Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie poklatkowego obrazu zachowania komórek glejowych po uszkodzeniu nerwów obwodowych u żywych larw danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez najpierw zamontowanie znieczulonych larw danio pręgowanego w aros o niskiej temperaturze topnienia na szalkach Petriego ze szklanym dnem i umieszczenie ich za pomocą igły preparującej. Następnie zamontowane larwy umieszcza się pod mikroskopem konfokalnym.

Do ablacji wybiera się nerw i uzyskuje się obraz aksonów i komórek glejowych nieuszkodzonego nerwu. Następnie wzdłuż nerwu wybierane są ROI, a laser jest wystrzeliwany w celu ablacji wybranych obszarów, tworząc transsekcję nerwu. Wreszcie, aksony i komórki glejowe są obrazowane w czasie poklatkowym po przecięciu nerwu.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują dynamiczne zachowanie komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji i biologii komórek glejowych, takie jak to, jak komórki glejowe reagują na uszkodzenie nerwów? I w jaki sposób różne podtypy glejowe koordynują swoje zachowanie podczas degeneracji i regeneracji?

Po skrzyżowaniu dorosłych ryb danio pręgowanych zawierających transgeny, które fluorescencyjnie znakują neurony ruchowe i komórki glejowe będące przedmiotem zainteresowania oraz inkubacji zarodków do 24 godzin po zapłodnieniu lub HPF, usuń wodę z jaj i zastąp ją jednym ząbkiem pH lub PTU w wodzie jajowej przed powrotem zarodków do inkubatora. Od tego momentu do około 96 HPF użyj fluorescencyjnej lunety do badania zarodków pod kątem obecności pożądanego genu fluorescencyjnego. Przenieść dodatnie zarodki do świeżej wody z jaj PTU i umieścić je z powrotem w inkubatorze.

Kiedy larwy osiągną sześć dni po zapłodnieniu lub DPF, wybierz kilka zarodków do zamontowania i przenieś je do mniejszego naczynia. Usuń wodę z naczynia i natychmiast zastąp ją 0,02% trikiem W wodzie jajecznej PTU inkubuj larwy w znieczuleniu około pięciu minut. Umieść Eloqua z 0,8% niskotopliwym agrosem przygotowanym wcześniej zgodnie z protokołem tekstowym w zlewce z wodą z kranu i kuchenką mikrofalową.

Przez 30 sekund lub do momentu, gdy zlewka ostygnie, aż rurka agros będzie letnia w dotyku. Następnie przenieś znieczulone larwy do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów. Usuń wodę z naczynia.

Następnie natychmiast przykryj larwy wystarczającą ilością ciepłego aros, aby wypełnić szklaną część naczynia z dnem. Gdy agros stwardnieje, użyj igły do preparowania, aby ustawić larwy na boku. Następnie przechyl go lekko na plecy, upewniając się, że zamontowane larwy dotykają szkła na dnie naczynia, co jest niezbędne do zranienia i obrazowania.

Użyj igły, aby utrzymać larwy na miejscu, aż agro zastygnie, a larwy zostaną unieruchomione. Następnie powoli odpipetuj tyle wody trica do naczynia, aby całkowicie pokryć agros i larwy. Włącz wszystkie oprzyrządowanie mikroskopu konfokalnego, odpowiednie lasery diodowe do ekscytujących transgenów danio pręgowanego oraz laser barwnikowy pompowany azotem.

Upewnij się, że pusty rozdzielacz wiązki jest na swoim miejscu, a ogniwo koerowe i barwnikowe o długości 435 nanometrów jest na swoim miejscu. Otwórz całkowicie tłumik laserowy, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania za pomocą soczewki zanurzeniowej 63 x 1,2 na wody i szklanego szkiełka z jedną lustrzaną stroną. Użyj oświetlenia w jasnym polu, aby znaleźć rysę lub wytrawienie lustra i ustawić na nim ostrość.

Korzystając z oprogramowania do obrazowania, wyświetl i ustaw ostrość akwafort na ekranie komputera z okna sterującego kalibracją lasera i ustawieniami mocy. Ustaw liczbę impulsów na jeden, a tłumienie na 3% transmisji z głównego paska narzędzi. Wybierz narzędzie elipsy i kliknij obraz na ekranie komputera.

Aby utworzyć pojedynczy okrągły zwrot z inwestycji, powtórz proces jeszcze trzy razy, aż na obrazie pojawią się losowo rozmieszczone cztery okrągłe RI. Następnie odpal laser. Jeśli laser działa i jest prawidłowo skalibrowany, spowoduje to utworzenie czterech małych wytrawień punktowych, po jednym w każdym okrągłym ROI Następnie wyjmij szklane szkiełko ze stolika mikroskopu i wyczyść obiektyw.

Zastąp ślepy rozdzielacz wiązki rozdzielaczem wiązki 100% ILL, aby przeciąć nerw ruchowy za pomocą ablacji laserowej. Nałóż niewielką kroplę medium zanurzającego w wodzie na obiektyw i umieść naczynie z zamontowaną larwą na odpowiednim etapie za pomocą klipsów, aby ustabilizować ją za pomocą okularu i oświetlenia szerokokątnego. Skoncentruj się na larwach i zlokalizuj neurony ruchowe.

Zeskanuj nerwy w segmentach hemi od 10 do 20 i wybierz nerw ruchowy do przecięcia. Następnie wyświetl podgląd nerwu na żywo na ekranie komputera. Wybierz płaszczyzny Z i uzyskaj obraz aksonów i komórek glejowych nieuszkodzonego nerwu.

Następnie przygotuj ustawienia obrazowania poklatkowego, aby uchwycić projekcje Z wszystkich typów komórek w odstępach od pięciu do 30 minut. W zależności od eksperymentu wyjmij rozdzielacz wiązki 100% ILL i zastąp go ślepym półfabrykatem. Wróć do podglądu nerwu na żywo i użyj odpowiedniego kanału fluorescencyjnego, aby zobaczyć aksony, które zostaną przecięte.

Za pomocą narzędzia elipsy utwórz cienki eliptyczny obszar zwrotu w obszarze, który ma zostać poddany ablacji. Następnie utwórz mniejsze ROI w wybranym regionie w oknie, które steruje ustawieniami lasera. Ustaw liczbę impulsów na dwa, a płytkę tłumiącą na 18% transmisji.

Następnie odpal laser w wybranych ROI. Odczekaj 10 lub więcej sekund i ponownie sprawdź obszar poddany ablacji pod kątem fluorescencji. Należy pamiętać, że ROI może początkowo wydawać się ablowany, gdy w rzeczywistości jest wybielony fotograficznie, a ROI może wymagać niewielkiej modyfikacji w trakcie ablacji, aby osiągnąć pełną transcięcję.

Jeśli fluorescencja powróci, zwiększ moc lasera i odpal laser. Ponownie powtarzaj to, aż fluorescencja zniknie w R OIS i nie powróci w ciągu 10 sekund. Po zakończeniu ablacji rozpocznij obrazowanie poklatkowe po zakończeniu ablacji.

Użyj oprogramowania do obrazowania, aby skompilować dane i utworzyć projekcje Z z kompozytu kolorów dla każdego punktu czasowego. Utwórz krótki film, aby jednocześnie analizować zachowanie komórek glejowych aksonów. Opisany tutaj test może być wykorzystany do oceny odpowiedzi komórek glejowych i innych populacji komórek związanych z nerwami na uszkodzenie aksonów in vivo.

Pokazany jest tutaj przykład uszkodzenia nerwu powstałego przy użyciu tej metody i odpowiedzi otaczających komórek glejowych. Eksperyment przeprowadzono na sześciu transgenicznych rybach danio pręgowanego DPF, u których ekspresja EGFP ukierunkowanego na błonę w okołonerwowym GLL i cytozolowej czerwieni DS w neuronach ruchowych. Uraz został wykonany wzdłuż projekcji rostralnej nerwu ruchowego tułowia, który został następnie zobrazowany w czasie zarówno w kanałach czerwonych EGFP, jak i DS.

Pozwoliło to na jednoczesną wizualizację zachowań aksonów i komórek glejowych bezpośrednio po urazie. Obrazy te są statycznymi punktami czasowymi zaczerpniętymi z filmu poklatkowego. Kropkowana elipsa pokazuje zwrot z inwestycji, który został ablowany za pomocą lasera w ciągu jednej minuty.

Po transsekcji lub MPT obszar po ablacji nie wykazywał fluorescencji, a strefa urazu mierzyła około 3,5 mikrometra od bliższego do dystalnego kikuta. Powodzenie transsekcji można potwierdzić, obrazując dystalny kikut nerwu i szukając oznak zwyrodnienia walleriana, w tym fragmentacji dystalnych aksonów i szybkiego klirensu. Brak fluorescencji aksonalnej wzdłuż dystalnego kikuta przy 120 MPT wskazuje, że aksony te rzeczywiście uległy zwyrodnieniu walleriana, a transakcja zakończyła się sukcesem.

Dostosowanie mocy lasera do idealnego ustawienia ma kluczowe znaczenie podczas wykonywania eksperymentów z ablacją laserową. Idealne ustawienia mocy lasera pozwolą czysto usunąć nerw tylko w wybranym ROI, a ustawienia mocy lasera, które są albo zbyt niskie, albo zbyt wysokie, przyniosą nieoptymalne wyniki, widoczne tutaj jest urazem, który został wykonany przy zbyt niskiej mocy lasera. Fluorescencja pozostała w ROI po wystrzeleniu lasera, co spowodowało niepełną transcięcję.

Z drugiej strony, jak pokazano na tym rysunku, zbyt duża moc lasera powodowała niezwykle dużą ablację. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zamontować danio pręgowanego do eksperymentów z przecięciem laserowym. Utwórz przekrój za pomocą lasera barwnikowego z pompą azotu i oceń odpowiedź otaczających komórek za pomocą poklatkowego obrazowania konfokalnego.