Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest obrazowanie w trybie time-lapse zachowania komórek glejowych po uszkodzeniu nerwów obwodowych u żywych larw zebrafish. Osiąga się to poprzez najpierw zamocowanie znieczulonych larw zebrafish w agarozie o niskiej temperaturze topnienia na szalkach Petriego z dna szklanego i ustawienie ich za pomocą igły sekcyjnej. Następnie zamocowane larwy umieszcza się w mikroskopie konfokalnym.

Wybrano nerw do ablacji i wykonano obraz aksonów oraz komórek glejowych nieuszkodzonego nerwu. Następnie wzdłuż nerwu wyznaczono obszary zainteresowania (ROI) i wykonano impuls laserowy w celu ablacji wybranych obszarów, co doprowadziło do przerwania ciągłości nerwu. Na koniec przeprowadzono obrazowanie time-lapse aksonów i komórek glejowych po przecięciu nerwu.

W rezultacie, dzięki zastosowaniu konfokalnej mikroskopii poklatkowej, można uzyskać wyniki obrazujące dynamiczne zachowanie komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu regeneracji i biologii komórek glejowych, takie jak: w jaki sposób komórki glejowe reagują na uszkodzenie nerwu oraz w jaki sposób poszczególne podtypy gleju koordynują swoje zachowanie podczas procesów degeneracji i regeneracji?

Po skrzyżowaniu dorosłych danio pręgowanych zawierających transgeny fluorescencyjnie znakujące interesujące neurony ruchowe i typy komórek glejowych oraz inkubacji embrionów do 24 godziny po zapłodnieniu (HPF), należy usunąć wodę z jaj i zastąpić ją wodą z jaj z dodatkiem 1 pH tooth threa lub PTU przed powrotem embrionów do inkubatora. Od tego momentu aż do około 96 HPF należy używać fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego w celu przesiewania embrionów pod kątem obecności pożądanego genu fluorescencyjnego. Embriony pozytywne należy przenieść do świeżej wody z jaj z PTU i zwrócić do inkubatora.

Gdy larwy osiągną szósty dzień po zapłodnieniu (DPF), należy wybrać kilka embrionów do montowania i przenieść je do mniejszego naczynia. Usunąć wodę z naczynia i natychmiast zastąpić ją wodą do jaj z 0,02% tricain i PTU, a następnie inkubować larwy w środku znieczulającym przez około pięć minut. Umieścić porcję 0,8% nisko topiącego się agarozy, przygotowanej wcześniej zgodnie z protokołem tekstowym, w zlewce z wodą z kranu i włożyć do kuchenki mikrofalowej.

Przez 30 sekund lub do momentu rozpuszczenia agrosu, pozostaw zlewkę do ostygnięcia, aż probówka z agrosem stanie się letnia w dotyku. Następnie przenieś znieczuloną larwę do szalki z przeszklonym dnem o średnicy 35 mm. Usuń z szalki całą wodę.

Następnie natychmiast przykryj larwy odpowiednią ilością ciepłego agarosu, aby wypełnić szklaną część dna naczynia. W miarę twardnienia agarosu, za pomocą igły sekcyjnej ustaw larwy bokiem. Następnie delikatnie przechyl je na grzbiet, upewniając się, że zamocowane larwy dotykają szkła na dnie naczynia, co jest niezbędne do naniesienia urazu i obrazowania.

Użyj igły, aby utrzymać larwy w pozycji do momentu stężenia agaru i unieruchomienia larwy. Następnie powoli pipetuj do naczynia odpowiednią ilość wody trica, aby całkowicie przykryć agar i larwy. Włącz całą aparaturę mikroskopu konfokalnego, odpowiednie lasery diodowe do wzbudzania transgenów rybek zebrafish oraz laser barwnikowy pompowany azotem.

Upewnij się, że pusty dzielnik wiązki jest zamontowany, a koer i kuweta z barwnikiem 435 nanometr są na miejscu. W pełni otwórz atenuator lasera, a następnie uruchom oprogramowanie do obrazowania, korzystając z obiektywu imersyjnego w wodzie 63 x 1,2 na oraz szkiełka przedmiotowego z jedną stroną lustrzaną. Użyj oświetlenia w polu jasnym, aby zlokalizować i ustawić ostrość na rysie lub nacięciu w lustrze.

Używając oprogramowania do obrazowania, wyświetl i ustaw ostrość trawienia na ekranie komputera w oknie sterującym kalibracją lasera i ustawieniami mocy. W głównym pasku narzędzi ustaw liczbę impulsów na jeden, a tłumienie na 3% transmission. Wybierz narzędzie elipsy i kliknij obraz na ekranie komputera.

Aby utworzyć pojedynczy okrągły obszar zainteresowania (ROI), powtórz ten proces jeszcze trzy razy, aż na obrazie znajdą się cztery okrągłe obszary ROI rozmieszczone losowo. Następnie uruchom laser. Jeśli laser działa i jest odpowiednio skalibrowany, spowoduje to powstanie czterech małych wytrawionych punktów, po jednym w każdym okrągłym obszarze ROI. Następnie wyjmij szkiełko przedmiotowe ze stolika mikroskopu i wyczyść obiektyw.

Zastąp pusty dzielnik wiązki dzielnikiem wiązki 100%ILL, aby przeprowadzić ablację laserową nerwu ruchowego. Nanieś niewielką kroplę medium imersyjnego do wody na obiektyw, a następnie umieść szalkę z zamontowaną larwą na odpowiednim stoliku, stabilizując ją za pomocą klipsów, korzystając z okularu i oświetlenia szerokopolowego. Ustaw ostrość na larwy i zlokalizuj neurony ruchowe.

Przeskanuj nerwy w hemi-segmentach od 10 do 20 i wybierz nerw ruchowy do przecięcia. Następnie wyświetl podgląd na żywo wybranego nerwu na ekranie komputera. Wybierz płaszczyzny Z i uzyskaj obraz aksonów oraz komórek glejowych nieuszkodzonego nerwu.

Następnie należy przygotować ustawienia obrazowania poklatkowego, aby rejestrować projekcje Z wszystkich typów komórek w odstępach od 5 do 30 minut. W zależności od eksperymentu należy usunąć dzielnik wiązki 100%ILL i zastąpić go pustym elementem (blank). Powróć do podglądu na żywo nerwu i użyj odpowiedniego kanału fluorescencji, aby zlokalizować aksony, które zostaną przecięte.

Używając narzędzia elipsy, utwórz cienki eliptyczny obszar ROI w miejscu przeznaczonym do ablacji. Następnie utwórz mniejsze obszary ROI w obrębie wybranego regionu w oknie sterowania ustawieniami lasera. Ustaw liczbę impulsów na dwa, a płytkę tłumiącą na 18%transmission.

Następnie naświetl laserem wybrane obszary ROI. Odczekaj 10 lub więcej sekund i ponownie sprawdź obszar ablacji pod kątem fluorescencji. Należy pamiętać, że obszar ROI może początkowo wydawać się zablowny, podczas gdy w rzeczywistości doszło do fotoblaknięcia, a obszary ROI mogą wymagać niewielkiej modyfikacji w trakcie ablacji, aby uzyskać całkowite przecięcie.

Jeśli fluorescencja powróci, zwiększ moc lasera i wykonaj impuls. Powtarzaj tę czynność do momentu, aż fluorescencja w obrębie R OIS zniknie i nie pojawi się ponownie w ciągu 10 sekund. Po zakończeniu ablacji rozpocznij obrazowanie time-lapse; kontynuuj do momentu zakończenia serii czasowej.

Użyj oprogramowania do analizy obrazowania, aby skompilować dane i utworzyć kolorowe kompozytowe projekcje Z dla każdego punktu czasowego. Utwórz film w formacie QuickTime, aby przeanalizować zachowanie aksonów i komórek glejowych jednocześnie. Opisany tutaj test może być wykorzystany do oceny odpowiedzi komórek glejowych i innych populacji komórek związanych z nerwami na uszkodzenie aksonalne in vivo.

Przedstawiono tutaj przykład uszkodzenia nerwu wywołanego tą metodą oraz reakcję otaczających go komórek glejowych. Eksperyment przeprowadzono na sześciodniowych (DPF) transgenicznych rybakach zebra, które wykazywały ekspresję ukierunkowanego na błonę EGFP w gleju okołonerwowym oraz cytozolowego DS red w neuronach ruchowych. Uszkodzenie wykonano wzdłuż przedniej projekcji nerwu ruchowego tułowia, a następnie wykonano obrazowanie time-lapse w kanałach EGFP i DS red.

Umożliwiło to jednoczesną wizualizację zachowań aksonów i komórek glejowych bezpośrednio po urazie. Obrazy te stanowią statyczne punkty czasowe wyodrębnione z filmu poklatkowego. Przerywana elipsa wskazuje ROI, która została ablacyjnie usunięta za pomocą lasera w pierwszej minucie.

Po przekroju lub MPT obszar ablacji był pozbawiony fluorescencji, a strefa urazu mierzyła około 3,5 micrometers od kikutu proksymalnego do dystalnego. Powodzenie przekroju można potwierdzić, obrazując dystalny kikut nerwu i szukając oznak degeneracji wallerowskiej, w tym fragmentacji aksonów dystalnych i ich szybkiego usuwania. Brak fluorescencji aksonalnej wzdłuż kikutu dystalnego w 120 MPT wskazuje, że aksony te rzeczywiście uległy degeneracji wallerowskiej, a przekrój zakończył się sukcesem.

Dostosowanie mocy lasera do optymalnych ustawień jest kluczowe podczas przeprowadzania eksperymentów z ablacji laserowej. Optymalne ustawienia mocy lasera pozwalają na czystą ablację nerwu wyłącznie w obrębie wybranego ROI, natomiast ustawienia mocy zbyt niskie lub zbyt wysokie przyniosą suboptymalne wyniki; przedstawiona tutaj rana powstała przy zbyt niskiej mocy lasera. Po wystrzale lasera fluorescencja pozostała w obrębie ROI, co skutkowało niepełną przekrojem.

Z drugiej strony, jak pokazano na tej rycinie, zbyt wysoka moc lasera spowodowała niezwykle rozległą ablację. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać wystarczającą wiedzę na temat tego, jak montować rybki zebrafish do eksperymentów z transekcją laserową. Wykonaj transekcję za pomocą azotowego pompowanego lasera barwnikowego i oceń odpowiedź otaczających komórek, wykorzystując konfokalny obrazowanie poklatkowe.