucz nienaświetlone obszary wywoływaczem, gdy mistrz mikrostudzienki jest gotowy. Dodaj dwie 100-mikronowe warstwy PDMS przez wirowanie z prędkością 900 obr./min przez 30 sekund, a następnie utwardzanie przez 10 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby uzyskać każdą warstwę.

Po zakończeniu przebij wlot o średnicy dwóch milimetrów w portach wylotowych. Na koniec wytwórz gazowy wzorzec mikroprzepływowy, obracając SU 8 o grubości od 2100 do 100 mikronów, jak w poprzedniej warstwie, i ponownie przenieś wzorce mikroprzepływowe gazu za pomocą litografii UV. Spłucz nieodsłonięty obszar wywoływaczem.

Następnie wylej warstwę PDMS o grubości 1,5 milimetra na gazowy master mikroprzepływowy i utwardź w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie przytnij PDMS do kształtu za pomocą żyletki. Następnie przebij porty wlotowe i wylotowe o średnicy dwóch milimetrów w warstwę pokrywy, aby wyrównać się z miejscem, w którym znajdują się na innych warstwach, aby połączyć ze sobą wiele warstw.

Najpierw przygotuj je, czyszcząc powierzchnie taśmą klejącą, wystawiając je na działanie łuku Corona, a następnie ręcznie wyrównując warstwy w następującej kolejności. Najpierw przymocuj membranę do dolnej warstwy gazu mikrostudzienkami skierowanymi do góry. Następnie przyklej warstwę mikroprzepływową glukozy na górze membrany mikrostudzienki.

Na koniec sklej warstwę wlotową i wylotową na samej górze, zamykając cały zespół. Pomóż w tworzeniu ścisłego wiązania, dodając kilogramowy ciężarek na wierzch zestawu i piecząc go w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie przeciek.

Przetestuj urządzenie, ładując wodę do warstwy wodnej, zanurzając urządzenie i przepuszczając powietrze przez warstwę gazu za pomocą strzykawki, szukając wycieków. Na koniec wysterylizuj szczelne urządzenia, przepuszczając 70% etanol przez warstwę wodną przez jedną do dwóch minut. Skonfiguruj mikrodozowniki, podłączając najpierw przewody sterujące mikrodozownikami do dołączonych sterowników.

Następnie podłącz sterowniki do cyfrowej płytki IO na portach odpowiadających ich kontrolkom widoku laboratorium. Następnie podłącz zasilacze prądu stałego o napięciu pięciu i 20 V do odpowiednich styków w jednostkach napędowych i podłącz cyfrowe IO do laptopa w celu wykonania kodów widoku laboratoryjnego do sterowania gazem, zgodnie z opisem w załączniku do dołączonego protokołu tekstowego. Następnie podłącz jeden mikrodozownik do azotu, a drugi do sprężonego powietrza, oba zawierające 5% dwutlenku węgla i ustaw oba gazy na dwa PS. Podłączam wyjścia dozownika w złączu T przed wejściem do urządzenia mikroprzepływowego.

Następnie zamontuj urządzenie na podgrzewanym stoliku odwróconego mikroskopu z 0% i 21% tlenu podłączonym do urządzenia. Następnie umieść światłowodowy czujnik tlenu na wyjściu płynu urządzenia, aby zmierzyć rozpuszczony tlen na wyjściu w czasie rzeczywistym. Następnie podłącz urządzenie do pompy perystaltycznej i zacznij przepływać przez urządzenie z prędkością 250 mikrolitrów na minutę.

Scharakteryzuj przejściową reakcję modulacji tlenu, zmieniając mikrodozowniki między pięcioma a 21% tlenu. Podłącz pompę perystaltyczną do urządzenia mikroprzepływowego i umieść rurkę na płycie grzejnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ogrzać płyn, zanim dostanie się do urządzenia mikroprzepływowego. Podłącz również port wyjściowy mikrofluidyki glukozy do kolektora frakcji, aby rozpocząć sekcję C 57 czarnych sześciu myszy i wyizolować oczka trzustki przez trawienie kolagenazy i separację gradientu gęstości F ccal, jak opisano w poniższych filmach dostępnych w JoVE po wyizolowaniu.

Inkubować oczka w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, 1% streptomycyny penicyliny i 20 milimolowych hałdach na szalkach Petriego przez 24 do 48 godzin. Użyj oczek w ciągu dwóch dni, aby zapewnić spójne rezultaty. Następnie należy przygotować świeży bufor wodorowęglanowy Ringera Krebsa, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, z jednym roztworem zawierającym dwie milimolowe glukozy i drugim zawierającym 14-milimolową glukozę.

Podgrzej roztwory w 50-mililitrowych stożkowych probówkach, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj plamę na izolowane oczka, dodając pięć mikromolów 4:02 AM i DMSO oraz 2,5 mikromola RH 1 23 i 100% etanolu do dwóch mililitrów buforu Krebsa zawierającego dwa milimole glukozy. Następnie nabierz oczka za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów i inkubuj je w plamie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po zabarwieniu załaduj około 20 oczek do urządzenia przez wlot mikrokanalików glukozy. Skieruj oczka do komory, zalewając bufor z wylotu z powrotem do wlotu. Następnie perfaktoruj oczka i buforuj przez 10 minut, aby zmyć nadmiar barwników.

Najpierw przeprowadź przez system dwumilimolowy bufor wodorowęglanu pierścienia Krebsa przez pięć minut, aby ustalić normalną linię bazową impulsu. Następnie stymuluj komorę 14-milimolowym buforem glukozy przez 15 minut, a następnie przemywaj 15 minut dwumilimolowym buforem glukozy. Podczas tego procesu zapisz 510 nanometrów dla dwóch emisji, wzbudzając dietę 340 nanometrów i 380 nanometrów.

Zarejestruj również emisję 530 RH 1 23 poprzez usunięcie barwnika na 480 nanometrach. Aby zminimalizować zakłócenia konwekcyjne podczas modulacji tlenu, zastosuj przepływ buforowy podczas etapów stymulacji i płukania i upewnij się, że przepływ został zatrzymany na pozostałych etapach podczas testowania. Zbieraj ścieki z wylotu glukozy w jednominutowych odstępach w celu wykorzystania w dodatkowej analizie przy użyciu podejścia mikroprzepływowego pokazanego na tym filmie, możliwe jest szybkie regulowanie procentu tlenu przepływającego przez cienką membranę PDMS za pomocą skomputeryzowanych mikrowtryskiwaczy.

Oto przykład tej modulacji w zakresie od jednej minuty do sześciu minut. Możliwe jest również zapewnienie ilościowych modulacji tlenu w czasie poniżej minuty w zakresie od dwóch do 8,5 części na milion poprzez dostarczanie tlenu od pięciu do 21%Niebieska linia pokazuje procent dostarczonego tlenu, a zielona to wynikowy rozpuszczony tlen w częściach na milion. Kiedy ten cykl jest stosowany w celu wytworzenia przerywanego niedotlenienia na oczkach, można zaobserwować korzyści płynące ze wstępnego kondycjonowania oczek przeciwko niedotlenieniu w porównaniu z nieregularnym pulsem normoksycznym, obserwując poprawę proporcji po leczeniu efekty niedotlenienia i przerywanego niedotlenienia, które można zaobserwować w przeregulowaniu i tłumieniu oscylacji stanów przejściowych wapnia, jak pokazano tutaj na niebiesko, jest odpowiedzią normoksyczną.

Na czerwono zaznaczona jest reakcja niedotlenienia, a zielona linia to uwarunkowana reakcja niedotlenienia. Przedstawiono tutaj pomiar wapnia, potencjału mitochondrialnego i insuliny. Są to wyniki mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym i testu EISA poza chipp, wykorzystującego razem wycieki mikroprzepływowe z systemu, które zaczynają budować multimodalny obraz odpowiedzi glukozy na insulinę w stanie przejściowym niedotlenienia.

Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, jednego dnia w celu wytworzenia urządzenia i wyizolowania komórek powieki oraz jednego dnia w przypadku samych eksperymentów z powiekami. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zweryfikowaniu dostarczonego stężenia tlenu poprzez połączenie z gazem urządzenia po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się ujściem płodu i inną mikrofizjologią tkanek do zbadania, w jaki sposób niedotlenienie i tymczasowe wzorce tlenu mogą wpływać na choroby takie jak cukrzyca, zaburzenia sercowo-naczyniowe i neurologiczne.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kontrolować modulację tlenu, manipulować mikrotkankami i generować powtarzalne, znaczące pomiary niedotlenienia tkanek za pomocą multimodalnych urządzeń mikroprzepływowych.