Izolacja i charakterystyka chemiczna lipidu A z bakterii Gram-ujemnych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wyizolowanie lipopolisacharydu z zewnętrznej powierzchni bakterii gram-ujemnych oraz strukturalna charakterystyka frakcji lipidu A przy użyciu protokołów tandemowego MS. Jest to realizowane poprzez ekstrakcję chemiczną lipopolisacharydu z powierzchni komórek bakteryjnych, a następnie łagodne hydrolizę kwasową w celu uwolnienia lipidu A z części polisacharydowej lipopolisacharydu. W drugim etapie roztwór lipidu A jest analizowany za pomocą MSMS z jonizacją przez elektroryś.

W naszej procedurze lipid A jest analizowany za pomocą MS MS opartej na dysocjacji indukowanej zderzeniami lub fotodysocjacji ultrafioletowej w celu charakterystyki strukturalnej. Wyniki wykazują różnice w wzorcach fragmentacji w widmach mas produkowanych za pomocą protokołów MS MS opartych na dysocjacji indukowanej zderzeniami lub fotodysocjacji ultrafioletowej, przy czym UVPD daje bardziej informacyjny wzorzec fragmentacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że tandemowa spektrometria mas pozwala na identyfikację analizowanych substancji docelowych na podstawie interpretacji diagnostycznych wzorców fragmentacji.

Fotodysocjacja ultrafioletowa (UVPD) jest wysokenergetyczną metodą MSMS, która generuje bardziej zróżnicowane jony fragmentacyjne niż istniejące techniki, takie jak dysocjacja indukowana zderzeniami. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ stosowana technika spektrometrii mas UVPD nie została jeszcze skomercjalizowana. Dodatkowo, metoda ta wykorzystuje laser, który przed rozpoczęciem procedury został zintegrowany ze spektrometrem mas za pomocą niestandardowej modyfikacji.

Zebrać komórki z 250 ml kultury bakteryjnej i odwirować je przy 10 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie odlać nadsącz z medium i przemyć osad komórkowy 50 ml 1x PBS. Po ponownym odwirowaniu i uformowaniu osadu komórkowego odlać nadsącz.

Następnie zawiesić komórki w 40 ml 1x PBS i rozdzielić je pomiędzy dwie teflonowe probówki wirówkowe o pojemności 250 ml. Do każdej probówki dodać 25 ml chloroformu i 50 ml metanolu, aby uzyskać jednofazową mieszaninę. Wymieszać poprzez odwracanie probówek i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut.

Aby zapewnić całkowitą lizę komórek, odwiruj mieszaninę z prędkością 2000 ×g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odlej nadsącz. Przemyj osad LPS około 100 ml jednofazowej mieszaniny Bly dire. Odwiruj z prędkością 2000 ×g przez 20 minut i odlej nadsącz.

Do osadu LPS dodać 27 ml buforu do łagodnej hydrolizy kwasowej i mieszać pipetą, aż pozostaną jedynie małe cząsteczki, a następnie sonikować za pomocą sonikatora z końcówką w celu homogenicznego resuspensowania. Resuspendować osad LPS w roztworze przy stałym cyklu pracy przez 20 sekund przy 50% mocy. Sonikację próbki powtórzyć dwukrotnie, stosując serie po 20 sekund z około pięciosekundnimi przerwami między nimi.

Następnie gotuj próbki w łaźni wodnej przez 30 minut. Wyjmij probówki z łaźni wodnej i pozwól próbce ostygnąć do temperatury pokojowej. Przed przejściem do ekstrakcji lipidu A po hydrolizie, przekształć roztwór SDS w dwufazową mieszaninę BLY, dodając 30 ml chloroformu oraz 30 ml metanolu (mieszanina chloroformu, metanolu i buforu do łagodnej hydrolizy kwasowej), wymieszaj przez odwracanie i odwiruj w wirówce.

Próbkę S wirować przez 10 minut przy 2000 ×g. Za pomocą pipety szklanej pobrać dolną fazę do czystej probówki wirówkowej z Teflonu. Następnie przeprowadzić drugą ekstrakcję, dodając 30 ml dolnej fazy z uprzednio wyrównanej dwufazowej mieszaniny bly dire do górnej fazy w probówce z próbką, wymieszać poprzez odwracanie i wirować przy 2000 ×g przez 10 minut. Pobrać dolną fazę za pomocą pipety szklanej i połączyć z uprzednio pobraną dolną fazą.

Przemyj połączone fazy dolne, dodając 114 ml wcześniej zrównoważonej górnej fazy Bly Dire, aby stworzyć dwufazową mieszaninę Bly Dire, wymieszaną przez odwracanie i wirowanie. Wiruj z prędkością 2000 ×g przez 10 minut, używając szklanej pipety transferowej. Przenieś fazę dolną do czystej szklanej kolby rotacyjnego parownika i wysusz próbkę za pomocą odparowania rotacyjnego.

Następnie dodaj 5 ml mieszaniny chloroformu i metanolu do kolby rotacyjnej i poddaj sonikacji w kąpieli przez co najmniej 30 sekund, aby pomóc w zawieszeniu lipidu A z ścianek kolby. Używając szklanej pipety transferowej, przenieś lipid do czystej szklanej probówki zamkniętej fenolowym zakrętką z wkładką PTFE.

Osusz próbkę strumieniem azotu, korzystając z suszarki azotowej. Ponownie zawieś osuszone lipidy w 1 ml mieszaniny chloroformu i metanolu. Po dodaniu rozpuszczalnika wymieszaj całość w wortexie, aby zapewnić całkowitą resuspensję.

Przenieś do małej szklanej fiolki na próbkę i wysusz za pomocą suszarki azotowej. Próbkę w formie suchej przechowuj w temperaturze -20°C do czasu przeprowadzenia analizy TLC lub MS. Próbkę można przechowywać w temperaturze -20°C do momentu kolejnej analizy.

Po przygotowaniu próbki wymieszaj 200 µL metanolu klasy HPLC z 200 µL chloroformu klasy HPLC w pustej małej szklanej fiolce na próbkę, a następnie przenieś 200 µL mieszaniny rozpuszczalników chloroform-metanol do fiolki zawierającej lipid A i poddaj zawartość fiolki sonikacji przez pięć minut lub do całkowitego rozpuszczenia materiału. Następnie skonfiguruj spektrometr mas dla ujemnego trybu jonizacji rozpylnej z wspomaganiem elektrycznym (ESI) i napełnij strzykawkę o pojemności 250 µL roztworem lipid A.

Wprowadź strzykawkę do pompy strzykawkowej i bezpośrednio infunduj rozcieńczony lipid. Próbkę podawaj z szybkością przepływu od 2,0 do 3,5 µL/min. Zoptymalizuj i wzmocnij sygnał jonów lipidów poprzez strojenie optyki jonowej.

Zarejestruj widmo masowe lipidu. Wyizoluj konkretny gatunek i aktywuj docelowy lipid A, wybierając CID jako metodę MSM. Następnie zwiększaj napięcie CID lub znormalizowaną energię kolizyjną aż do fragmentacji lipidu prekursorowego.

Gatunek charakteryzuje się względną obfitością na poziomie około 10% w porównaniu do najwyższego jonu produktowego; należy pozyskiwać i uśredniać widma do momentu uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu. W przypadku jonów produktowych należy przygotować próbkę oraz spektrometr mas zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Włącz laser połączony ze spektrometrem mas.

Szczegóły dotyczące ustawień MS znajdują się w protokole tekstowym; skonfiguruj oprogramowanie instrumentu w taki sposób, aby laser wyzwalał laser ekscymerowy w momencie wejścia jonów do komórki HCD. Następnie włącz generator impulsów tak, aby laser pulsował co 2 ms. Wyizoluj jon prekursorowy lipidu, wybierając HCD jako metodę MS MS i ustawiając energię kolizyjną na 1% znormalizowanej energii kolizyjnej. Aktywuj wyizolowany jon lipidowy poprzez zwiększenie energii lasera i dostosowanie liczby impulsów laserowych, co zazwyczaj wynosi dziesięć impulsów o energii 6 mJ. Na koniec zbierz i uśrednij widma, aż do uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu.

W przypadku jonów produktów UVPD. Negatywne widmo mas MALDI TOF lipidu A z szczepu E Coli K 12 W 3 110 wykazuje pojedynczy gatunek zdeprotonowany przy stosunku masy do ładunku 1796,2 jako główny obserwowany gatunek. Szczegóły analizy MALDI TOF zostały omówione w tekście protokołu.

Alternatywnie, ta sama próbka lipidów poddana ESI w trybie ujemnym generuje głównie dwukrotnie zdeprotonowane jony lipidów o stosunku masy do ładunku 898,1. Obserwuje się również pojedynczo zdeprotonowane jony lipidów o stosunku masy do ładunku 1796,20, jednak ich względna obfitość jest niższa niż w przypadku form dwukrotnie zdeprotonowanych. Fragmentacja za pomocą CID lub UVPD przy 193 nanometrach została przeprowadzona na pojedynczo zdeprotonowanym jonie lipidów. Techniki te mogą być wykorzystane do dokładniejszego przypisania struktur chemicznych, w szczególności lipidów.

Gatunek zawierający złożone kombinacje modyfikacji lub wcześniej nieopisane modyfikacje chemiczne. Profile fragmentacji przedstawiono za pomocą linii przerywanych reprezentujących miejsca rozszczepienia, które są dopasowane do wartości głównego stosunku ładunku pod każdą z podanych struktur. Wartości głównego stosunku ładunku oraz miejsca rozszczepienia wyróżnione czerwonym kolorem czcionki reprezentują unikalne jony produktów związane z lipidem znakowanym UVPD 32 P.

Lipid A wyizolowany z dwóch różnych szczepów E. coli K12 został przeanalizowany za pomocą TLC. Protokół tej procedury został szczegółowo opisany w protokole tekstowym. Szczep K12 W3110 zawiera głównie lipid A bisfosforylowany i trisfosforylowany lub w przypadku użycia lipidu 32P obserwuje się bardziej złożony obraz TLC.

Wyizolowano z szczepu E. coli WD 1 0 1. WD 1 0 1 produkuje lipid, który jest silnie zmodyfikowany rabinozą i fosfoetanoloaminą.

Ponieważ do modyfikacji dostępne są zarówno pierwszy, jak i czwarty fosforan, lipid A z WD 1 0 1 może być opisany jako zmodyfikowany pojedynczo, zawierający tylko jedną cząsteczkę L-arabinozy lub fosfoetanolaminy przy którymkolwiek z fosforanów, lub zmodyfikowany podwójnie, gdzie oba fosforany są zmodyfikowane w sposób kombinatoryczny. Oprócz modyfikacji przy pierwszym i czwartym fosforanie obserwuje się również przyłączenie palmitanu, co zwiększa wartość RF gatunków lipid A w tym układzie rozpuszczalników. Niniejszy protokół w wyjątkowy sposób utorował drogę badaczom z dziedziny mikrobiologii do dalszego zgłębiania zależności między strukturą a funkcją w odniesieniu do tego, jak modyfikacje lipid A wpływają na biologię bakterii gram-ujemnych.

Jesteśmy również bardzo zainteresowani i wykazaliśmy skuteczność spektrometrii mas opartej na UVPD w charakteryzowaniu struktur cząsteczek istotnych biologicznie, takich jak glikany, białka, kwasy nukleinowe i inne złożone lipidy. Należy pamiętać, że praca z rozpuszczalnikami organicznymi, materiałami niebezpiecznymi biologicznie oraz laserami może być niezwykle ryzykowna. Należy podkreślić, że z rozpuszczalnikami należy pracować w wentylowanych dygestoriach chemicznych.

Należy zawsze stosować odpowiedni sprzęt ochronny, taki jak rękawiczki i gogle, a laser wykorzystywany do UVPD powinien być odpowiednio osłonięty.