Name: Protokół genetycznej indukcji i wizualizacji łagodnych i inwazyjnych nowotworów w kompleksach głowowych Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-11T15:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę indukcji łagodnych i inwazyjnych nowotworów u Drosophila melanogaster poprzez dyssekcję kompleksu głowowego larw. Protokół umożliwia wizualizację GFP-znakowanych guzów i badanie dynamiki nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w moim laboratorium są wspierane przez fundusze startowe Wydziału Biologii WKU, grant Fundacji Badawczej WKU RCAP-I # 11-8032 oraz przez grant KBRIN-AREA finansowany przez grant nadrzędny z National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem grantu 5P20GM103436-13. Chciałbym również podziękować dr Tian Xu, w którego laboratorium zapoznałem się z tą techniką, oraz dr Raymondowi Pagliariniemu, który jako pierwszy wprowadził tę technikę w laboratorium Xu.

1. Indukcja łagodnych nieinwazyjnych nowotworów
<ol>
	<li>Do indukcji łagodnych nowotworów należy stosować zapasy wymienione w Tabeli 2.</li>
	<li>Przygotować kulturę starterową dla stada "testowego" o następującym genotypie: y,w, ey-FLP1; Wanna-Gal80, FRT40A; Act5C>y+>Gal4, UAS-GFP</li>
	<li>Przygotować kulturę starterową dla "przetestowanego" stada o następującym genotypie: w; FRT40A, UAS-RASV12/CyO</li>
	<li>Zbierz dziesięć dziewic płci żeńskiej ze stada "testera" i dziesięciu samców ze stada "przetestowanego".</li>
	<li>Skrzyżuj samce i samice z "testera" i "przetestowanego" stada, umieszczając je oba w fiolce z pokarmem dla much.</li>
	<li>Umieścić krzyżówkę w inkubatorze o temperaturze 25 °C i pozwolić samcom i samicom na łączenie się w pary i składanie jaj przez 24-48 godzin.</li>
	<li>Sprawdzić, czy w fiolkach znajduje się wystarczające złożenie jaj i czy nie ma larw pierwszego stadium rozwojowego, upewniając się, że kultura nie wysycha.
	<ol>
		<li>Dodaj kilka kropli autoklawowanej wody destylowanej do kultury, aby była wilgotna (jeśli kultura wysycha).</li>
		<li>Kontynuuj monitorowanie hodowli i powtórz krok 1.7.1 w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj wędrujące larwy trzeciego stadium pod stereomikroskopem fluorescencyjnym, jak opisano w sekcji 3.</li>
</ol>
2. Indukcja nowotworów inwazyjnych
<ol>
	<li>Do indukcji nowotworów inwazyjnych należy stosować zapasy wymienione w tabeli 2.</li>
	<li>Należy użyć kultury starterowej z kroku 1.2 powyżej o następującym genotypie: y,w, ey-FLP1; Wanna-Gal80, FRT40A; Act5C>y+>Gal4, UAS-GFP</li>
	<li>Przygotować kulturę starterową dla "przetestowanego" stada o następującym genotypie: w; lgl4, FRT40A, UAS-RasV12/CyO</li>
	<li>Zbierz dziesięć dziewic płci żeńskiej ze stada "testera" i dziesięciu samców ze stada "przetestowanego".</li>
	<li>Skrzyżuj samce i samice z "testera" i "przetestowanego" stada, umieszczając je oba w fiolce z pokarmem dla much.</li>
	<li>Umieścić krzyżówkę w inkubatorze o temperaturze 25 °C i pozwolić samcom i samicom na łączenie się w pary i składanie jaj przez 24-48 godzin.</li>
	<li>Sprawdzić, czy w fiolkach znajduje się wystarczające złożenie jaj i czy nie ma larw pierwszego stadium rozwojowego, upewniając się, że kultura nie wysycha.
	<ol>
		<li>Dodaj kilka kropli autoklawowanej wody destylowanej do kultury, aby była wilgotna (jeśli kultura wysycha).</li>
		<li>Kontynuuj monitorowanie kultury pod kątem suchości i powtórz krok 2.7.1 w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj larwy trzeciego stadium rozwojowego pod stereomikroskopem fluorescencyjnym, jak opisano w sekcji 3.</li>
</ol>
3. Obserwacja łagodnych i inwazyjnych nowotworów
<ol>
	<li>Użyj larw trzeciego stadium do łagodnej izolacji i wizualizacji guza.
	<ol>
		<li>Zwilż pędzel w wodzie destylowanej i za pomocą tego pędzla zeskrob kilka larw trzeciego stadium ze ścianki fiolki z kulturą.</li>
		<li>Umieść larwy w szkiełku wgłębieniowym z 1X PBS, a następnie za pomocą mokrego pędzla zeskrob z naskórka larwy wszelki materiał spożywczy</li>.
		<li>Umieścić larwy na szalce Petriego i pozostawić w temperaturze -20 °C w zamrażarce na 30 minut w celu unieruchomienia larwy.
		<ol>
			<li>Alternatywna metoda unieruchamiania larw za pomocą FLYNAP.</li>
			<li>Umieścić różdżkę FLYNAP zanurzoną w FLYNAP w fiolce z 3.1.3.2 i po włożeniu fiolki odstawić zatkaną fiolkę z larwami na 30 do 40 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść unieruchomioną larwę na szkiełku podstawowym, dodaj kroplę lekkiego oleju halowęglowego, przykryj szkłem nakrywkowym i obserwuj pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym z możliwością wizualizacji białka zielonej fluorescencji (GFP).</li>
		<li>Łagodne larwy zawierające guz będą fluoryzować na zielono w przednim obszarze, w którym obecny jest kompleks głowowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz larwy dnia 10 (po indukcji) z hodowli ustawionej w kroku #2 powyżej do obserwacji nowotworów inwazyjnych. Larwy dnia 10 są wybierane, ponieważ inwazyjne larwy zawierające guz mają wydłużone stadium larwalne i na ogół nie przepoczwarzają się.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami od 3.1.1 do 3.1.4, z wyjątkiem tego, że zamiast larw w trzecim stadium należy użyć larw dnia 10.
	<ol>
		<li>Inwazyjne larwy zawierające guz w dniu 10 będą fluoryzować na zielono w przedniej części, w której obecny jest kompleks głowowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli mikroskop fluorescencyjny jest wyposażony w kamerę cyfrową, należy wykonać zdjęcia fluoryzujących łagodnych i inwazyjnych larw zawierających guz</li>.
</ol>
4. Sekcja kompleksu głowowego i dalsza obserwacja łagodnych i inwazyjnych nowotworów
Przezroczysty naskórek larwy utrudnia obserwację stopnia inwazji nowotworów. W ten sposób zakres inwazji jest lepiej zobrazowany poprzez wypreparowanie kompleksu głowowego z larwy. Następujące kroki należy wykorzystać do rozbioru kompleksu głowowego.
<ol>
	<li>Za pomocą mokrego pędzla wybierz larwy trzeciego stadium (w przypadku guzów łagodnych) i larwy dnia 10 (w przypadku guzów inwazyjnych) z odpowiednich fiolek hodowlanych.</li>
	<li>Umieść larwy w studzience naczynia rozwarstwiającego zawierającego zimny 1X PBS. Użyj pędzla, aby zeskrobać wszelkie resztki jedzenia z naskórka larw.
	<ol>
		<li>Przenieść czyste larwy do świeżej studzienki naczynia rozwarstwiającego zawierającego zimny 1X PBS.</li>
		<li>Sprawdzić obecność fluorescencji GFP za pomocą stereomikroskopu zdolnego do wykrycia fluorescencji. Wyrzuć larwy niezawierające GFP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 1,0 ml zimnego 1X PBS do świeżej studzienki na naczyniu separacyjnym i za pomocą kleszczy przenieś larwę zawierającą łagodne lub inwazyjne guzy (protokół sekcji pozostaje taki sam dla tych dwóch typów guzów).</li>
	<li>Przytrzymaj larwę za pomocą kleszczy około 2/3 od przedniego końca.
	<ol>
		<li>Użyj drugiej pary kleszczy i sprytnie oddziel tylną 1/3 larwy i wyrzuć ją.</li>
		<li>Puść przednie 2/3 larwy. Gdy ciśnienie wewnątrz larwy zostanie uwolnione, zawartość larwy będzie wyciekać z jamy ciała.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby usunąć jelito, tłuszcz i inną wewnętrzną zawartość larwy, która wyciekła z jamy ciała.</li>
		<li>Użyj pary kleszczy, aby przytrzymać haczyk ustny larwy i wepchnij go w naskórek larwy, a następnie za pomocą drugiej pary kleszczy całkowicie odwróć larwę.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie i ostrożnie usunąć ciało tłuszczowe, gruczoły ślinowe, jelita, kompleks dysku skrzydłowego i wszelkie rurki tchawicze. Kompleks głowowy powinien być teraz widoczny przyczepiony do haczyka gębowego odwróconej larwy. Półkule mózgowe i brzuszny rdzeń nerwowy (VNC) nadal byłyby połączone z naskórkiem larwy poprzez nerwy emanujące z VNC.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie przerwać połączenia między nerwami głowowymi a naskórkiem larw.</li>
		<li>Ponieważ połączenia nerwowe między VNC a naskórkiem larwy są zerwane, a nadmiar tkanki tłuszczowej i innych tkanek usuwany, kompleks głowowy stanie się wyraźnie widoczny i zostanie przyczepiony do naskórka larwy tylko na haczykach gębowych.</li>
		<li>Kompleks głowowy można pozostawić przyczepiony do naskórka larw, jeśli kompleks musi zostać utrwalony do dalszych zastosowań, takich jak barwienie przeciwciał lub do późniejszej wizualizacji.</li>
		<li>Jeśli nie będą wykonywane dalsze aplikacje, kompleks głowowy można odłączyć od naskórka larw i umieścić w kropli podłoża montażowego na bazie glicerolu w celu dalszej obserwacji i analizy. Użyj VECTASHIELD jako nośnika montażowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bale, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling and human disease.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li>
<li>Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+development%2C+disease+and+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in development, disease and translational medicine.</a> Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).</li>
<li>Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+tauopathies%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of tauopathies: what have we learned.</a> Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980(2012).</li>
<li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Reiter, L. T., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+melanogaster+to+uncover+human+disease+gene+function+and+potential+drug+target+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins.</a> Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).</li>
<li>Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+and+functions+of+beta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The many faces and functions of beta-catenin.</a> EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302, 1227-1231 (2003).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).</li>
<li>Boccaccio, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+growth%3A+a+MET-driven+genetic+programme+for+cancer+and+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells.</a> Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).</li>
<li>Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+remodeling+is+essential+for+Drosophila+disc+eversion+and+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).</li>
<li>Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cofilin+pathway+in+breast+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).</li>
<li>Brand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+as+a+cell+and+developmental+marker+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system.</a> Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).</li>
<li>Brand, A. H., Dormand, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GAL4+system+as+a+tool+for+unravelling+the+mysteries+of+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system.</a> Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).</li>
<li>Vidal, M., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila models for cancer research.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).</li>
<li>Parks, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+generation+of+high-resolution+deletion+coverage+of+the+Drosophila+melanogaster+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome.</a> Nat Genet. 36, 288-292 (2004).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics%3A+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121, 1053-1063 (1995).</li>
<li>Rebay, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+novel+components+of+the+Ras%2FMitogen-activated+protein+kinase+signaling+pathway+that+interact+with+the+yan+gene+of+Drosophila+identifies+split+ends%2C+a+new+RNA+recognition+motif-containing+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein.</a> Genetics. 154, 695-712 (2000).</li>
<li>Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+modifiers+of+a+kinase+suppressor+of+Ras-dependent+rough+eye+phenotype+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila.</a> Genetics. 156, 1231-1242 (2000).</li>
<li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+in+vivo+models+of+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">New developments in in vivo models of neoplasia.</a> Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).</li>
<li>Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+spontaneous+melanoma+metastasis+in+scid+mice+with+an+antibody+to+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor.</a> Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).</li>
<li>Konantz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).</li>
<li>McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in the mouse.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).</li>
<li>Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+mouse+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in mouse and man.</a> Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).</li>
<li>Stefanatos, R. K., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%3A+a+bold+past%2C+a+bright+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future.</a> J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).</li>
<li>Beaucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+brain+tumor+metastases+express+both+neuronal+and+glial+cell+type+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers.</a> Dev Biol. 301, 287-297 (2007).</li>
<li>Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+ability+of+Drosophila+tumors+depends+on+MMP+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity.</a> Dev Biol. 303, 625-634 (2007).</li>
<li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).</li>
<li>Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cell+polarity+drives+tumor+growth+and+invasion+through+JNK+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila.</a> Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).</li>
<li>Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cell-autonomous+induction+of+tissue+overgrowth+by+JNK%2FRas+cooperation+in+a+Drosophila+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).</li>
<li>Uhlirova, M., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK-+and+Fos-regulated+Mmp1+expression+cooperates+with+Ras+to+induce+invasive+tumors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila.</a> EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).</li>
<li>Menut, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mosaic+genetic+screen+for+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressor+genes+based+on+defective+pupation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation.</a> Genetics. 177, 1667-1677 (2007).</li>
<li>Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Ras%28V12%29+and+scribbled+clones+induces+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion.</a> Nature. 463, 545-548 (2010).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Rak jest złożoną chorobą, która jest obecnie znacznie lepiej rozumiana niż w przeszłości. Jednak wciąż wiele musi się nauczyć i wyjaśnić, zanim uzyskamy pełny obraz mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska. Przedstawiony tutaj prosty protokół umożliwia genetyczne indukowanie łagodnych i inwazyjnych nowotworów w całym organizmie, a następnie badanie biologii związanej z progresją nowotworów w tym modelu. Większość istniejących technik u Drosophila i innych organizmów wykorzystuje albo system oparty na hodowli...

Postęp nowotworów od stanu łagodnego do przerzutowego jest procesem etapowym, który charakteryzuje się unikaniem mechanizmów ochronnych obecnych w organizmie 8. Na przykład komórki nowotworowe w organizmie muszą być w stanie uniknąć apoptozy i układu odpornościowego, przebić się przez wyspecjalizowaną macierz zewnątrzkomórkową (ECM) zwaną błoną podstawną i przezwyciężyć wszelkie kontrole społeczne narzucone przez otaczające komórki. To właśnie poprzez stopniową progresję komórki rakowe nabywają zdolność do migracji i kolonizacji odległych miejsc w procesie zwanym przerzutami. Nasze zrozumienie tego, w jaki sposób komórka nowotworowa pokonuje bariery narzucone przez organizm, jest wciąż w powijakach, jednak wyłaniający się obraz z dotychczasowych badań wskazuje na wielokrotne stosowanie normalnych procesów rozwojowych i szlaków sygnałowych przez komórki rakowe 11-13.
Muszka owocowa Drosophila melanogaster ogromnie przyczyniła się do naszego zrozumienia normalnego rozwoju i chorób dzięki zastosowaniu zaawansowanych technik genetycznych opracowanych w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat 14-17. Korzystając z narzędzi do mutagenezy i nadekspresji, udało nam się lepiej zrozumieć różne onkogeny i geny supresorowe nowotworów 18-22. Jednak przerzuty nowotworowe są wynikiem współpracy między kilkoma zmianami genetycznymi, która była badana głównie w modelach hodowli komórkowych 23,24, a także w różnych modelach ksenoprzeszczepów 25-27. Modele te, choć potężne, mają swoje ograniczenia, ponieważ nie naśladują całkowicie warunków występujących w żywym organizmie. Co więcej, modele transgeniczne dostępne u myszy są kłopotliwe i nie sprzyjają analizie genetycznej zachowań inwazyjnych 28,29. W kilku badaniach podjęto próbę zrozumienia inwazji komórek nowotworowych u Drosophila 30,31. Techniki te wykorzystują przede wszystkim przeszczepianie guzów pierwotnych do gospodarzy, a następnie polegają na śledzeniu przeszczepionych guzów pod kątem inwazji sąsiednich tkanek 32,33. Potężna technika o nazwie MARCM 10 została zaadaptowana przez Pagliariniego i Xu do modelowania inwazji guza u Drosophila 9. To eleganckie modelowanie genetyczne inwazji guza wykorzystało współpracę między aktywowanym onkogenem a utratą polarności komórek. Siła tego modelowania polega na tym, że inwazyjne guzy powstają w nienaruszonym organizmie, co pozwala uniknąć konieczności przeszczepiania tkanek. Aby doprowadzić do współpracy onkogennej, aktywowany onkogen, taki jak RasV12, ulega ekspresji w klonach komórek w krążku oczkowo-antenowym larwy. W wyniku techniki MARCM klony te są również oznaczane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu łatwej wizualizacji i stają się homozygotyczne pod względem mutantów polaryzacji komórek, takich jak śmiertelne gigantyczne larwy, nabazgrane i duże dyski. Rezultatem są inwazyjne guzy w kompleksie głowowym oznaczone GFP. W tym raporcie pokazuję, jak indukować i wizualizować te inwazyjne nowotwory zarówno w kontekście nienaruszonej larwy, jak i w wypreparowanym kompleksie głowowym. Przedstawiona tutaj indukcja guza wykorzystuje odczynniki na drugim chromosomie Drosophila. W tabeli 2 przedstawiam wykaz stad chromosomów X i 3, które można wykorzystać do tego samego celu. Wierzę, że ten uproszczony protokół sprawi, że technika ta będzie łatwo dostępna dla badaczy zainteresowanych zrozumieniem molekularnych podstaw progresji nowotworu.

<table><tbody><tr><td>10X PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) pH 7,2 roztwór podstawowy</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schłodzony 1X PBS pH7,2 roztwór roboczy</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td>Zrób świeże i przechowuj w lodówce, może być używany do tygodnia</td></tr><tr><td>Flynap</td><td>Carolina Biologicals</td><td></td><td>Znieczulenie muchowe potrzebne do znieczulenia larw</td></tr><tr><td>Utrwalacz</td><td>0,1 M RURY, pH 7,2, 4% Paraformaldehyd</td><td></td><td>Potrzebne do naprawienia wypreparowanego kompleksu głowowego Wiadro</td></tr> z <tr><td>lodem</td><td>Kilka</td><td></td><td>roztworów do konserwacji na lodzie. Również rozciąć kompleks głowowy w schłodzonym 1X PBS, a następnie umieścić na lodzie w tubie</td></tr><tr><td>Eppendorf 1,7 ml probówka Eppendorf</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełka podstawowe, szkło nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Media montażowe lub inne media montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon 200 lub 700 Oil</td><td>Polysciences Inc. lub Halocarbon.com</td><td></td><td>Halocarbon 200 służy do mocowania larw w celu wizualizacji na stereoskopie fluorescencyjnym</td></tr><tr><td>Lakier do paznokci Sally Hansen "Hard as Nails"</td><td>Można go znaleźć w każdym sklepie</td><td></td> z towarami ogólnymi <td>Potrzebne do uszczelnienia krawędzi szkiełka nakrywkowego</td></tr><tr><td>Stereomikroskop fluorescencyjny Leica MZ16.5 lub dowolny inny stereomikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica i inne</td><td></td><td>Potrzebne do obserwacji fluorescencji GFP u larw</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 9-dołkowa płytka punktowa lub dowolna inna miska preparcyjna</td><td>Pędzel Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Można znaleźć w każdym sklepie</td><td></td><td></td></tr><tr> z towarami ogólnymi<td colspan="4">Tabela 1. Materiały potrzebne do wykonania protokołu eksperymentalnego przedstawionego w tym artykule.</td></tr></tbody></table>

protokół genetycznej indukcji i wizualizacji łagodnych i inwazyjnych nowotworów w kompleksach głowowych drosophila melanogaster

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila rzuciła światło na nasze zrozumienie genetycznych podstaw normalnego rozwoju i chorób przez ostatnie kilkadziesiąt lat, a dziś nadal ogromnie przyczynia się do naszego zrozumienia złożonych chorób 1-7. Progresja nowotworów od stanu łagodnego do przerzutowego jest złożonym zdarzeniem 8 i została modelowana u Drosophila, aby pomóc nam lepiej zrozumieć genetyczne podstawy tej choroby 9. Poniżej przedstawiam prosty protokół genetycznego indukowania, obserwacji, a następnie analizy progresji nowotworów u larw Drosophila. Technika indukcji guza opiera się na systemie MARCM 10 i wykorzystuje współpracę między aktywowanym onkogenem, RasV12, a genami utraty polarności komórek (bazgroły, dyski duże i śmiertelne gigantyczne larwy) w celu wytworzenia inwazyjnych guzów 9. Pokazuję, w jaki sposób te guzy można uwidocznić w nienaruszonych larwach, a następnie jak można je wypreparować do dalszej analizy. Przedstawiony tutaj uproszczony protokół powinien umożliwić wykorzystanie tej techniki przez badaczy zainteresowanych zrozumieniem roli genu w inwazji guza.

W wyniku zastosowania przedstawionego tutaj protokołu użytkownik będzie mógł wywołać łagodne guzy poprzez nadekspresję aktywnego onkogenu w larwalnym tarczku wyobraźnię oka i czułków. Użytkownik będzie mógł również wywołać guzy inwazyjne w tarczku wyobraźnię oka i czułków poprzez nadekspresję aktywnego onkogenu w klonach komórek, które są jednocześnie mutantami w obrębie genu polaryzacji komórkowej. Guzy można łatwo zwizualizować za pomocą fluorescencyjnego stereomikroskopu jako tkankę „zielono fluorescencyjną” w całych ...

Współpraca między aktywowanym onkogenem, takim jak RASV12, a mutacjami w genach polaryzacji komórek, takimi jak bazgroły, powoduje wzrost guza u Drosophila, gdzie komórki nowotworowe również wykazują inwazyjne zachowania. W tym miejscu przedstawiono prosty protokół indukcji i obserwacji nowotworów łagodnych i inwazyjnych.

Protokół genetycznej indukcji i wizualizacji łagodnych i inwazyjnych nowotworów w kompleksach głowowych Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie łagodnych i inwazyjnych nowotworów u muszki owocówki drosophila, a następnie ich wizualizacja poprzez sekcję kompleksu głowowego larw. Proces ten rozpoczyna się od przeprowadzenia krzyżówek między wybranymi szczepami i izolacji potomstwa larwalnego, u którego rozwinęły się nowotwory inwazyjne lub łagodne. Kolejnym krokiem jest sekcja wybranych larw.Aby odsłonić kompleks głowowy, należy najpierw przeciąć go w dwóch trzecich długości, unieruchomić, a następnie wywinąć na drugą stronę. Następnie usuwa się tkanki ciała tłuszczowego i jelita, a potem przerywa się wszelkie połączenia nerwowe z brzuszny łańcuchem nerwowym oraz naskórkiem larwalnym. Ostatnim krokiem jest obrazowanie kompleksu głowowego lub jego utrwalenie do dalszych zastosowań.Ostatecznie wyniki mogą wykazać obecność naciekających lub łagodnych guzów znakowanych GFP przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na niektóre z kluczowych pytań w biologii nowotworów. Na przykład można chcieć zrozumieć, które geny mogą hamować progresję guzów w organizmie nienaruszonym.Po uzyskaniu wymaganych szczepów genetycznych przygotować kulturę startową szcz

a-protocol-for-genetic-induction-visualization-benign-invasive-tumors

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Protokół indukcji genetycznej i wizualizowania łagodnych i inwazyjnych guzów w kompleksach głowowych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Opisujemy protokół preparacji, utrwalania i barwienia immunologicznego organów steroidogennych u larw Drosophila i dorosłych samic w celu zbadania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Oprócz narządów steroidogennych wizualizujemy unerwienie narządów steroidogennych, a także steroidogennych komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste linii rozrodczej.

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Analiza klonów mozaiki w nabłonku dysku imaginalnego Drosophila to potężny system modelowy do badania genetycznych i komórkowych mechanizmów nowotworzenia. W tym miejscu opisujemy protokół indukcji guzów w dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila za pomocą systemu GAL4-UAS i wprowadzamy metodę diagnozy w celu klasyfikacji fenotypów guza.

Indukcja i diagnostyka nowotworów w nabłonku dysku wyobrażeniowego Drosophila

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Ten protokół dostarcza szczegółowych wskazówek dotyczących początkowej i kontynuowanej pokoleniowej allotransplantacji guzów Drosophila do brzucha dorosłych gospodarzy w celu zbadania różnych aspektów nowotworu. Korzystając z aparatu do automatycznego wstrzykiwania, naukowcy mogą osiągnąć lepszą wydajność i wydajność guza w porównaniu z tymi osiąganymi tradycyjnymi, ręcznymi metodami.

Allotransplantacja guza u Drosophila melanogaster za pomocą programowalnego wtryskiwacza Auto-Nanolitr

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Poznaj metodę indukcji łagodnych i inwazyjnych nowotworów u Drosophila melanogaster poprzez dyssekcję kompleksu głowowego larw. Protokół umożliwia wizualizację GFP-znakowanych guzów i badanie dynamiki nowotworowej.

Protokół genetycznej indukcji i wizualizacji łagodnych i inwazyjnych nowotworów w kompleksach głowowych Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów