Name: Zoptymalizowane protokoły zarządzania szczepem Mycobacterium leprae: konserwacja i konserwacja zamrożonych stad u nagich myszy Athymic (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj zoptymalizowane protokoły przygotowania zawiesiny Mycobacterium leprae z tkanki mysiej, oceny żywotności bakterii oraz długoterminowego przechowywania zamrożonych szczepów w laboratorium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Beatriz G. C. Sartori, Lázarze M. Trino, Anie Elisie Fusaro i Cláudii P. M. Carvalho za pomoc techniczną. Dziękujemy Pranabowi K. Dasowi za wsparcie w tworzeniu ośrodka dla zwierząt. Dziękujemy Laisowi R. R. Costa, za korektę manuskryptu. Badanie to zostało wsparte grantami z Fundação Paulista contra Hanseníase i Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).

1. Przygotowanie zawiesiny Mycobacterium leprae
<ol>
	<li>Przed eutanazją atymimiczną nagą mysz (NU-Foxn1nu) przygotuj roztwór trypsyny i pożywkę hodowlaną (Protokół odczynników - Protokoły 1, 2 i 3). Eutanazja nagich myszy 4-5 miesięcy po zaszczepieniu M. leprae zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt: 2013 wydanie10 (eksperymenty i wykorzystanie zdjęć zwierząt zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). Wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego używanej do obchodzenia się ze zwierzętami wyczyść całą mysz 70% alkoholem etanolowym.</li>
	<li>Przytrzymaj tylną łapę za pomocą kleszczy hemostatycznych dystalnie do stawu stępu. Odetnij łapę nożyczkami poniżej kleszczy i zanurz łapę w 2% jodu na 20 minut. Następnie powtórz procedurę dla drugiej tylnej łapy.</li>
	<li>Przenieś łapy do czystej szafy bezpieczeństwa biologicznego w celu dalszej pracy. Wyjmij łapy z 2% jodu, osusz je sterylną gazą, a następnie zbierz dwie poduszki stóp za pomocą ostrza skalpela numer 22 lub 23, usuwając wszystkie tkanki miękkie (skórę właściwą, naskórek, ścięgna i nerwy) w pobliżu kości. Usuń kości śródstopia oraz 1. i 5. paliczki. Umieść materiał na sterylnej szalce Petriego i usuń naskórek, zeskrobując go ostrzem skalpela. Pokrój tkankę na małe kawałki nożyczkami i przenieś je do rurki o okrągłym dnie. Zważ tkankę i dodaj 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS). Trzymaj probówkę na lodzie, aby uniknąć rozgrzania próbki.</li>
	<li>Dodać kolejny 1 ml HBSS i homogenizować próbkę za pomocą homogenizatora tkankowego.
	<ol>
		<li>Pierwszy cykl homogenizacji: 3 impulsy po 15 sekund przy prędkości 4 (14 450 obr./min).</li>
		<li>Przenieść sklarowany osad do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, przepuszczając go przez sitko do komórek w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń. Pozwól, aby roztwór przeszedł grawitacyjnie.</li>
		<li>Dodać dodatkowe 2 ml HBSS i powtórzyć cykl homogenizacji (sekcja 1.4.1) i ponownie przepuścić próbki przez sitko do komórek.</li>
		<li>Opłucz sitko, dodając HBSS, aby doprowadzić objętość do 9 ml. Wyrzuć sitko do komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność 0,5% roztworu trypsyny. Dodać 1 ml trypsyny do 9 ml zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05% trypsyny. Wyrzuć pozostałą rozmrożoną trypsynę. Inkubować przez 60 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po inkubacji zwiększyć objętość do 40 ml, dodając sterylną sól fizjologiczną w celu rozcieńczenia trypsyny.</li>
	<li>Wirować przy 1 700 x g przez 30 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, ostrożnie odwracając probówkę. Zawiesić osad, stukając w probówkę, a następnie dodać 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Przenieść zawiesinę do nowej stożkowej rurki mierzącej końcową objętość zawiesiny (w celu obliczenia wydajności/gram tkanki).</li>
	<li>Homogenizować zawiesinę bakcylarną za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 26 G, przenosząc zawiesinę do nowej probówki.</li>
	<li>Przeprowadzić kontrolę mikrobiologiczną zawiesiny, umieszczając 2 krople (50 ul) w każdej pożywce: 7H9 i pożywce Lowensteina-Jensena i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 dni, w celu wykrycia skażających prątków. Podobnie, należy zaszczepić pożywkę do infuzji mózgowo-sercowej (BHI) i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, w celu wykrycia skażających bakterii tlenowych.</li>
	<li>Podwielokrotność zawiesiny przelać do probówek do barwienia: 35 μl do barwienia na zimno metodą Ziehl-Neelsen (protokół 2) i 200 μl do oznaczania żywotności (protokół 3).</li>
	<li>Po barwieniu metodą Ziehl-Neelsen (ZN) obliczyć liczbę pałeczek kwasoodpornych/ml (AFB/ml). W przypadku inokulacji u nagich myszy należy przygotować zawiesinę 1 x 108 AFB/ml; upewnić się, że objętość jest wystarczająca do zaszczepienia 30 μl/opuszkę na stopę/zwierzę (Protokół 5) i utrzymywać zawiesinę w niskiej temperaturze do momentu zaszczepienia. Do zamrożenia należy przygotować zawiesinę 1 x 107 AFB/ml (protokół 4).</li>
</ol>
2. Barwienie na zimno Ziehl-Neelsen 
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem barwienia należy przygotować roztwór surowicy/fenolu i roztwory barwiące ZN (Protokół odczynników - Protokoły 4 i 5). Narysuj trzy koła (średnica wewnętrzna 10 mm) na trzech szklanych szkiełkach za pomocą pisaka immunohistochemicznego. Zidentyfikuj szkiełka: (1) normalne lub nierozcieńczone, (2) 1:10 i (3) 1:100 za pomocą ołówka numer 2 (Uwaga: część grafitu blaknie po barwieniu ZEN).</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę bakcylarną (etap 1.10) do rozcieńczeń seryjnych w stosunku 1:10 i 1:100, tj. dodać 5 μl nierozcieńczonej zawiesiny i 45 μl soli fizjologicznej, następnie pobrać 5 μl roztworu 1:10 i dodać 45 μl soli fizjologicznej.</li>
	<li>Dodać 5 μl roztworu surowicy/fenolu i 10 μl zawiesiny bakcylarnej na okrąg. Homogenizuj i rozprowadź równomiernie w obszarze koła za pomocą uchwytu jednorazowej pętli. Poczekaj, aż zawiesina wyschnie na wypoziomowanym stole.</li>
	<li>Po wyschnięciu utrwal rozmaz, przesuwając szkiełko 3 razy po niebieskim płomieniu palnika Bunsena (łącznie około 20 sekund)11.</li>
	<li>W celu barwienia pokryć całą powierzchnię szkiełka przefiltrowaną karbofuchzyną Ziehl-Neelsen (około 5 ml) przez 20 min.</li>
	<li>Opłucz szkiełko pod bieżącą wodą (powolny przepływ).</li>
	<li>Przykryj szkiełko 10% kwaśnym roztworem alkoholu na około 20 sekund.</li>
	<li>Ponownie umyj szkiełko pod bieżącą wodą.</li>
	<li>Przykryj szkiełko roztworem błękitu metylenowego na 5 minut.</li>
	<li>Opłucz szkiełko pod bieżącą wodą i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Policz 20 pól/okrąg (łącznie 60 pól/slajd) za pomocą obiektywu zanurzeniowego 100X. Obliczanie prątków kwasoodpornych/ml (AFB/ml) przeprowadza się w następujący sposób, zgodnie z opisem w Technikach laboratoryjnych dla trądu12: 
	AFB/pole = całkowita liczba pałeczek znalezionych w 3 okręgach (60 pól) podzielona przez 60, 
	AFB/ml = AFB/pole x stała (pole koła x 100 podzielone przez obszar apertury soczewki obiektywu), a w przypadku liczenia rozcieńczonej zawiesiny pomnóż liczbę AFB/ml przez współczynnik rozcieńczenia (10 lub 100).</li>
</ol>
3. Określenie żywotności 
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem należy przygotować autoklawowaną zawiesinę M. leprae (Protokół odczynników - Protokół 7). Użyć odpowiedniego zestawu (patrz tabela odczynników i wyposażenia) do jakościowego oznaczania żywotności M. leprae w zawiesinie. Rozcieńczyć roztwory w następujący sposób (wszystkie procedury należy wykonywać przy słabym świetle): rozcieńczyć roztwór A przez współczynnik 10 w soli fizjologicznej (1 μl bulionu plus 9 μl soli fizjologicznej), rozcieńczyć roztwór B 20 przez współczynnik soli fizjologicznej (1 μl bulionu plus 19 μl soli fizjologicznej).</li>
	<li>Dodać 3,6 μl rozcieńczonego roztworu A i 6 μl rozcieńczonego roztworu B do 200 μl zawiesiny bakterii, która ma być badana (krok 1.10). Uprzednio autoklawowana zawiesina M. leprae jest rutynowo stosowana jako kontrola ujemna do barwienia żywotności.</li>
	<li>Inkubować zawiesiny przez 15 minut, w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 10 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 μl 10% glicerolu. Nanieść 8 μl na powierzchnię czystego szkiełka podstawowego i przykryć go małym szkiełkiem nakrywkowym. Przeanalizować szkiełko za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, zawierającego odpowiednie filtry (patrz zalecenia dotyczące sond molekularnych). Oceń wyniki, porównując barwienie Syto 9 (Sy) z barwieniem jodkiem propidyny (PI). 
	Uwaga: Barwnik Sy wnika w 100% zarówno w martwe, jak i żywe bakterie, a barwnik PI wnika tylko w bakterie z uszkodzonymi błonami. Autoklawizowana zawiesina (kontrola ujemna) może tworzyć grudki bakterii ze względu na obecność resztek komórkowych. Skala półilościowa stosowana do oceny żywych/martwych waha się od 0 do 2+; 0 oznacza, że mniej niż 30% komórek jest dodatnich pod kątem barwienia PI; 1+ oznacza, że od 30 do 50% komórek jest dodatnich pod kątem barwienia PI; 2+ oznacza, że ponad 50% komórek jest dodatnich pod kątem barwienia PI. Wynik 0 jest uważany za najbardziej odpowiedni do użycia.</li>
</ol>
4. Zamrażanie/rozmrażanie M. leprae Zawiesina
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem należy przygotować pożywkę zamrażającą (Protokół odczynników - Protokół 6). Aby zamrozić, wykonaj czynności opisane poniżej:
	<ol>
		<li>Dodać 150 μl zawiesiny zawierającej 1 x 107 AFB/ml do sterylnego kriowialu wraz z 1 ml pożywki do zamrażania.</li>
		<li>Umieścić kriowial w pojemniku do zamrażania i przechowywać pojemnik w temperaturze -80 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Przenieść zamrożoną fiolkę do pojemnika do przechowywania i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby rozmrozić, wykonaj czynności opisane poniżej:
	<ol>
		<li>Usunąć kriowial z zamrożoną zawiesiną z temperatury -80 °C i umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby rozpocząć rozmrażanie zawiesiny.</li>
		<li>Wlać zawiesinę do probówki zawierającej 20 ml jałowego roztworu soli fizjologicznej. Zawiesinę delikatnie wymieszać aż do zakończenia rozmrażania.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę przez 30 minut, w sile 1 700 x g, w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant i dodaj tyle sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby osiągnąć pożądaną objętość. Homogenizować zawiesinę, przepuszczając ją przez strzykawkę (krok 1.8).</li>
		<li>W przypadku barwienia ZEN, określania żywotności i inokulacji należy postępować zgodnie z protokołami 2, 3 i 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Szczepienie myszy 
<ol>
	<li>Do tej procedury potrzebne są dwie osoby, jedna do unieruchomienia myszy, a druga do podania inokulum. Ze zwierzęciem, które ma zostać zaszczepione, należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi i przepisami etycznymi, a wszystkie procedury muszą zostać zatwierdzone przez instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Powstrzymaj nagą mysz za kark z łapami skierowanymi do góry.</li>
	<li>Homogenizować zawiesinę, przepuszczając ją przez igłę o stężeniu 26 G. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml odessać wystarczającą ilość zawiesiny bakcylarnej, aby zaszczepić dwie opuszki stóp (30 μl/opuszkę stopy).</li>
	<li>Chwyć tylną łapę, przed wstrzyknięciem oczyść opuszkę stopy 70% alkoholem etanolowym i wprowadź igłę śródskórnie ze skosem igły skierowanym do góry, od bliższej do dalszej strony opuszki stopy. Wstrzyknąć 30 μl zawiesiny. Zastrzyki z opuszki stopy można wykonywać u znieczulonych myszy.</li>
	<li>Odczekać 5 sekund przed wyjęciem igły ze skóry, aby uniknąć refluksu inokulum. Myszy powinny być trzymane na miękkim ściółce po zaszczepieniu, a poruszanie się i oznaki samookaleczenia powinny być monitorowane.</li>
</ol>

<ol><li>Saúde, M. inistérioda, Brasil, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretaria+de+Vigil%C3%A2ncia+em+Sa%C3%BAde%3A+situa%C3%A7%C3%A3o+epidemiol%C3%B3gica+da+hansen%C3%ADase+no+Brasil.+Informe+epidemiol%C3%B3gico+2008%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Secretaria de Vigilância em Saúde: situação epidemiológica da hanseníase no Brasil. Informe epidemiológico 2008.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Scollard, D. M., Adams, L. B., Gillis, T. P., Krahenbuhl, J. L., Truman, R. W., Williams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuing+challenges+of+leprosy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The continuing challenges of leprosy.</a> Clin. Microbiol. Rev. 19 (2), 338-381 (2006).</li>
<li>Rosa, P. S., Belone, A. deF., Lauris, J. R., Soares, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-needle+aspiration+may+replace+skin+biopsy+for+the+collection+of+material+for+experimental+infection+of+mice+with+Mycobacterium+leprae+and+Lacazia+loboi%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Fine-needle aspiration may replace skin biopsy for the collection of material for experimental infection of mice with Mycobacterium leprae and Lacazia loboi.</a> Int. J. Infect. Dis. 14, 49-53 (2010).</li>
<li>Truman, R. W., Krahenbuhl, J. L. V. iableM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((leprae+as+a+research+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Lepr.+Other+Mycobact.+Dis%22%5BJournal%5D)">leprae as a research reagent.</a> Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 69 (1), 1-12 (2001).</li>
<li>Levy, L., Ji, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+foot-pad+technique+for+cultivation+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22Lepr.+Rev%22%5BJournal%5D)">The mouse foot-pad technique for cultivation of Mycobacterium leprae.</a> Lepr. Rev. 77 (1), 5-24 (2006).</li>
<li>Lahiri, R., Randhawa, B., Krahenbuhl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+viability-staining+method+for+Mycobacterium+leprae+derived+from+the+athymic+%28nu%2Fnu%29+mouse+foot+pad%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of a viability-staining method for Mycobacterium leprae derived from the athymic (nu/nu) mouse foot pad.</a> J. Med. Microbiol. 54 (3), 235-242 (2005).</li>
<li>Katoch, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contemporary+relevance+of+the+mouse+foot+pad+model+for+cultivating%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The contemporary relevance of the mouse foot pad model for cultivating.</a> 80 (2), 2-120 (2009).</li>
<li>Colston, M. J., Hilson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+freezing+and+storage+in+liquid+nitrogen+on+the+viability+and+growth+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of freezing and storage in liquid nitrogen on the viability and growth of Mycobacterium leprae.</a> J. Med. Microbiol. 12 (1), 1-137 (1979).</li>
<li>Portaels, F., Fissette, K., De Ridder, K., Macedo, P. M., De Muynck, A., Silva, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+freezing+and+thawing+on+the+viability+and+the+ultrastructure+of+in+vivo+grown+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Lepr.+Other+Mycobact.+Dis%22%5BJournal%5D)">Effects of freezing and thawing on the viability and the ultrastructure of in vivo grown mycobacteria.</a> Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis. 56 (4), 580-587 (1988).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+Veterinary+Medical+Association%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22%5BJournal%5D)">American Veterinary Medical Association.</a> AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Edition. Schaumburg, Illinois, USA, https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf. 1-102 (2013).</li>
<li>Saúde, M. inistérioda, Brasil, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guia+de+procedimentos+t%C3%A9cnicos+-+Baciloscopia+em+hansen%C3%ADase%2C+S%C3%A9rie+A%3A+Normas+e+manuais+t%C3%A9cnicos%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Guia de procedimentos técnicos - Baciloscopia em hanseníase, Série A: Normas e manuais técnicos.</a> , (2010).</li>
<li>Health Organization, W. orld, Geneva, , Laboratory techniques for leprosy Forthcoming.</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Bardzo potrzebny jest szczegółowy opis dobrze zilustrowanego, skutecznego protokołu rozmnażania M. leprae . Nasze badanie pokazuje, że protokół przygotowania inokulum przez filtrację i trawienie trypsyny pozwala na uzyskanie inokulum z bardzo małą ilością zanieczyszczeń komórkowych i z wysoką żywotnością pałeczek (wynik 0+). Wodorotlenek sodu został użyty do dezagregacji tkanki w celu oczyszczenia z pałeczek6. Badania przeprowadzone w naszym laboratorium z użyciem wodorotlenku sodu do oczyszczania M. leprae doprowadziły do powstania grudek prątków, co utrudniało homogenizację zawiesiny w celu określenia żywotności i inokulacji zwierząt (dane nie pokazane).
Potencjalne problemy napotkane podczas przygotowania inokulum przez filtrację i trawienie trypsyny obejmują dużą ilość resztek komórkowych i zanieczyszczenie inokulum czynnikami bakteryjnymi lub grzybiczymi. W przypadku, gdy po oczyszczeniu obserwuje się duże ilości resztek komórkowych, albo trypsyna nie jest już aktywna, albo występuje nadmierna ilość materiału biologicznego. Należy ocenić aktywność enzymatyczną roztworu podstawowego trypsyny. W przypadku podejrzenia nadmiernej ilości wyjściowego materiału biologicznego, materiał ten należy podzielić na podwielokrotności, a protokół należy przeprowadzić w oddzielnych partiach. Aby uniknąć zanieczyszczenia inokulum czynnikami bakteryjnymi lub grzybiczymi, należy zachować ostrożność w przetwarzaniu materiału w warunkach aseptycznych. W przypadku wykrycia skażenia grzybiczego i/lub bakteryjnego zawiesinę należy wyrzucić.
Ograniczeniem naszego protokołu jest subiektywność oceny żywotności przy użyciu opisanej metody półilościowej. Rentowność oceniana półilościowo jest bardziej praktyczna, choć mniej precyzyjna niż opublikowana metodailościowa6. Ocena żywotności 0+ i 1+ jest zadowalająca dla utrzymania rozmnażania i zamrażania M. leprae. Lahiri i wsp. wykazały już, że nagie myszy zaszczepione 80-90% żywotnym inokulum dają opuszki stóp odpowiednie do zbioru (pałeczki o wysokiej żywotności) po 4-5 miesiącach od zaszczepienia. Dlatego wczesna infekcja (około 4 miesięcy) jest najlepszym czasem zbiorów. W przypadku zbioru zamrożonych inokulantów, myszy w niniejszym protokole były utrzymywane w stanie zaszczepionym przez dłuższy okres (7 miesięcy), aby zagwarantować krzywe wzrostu. Kluczowym krokiem w celu zapewnienia odpowiedniej żywotności jest stosowanie świeżych zawiesin pałeczek, najlepiej w ciągu 24 godzin po pobraniu materiału biologicznego od gospodarza i przetworzeniu. Ponadto jakość odczynników, świeżo przygotowanej rozcieńczonej trypsyny i roztworów barwiących żywotność, jest niezbędna do zagwarantowania powtarzalnych wyników.
Innym ograniczeniem tego protokołu jest to, że ostateczna zawiesina M. leprae nie jest wolna od DNA gospodarza, RNA, białka itp. Dlatego należy dodać inne etapy oczyszczania, aby uzyskać zawiesinę M. leprae wolną od składników komórki gospodarza.
Opisano metodę utrzymywania żywotnych pałeczek poprzez zamrażanie całych próbek tkanek zmian chorobowych M. leprae 9. Jednak badanie przeprowadzone przez Portaelsa i wsp. wykazały znaczną utratę żywotności, wynoszącą od 65 do 97% po zamrożeniu i rozmrożeniu próbek tkanek zakażonych M. leprae uzyskanych z pancernika9. Nasz protokół wykazał, że wskaźnik żywotności obserwowany w zawiesinach M. leprae po zamrożeniu i rozmrożeniu spadł w porównaniu z podwielokrotnością, która nie została zamrożona (Tabela 1). Rzeczywiście, zamrożenie M. leprae Zawiesina w pożywce do zamrażania dawała żywotność w zakresie 50-70%, przy wyniku żywotności 1+, podczas gdy wynik żywotności 0+ uzyskano w zawiesinie niezamrożonej. Niemniej jednak namnażanie M. leprae było zadowalające po 7 miesiącach od inokulacji nagich myszy (Tabela 1). Inokulacja nagich myszy odtworzonymi próbkami utrzymywanymi w stanie zamrożonym przez 60 dni spowodowała średnio 100-krotny wzrost liczby pałeczek w porównaniu z początkowym inokulum. Wydaje się, że zamrożenie zawiesiny M. leprae w pożywkach do zamrażania, zamiast w zakażonych próbkach tkanek, jest bardziej efektywne. Krytycznym krokiem naszego protokołu jest powolne zamrażanie AFB w pojemniku do zamrażania, niezbędne do utrzymania żywotności pałeczek, jak wykazano przez Colstona i Hilsona8. W przyszłości zostaną przeprowadzone eksperymenty w celu oceny żywotności pałeczek po dłuższych okresach zamrażania.
Podsumowując, ponieważ M. leprae nie rośnie in vitro, nasz protokół pozwala na szybką i łatwą alternatywę dla utrzymania żywotnego inokulum, a udany etap zamrażania umożliwia utrzymanie szczepów bez ciągłego przenikania u zwierząt, umożliwiając w ten sposób utworzenie banku zdefiniowanych szczepów.
Ta sekcja zawiera instrukcje dotyczące przygotowania odczynników do wykonania tego protokołu.
1. Trypsyna
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trypsyna</td>
			<td>0,5 grama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 100 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Filtruj sterylizację. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Godzina 7H9
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baza bulionowa 7H9</td>
			<td>4,7 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% zapasów glicerolu</td>
			<td>Pojemność 5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 900 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Wymieszaj bazę z wodą, a następnie dodaj glicerol, mieszając. Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Napar z mózgu i serca (BHI)
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BHI powiedział:</td>
			<td>37 gramów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 1 000 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Surowica fenolowa
4.1) 5% fenolu
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fenol</td>
			<td>Pojemność 5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 100 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
4.2) Fenol w surowicy
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>płodowa surowica bydlęca</td>
			<td>Pojemność 2 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% fenolu</td>
			<td>Pojemność 98 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Roztwory do barwienia na zimno Ziehl-Neelsen
5.1) KarboFuchsyna
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fuchsin powiedział:</td>
			<td>1 gramów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kryształy fenolu stopione do temperatury 60 °C</td>
			<td>Pojemność 5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czysty alkohol etylowy</td>
			<td>Pojemność 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda destylowana</td>
			<td>do 100 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Filtruj przed każdym użyciem.
5.2) Niebieska baza metylenowa
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Błękit metylenowy</td>
			<td>3 gramów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% alkoholu etylowego</td>
			<td>do 200 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
5.3) Kwas alkoholowy
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70% alkoholu</td>
			<td>Pojemność 990 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kwas chloridowy</td>
			<td>Pojemność 10 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
6. Podłoże do zamrażania:
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organizacja OADC (Organizacja Zarządzania T</td>
			<td>Pojemność 10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicerol</td>
			<td>Pojemność 20 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 średni</td>
			<td>do 100 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Autoklaw glicerolu przed użyciem i sterylizuj OADC przez filtrację.
7. Autoklawizowana zawiesina M. leprae
Autoklaw w temperaturze 121 °C przez 20 min. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

Trąd, choroba wywoływana przez Mycobacterium leprae, jest ważnym problemem zdrowia publicznego w wielu krajach na całym świecie1,2. Pomimo tego, że jest znana jako choroba zakaźna, która atakuje zarówno skórę, jak i nerwy obwodowe, nadal istnieje kilka luk w wiedzy na temat mechanizmów zaangażowanych w złożoną immunopatogenezę choroby.
Wśród trudnych cech M. leprae, które utrudniają jego badanie, są jego niezdolność do wzrostu w sztucznych pożywkach hodowlanych i stosunkowo długi czas podwojenia (około 14 dni)3,4. Większość procedur eksperymentalnych z użyciem M. leprae opiera się na prątkach oczyszczonych ze zmian skórnych pacjentów z trądem lub z eksperymentalnych modeli zwierzęcych, takich jak pancerniki i kilka szczepów myszy5,6.
Przez wiele lat badacze polegali na oczyszczaniu M. leprae ze zmian skórnych u pacjentów z trądem wielopałeczkowym do wykorzystania w procedurach eksperymentalnych. Próbowano stworzyć kilka warunków laboratoryjnych dla hodowli in vitro lub utrzymania żywego M. leprae, ale do tej pory modele zwierzęce okazały się najbardziej odpowiednie do celów badawczych. W latach sześćdziesiątych i siedemdziesiątych XX wieku naukowcy zaczęli wykorzystywać myszy i pancerniki do wykrywania i oceny żywotności M. leprae, monitorowania wzrostu bakterii w odpowiedzi na leki anty-M. leprae oraz we wzroście i utrzymaniu szczepów prątków2,4.
Modele zwierzęce mają pewne ograniczenia, szczególnie u pancerników i naczelnych, w tym kwestie etyczne, koszty utrzymania, specjalną infrastrukturę potrzebną do utrzymania zwierząt oraz słabą powtarzalność wyników i końcowych plonów. Obecnie myszy są preferowanym zwierzęciem modelowym do badań nad trądem. Warunki laboratoryjne do wykorzystania myszy są łatwo dostępne, łatwe do wykonania i pozwalają na ustandaryzowane protokoły7,8,9. Nagie myszy były wykorzystywane do utrzymania szczepów M. leprae, ponieważ nawet przy niskim obciążeniu żywotnymi pałeczkami, odpowiedź immunologiczna z niedoborem limfocytów T prowadzi do wybujałego tworzenia ziarniniaków i dobrego namnażania się bakterów. W ten sposób ten zwierzęcy model zyskał szeroką akceptację w społeczności badawczej zajmującej się trądem.
W niniejszym raporcie opisujemy prosty protokół enzymatycznego oczyszczania pałeczek z opuszków nagich myszy, przeznaczony do przygotowania zawiesiny M. leprae z minimalną ilością resztek komórkowych i o wysokim wskaźniku żywotności bakterii. Żywotność określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, którą można szybko wykonać w laboratorium. Pokazujemy również modyfikację standardowej metody liczenia pałeczek poprzez barwienie na zimno metodą Ziehl-Neelsen i mikroskopię świetlną. Dodatkowo przedstawiamy alternatywny protokół utrzymania i przechowywania szczepów M. leprae, pozwalający na zamrażanie i rozmrażanie zapasów bakteryjnych.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do żywotności bakterii BacLight</td><td>Invitrogen; Sondy molekularne</td><td>L7007</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Cryo 1 &deg; C Pojemnik do zamrażania</td><td>Nalgene</td><td>5100001</td><td></td></tr><tr><td>Lowenstein-Jensen medium</td><td>LB Laborclin</td><td>901122</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>TEK Nova Inc</td><td>S5812</td><td></td></tr><tr><td>Pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml/stożkowa podstawa</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek&nbsp; - 40 &mikro; m Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T-7409</td><td></td></tr><tr><td>Baza bulionowa Middlebrook 7H9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0178 Fluka</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Gibco BRL</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Napar z mózgu (BHI)</td><td>Oxoid LTDA</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Fuchsin</td><td>Merck Millipore</td><td>1159370025</td><td></td></tr><tr><td>Fenol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15509037</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Merck Millipore</td><td>EX02764</td><td></td></tr><tr><td>Kwas klorydryczny</td><td>Merck</td><td>1131349010</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook OADC (kwas oleinowy-albumina-dekstroza-katalaza)</td><td>Becton Dickinson</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco; LifeTechnologies</td><td>26140079</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowane protokoły zarządzania szczepem mycobacterium leprae: konserwacja i konserwacja zamrożonych stad u nagich myszy athymic

Optimized Protocols for Mycobacterium leprae Strain Management: Frozen Stock Preservation and Maintenance in Athymic Nude Mice

Trąd, wywołany przez Mycobacterium leprae, jest ważną chorobą zakaźną, która nadal występuje endemicznie w wielu krajach na całym świecie, w tym w Brazylii. Obecnie nie są znane żadne metody hodowli M. leprae in vitro, co stanowi poważną przeszkodę w badaniach nad tym patogenem w laboratorium. Dlatego utrzymanie i wzrost szczepów M. leprae zaleca się przeprowadzać u atymicznych myszy nagich (NU-Foxn1 nu). Warunki laboratoryjne do wykorzystania myszy są łatwo dostępne, łatwe do wykonania i pozwalają na standaryzację i opracowanie protokołów w celu uzyskania powtarzalnych wyników. W niniejszym raporcie opisujemy prosty protokół oczyszczania z pałeczek z nagich opuszków myszy za pomocą trypsyny, który daje zawiesinę z minimalną ilością resztek komórkowych i wysokim wskaźnikiem żywotności bakterii, określonym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Zademonstrowano również modyfikację standardowej metody liczenia pałeczek za pomocą barwienia Ziehla-Neelsena i mikroskopii świetlnej. Dodatkowo opisujemy protokół zamrażania i rozmrażania zapasów pałeczek jako alternatywny protokół utrzymania i przechowywania szczepów M. leprae.

Powodzenie protokołu można ocenić na trzy sposoby. Po pierwsze, ocenę jakości inokulum określa się na podstawie ilości zanieczyszczeń komórkowych oraz wynikowego procentu żywych prątków w końcowej zawiesinie (patrz Protokół 3). Jak pokazano na rycinach 1 i 2, końcowa zawiesina prątków zawierała bardzo mało zanieczyszczeń komórkowych i charakteryzowała się wysoką żywotnością (wynik 0+); należy zauważyć, że większość prątków została zabarwiona zielonym barwnikiem fluorescencyjnym Syto 9 (barwnik przenika przez 100% bakterii martwych i żywych, rycina 1), a tylko nieliczne prątki zostały zabarwione czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym PI (barwnik przenika tylko przez bakterie z uszkodzonymi błonami, rycina 2).
<img alt="Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego; ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego w komórkach." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Barwienie zawiesiny M. leprae barwnikiem Syto 9. Zielona fluorescencja wskazuje obecność żywych i martwych M. leprae. 400X.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; czerwone cząsteczki; analiza struktury komórkowej; wzbudzenie optyczne." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50620/50620fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Barwienie PI zawiesiny M. leprae. Czerwona fluorescencja wskazująca na niewielką liczbę martwych M. leprae. Powiększenie 400X.
Po drugie, inokulum o wysokiej żywotności wpłynie na namnażanie się prątków w stopach zwierząt 4-5 miesięcy po inokulacji, co doprowadzi do rozwoju wyraźnych zmian makroskopowych, jak pokazano w filmie (Protokół 1). Trzecim sposobem oceny skuteczności protokołu jest analiza przeżywalności i namnażania się AFB w stopach myszy inokulowanych prątkami, które były zamrożone przez różne okresy czasu (patrz Protokół 4).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Eksperyment (zwierzęcy)</td>
			<td>Liczba AFB/ml zamrożona w dniu 0</td>
			<td>Wskaźnik żywotności/dzień 0</td>
			<td>Okres mrożenia (dni)</td>
			<td>Liczba zaszczepionych prątków kwasoodpornych (AFB) po zamrożeniu</td>
			<td>Wskaźnik żywotności po zamrażaniu</td>
			<td>Liczba odzyskanych AFB/ml po 7 miesiącach </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 (1)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>60</td>
			<td>1,7 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>2,3 x 108</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 (2)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>60</td>
			<td>1,7 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>3,8 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 (3)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>60</td>
			<td>1,7 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>8,5 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 (4)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>60</td>
			<td>1,7 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>4,6 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 (1)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>15</td>
			<td>4,2 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>1,7 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 (2)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>15</td>
			<td>4,2 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>4,8 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 (3)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>15</td>
			<td>4,2 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>8,6 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 (1)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>15</td>
			<td>1,7 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>1,2 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 (2)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>15</td>
			<td>1,7 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>1,8 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 (3)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>15</td>
			<td>1,7 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>1,8 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 (4)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>15</td>
			<td>1,7 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>2,6 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 (5)</td>
			<td>1,0 x 107</td>
			<td>0+</td>
			<td>15</td>
			<td>1,7 x 105</td>
			<td>1+</td>
			<td>3,7 x 106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Wyniki namnażania M. leprae z wykorzystaniem zawiesin po zamrażaniu.
Tabela 1 przedstawia wyniki wzrostu M. leprae z wykorzystaniem zawiesin po zamrożeniu. Wynik żywotności zawiesin po rozmrożeniu wyniósł 1+. Protokół zamrażania przeprowadzono w trzech niezależnych eksperymentach, aby przetestować różne okresy zamrażania. W obu eksperymentach z inokulatem zamrożonym na 15 lub 60 dni wynik był podobny; namnażanie po zamrożeniu doprowadziło do 10–1000-krotnego wzrostu liczby AFB odzyskanych z każdej poduszki stopy po 7 miesiącach od inokulacji (Tabela 1). Zatem zamrożenie zawiesin M. leprae w medium 7H9 uzupełnionym o OADC (kwas oleinowy-albumina-dekstroza-katalaza) pozwoliło na zachowanie żywotności.
Użyto trzech inokulum do oceny namnażania M. leprae po dwóch różnych okresach mrożenia (15 i 60 dni). Po 7 miesiącach prątki odzyskano z poduszek stóp inokulowanych myszy i policzono po barwieniu metodą Ziehla-Neelsena. Półilościowa skala żywotności: 0 oznacza brak do 30% komórek barwionych PI; 1+ oznacza od 30-50% komórek barwionych PI; 2+ oznacza powyżej 50% komórek barwionych PI. AFB: prątki kwasoodporne.

Mycobacterium leprae, czynnik wywołujący trąd, nie rośnie in vitro. Opisujemy łatwy do naśladowania protokół przygotowania zawiesiny bakteryjnej, aby zapewnić utrzymanie dużych ilości M. leprae do różnych zastosowań. Szczegółowo opisano protokoły rozmnażania przez inokulację opuszki myszy na puszystej podeszwie, ocenę żywotności, zamrażanie i rozmrażanie stada prątków.

Zoptymalizowane protokoły zarządzania szczepem Mycobacterium leprae: konserwacja i konserwacja zamrożonych stad u nagich myszy Athymic

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is an important infectious disease that is still endemic in many countries around the world, including Brazil. ...

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie sposobu przygotowania wysoce żywotnej zawiesiny lipidowej prątków do podania myszom nude. Pobierzemy materiał biologiczny od zakażonej myszy, najlepiej we wczesnym stadium infekcji.Aby zagwarantować wysoką przeżywalność uzyskanych narządów, przeprowadź eutanazję zwierzęcia wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Zatamuj tętnice udowe za pomocą kleszczyków hemostatycznych. Odetnij kończyny i zanurz je w 2% jodzie na 20 minut. W celu dekontaminacji utrzymaj kończynę w pozycji z poduszką stopy skierowaną do góry.Pobierz tkankę miękką. Za pomocą ostrza skalpela usuń kości pierwszej i piątej paliczki, aby ułatwić homogenizację tkanki. Umieść tkankę w sterylnej szalce Petriego. Zeskrob naskórek.Pokrój tkankę ziarninową nożyczkami na małe kawałki i odstaw je do późniejszego obliczenia wydajności tkanki. Przenieś małe kawałki do probówki zawierającej 1 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa. Dodaj kolejny 1 ml roztworu Hanksa i homogenizuj tkankę trzy razy po 15 sekund przy prędkości 4.Umieść sitko do oddzielania komórek w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Przenieś zawiesinę pipetą na sitko i pozwól roztworowi przepłynąć pod wpływem grawitacji. Aby usunąć zanieczyszczenia, dodaj do zawiesiny kolejne 2 ml roztworu Hanksa i ponownie ją zhomogenizuj.Stosując ten sam cykl, przepuść zawiesinę przez to sito. Przepłucz sito, dodając roztwór Hanksa. Aby doprowadzić całkowitą objętość zawiesiny do 9 ml, dodaj do niej 1 ml 0,5% roztworu trypsyny, aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 0,05%.Wymieszać zawartość, delikatnie odwracając probówkę, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Po inkubacji uzupełnić objętość zawiesiny do 4 mL, dodając sterylną sól fizjologiczną, a następnie wirować przy 1700 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadosad i resuspendować osad, opukując probówkę. Dodać 1 mL soli fizjologicznej i wymieszać.Przenieś zawiesinę do nowej probówki. Uhomogenizuj zawiesinę naczyniową, używając strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 26 G, przenosząc zawiesinę do nowej probówki. Przeprowadź kontrolę mikrobiologiczną zawiesiny, nakładając dwie krople na podłoże 18 oraz na podłoże BHI (brain heart infusion).11 Stein Genesen inkubowano w temperaturze 37°C. Następnie zastosowano rutynowe procedury kontroli mikrobiologicznej w celu przeprowadzenia barwienia według kodu Z.Przygotować rozcieńczenia zawiesiny S w soli fizjologicznej w stosunku 1:10 oraz 1:100. Każde rozcieńczenie należy zhomogenizować przed przygotowaniem preparatów do liczenia. Przygotować trzy szkiełka przedmiotowe, rysując na powierzchni każdego z nich trwałą markerem trzy okręgi o średnicy wewnętrznej 10 mm.Następnie obrysuj okręgi za pomocą pisaka do immunohistochemii. Opisz te pola ołówkiem numer dwa, przygotowując pola dla trzech stężeń: nierozcieńczonego, 1:10 oraz 1:100.Do każdego okręgu pipetuj 5 µL roztworu surowicy z fenolem oraz 10 µL zawiesiny sary, homogenizuj i równomiernie rozprowadź zawiesinę na całej powierzchni okręgu. Za pomocą trzonka jednorazowej pętliki umieść preparaty na płaskim stole do wyschnięcia. Po wyschnięciu utrwal je, przechodząc trzy razy nad niebieskim płomieniem, trzymając zawiesiny bachelor skierowane do góry.Wykonaj podtrzymanie kodu Zuni. Zbadaj te preparaty. Trzy rozcieńczenia.Wybierz najodpowiedniejsze rozcieńczenie do zliczania sary. Przygotuj 200 µL zawiesiny sary zabitej poprzez autoklawowanie zawiesiny naczyniowej przez 30 minut w temperaturze 121 °C. Do barwienia fluorescencyjnego lipidów mikrobakteryjnych użyj zestawu do badania żywotności bakterii L 7 0 0 7 live dead back light.Przygotować rozcieńczenie 1:10 roztworu A oraz rozcieńczenie 1:20 roztworu B bezpośrednio przed użyciem. Do każdych 200 µL nierozcieńczonej zawiesiny naczyniowej, oryginalnej i utrwalonej, dodać 3,6 µL rozcieńczonego roztworu A oraz 6 µL rozcieńczonego roztworu B. Po 15 minutach inkubacji w ciemności odwirować zawiesinę przy 10 600 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz za pomocą pipety.Resuspender osad w 50 µL 10% glicerolu, homogenizując go poprzez pipetowanie w górę i w dół. Nanieść 8 µL każdej zawiesiny na szkiełko przedmiotowe i przykryć małym szkiełkiem nakrywką. Chronić przed światłem.Obserwować zawiesiny pod mikroskopem fluorescencyjnym. Przygotować zawiesinę o stężeniu od 10 do siedmiu BA lip na ml, wlewając 1 ml medium do mrożenia do każdej fiolki kriogenicznej. Następnie dodać 150 µL zawiesiny S do 1 ml medium do mrożenia i ujednorodnić mieszaninę poprzez odwracanie probówki.Umieść probówkę kriogeniczną w pojemniku do mrożenia. Przechowuj pojemnik w temperaturze -80°C przez co najmniej 24 godziny. Przenieś probówki do pudełka do przechowywania i utrzymuj je w temperaturze -80°C do czasu rozmrażania.Rozmrozić zamrożoną zawiesinę w kąpieli wodnej ustawionej na 37 °C. Przenieść zawiesinę do probówki stożkowej zawierającej 20 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Odwirować w celu zagęszczenia.Linie baline prowadzono zgodnie z protokołem podtrzymującym Z w celu zliczania oraz protokołem barwienia fluorescencyjnego w celu określenia żywotności. Przygotowano zawiesinę zawierającą od 10 do 8 BA na posiłek, homogenizując ją przed inokulacją każdego zwierzęcia. Pobrano 100 µL do strzykawki insulinowej i inokulowano 30 µL w tylne poduszki stóp każdego zwierzęcia w badaniu określania żywotności.Zielona fluorescencja jest obserwowana we wszystkich BAI, a czerwona fluorescencja tylko w przypadku bai. Gdy BAI stanowią kontrolę ujemną, obserwuje się taką samą intensywność zielonego i czerwonego światła BAI. Inokulacja M Lepar zamrożonych przez różne okresy skutkuje 10 do 1000-krotnym wzrostem liczby odzyskanych BAI po siedmiu miesiącach.Na koniec chcielibyśmy dodać, że ponieważ IL leid nie rośnie in vitro, niniejszy protokół zapewnia szybki i łatwy sposób utrzymania żywych yl Leid do dalszych zastosowań laboratoryjnych.

optimized-protocols-for-mycobacterium-leprae-strain-management-frozen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zoptymalizowane Protokoły dla Zarządzania Szczepami Mycobacterium leprae: Przechowywanie i Utrzymywanie Wstrzykiwań w Myszach Nagich Atymicznych

Do badania patogenezy Hc wykorzystano myszy C57BL/6, które stanowią najlepszy model. Badamy potencjalne korzyści z odporności humoralnej przeciwko temu grzybowi i wytworzyliśmy kilka przeciwciał monoklonalnych (mAbs) [przeciwko histonie H2B oraz białku szoku termicznego 60kDa], których skuteczność ochronną przetestowano po podaniu domięśniowym.

Pasywna administracja przeciwciał monoklonalnych przeciwko H. capsulatum oraz innym patogenom grzybiczym

Ten film demonstruje skuteczną technikę homogenizacji w celu wygenerowania emulsji antygenowo-adiuwantowej do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) w modelu mysim. Emulsja zawiera autoantygen — glikoproteinę mielinową oligodendrocytów (MOG) — w fazie wodnej, otoczoną ciągłą fazą olejową zawierającą inaktywowane bakterie chorobotwórcze. Emulsja zapewnia przedłużone uwalnianie antygenów w celu przedłużenia odpowiedzi immunologicznej.

Przygotowanie emulsji z adiuwantem antygenowym w celu wywołania autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Ten film demonstruje metodę generowania mysiego modelu mysiego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Po indukcji PMU przez wstrzyknięcie do ciała szklistego zabitych termicznie Mycobacterium tuberculosis u myszy uprzednio uodpornionej tym samym immunogenem, postęp przewlekłego stanu zapalnego w oku jest analizowany za pomocą obrazowania i badania...

Mysi model prątkowego zapalenia błony naczyniowej oka do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Ten film demonstruje test do monitorowania migracji komórek dendrytycznych po zakażeniu opuszki stopy Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG u myszy. Po zakażeniu bakteryjnym aktywowane komórki DC skóry są znakowane przepuszczalnym dla komórek barwnikiem estru sukcynimidylu dioctanu karboksyfluoresceiny (CFSE). Po odpowiednim odstępie czasu na migrację DC do węzła chłonnego drenującego podniebienie, komórki węzła są izolowane i poddawane barwieniu immunologicznemu w celu uzyskania...

Test oparty na CFSE do monitorowania migracji komórek dendrytycznych skóry do drenujących węzłów chłonnych u zakażonych myszy

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Opisane tutaj są trzy eksperymentalne podejścia do badania dynamiki infekcji HIV u humanizowanych myszy. Pierwsza z nich pozwala na badanie przewlekłych zdarzeń infekcyjnych, podczas gdy dwie ostatnie pozwalają na badanie ostrych zdarzeń po pierwotnym zakażeniu lub reaktywacji wirusa.

Przewlekłe, ostre i reaktywowane zakażenie wirusem HIV w humanizowanych modelach myszy z niedoborem odporności

Ten protokół opisuje kroki do wywołania Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) u myszy. Ta metoda przedstawia kroki, które pomogą w wytworzeniu niezawodnego i solidnego zapalenia oka w systemie modelu mysiego. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy oczy błony naczyniowej oka i nieobjęte stanem zapalnym inne oczy od pojedynczych zwierząt w celu dalszej oceny za pomocą testów immunologicznych, transkryptomicznych i proteomicznych.

Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Aby wywołać eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia, zwierzęcy model stwardnienia rozsianego, myszy są immunizowane emulsją typu woda w oleju zawierającą autoantygen i kompletny adiuwant Freunda. Chociaż istnieje kilka protokołów przygotowania tych emulsji, tutaj przedstawiono szybki, prosty i ustandaryzowany protokół homogenizacji do przygotowania emulsji.

Szybka, prosta i standaryzowana metoda homogenizacji do przygotowania emulsji antygenowych/adiuwantowych do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Myszy są ogólnie odporne na infekcje Mycobacterium abscessus, co komplikuje odkrycie i opracowanie bardzo potrzebnych antybiotyków przeciwko infekcjom płuc. W tym miejscu opisujemy metodę przygotowania inokulum i zakażenia dotchawiczego, która, jak wykazano, zapewnia trwałą infekcję u myszy immunokompetentnych.

Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

Poznaj zoptymalizowane protokoły przygotowania zawiesiny Mycobacterium leprae z tkanki mysiej, oceny żywotności bakterii oraz długoterminowego przechowywania zamrożonych szczepów w laboratorium.

Zoptymalizowane protokoły zarządzania szczepem Mycobacterium leprae: konserwacja i konserwacja zamrożonych stad u nagich myszy Athymic (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowane protokoły zarządzania szczepem Mycobacterium leprae: konserwacja i konserwacja zamrożonych stad u nagich myszy Athymic

Przeglądaj więcej filmów