Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja wad behawioralnych larw danio pręgowanego po leczeniu środkami toksycznymi lub farmaceutykami. Osiąga się to poprzez pierwsze zebranie i potraktowanie zarodków lub larw chemikaliami do pierwszych siedmiu dni rozwoju. Drugim krokiem jest wykonanie torów do pływania agro za pomocą specjalnie zaprojektowanych form.

Następnie leczone larwy umieszcza się na pasach agros w celu analizy behawioralnej za pomocą fotografii poklatkowej. Ostatnim krokiem jest zaimportowanie obrazów do obrazu J i użycie specjalnego makra napisanego przez nas w celu zebrania danych o współrzędnych XY larw na pasach. Ostatecznie wysokoprzepustowy test behawioralny służy do znalezienia różnic w zachowaniu unikania i osi figmy, a także w prędkości pływania i odpoczynku między grupami leczonymi.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak te dostępne na rynku, jest to, że możemy użyć naszej metody do obserwacji bardziej złożonych zachowań. Jest również niedrogi w budowie i łatwy w konfiguracji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki behawioralnej, takie jak to, jak toksyny wpływają na rozwój mózgu i zachowanie podczas wczesnej ekspozycji embrionalnej.

Może również dostarczyć informacji na temat subtelnych wad mózgu u ludzi, których nie można znaleźć za pomocą innych obecnych badań przesiewowych toksyczności. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ złapanie larw może być trudne. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki mają krzywą uczenia się, ponieważ protokół obejmuje niestandardowe systemy.

Aby rozpocząć tę procedurę, włóż do zbiorników szklane naczynia Pyrex ze sztuczną trawą wykonaną z zielonej przędzy. O świcie pozostaw naczynia w zbiornikach na dwie godziny w celu zebrania zarodków danio pręgowanego. Wlej szklane naczynia zawierające zarodki przez ręczne sitko z wodą dejonizowaną.

Następnie hoduj zarodki w wodzie jajecznej zawierającej 60 miligramów na litr oceanu instant w wodzie dejonizowanej i 0,25 miligrama na litr błękitu metylenowego, który jest stosowany jako inhibitor pleśni. Zarodki mogą być trzymane w ilości od 50 do 60 larw na 50 mililitrów lub w większych zbiornikach hodowlanych, dopóki zarodki nie będą gotowe do leczenia środkami toksycznymi. W zależności od hipotezy indywidualnego eksperymentu, zarodki mogą być leczone natychmiast lub w określonych stadiach rozwoju przy użyciu środków toksycznych lub farmaceutyków, które zwykle rozpuszcza się w DMSO, a następnie rozcieńcza bezpośrednio w pożywce wodnej jaja.

Kolor niebieski jest używany do celów demonstracji wideo podczas leczenia zarodków i larw. Larwy i zarodki mogą być trzymane na głębokich szalkach Petriego w gęstości około 50 do 60 larw na 50 mililitrów, aż do analizy behawioralnej po siedmiu dniach od zapłodnienia, zmieniaj roztwór wodny jaja co najmniej co drugi dzień, aby uniknąć rozwoju grzybów lub bakterii z martwych zarodków. Plastikowe formy zostały wyprodukowane w celu stworzenia pasów za pomocą aros, który wlewa się do jednostudzienkowych plastikowych talerzy firmy Thermos Scientific.

Formy zawierają pięć pasów, w których boki są ustawione pod kątem 60 stopni. Zobacz protokół tekstowy dołączony do tego filmu, aby zapoznać się z wymiarami form i płyt? Najpierw przygotuj aros, topiąc 0,8% aros w dejonizowanej wodzie z 60 miligramami na litr oceanu instant.

Następnie wygeneruj pasy, wlewając 50 mililitrów stopionego aros do pojedynczej płytki dołkowej. Następnie bardzo powoli umieść formę na wierzchu płynnego aros, który eliminuje tworzenie się pęcherzyków. Usuń pleśń, gdy aros ostygnie.

Pasy aros można przechowywać w temperaturze pokojowej z pokrywkami na naczyniach do 36 godzin. W celu przeprowadzenia wysokoprzepustowej analizy behawioralnej szafy do obrazowania są przygotowywane z 15-megapikselową kamerą cyfrową przymocowaną do górnej części szafy skierowanej w dół na dole szafy. Laptop z ekranem o przekątnej 15,6 cala jest umieszczany ekranem skierowanym do góry.

Aby uniknąć przegrzania larw, najlepiej używać laptopa, którego temperatura ekranu nie przekracza 28 stopni Celsjusza. Umieść plastikowy dyfuzor na ekranie laptopa, na którym zostaną umieszczone talerze agros. Dyfuzor zapobiegnie większej liczbie wzorów na zebranych obrazach.

Aby rozpocząć przechwytywanie obrazu, ostrożnie przenieś larwy z szalki Petriego na pas agros, aby zmniejszyć stres larw. Na każdym torze można umieścić do 20 larw, ale zwykle używa się pięciu larw na pas, aby ułatwić jak najdokładniejsze śledzenie prędkości pływania i zmniejszyć liczbę larw potrzebnych na eksperyment, napełnić tory wodą jajeczną, z lub bez farmaceutyków lub toksyn, w zależności od eksperymentu. Nie należy wypełniać pasów do końca, dopóki nie zostaną umieszczone w szafkach obrazowych, aby zapobiec przepełnieniu.

Odczekaj 10 minut, aby larwy zaaklimatyzowały się po okresie aklimatyzacji. Umieść cztery płytki ręcznie bezpośrednio na ekranie laptopa. W tym czasie pasy mogą być uzupełniane jajami, wodą lub obróbką chemiczną, tak aby znajdowały się na poziomie górnej części pasa, aby wyeliminować cienie na krawędziach pasów.

W obrazach zaprogramuj komputer do fotografii poklatkowej, robiąc zdjęcia co sześć sekund, co daje w sumie 300 zdjęć na eksperyment. Ustaw aparat na niższą rozdzielczość, aby obrazować z prędkością wideo. Podczas gdy niższa rozdzielczość ogranicza nagrania do jednej płytki wielodołkowej.

Nagrania wideo są odpowiednie do obrazowania szybkich zawodów pływackich. Użyj prezentacji PowerPoint jako bodźca awersyjnego dla larw w tej demonstracji. PowerPoint zaczyna się od pustego białego tła przez 15 minut, po którym następuje 15 ruchomych czerwonych pasków w górnej połowie płyty.

Aby uniknąć parowania cieczy w obrębie pasów ruchu, należy utrzymać maksymalny czas obrazowania poniżej jednej godziny. Otwórz obrazy z obrazem J w tej demonstracji. Stosowane jest wewnętrzne makro do analizy larw w pięciu pasach, które może być udostępnione każdemu użytkownikowi.

Użyj monitów w makrze, aby ustawić parametry, takie jak liczba obrazów i kolor do odjęcia. Następnie makro automatycznie dzieli kanał koloru, tak aby można było usunąć kolor czerwony. Odejmuje tło, stosuje próg i identyfikuje larwy na podstawie analizy cząstek.

Po przepuszczeniu wszystkich obrazów przez obraz J Macro, zostanie wyświetlony plik wyników, który będzie zawierał współrzędne XY poszczególnych larw dla każdego obrazu, wraz z numerem obrazu i numerem pasa. Zapisz plik wyników w formacie programu Excel i posortuj na podstawie pustego tła w stosunku do tła ruchomego paska, a następnie numeru studzienki. Użyj szablonu programu Excel, który ma wbudowane równania, aby automatycznie określić rozmieszczenie larw w studniach, odległość między larwami, prędkość ruchu i ilość odpoczynku.

Najbardziej aktualny szablon Excela utworzony w laboratorium Cretin jest dostępny na żądanie i tworzy wykresy przedstawiające różne grupy leczenia w arkuszu Excel, wraz z testem T do porównania między grupami leczonymi i kontrolnymi. Dalsza analiza statystyczna może być przeprowadzona za pomocą programu statystycznego SPSS. Wyniki przedstawiono dla larw traktowanych wodą jajeczną i DMSO jako kontrolą i różnymi stężeniami pestycydów fosforoorganicznych powszechnie występujących w żywności nieekologicznej.

Tutaj białe paski pokazują dane z larw wystawionych na puste tło, a czerwone paski pokazują dane z larw wystawionych na czerwony ruchomy pasek. Kontrola. Larwy wyhodowane w wodzie z jaj wykazują zwiększoną preferencję do przebywania w naczyniu po tym, jak zostaną przedstawione ruchomym czerwonym paskiem. Podobne wyniki uzyskuje się, gdy larwy są hodowane w wodzie jajowej zawierającej jeden mikrogram na mililitr DMSO, rozpuszczalnika, który jest powszechnie stosowany do rozpuszczania różnych farmaceutyków i toksyn w postaci 1000 x roztwory podstawowe.

Wykresy wskazują pomiary, które można uzyskać z analizy behawioralnej, w tym procent larw na dole pasa, procent larw na końcu pasa, procent larw na krawędzi pasa, odległość między prędkością pływania ryb larw i procent czasu, w którym larwy są w spoczynku. Przedstawione wyniki są próbką z jednego eksperymentu. Jednak po powtórzeniu wyniki wskazują, że prędkość pływania i zachowanie figmy są zmieniane przez niskie stężenia pestycydów fosforoorganicznych, które naśladują poziomy w żywności dla ludzi Po opanowaniu obrazowanie i analizę obrazową można wykonać w ciągu półtorej godziny, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

Najważniejszym aspektem tej procedury jest pamiętanie o utrzymywaniu pożywki w czystości poprzez codzienną wymianę na nową pożywkę.