Zoptymalizowane protokoły zarządzania szczepem Mycobacterium leprae: konserwacja i konserwacja zamrożonych stad u nagich myszy Athymic

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie sposobu przygotowania wysoce żywotnej zawiesiny lipidowej prątków do podania myszom nude. Pobierzemy materiał biologiczny od zakażonej myszy, najlepiej we wczesnym stadium infekcji.

Aby zagwarantować wysoką przeżywalność uzyskanych narządów, przeprowadź eutanazję zwierzęcia wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Zatamuj tętnice udowe za pomocą kleszczyków hemostatycznych. Odetnij kończyny i zanurz je w 2% jodzie na 20 minut. W celu dekontaminacji utrzymaj kończynę w pozycji z poduszką stopy skierowaną do góry.

Pobierz tkankę miękką. Za pomocą ostrza skalpela usuń kości pierwszej i piątej paliczki, aby ułatwić homogenizację tkanki. Umieść tkankę w sterylnej szalce Petriego. Zeskrob naskórek.

Pokrój tkankę ziarninową nożyczkami na małe kawałki i odstaw je do późniejszego obliczenia wydajności tkanki. Przenieś małe kawałki do probówki zawierającej 1 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa. Dodaj kolejny 1 ml roztworu Hanksa i homogenizuj tkankę trzy razy po 15 sekund przy prędkości 4.

Umieść sitko do oddzielania komórek w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Przenieś zawiesinę pipetą na sitko i pozwól roztworowi przepłynąć pod wpływem grawitacji. Aby usunąć zanieczyszczenia, dodaj do zawiesiny kolejne 2 ml roztworu Hanksa i ponownie ją zhomogenizuj.

Stosując ten sam cykl, przepuść zawiesinę przez to sito. Przepłucz sito, dodając roztwór Hanksa. Aby doprowadzić całkowitą objętość zawiesiny do 9 ml, dodaj do niej 1 ml 0,5% roztworu trypsyny, aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 0,05%.

Wymieszać zawartość, delikatnie odwracając probówkę, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Po inkubacji uzupełnić objętość zawiesiny do 4 mL, dodając sterylną sól fizjologiczną, a następnie wirować przy 1700 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić nadosad i resuspendować osad, opukując probówkę. Dodać 1 mL soli fizjologicznej i wymieszać.

Przenieś zawiesinę do nowej probówki. Uhomogenizuj zawiesinę naczyniową, używając strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 26 G, przenosząc zawiesinę do nowej probówki. Przeprowadź kontrolę mikrobiologiczną zawiesiny, nakładając dwie krople na podłoże 18 oraz na podłoże BHI (brain heart infusion).

11 Stein Genesen inkubowano w temperaturze 37°C. Następnie zastosowano rutynowe procedury kontroli mikrobiologicznej w celu przeprowadzenia barwienia według kodu Z.

Przygotować rozcieńczenia zawiesiny S w soli fizjologicznej w stosunku 1:10 oraz 1:100. Każde rozcieńczenie należy zhomogenizować przed przygotowaniem preparatów do liczenia. Przygotować trzy szkiełka przedmiotowe, rysując na powierzchni każdego z nich trwałą markerem trzy okręgi o średnicy wewnętrznej 10 mm.

Następnie obrysuj okręgi za pomocą pisaka do immunohistochemii. Opisz te pola ołówkiem numer dwa, przygotowując pola dla trzech stężeń: nierozcieńczonego, 1:10 oraz 1:100.

Do każdego okręgu pipetuj 5 µL roztworu surowicy z fenolem oraz 10 µL zawiesiny sary, homogenizuj i równomiernie rozprowadź zawiesinę na całej powierzchni okręgu. Za pomocą trzonka jednorazowej pętliki umieść preparaty na płaskim stole do wyschnięcia. Po wyschnięciu utrwal je, przechodząc trzy razy nad niebieskim płomieniem, trzymając zawiesiny bachelor skierowane do góry.

Wykonaj podtrzymanie kodu Zuni. Zbadaj te preparaty. Trzy rozcieńczenia.

Wybierz najodpowiedniejsze rozcieńczenie do zliczania sary. Przygotuj 200 µL zawiesiny sary zabitej poprzez autoklawowanie zawiesiny naczyniowej przez 30 minut w temperaturze 121 °C. Do barwienia fluorescencyjnego lipidów mikrobakteryjnych użyj zestawu do badania żywotności bakterii L 7 0 0 7 live dead back light.

Przygotować rozcieńczenie 1:10 roztworu A oraz rozcieńczenie 1:20 roztworu B bezpośrednio przed użyciem. Do każdych 200 µL nierozcieńczonej zawiesiny naczyniowej, oryginalnej i utrwalonej, dodać 3,6 µL rozcieńczonego roztworu A oraz 6 µL rozcieńczonego roztworu B. Po 15 minutach inkubacji w ciemności odwirować zawiesinę przy 10 600 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz za pomocą pipety.

Resuspender osad w 50 µL 10% glicerolu, homogenizując go poprzez pipetowanie w górę i w dół. Nanieść 8 µL każdej zawiesiny na szkiełko przedmiotowe i przykryć małym szkiełkiem nakrywką. Chronić przed światłem.

Obserwować zawiesiny pod mikroskopem fluorescencyjnym. Przygotować zawiesinę o stężeniu od 10 do siedmiu BA lip na ml, wlewając 1 ml medium do mrożenia do każdej fiolki kriogenicznej. Następnie dodać 150 µL zawiesiny S do 1 ml medium do mrożenia i ujednorodnić mieszaninę poprzez odwracanie probówki.

Umieść probówkę kriogeniczną w pojemniku do mrożenia. Przechowuj pojemnik w temperaturze -80°C przez co najmniej 24 godziny. Przenieś probówki do pudełka do przechowywania i utrzymuj je w temperaturze -80°C do czasu rozmrażania.

Rozmrozić zamrożoną zawiesinę w kąpieli wodnej ustawionej na 37 °C. Przenieść zawiesinę do probówki stożkowej zawierającej 20 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Odwirować w celu zagęszczenia.

Linie baline prowadzono zgodnie z protokołem podtrzymującym Z w celu zliczania oraz protokołem barwienia fluorescencyjnego w celu określenia żywotności. Przygotowano zawiesinę zawierającą od 10 do 8 BA na posiłek, homogenizując ją przed inokulacją każdego zwierzęcia. Pobrano 100 µL do strzykawki insulinowej i inokulowano 30 µL w tylne poduszki stóp każdego zwierzęcia w badaniu określania żywotności.

Zielona fluorescencja jest obserwowana we wszystkich BAI, a czerwona fluorescencja tylko w przypadku bai. Gdy BAI stanowią kontrolę ujemną, obserwuje się taką samą intensywność zielonego i czerwonego światła BAI. Inokulacja M Lepar zamrożonych przez różne okresy skutkuje 10 do 1000-krotnym wzrostem liczby odzyskanych BAI po siedmiu miesiącach.

Na koniec chcielibyśmy dodać, że ponieważ IL leid nie rośnie in vitro, niniejszy protokół zapewnia szybki i łatwy sposób utrzymania żywych yl Leid do dalszych zastosowań laboratoryjnych.