Name: Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Poznaj izolację i charakterystykę chemiczną lipidu A z bakterii Gram-ujemnych przy użyciu spektrometrii mas. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy oporności na antybiotyki i odpowiedź immunologiczną gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Granty AI064184 i AI76322 z National Institutes of Health (NIH) oraz przez Grant 61789-MA-MUR z Biura Badań Wojskowych dla M.S.T. Badania były również wspierane przez Welch Foundation Grant F1155 i R01GM103655 grantu NIH dla J.S. B.

<ol><li>Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+endotoxin+and+its+impact+on+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+endotoxin+research%22%5BJournal%5D)">Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis.</a> Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).</li>
<li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+Modification+Systems+in+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).</li>
<li>Kim, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+TLR4-MD-2+complex+with+bound+endotoxin+antagonist+Eritoran%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran.</a> Cell. 130, 906-917 (2007).</li>
<li>Rietschel, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin%3A+molecular+relationships+of+structure+to+activity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).</li>
<li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Innate immunity.</a> The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).</li>
<li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+and+interleukin-1+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism.</a> Blood. 77, 1627-1652 (1991).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+acylation+and+bacterial+resistance+against+vertebrate+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides.</a> Cell. 95, 189-198 (1998).</li>
<li>Yi, E. C., Hackett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+method+for+lipopolysaccharide+and+lipid+A+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria.</a> The Analyst. 125, 651-656 (2000).</li>
<li>Westphal, O. aJ., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Lipopolysaccharide.+Extraction+with+phenol-water+and+further+application+of+the+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohydr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure.</a> Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).</li>
<li>Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+extraction+of+R+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry+%2F+FEBS%22%5BJournal%5D)">A new method for the extraction of R lipopolysaccharides.</a> European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).</li>
<li>Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+eight+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octylosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).</li>
<li>Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+unmodified+endotoxin+preparations+by+252Cf+plasma+desorption+mass+spectrometry.+Determination+of+molecular+masses+of+the+constituent+native+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides.</a> The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+journal+of+biochemistry+and+physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+NMR+spectroscopy+of+lipid+A+molecules+containing+4-amino-4-deoxy-L-arabinose+and+phosphoethanolamine+substituents.+Different+attachment+sites+on+lipid+A+molecules+from+NH4VO3-treated+Escherichia+coli+versus+kdsA+mutants+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biosynthesis+of+free+lipid+A+molecules+that+replace+lipopolysaccharide+in+Francisella+tularensis+subsp.+novicida%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida.</a> Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).</li>
<li>Strain, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+polar+substituents+and+fatty+acyl+chains+on+lipid+A+precursors+from+a+3-deoxy-D-manno-octulosonic+acid-deficient+mutant+of+Salmonella+typhimurium.+Studies+by+1H%2C+13C%2C+and+31P+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).</li>
<li>Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IR+and+UV+Photodissociation+as+Analytical+Tools+for+Characterizing+Lipid+A+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry+%28Washington%2C+DC%2C+United+States%22%5BJournal%5D)">IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures.</a> Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).</li>
<li>Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+investigation+of+bacterial+lipopolysaccharides+by+mass+spectrometry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+acylation+of+Vibrio+cholerae+lipopolysaccharide+requires+phosphorylation+of+Kdo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo.</a> The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).</li>
<li>Hankins, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+a+novel+Vibrio+cholerae+lipid+A+secondary+hydroxy-acyltransferase+and+its+role+in+innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition.</a> Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).</li>
<li>Chan, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+characterization+of+lipid+A%3A+electrospray+ionization+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).</li>
<li>Boue, S. M., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+the+structure+of+lipid+A+from+Enterobacter+agglomerans+by+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).</li>
<li>Kussak, A., Weintraub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadrupole+ion-trap+mass+spectrometry+to+locate+fatty+acids+on+lipid+A+from+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria.</a> Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).</li>
<li>El-Aneed, A., Banoub, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+molecular+structure+of+lipid+A+isolated+from+both+a+rough+mutant+and+a+wild+strain+of+Aeromonas+salmonicida+lipopolysaccharides+using+electrospray+ionization+quadrupole+time-of-flight+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).</li>
<li>Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+advances+in+lipidomica%3A+collision-induced+decomposition+of+Kdo2-lipid+A%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediators%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).</li>
<li>Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lipid+A+from+Escherichia+coli+O157%3AH7%3AK-+using+thin-layer+chromatography+and+ion-trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).</li>
<li>Wang, Z., Li, J., Altman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+the+lipid+A+region+of+Aeromonas+salmonicida+subsp.+salmonicida+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide.</a> Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).</li>
<li>Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+lipid+A+from+nontypeable+and+type+f+Haemophilus+influenzae%3A+variability+of+fatty+acid+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution.</a> Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).</li>
<li>Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+bacterial+lipid+A+analysis+by+negative+electrospray+ion+trap+mass+spectrometry%3A+Stepwise+dissociations+of+deprotonated+species+under+low+energy+CID+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions.</a> Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).</li>
<li>Silipo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterizations+of+lipids+A+by+MS%2FMS+of+doubly+charged+ions+on+a+hybrid+linear+ion+trap%2Forbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer.</a> J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+pyrophosphorylated+forms+of+lipid+A+in+gram-negative+bacteria+using+a+multivaried+mass+spectrometric+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.+A%22%5BJournal%5D)">Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).</li>
<li>Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+structure+characterization+of+lipid+A+extracted+from+Yersinia+pestis+for+determination+of+its+phosphorylation+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).</li>
<li>Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+addition+to+Vibrio+cholerae+LPS+establishes+a+link+between+surface+remodeling+in+gram-positive+and+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).</li>
<li>Han, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+sulfation+in+a+Gram-negative+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium.</a> Nature. 3, 1153-1110 (2012).</li>
<li>Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+phosphorylation+of+lipid+A+is+linked+to+the+synthesis+of+undecaprenyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate.</a> Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).</li>
<li>Galloway, S. M., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Escherichia+coli+defective+in+the+first+step+of+endotoxin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis.</a> The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).</li>
<li>Trent, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+a+polyisoprene-linked+amino+sugar+in+polymyxin-resistant+Salmonella+typhimurium+and+Escherichia+coli%3A+structural+characterization+and+transfer+to+lipid+A+in+the+periplasm%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).</li>
<li>Chung, H. S., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxygenases+in+Burkholderia+ambifaria+and+Yersinia+pestis+that+hydroxylate+the+outer+Kdo+unit+of+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).</li>
<li>Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+A+modifications+characteristic+of+Salmonella+typhimurium+are+induced+by+NH4VO3+in+Escherichia+coli+K12.+Detection+of+4-amino-4-deoxy-L-arabinose%2C+phosphoethanolamine+and+palmitate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate.</a> The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).</li>
<li>Raetz, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kdo2-Lipid+A+of+Escherichia+coli%2C+a+defined+endotoxin+that+activates+macrophages+via+TLR-4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4.</a> Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

W tym protokole szczegółowo opisaliśmy izolację gatunków lipidów A z całych komórek bakterii i opisaliśmy metody analityczne oparte na TLC lub MS w celu chemicznej charakterystyki tego wyizolowanego materiału. Tandemowa spektrometria mas jest potężną strategią charakterystyki strukturalnej de novo związków biologicznych i jest nieoceniona w charakterystyce chemicznej całego wachlarza cząsteczek lipidów A obserwowanych w przyrodzie. CID i UVPD to dwie uzupełniające się metody aktywacji, które tworzą różne rodzaje...

Lipopolisacharyd (LPS) jest główną cząsteczką na powierzchni zewnętrznej prawie wszystkich organizmów Gram-ujemnych i składa się z trzech domen molekularnych: dystalnego polisacharydu antygenu O, oligosacharydu rdzeniowego i lipidu A związanego z błoną, domeny A osadzonej na zewnętrznej warstwie dwuwarstwy błony zewnętrznej1,2. Domena lipidu A składa się z reszt 3-deoksy-D-manno-oct-2-ulosonu (Kdo) i cząsteczki lipidu A, gdzie lipid A można zdefiniować jako rozpuszczalną w chloroformie część LPS po hydrolizie łagodnegokwasu 1,2. Standardową cząsteczkę lipidu A można chemicznie zdefiniować jako szkielet diglucozynaminy, który jest heksa-acylowany i bis-fosforylowany; zgodne z głównymi gatunkami lipidów A obserwowanymi w organizmie modelowym Escherichia coli (E. coli)1,2. Dziewięć konstytutywnie eksprymowanych genów, zachowanych w bakteriach Gram-ujemnych, jest odpowiedzialnych za produkcję domeny lipidowej A (ryc. 1)1,2. Większość bakterii ma dodatkowy zestaw genów, które różnią się stopniem zachowania filogenetycznego, które uczestniczą w dalszej modyfikacji chemicznej lipidu A3. Najczęściej obserwowanymi działaniami są defosforylacja, usuwanie łańcuchów acylowych i dodawanie ugrupowań chemicznych, takich jak aminocukiery (np. aminoarabinoza) i/lub fosfoetanoloamina (ryc. 1). Wiele enzymów odpowiedzialnych za modyfikację lipidów A jest bezpośrednio aktywowanych przez sygnały środowiskowe, takie jak kationy dwuwartościowe, lub ich ekspresja jest regulowana przez dwuskładnikowe systemy regulujące odpowiedź3.
Rozpoznawanie gatunku lipidu A przez wrodzony układ odpornościowy gospodarza odbywa się za pośrednictwem receptora Toll-like 4 / szpikowego czynnika różnicowania 2 (TLR4/MD2) koreceptora4. Siły hydrofobowe między MD2 a łańcuchami acylowymi lipidu A, a także między TLR4 a grupami fosforanowymi 1 i 4' lipidu A sprzyjają silnemu powiązaniu lipidu A z TLR4 / MD24,5. Modyfikacje, które zmieniają stan acylacji lub ujemny ładunek lipidu A, wpływają na rozpoznawanie lipidów A na podstawie TLR4 / MD2 i dalszą stymulację wrodzonych aktywatorów odpowiedzi immunologicznej NF-κB i mediatorów stanu zapalnego, takich jak TNFα i IL1-β6,7. Modyfikacje, które maskują ujemny ładunek lipidu A, zapobiegają również wiązaniu się bakteriobójczych kationowych peptydów przeciwdrobnoustrojowych z powierzchniami komórek Gram-ujemnych3,8. Przypuszcza się, że wiele modyfikacji lipidów A zwiększa sprawność bakterii w określonych warunkach środowiskowych, takich jak wnętrze ludzkiego gospodarza lub w niszy ekologicznej. Z tego powodu wiele enzymów modyfikujących jest atrakcyjnymi celami w racjonalnym rozwoju związków przeciwdrobnoustrojowych. Różnorodność chemiczna struktur lipidowych A w odniesieniu do organizmu i/lub środowiska oraz biologiczne implikacje tych różnorodnych struktur sprawiają, że charakterystyka strukturalna lipidu A jest ważnym przedsięwzięciem w badaniach nad bakteriami Gram-ujemnymi.
Izolacja cząsteczek lipidu A z całych bakterii polega na ekstrakcji LPS z powierzchni komórki bakteryjnej, hydrolitycznym etapie uwalniania lipidu A, po którym następuje końcowa procedura oczyszczania9-11. Najczęściej cytowaną procedurą ekstrakcji LPS jest procedura ekstrakcji gorącą wodą fenolową, po raz pierwszy wprowadzona przez Westphala i Janna10. Po ekstrakcji cały LPS poddaje się łagodnej hydrolizie kwasowej, która chemicznie oddziela Kdo od 6'-hydroksylu dystalnego cukru glukozaminowego lipidu A (ryc. 1). Istnieje wiele pułapek związanych z procedurą z gorącą wodą fenolową, w tym użycie odczynnika wysokiego ryzyka, konieczność degradacji współekstrahowanych kwasów nukleinowych i białek, a do wypełnienia protokołu10 potrzeba kilku dni.
Nasze laboratorium dalej rozwija metodę ekstrakcji i izolacji lipidu A, którą po raz pierwszy opracowali Caroff i Raetz12,13. W porównaniu z procedurami z użyciem gorącej wody fenolowej, przedstawiona tutaj metoda jest szybsza i wydajniejsza oraz obejmuje szeroki zakres objętości hodowli od 5 ml do wielu litrów. Co więcej, w przeciwieństwie do ekstrakcji gorącą wodą fenolową, nasza metoda nie selekcjonuje szorstkich lub gładkich typów LPS, zapewniając optymalny odzysk lipidów A. W naszym protokole liza chemiczna całych komórek bakteryjnych jest przeprowadzana przy użyciu mieszaniny chloroformu, metanolu i wody, przy czym LPS można granulować przez odwirowanie. Połączenie hydrolizy łagodnego kwasu i ekstrakcji rozpuszczalnikiem (Bligh-Dyer) stosuje się do uwolnienia lipidu A z kowalencyjnie przyłączonego polisacharydu. Metoda Bligha i Dyera została po raz pierwszy zastosowana do ekstrakcji form lipidów z różnych tkanek zwierzęcych iroślinnych14, zmodyfikowanych tutaj w celu oddzielenia hydrolizowanego polisacharydu od lipidu A. W tym ostatnim etapie separacji lipidy rozpuszczalne w chloroformie selektywnie rozdzielają się na dolną fazę organiczną. W celu dalszego oczyszczenia lipidu A można zastosować chromatografię kolumnową z odwróconymi fazami lub chromatografią anionową12.
Po wyizolowaniu gatunku lipidu A z całych komórek, można użyć wielu metod analitycznych do scharakteryzowania struktury chemicznej izolowanego materiału, takich jak NMR, TLC i analiza oparta na MS. NMR pozwala na nieniszczące wyjaśnienie strukturalne i dostarcza szczegółów strukturalnych związanych z wiązaniami glikozydowymi, jednoznacznym przypisaniem pozycji łańcucha acylowego i przypisaniem miejsc przyłączenia dla modyfikacji lipidów A, takich jak aminoarabinoza lub fosfoetanoloamina15-17. Analiza NMR lipidu A nie jest omówiona w naszym protokole, ale została odpowiednio opisana w innym miejscu15,16. Do szybkiej analizy często stosuje się metody oparte na TLC, ale nie dostarczają bezpośrednich informacji na temat dokładnej struktury chemicznej. Protokoły oparte na stwardnieniu rozsianym są najczęściej stosowaną metodą charakteryzowania struktur lipidowych A18,19. Jonizacja desorpcyjna laserowa związana z matrycą (MALDI)-MS jest często stosowana do wstępnego badania nienaruszonych gatunków lipidów A. Pojedynczo naładowane jony są generowane z analitu przygotowanego zgodnie z naszymi procedurami ekstrakcji. Ponieważ wymagana jest bardziej dokładna analiza statyczno-wytrzymałościowa, metody oparte na MS/MS okazują się bardziej pouczające niż MALDI-MS. W połączeniu z jonizacją elektrorozpylania (ESI) pojedynczo lub wielokrotnie naładowane jony prekursorowe lipidu A są dalej fragmentowane przez dysocjację wywołaną zderzeniem (CID) lub fotodysocjację ultrafioletową (UVPD), w celu wytworzenia strukturalnie informacyjnych jonów produktowych18,20,21. Neutralne produkty utraty jonów prekursorowych lipidów A są również często generowane podczas ESI-MS, zapewniając dodatkową warstwę informacji strukturalnej.
Tandemowa spektrometria mas (MS/MS) okazała się niezastąpioną i wszechstronną metodą wyjaśniania struktur lipidów A. Podczas MS/MS jony są aktywowane w celu uzyskania diagnostycznego wzorca fragmentacji, który można wykorzystać do wyjaśnienia struktury jonu prekursorowego. Najszerzej dostępną metodą MS/MS jest CID. Metoda ta wytwarza jony fragmentacyjne poprzez zderzenia wybranego jonu prekursorowego z obojętnym gazem docelowym, co powoduje depozycję energii, która prowadzi do dysocjacji. CID okazał się kluczowym narzędziem w przypisywaniu struktury lipidów A dla szerokiego zakresu gatunków bakterii22-33.
Chociaż CID jest najbardziej uniwersalnie stosowaną metodą MS/MS, generuje ograniczoną liczbę jonów produktowych. 193 nm UVPD jest alternatywną i komplementarną metodą MS/MS. Metoda ta wykorzystuje laser do naświetlania jonów, a absorpcja fotonów powoduje energetyzację jonów i późniejszą dysocjację. Ta technika MS/MS o wyższej energii wytwarza bardziej zróżnicowany wachlarz jonów produktowych niż CID, a tym samym zapewnia bardziej informacyjne wzorce fragmentacji. W szczególności UVPD dostarcza informacji o subtelnych zmianach w gatunkach lipidów A w oparciu o rozszczepienia wiązań glikozydowych, aminowych, acylowych i połączonych C-C18,21,34.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C607</td><td>Metanol klasy HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A452</td><td></td></tr><tr><td>Teflonowe butelki wirówkowe FEP</td> klasy HPLC <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-562-21</td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy 60 płytek TLC</td><td>EMD Biosciences</td><td>5626-6</td><td></td></tr><tr><td>Klasa nr 3MM Bibuła chromatograficzna</td><td>Whatman</td><td>3030700</td><td></td></tr> Naukowy <tr><td>spektrometr</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mas Orbitrap Elite</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emitery PicoTip Nanospray ESI</td><td>Nowe urządzenia</td><td></td><td>&#8805; 30 &mu; m w celu zmniejszenia zatykania</td></tr><tr><td>Model 505 Generator impulsów/opóźnień</td><td>Berkeley Nucleonics Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gorąca płyta Thermoylne 2200</td><td>Barnstead/Thermolyne</td><td>HPA2235MQ</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm GPI 15-415 Gwintowane jednorazowe probówki do hodowli borokrzemianów</td><td>Corning Pyrex</td><td>99449-16X</td><td></td></tr><tr><td>Wielokrotnego użytku gwintowane nakrętki z PTFE GPI 45-415</td><td>Corning</td><td>9999-152</td><td></td></tr><tr><td>Osobisty system obrazowania molekularnego (phosphorimager)</td><td>BioRad</td><td>170-9400</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta autoradiograficzna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FBCS810</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorscreen SO230</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide Mass Standards Kit</td><td>Sequazyme</td><td>P2-3143-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier S250-A</td><td>Branson</td><td>101063196</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml 12x32 mm Fiolka ze stożkowym gwintem podstawy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4000-V1</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu a z bakterii gram-ujemnych

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolisacharyd (LPS) to główna cząsteczka bakterii Gram-ujemnych na powierzchni komórki, osadzona na zewnętrznej warstwie błony zewnętrznej. LPS można podzielić na trzy domeny: dystalny O-polisacharyd, oligosacharyd rdzeniowy i domenę lipidową A składającą się z gatunku cząsteczkowego lipidu A i reszt kwasu 3-deoksy-D-manno-oct-2-ulosonowego (Kdo). Domena lipidu A jest jedynym składnikiem niezbędnym do przetrwania komórek bakteryjnych. Po syntezie lipid A jest modyfikowany chemicznie w odpowiedzi na stresy środowiskowe, takie jak pH lub temperatura, w celu promowania odporności na związki antybiotykowe i unikania rozpoznania przez mediatory wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Poniższy protokół szczegółowo opisuje izolację lipidu A na małą i dużą skalę od bakterii Gram-ujemnych. Wyizolowany materiał jest następnie chemicznie charakteryzowany za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) lub spektrometrii mas (MS). Oprócz matrycowo wspomaganej matrycowo desorpcji/jonizacji czasu przelotu (MALDI-TOF) MS, opisujemy również tandemowe protokoły MS do analizy form molekularnych lipidów A przy użyciu jonizacji elektronrozpylającej (ESI) sprzężonej z dysocjacją wywołaną zderzeniem (CID) i nowo zastosowanymi metodami fotodysocjacji ultrafioletowej (UVPD). Nasze protokoły MS pozwalają na jednoznaczne określenie struktury chemicznej, co ma zasadnicze znaczenie dla charakterystyki cząsteczek lipidów A, które zawierają unikalne lub nowatorskie modyfikacje chemiczne. Opisujemy również znakowanie radioizotopowe, a następnie izolację lipidu A z komórek bakteryjnych do analizy za pomocą TLC. W porównaniu z protokołami opartymi na MS, TLC zapewnia bardziej ekonomiczną i szybszą metodę charakteryzacji, ale nie może być używana do jednoznacznego przypisywania struktur chemicznych lipidów A bez użycia wzorców znanej struktury chemicznej. W ciągu ostatnich dwóch dekad izolacja i charakterystyka lipidu A doprowadziła do wielu ekscytujących odkryć, które poprawiły naszą wiedzę na temat fizjologii bakterii Gram-ujemnych, mechanizmów oporności na antybiotyki, wrodzonej odpowiedzi immunologicznej człowieka i dostarczyły wielu nowych celów w rozwoju związków przeciwbakteryjnych.

Kanoniczny lipid A E. coli oraz Salmonella enterica serowaru Typhimurium jest heksaacylanym disacharydem glukozaminy z grupami fosforanowymi w pozycjach 1 i 4'. Podczas wzrostu w bogatych pośrodkach (np. bulionie Lurii) część lipidu A zawiera grupę pirofosforanową w pozycji 1, co prowadzi do powstania gatunku tris-fosforylowanego36 (Rysunek 1). Kdo (kwas 3-deoksy-D-manno-oktulozonowy) jest przyłączony do grupy 6'-hydroksylowej i służy jako mostek łą...

Izolacja i charakterystyka domeny lipidów A lipopolisacharydu (LPS) od bakterii Gram-ujemnych dostarcza wglądu w oparte na powierzchni komórek mechanizmy oporności na antybiotyki, przeżywalność i sprawność bakterii, oraz jak chemicznie zróżnicowane gatunki molekularne lipidów A różnie modulują wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie lipopolisacharydu z zewnętrznej powierzchni bakterii gram-ujemnych oraz strukturalna charakterystyka frakcji lipidu A przy użyciu protokołów tandemowego MS. Jest to realizowane poprzez ekstrakcję chemiczną lipopolisacharydu z powierzchni komórek bakteryjnych, a następnie łagodne hydrolizę kwasową w celu uwolnienia lipidu A z części polisacharydowej lipopolisacharydu. W drugim etapie roztwór lipidu A jest analizowany za pomocą MSMS z jonizacją przez elektroryś. W naszej procedurze lipid A jest analizowany za pomocą MS MS opartej na dysocjacji indukowanej zderzeniami lub fotodysocjacji ultrafioletowej w celu charakterystyki strukturalnej. Wyniki wykazują różnice w wzorcach fragmentacji w widmach mas produkowanych za pomocą protokołów MS MS opartych na dysocjacji indukowanej zderzeniami lub fotodysocjacji ultrafioletowej, przy czym UVPD daje bardziej informacyjny wzorzec fragmentacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że tandemowa spektrometria mas pozwala na identyfikację analizowanych substancji docelowych na podstawie interpretacji diagnostycznych wzorców fragmentacji.Fotodysocjacja ultrafioletowa (UVPD) jest wysokenergetyczną metodą MSMS, która generuje bardziej zróżnicowane jony fragmentacyjne niż istniejące techniki, takie jak dysocjacja indukowana zderzeniami. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ stosowana technika spektrometrii mas UVPD nie została jeszcze skomercjalizowana. Dodatkowo, metoda ta wykorzystuje laser, który przed rozpoczęciem procedury został zintegrowany ze spektrometrem mas za pomocą niestandardowej modyfikacji.Zebrać komórki z 250 ml kultury bakteryjnej i odwirować je przy 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie odlać nadsącz z medium i przemyć osad komórkowy 50 ml 1x PBS. Po ponownym odwirowaniu i uformowaniu osadu komórkowego odlać nadsącz.Następnie zawiesić komórki w 40 ml 1x PBS i rozdzielić je pomiędzy dwie teflonowe probówki wirówkowe o pojemności 250 ml. Do każdej probówki dodać 25 ml chloroformu i 50 ml metanolu, aby uzyskać jednofazową mieszaninę. Wymieszać poprzez odwracanie probówek i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.Aby zapewnić całkowitą lizę komórek, odwiruj mieszaninę z prędkością 2000 ×g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odlej nadsącz. Przemyj osad LPS około 100 ml jednofazowej mieszaniny Bly dire. Odwiruj z prędkością 2000 ×g przez 20 minut i odlej nadsącz.Do osadu LPS dodać 27 ml buforu do łagodnej hydrolizy kwasowej i mieszać pipetą, aż pozostaną jedynie małe cząsteczki, a następnie sonikować za pomocą sonikatora z końcówką w celu homogenicznego resuspensowania. Resuspendować osad LPS w roztworze przy stałym cyklu pracy przez 20 sekund przy 50% mocy. Sonikację próbki powtórzyć dwukrotnie, stosując serie po 20 sekund z około pięciosekundnimi przerwami między nimi.Następnie gotuj próbki w łaźni wodnej przez 30 minut. Wyjmij probówki z łaźni wodnej i pozwól próbce ostygnąć do temperatury pokojowej. Przed przejściem do ekstrakcji lipidu A po hydrolizie, przekształć roztwór SDS w dwufazową mieszaninę BLY, dodając 30 ml chloroformu oraz 30 ml metanolu (mieszanina chloroformu, metanolu i buforu do łagodnej hydrolizy kwasowej), wymieszaj przez odwracanie i odwiruj w wirówce.Próbkę S wirować przez 10 minut przy 2000 ×g. Za pomocą pipety szklanej pobrać dolną fazę do czystej probówki wirówkowej z Teflonu. Następnie przeprowadzić drugą ekstrakcję, dodając 30 ml dolnej fazy z uprzednio wyrównanej dwufazowej mieszaniny bly dire do górnej fazy w probówce z próbką, wymieszać poprzez odwracanie i wirować przy 2000 ×g przez 10 minut. Pobrać dolną fazę za pomocą pipety szklanej i połączyć z uprzednio pobraną dolną fazą.Przemyj połączone fazy dolne, dodając 114 ml wcześniej zrównoważonej górnej fazy Bly Dire, aby stworzyć dwufazową mieszaninę Bly Dire, wymieszaną przez odwracanie i wirowanie. Wiruj z prędkością 2000 ×g przez 10 minut, używając szklanej pipety transferowej. Przenieś fazę dolną do czystej szklanej kolby rotacyjnego parownika i wysusz próbkę za pomocą odparowania rotacyjnego.Następnie dodaj 5 ml mieszaniny chloroformu i metanolu do kolby rotacyjnej i poddaj sonikacji w kąpieli przez co najmniej 30 sekund, aby pomóc w zawieszeniu lipidu A z ścianek kolby. Używając szklanej pipety transferowej, przenieś lipid do czystej szklanej probówki zamkniętej fenolowym zakrętką z wkładką PTFE.Osusz próbkę strumieniem azotu, korzystając z suszarki azotowej. Ponownie zawieś osuszone lipidy w 1 ml mieszaniny chloroformu i metanolu. Po dodaniu rozpuszczalnika wymieszaj całość w wortexie, aby zapewnić całkowitą resuspensję.Przenieś do małej szklanej fiolki na próbkę i wysusz za pomocą suszarki azotowej. Próbkę w formie suchej przechowuj w temperaturze -20°C do czasu przeprowadzenia analizy TLC lub MS. Próbkę można przechowywać w temperaturze -20°C do momentu kolejnej analizy.Po przygotowaniu próbki wymieszaj 200 µL metanolu klasy HPLC z 200 µL chloroformu klasy HPLC w pustej małej szklanej fiolce na próbkę, a następnie przenieś 200 µL mieszaniny rozpuszczalników chloroform-metanol do fiolki zawierającej lipid A i poddaj zawartość fiolki sonikacji przez pięć minut lub do całkowitego rozpuszczenia materiału. Następnie skonfiguruj spektrometr mas dla ujemnego trybu jonizacji rozpylnej z wspomaganiem elektrycznym (ESI) i napełnij strzykawkę o pojemności 250 µL roztworem lipid A.Wprowadź strzykawkę do pompy strzykawkowej i bezpośrednio infunduj rozcieńczony lipid. Próbkę podawaj z szybkością przepływu od 2,0 do 3,5 µL/min. Zoptymalizuj i wzmocnij sygnał jonów lipidów poprzez strojenie optyki jonowej.Zarejestruj widmo masowe lipidu. Wyizoluj konkretny gatunek i aktywuj docelowy lipid A, wybierając CID jako metodę MSM. Następnie zwiększaj napięcie CID lub znormalizowaną energię kolizyjną aż do fragmentacji lipidu prekursorowego.Gatunek charakteryzuje się względną obfitością na poziomie około 10% w porównaniu do najwyższego jonu produktowego; należy pozyskiwać i uśredniać widma do momentu uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu. W przypadku jonów produktowych należy przygotować próbkę oraz spektrometr mas zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Włącz laser połączony ze spektrometrem mas.Szczegóły dotyczące ustawień MS znajdują się w protokole tekstowym; skonfiguruj oprogramowanie instrumentu w taki sposób, aby laser wyzwalał laser ekscymerowy w momencie wejścia jonów do komórki HCD. Następnie włącz generator impulsów tak, aby laser pulsował co 2 ms. Wyizoluj jon prekursorowy lipidu, wybierając HCD jako metodę MS MS i ustawiając energię kolizyjną na 1% znormalizowanej energii kolizyjnej. Aktywuj wyizolowany jon lipidowy poprzez zwiększenie energii lasera i dostosowanie liczby impulsów laserowych, co zazwyczaj wynosi dziesięć impulsów o energii 6 mJ. Na koniec zbierz i uśrednij widma, aż do uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu.W przypadku jonów produktów UVPD. Negatywne widmo mas MALDI TOF lipidu A z szczepu E Coli K 12 W 3 110 wykazuje pojedynczy gatunek zdeprotonowany przy stosunku masy do ładunku 1796,2 jako główny obserwowany gatunek. Szczegóły analizy MALDI TOF zostały omówione w tekście protokołu.Alternatywnie, ta sama próbka lipidów poddana ESI w trybie ujemnym generuje głównie dwukrotnie zdeprotonowane jony lipidów o stosunku masy do ładunku 898,1. Obserwuje się również pojedynczo zdeprotonowane jony lipidów o stosunku masy do ładunku 1796,20, jednak ich względna obfitość jest niższa niż w przypadku form dwukrotnie zdeprotonowanych. Fragmentacja za pomocą CID lub UVPD przy 193 nanometrach została przeprowadzona na pojedynczo zdeprotonowanym jonie lipidów. Techniki te mogą być wykorzystane do dokładniejszego przypisania struktur chemicznych, w szczególności lipidów.Gatunek zawierający złożone kombinacje modyfikacji lub wcześniej nieopisane modyfikacje chemiczne. Profile fragmentacji przedstawiono za pomocą linii przerywanych reprezentujących miejsca rozszczepienia, które są dopasowane do wartości głównego stosunku ładunku pod każdą z podanych struktur. Wartości głównego stosunku ładunku oraz miejsca rozszczepienia wyróżnione czerwonym kolorem czcionki reprezentują unikalne jony produktów związane z lipidem znakowanym UVPD 32 P.Lipid A wyizolowany z dwóch różnych szczepów E. coli K12 został przeanalizowany za pomocą TLC. Protokół tej procedury został szczegółowo opisany w protokole tekstowym. Szczep K12 W3110 zawiera głównie lipid A bisfosforylowany i trisfosforylowany lub w przypadku użycia lipidu 32P obserwuje się bardziej złożony obraz TLC.Wyizolowano z szczepu E. coli WD 1 0 1. WD 1 0 1 produkuje lipid, który jest silnie zmodyfikowany rabinozą i fosfoetanoloaminą.Ponieważ do modyfikacji dostępne są zarówno pierwszy, jak i czwarty fosforan, lipid A z WD 1 0 1 może być opisany jako zmodyfikowany pojedynczo, zawierający tylko jedną cząsteczkę L-arabinozy lub fosfoetanolaminy przy którymkolwiek z fosforanów, lub zmodyfikowany podwójnie, gdzie oba fosforany są zmodyfikowane w sposób kombinatoryczny. Oprócz modyfikacji przy pierwszym i czwartym fosforanie obserwuje się również przyłączenie palmitanu, co zwiększa wartość RF gatunków lipid A w tym układzie rozpuszczalników. Niniejszy protokół w wyjątkowy sposób utorował drogę badaczom z dziedziny mikrobiologii do dalszego zgłębiania zależności między strukturą a funkcją w odniesieniu do tego, jak modyfikacje lipid A wpływają na biologię bakterii gram-ujemnych.Jesteśmy również bardzo zainteresowani i wykazaliśmy skuteczność spektrometrii mas opartej na UVPD w charakteryzowaniu struktur cząsteczek istotnych biologicznie, takich jak glikany, białka, kwasy nukleinowe i inne złożone lipidy. Należy pamiętać, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi, materiałami niebezpiecznymi biologicznie oraz laserami może być niezwykle ryzykowna. Należy podkreślić, że z rozpuszczalnikami należy pracować w wentylowanych dygestoriach chemicznych.Należy zawsze stosować odpowiedni sprzęt ochronny, taki jak rękawiczki i gogle, a laser wykorzystywany do UVPD powinien być odpowiednio osłonięty.

isolation-chemical-characterization-lipid-from-gram-negative

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisujemy zmodyfikowaną metodę ekstrakcji gorącym wodnym fenolem w celu oczyszczania lipopolisacharydu (LPS) z bakterii Gram-ujemnych. Po ekstrakcji LPS można następnie poddać analizie za pomocą SDS-PAGE i zwizualizować poprzez bezpośrednie barwienie lub Western immunoblot.

Oczyszczanie i wizualizacja lipopolisacharydu z bakterii Gram-ujemnych za pomocą ekstrakcji gorącą mieszaniną wodno-fenolową

Ten film demonstruje rozdzielanie kwasów mykolowych metodą chromatografii cienkowarstwowej. Technika ta oddziela różne kwasy mykolowe - długołańcuchowe lipidy obecne w ścianie komórkowej prątków - na podstawie ich polarności.

Separacja wariantów kwasu mykolowego oparta na chromatografii cienkowarstwowej: metoda rozdzielania lipidów ściany komórkowej prątków na podstawie polarności

Bakteryjna ściana komórkowa składa się z peptydoglikanu, makromolekularnej sieci nici cukrowych połączonych peptydami. Ultrasprawna chromatografia cieczowa zapewnia wysoką rozdzielczość i przepustowość dla nowatorskich odkryć składu peptydoglikanu. Przedstawiamy procedurę izolacji ścian komórkowych (woreczków) i ich późniejszego przygotowania do analizy za pomocą UPLC.

Izolacja i przygotowanie ścian komórkowych bakterii do analizy składu metodą ultra sprawnej chromatografii cieczowej

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą metody podziału fazy niejonowego środka powierzchniowo czynnego jest opisane do bezpośredniego użycia w testach TLR lub innych zastosowaniach. Dalsze kroki są szczegółowo opisane w celu przygotowania N-końcowych lipopeptydów tryptycznych do charakterystyki strukturalnej za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego metodą spektrometrii mas

Ta metoda dostarcza ram do badania inkorporacji egzogennych kwasów tłuszczowych z kompleksowych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, szczególnie Staphylococcus aureus. Aby to osiągnąć, opisano protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego i późniejszego profilowania fosfolipidów bakteryjnych za pomocą spektrometrii mas.

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Bakterie Gram-ujemne wytwarzają dwie przestrzennie oddzielone błony. Błona zewnętrzna jest oddzielona od błony wewnętrznej warstwą peryplazmy i peptydoglikanu. Zdolność do wyizolowania podwójnych warstw tych drobnoustrojów miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patogenezy.

Rozdzielenie otoczki komórkowej dla bakterii Gram-ujemnych na frakcje błony wewnętrznej i zewnętrznej z dostosowaniami technicznymi dla Acinetobacter baumannii

Przedstawiono protokół ekstrakcji całkowitej zawartości lipidów w ścianie komórkowej szerokiej gamy prątków. Ponadto przedstawiono protokoły ekstrakcji i analizy różnych rodzajów kwasów mykolowych. Dostępny jest również protokół chromatografii cienkowarstwowej do monitorowania tych związków prątków.

Analiza składu lipidowego prątków metodą chromatografii cienkowarstwowej

Chemia biomimetyczna oparta na rodnikach została zastosowana do tworzenia bibliotek niezbędnych do rozwoju biomarkerów.

Wolne rodniki w biologii chemicznej: od zachowania chemicznego do rozwoju biomarkerów

Origami DNA to potężna metoda wytwarzania precyzyjnych obiektów w nanoskali poprzez programowanie samoorganizacji cząsteczek DNA. Tutaj opisujemy protokół składania robota reagującego biologicznie z origami DNA, jego oczyszczania i barwienia ujemnego do obrazowania pod mikroskopem elektronowym transmisyjnym (TEM).

Składanie i charakterystyka bioresponsywnego robota z DNA Origami

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Poznaj izolację i charakterystykę chemiczną lipidu A z bakterii Gram-ujemnych przy użyciu spektrometrii mas. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy oporności na antybiotyki i odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Przeglądaj więcej filmów