Ilościowa i czasowa kontrola mikrośrodowiska tlenu na poziomie pojedynczej wyspy trzustkowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zastosowanie krótkotrwałej, przerywanej hipoksji w skali minutowej do mikroskalowych wysepek trzustkowych w celu zbadania efektów prekondycjonowania. Jest to realizowane poprzez najpierw wykonanie multimodalnego urządzenia mikrofluidycznego z cienką membraną przepuszczalną dla gazów. Drugim krokiem jest stworzenie zautomatyzowanego systemu modulacji tlenu.

Następnie oczka są ostrożnie umieszczane w urządzeniu, a następnie podłączane są mikroprzepływy cieczy i tlenu. Ostatnim krokiem jest skoordynowanie mikroskopii z multimodalnymi mikroprzepływami w celu wizualizacji parametrów oczka, które zmieniają się podczas modulacji poziomu tlenu. Ostatecznie zastosowano technikę przerywanego niedotlenienia oczka, aby wykazać, że odpowiedź glikemiczna jest wyraźnie upośledzona w warunkach hipoksji.

Podczas gdy czasowe modulacje hipoksji mogą trenować organy eyelids, aby reagowały z mniejszym upośledzeniem, główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pomiar tlenu rozpuszczonego czy stosowanie komory hipoksycznej, jest możliwość precyzyjnego dostarczania określonego stężenia tlenu do powiek w szybkich, minimalnych odstępach czasu, bez stresu ścinającego wynikającego ze skomplikowanych przepływów.

Umożliwia ono również monitorowanie w czasie rzeczywistym za pomocą fluorescencji i mikroskopii. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie transplantacji allogenicznych, takie jak zdefiniowanie upośledzeń wywołanych hipoksją w miejscach przeszczepienia lub opracowanie schematów prekondycjonowania w celu poprawy wyników transplantacji. Zatem metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat hipoksji allogenicznej.

Metodę tę można zastosować również w odniesieniu do innych tkanek i układów, takich jak ośrodkowy układ nerwowy, tkanki serca, nerki oraz inne organy do transplantacji. Demonstracja wideo tej metody jest kluczowa, ponieważ wiele etapów wytwarzania urządzenia i obsługi przelotek jest trudnych do opanowania ze względu na nowatorski, interdyscyplinarny charakter techniki, choć stają się one łatwiejsze po zapoznaniu się z nimi. Należy rozpocząć od wykonania warstwy pokrywy urządzenia mikroprzepływowego.

Aby to osiągnąć, wlej do pustej szalki Petriego wymieszany PDMS firmy DGA do wysokości 1,5 milimetra i utwardzaj w temperaturze 80 °C przez dwie godziny. Następnie przygotuj warstwę mikrofluidyczną do glukozy z matrycą komory perfuzyjnej, nakładając metodą spin coatingu dwie warstwy SU 8 21 50 o grubości 350 mikronów każda, aby utworzyć pojedynczą warstwę o grubości 700 mikronów na czterocalowym waflu krzemowym. Następnie naświetl go promieniami UV przy użyciu maski fotolitograficznej warstwy mikrofluidycznej do glukozy, aby przenieść wzór mikrokanałów na warstwę SU 8.

Wypłucz nienaświetlony obszar wywoływaczem SU-8. Następnie wlej przygotowany wcześniej PDMS firmy DGA na warstwę MA do wysokości 3 mm i utwardź w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Po utwardzeniu wytnij glukozową warstwę mikroprzepływową w odpowiednim kształcie i użyj wycinaka o średnicy 2 mm do utworzenia portów wlotowego i wylotowego, a wycinaka o średnicy 8 mm do wykonania komory głównej.

Następnie przygotuj matrycę mikrootworów do unieruchamiania powieki, nanosząc metodą spin coatingu warstwę SU 8 2100 o grubości 100 micron na czysty czterocalowy wafle krzemowy, a następnie wykorzystaj litografię UV do przeniesienia wzoru mikrootworów na tę warstwę. Po ukończeniu matrycy mikrootworów wypłucz nienaświetlone obszary za pomocą developera. Nałóż dwie warstwy PDMS o grubości 100 micron, stosując spin coating przy 900 RPM przez 30 sekund, a następnie utwardzaj każdą warstwę przez 10 minut w temperaturze 80 degrees Celsius.

Po zakończeniu wykonaj otwory wlotowe i wylotowe o średnicy dwóch milimetrów. Na koniec przygotuj matrycę gazowego układu mikroprzepływowego, nakładając SU 8 2100 metodą wirową do grubości 100 mikronów, analogicznie jak w poprzedniej warstwie, a następnie ponownie przenieś wzory gazowego układu mikroprzepływowego za pomocą litografii UV. Nieutwardzone obszary wypłucz za pomocą wywoływacza.

Następnie wlej warstwę PDMS o grubości 1,5 mm na matrycę mikrofluidyki gazowej i utwardzaj w temperaturze 80 °C przez dwie godziny. Potem wytnij PDMS w odpowiedni kształt za pomocą żyletki. Następnie wykonaj w warstwie pokrywy otwory wlotowe i wylotowe o średnicy 2 mm, tak aby pokrywały się z otworami w pozostałych warstwach, co umożliwi połączenie wszystkich warstw ze sobą.

W pierwszej kolejności przygotuj je, oczyszczając powierzchnie taśmą klejącą, poddając je działaniu wyładowania koronowego, a następnie wyrównując warstwy ręcznie w następującej kolejności. Najpierw przymocuj membranę do dolnej warstwy gazowej, tak aby mikrootwory były skierowane do góry. Następnie przymocuj mikrofluidyczną warstwę glukozy na wierzchu membrany z mikrootworami.

Na koniec należy skleić warstwę wlotową i wylotową na samej górze, kapsułując cały zespół. Aby zapewnić szczelne połączenie, należy położyć na zespole obciążnik o masie 1 kg i wypiekać go w temperaturze 100 °C przez trzy godziny. Następnie należy sprawdzić szczelność.

Przetestuj urządzenie, wlewając wodę do warstwy wodnej, zanurzając urządzenie i przepuszczając powietrze przez warstwę gazową za pomocą strzykawki, sprawdzając jednocześnie, czy nie występują wycieki. Na koniec wysterylizuj urządzenia wolne od wycieków, przepuszczając 70% ethanol przez warstwę wodną przez jedną lub dwie minuty. Przygotuj mikrodozowniki, podłączając najpierw przewody sterujące mikrodozowników do dołączonych jednostek sterujących.

Następnie podłącz sterowniki do cyfrowej płyty wejść/wyjść (IO) w portach odpowiadających ich sterownikom w programie LabVIEW. Dalej, podłącz zasilacze DC o napięciu 5 V i 20 V do odpowiednich styków w jednostkach napędowych oraz podłącz cyfrową płytę IO do laptopa, aby uruchomić kody LabVIEW do sterowania przepływem gazów, zgodnie z opisem w dodatku do towarzyszącego protokołu tekstowego. Następnie podłącz jeden mikrodyspenser do azotu, a drugi do sprężonego powietrza, z których oba zawierają 5% carbon dioxide, i ustaw oba gazy na wartość 2 PSI. Połącz wyjścia dyspenserów w połączeniu typu T przed wprowadzeniem gazów do urządzenia mikrofluidycznego.

Następnie zamontuj urządzenie na podgrzewanym stoliku mikroskopu odwróconego, podłączając do niego tlen w stężeniach 0% i 21%. Następnie umieść światłowodowy czujnik tlenu przy wylocie cieczy z urządzenia, aby w czasie rzeczywistym mierzyć zawartość rozpuszczonego tlenu w wypływie. Następnie podłącz urządzenie do pompy perystaltycznej i rozpocznij przepływ wody przez urządzenie z prędkością 250 µL/min.

Zcharakteryzuj odpowiedź przejściową modulacji tlenu, cyklicznie zmieniając poziom tlenu w mikrodozownikach między 5% a 21%. Podłącz pompę perystaltyczną do urządzenia mikroprzepływowego i umieść rurki na płytce grzejnej o temperaturze 37 °C, aby ogrzać ciecz przed jej wprowadzeniem do urządzenia mikroprzepływowego. Ponadto podłącz port wyjściowy mikroprzepływowego układu glukozowego do kolektora frakcji. Następnie przeprowadź sekcję myszy C 57 black six i wyizoluj wysepki trzustkowe poprzez trawienie kolagenazą i rozdział w gradiencie gęstości Ficoll, zgodnie z opisem w następujących filmach dostępnych w JoVE po zakończeniu izolacji.

Inkubuj fragmenty rogówki (eyelets) w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny i streptomycyny oraz 20 mM HEPES w czarenkach Petriego przez 24 do 48 godzin. Wykorzystaj fragmenty rogówki w ciągu dwóch dni, aby zapewnić spójność wyników. Następnie przygotuj świeży bufor Krebsa-Ringer z wodorowęglanem, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, przygotowując jeden roztwór zawierający 2 mM glukozy oraz drugi zawierający 14 mM glukozy.

Podgrzej roztwory w 50 ml probówkach stożkowych, umieszczając je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie przygotuj barwnik dla wyizolowanych eyeletów, dodając 5 µM 4:02 AM i DMSO oraz 2,5 µM RH 1 23 i 100% etanol do 2 ml buforu Krebsa zawierającego 2 mM glukozy. Następnie pobierz eyelety pipetą o pojemności 10 µl i inkubuj je w barwniku przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

Po zabarwieniu należy załadować około 20 eyeletów do urządzenia poprzez wlot mikrokanału glukozy. Przesuń eyelety do komory, przepompowując bufor z wylotu z powrotem do wlotu. Następnie perfunduj eyelety i bufor przez 10 minut, aby wypłukać nadmiar barwników.

W pierwszej kolejności przepuść przez układ dwa milimolowy bufor Krebsa-Ringera z wodorowęglanami przez pięć minut, aby ustanowić prawidłową linię bazową tętna. Następnie stymuluj komorę buforem z 14 milimolowym stężeniem glukozy przez 15 minut, po czym przeprowadź 15-minutowe płukanie buforem z dwumilimolowym stężeniem glukozy. Podczas tego procesu rejestruj emisję przy 510 nanometrach dla dwóch kanałów, wzbudzając dielektryk przy 340 nanometrach i 380 nanometrach.

Należy również zarejestrować emisję 530 nm barwnika RH 1 23 poprzez wzbudzenie go przy 480 nanometrach. Aby zminimalizować zakłócenia konwekcyjne podczas modulacji tlenu, należy zastosować przepływ buforu podczas etapów stymulacji i płukania oraz upewnić się, że przepływ zostaje zatrzymany w pozostałych etapach testowania. Należy zbierać effluent z wylotu glukozy w odstępach jednominutowych do wykorzystania w dodatkowych analizach z wykorzystaniem podejścia mikrofluidycznego pokazanego w tym filmie; możliwe jest szybkie regulowanie procentowej zawartości tlenu przepływającego obok cienkiej membrany PDMS za pomocą komputerowych mikroinżektorów.

Oto przykład tej modulacji w zakresie od jednej do sześciu minut. Możliwe jest również zapewnienie ilościowych modulacji tlenu trwających poniżej minuty, w zakresie od 2 do 8,5 części na milion, poprzez dostarczanie tlenu w stężeniu od 5 do 21%. Niebieska linia przedstawia procent dostarczanego tlenu, a zielona wynikające z tego stężenie tlenu rozpuszczonego w częściach na milion. Gdy cykl ten jest stosowany w celu wywołania przerywanej hipoksji w eyeletach, można zaobserwować korzyści z prekondycjonowania eyeletów przeciwko hipoksji w porównaniu z nieregularnym impulsem normoksycznym, obserwując poprawę stosunku po zabiegu; efekty hipoksji i przerywanej hipoksji można zaobserwować w przeregulowaniu i tłumieniu oscylacji transientów wapniowych, co pokazano tutaj – na niebiesko przedstawiono odpowiedź normoksyczną.

Na czerwono zaznaczono odpowiedź na hipoksję, a zielona linia reprezentuje uwarunkowaną odpowiedź na hipoksję. Przedstawiono tutaj pomiary poziomu wapnia, potencjału mitochondrialnego oraz insuliny. Są to wyniki mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym oraz analizy EISA poza układem (off-chip), przeprowadzonej z wykorzystaniem odpływu mikrofluidycznego z systemu. Wspólnie dane te pozwalają na stworzenie multimodalnego obrazu odpowiedzi glukozy i insuliny podczas przejściowej hipoksji.

Po opanowaniu ta technika może zostać zrealizowana w ciągu dwóch dni, jeśli jest wykonywana prawidłowo: jeden dzień na wykonanie urządzenia i wyizolowanie komórek powieki oraz jeden dzień na same eksperymenty z powieką. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o weryfikacji dostarczanego stężenia tlenu poprzez kalibrację dozownika gazu w urządzeniu po jego przygotowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się mikrofizjologią tkanek płodowych i innych tkanek do zbadania, w jaki sposób hipoksja i przejściowe wzorce natlenienia mogą wpływać na schorzenia takie jak cukrzyca oraz zaburzenia sercowo-naczyniowe i neurologiczne.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak kontrolować modulację tlenu, manipulować mikrotkankami oraz generować powtarzalne i istotne pomiary hipoksji tkankowej z wykorzystaniem multimodalnych urządzeń mikroprzepływowych.