Protokół genetycznej indukcji i wizualizacji łagodnych i inwazyjnych nowotworów w kompleksach głowowych Drosophila melanogaster
11 września 2013
Współpraca między aktywowanym onkogenem, takim jak RASV12, a mutacjami w genach polaryzacji komórek, takimi jak bazgroły, powoduje wzrost guza u Drosophila, gdzie komórki nowotworowe również wykazują inwazyjne zachowania. W tym miejscu przedstawiono prosty protokół indukcji i obserwacji nowotworów łagodnych i inwazyjnych.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie łagodnych i inwazyjnych nowotworów u drosophila, a następnie ich wizualizacja poprzez wypreparowanie larwalnego kompleksu głowowego. Rozpoczyna się to od ustawienia się w poprzek pożądanych szczepów i wyizolowania potomstwa larw, noszącego inwazyjne lub łagodne guzy. Następnym krokiem jest wypreparowanie wybranych larw.
Aby odsłonić kompleks głowowy, najpierw przecinając je w dwóch trzecich w dół, zabezpieczając, a następnie wywracając na lewą stronę. Następnie oczyszczane jest ciało tłuszczowe i tkanki jelitowe, a następnie wszelkie nerwy nadal przyczepione do brzusznego rdzenia nerwowego i naskórka larwalnego również są przerywane. Ostatnim krokiem jest zobrazowanie kompleksu głowowego lub naprawienie go do dalszych zastosowań.
Ostatecznie wyniki mogą wykazać inwazyjne lub łagodne guzy oznaczone GFP dzięki zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na niektóre z kluczowych pytań w biologii raka. Na przykład możesz chcieć zrozumieć, które geny mogą hamować postęp nowotworów w nienaruszonym organizmie.
Po uzyskaniu wymaganych zapasów genetycznych należy przygotować kulturę starterową szczepu testowego. Przygotuj również kulturę starterową dla badanego stada. Skrzyżuj 10 dziewic żeńskich ze stada testowego z 10 samcami z badanego stada.
Pozwól muchom łączyć się w pary i składać jaja przez 24 do 48 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza, a następnie przenieś je do świeżej fiolki, aby uzyskać więcej potomstwa. Monitorować fiolki krzyżowe pod kątem jaj i larw pierwszego stadium rozwojowego. Skonfiguruj nowy krzyżyk.
Jeśli zebrane fiolki wykazują słabe odkładanie jaj. Jeśli zebrane fiolki zaczną wysychać, dodaj tylko trzy do czterech kropli wody destylowanej w autoklawie, aby kultura była wilgotna. Kontynuować monitorowanie fiolek aż do wędrówki.
Obecne są larwy w trzecim stadium rozwojowym. Następnie przystąp do monitorowania ich pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Korzystając z tej samej procedury, zbierz muchy z inwazyjnymi nowotworami, używając wymienionych stad do piątego lub szóstego dnia hodowli, wędrujące larwy trzeciego stadium będą dostępne z łagodnych kultur nowotworowych.
Jednak nie będą one dostępne do 10 dnia od inwazyjnych kultur nowotworowych. Aby zebrać larwy trzeciego stadium rozwojowego, zwilż cienki pędzel wodą destylowaną i zeskrob je ze ścianki fiolki. Umieść larwy w szkiełku wgłębieniowym z zimnym XPBS, a następnie za pomocą mokrego pędzla
.Zeskrob wszelki materiał spożywczy z ich naskórka. Na kilka minut unieruchomienia umieść larwę na talerzu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 30 minut. Aby uzyskać dłuższy czas unieruchomienia, umieść larwy w fiolce hodowlanej, mając tylko drzemkę muchy na różdżce.
Zatkać fiolkę z kulturą i odstawić na 40 minut. Następnie przenieś unieruchomione larwy na szklane szkiełko. Dodaj kroplę lekkiego oleju węglowego halo i przykryj larwy szkłem nakrywkowym.
Teraz obserwuj larwy pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. W celu wyrażenia GFP wybierz zielone larwy fluorescencyjne i przystąp do sekcji. Łagodne larwy zawierające guz będą fluoryzować na zielono w przedniej części, w której obecny jest kompleks głowowy.
Guzy inwazyjne będą również fluoryzować na zielono w przedniej części larw w kompleksie głowowym. Jeśli to możliwe, pamiętaj o fotograficznym udokumentowaniu fluoryzujących guzów. Tak więc półprzezroczysty naskórek larwy utrudnia obserwację zakresu migracji guzów, dlatego musimy przeprowadzić sekcję guzów.
Zacznij od użycia kleszczy do przeniesienia świeżej larwy z dowolnym guzem. Wpisz do studzienki naczynia preparacyjnego zawierającego jeden mililitr zimnego XPBS. Przytrzymaj larwy za pomocą kleszczy w odległości około dwóch trzecich odległości od przedniego końca.
Używając innej pary kleszczy, sprytnie oddziel tylną trzecią część larw i wyrzuć ją. Następnie puścił przednie dwie trzecie. Gdy ciśnienie wewnątrz larw zostanie uwolnione, jego zawartość będzie wyciekać z jamy ciała.
Za pomocą kleszczy usuń tkanki, które wyciekły z jamy ciała. Następnie przytrzymaj haczyk gębowy larwy i wepchnij go w naskórek larwy. Używając drugiej pary kleszczy, całkowicie odwróć larwy.
Teraz za pomocą kleszczy, delikatnie i ostrożnie, usuń gruczoły ślinowe ciała tłuszczowego, jelita, kompleks dysku skrzydłowego i wszelkie rurki tchawicze. Kompleks głowowy może być teraz widoczny przyczepiony do haczyka gębowego. Półkule mózgowe i VNC są nadal połączone z naskórkiem larwy za pośrednictwem nerwów emanujących z VNC.
Za pomocą kleszczy delikatnie zerwij te połączenia. Następnie usuń nadmiar tkanki tłuszczowej, ciała lub innych tkanek, aby kompleks głowowy stał się wyraźnie widoczny. Przyczepiony do naskórka larwalnego na haczykach gębowych.
Pozostaw kompleks głowowy takim, jaki jest, do dalszego przetwarzania przed wizualizacją. W przeciwnym razie, aby bezpośrednio uwidocznić kompleks głowowy, odłącz go od naskórka i umieść w kropli pożywki montażowej na bazie glicerolu, takiej jak tarcza wektorowa. Za pomocą opisanego protokołu indukowano guzy w oku.
Krążek aniny, łagodne guzy pozostały zlokalizowane w krążku oka aniny, gdzie są indukowane. Zauważ, że tkanka znakowana GFP nie migrowała do sąsiednich narządów, takich jak brzuszny rdzeń nerwowy w kompleksie głowowym zawierającym inwazyjne guzy od 10 dnia po przeroście larw tkanki nowotworowej. Ponadto, jak wskazuje czerwona strzałka, guzy zaatakowały sąsiednie narządy, takie jak VNC i haczyki w ustach.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak genetycznie indukować łagodne i inwazyjne nowotwory, a następnie wizualizować je, analizując kompleks głowowy intra ano gastro.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół indukowania i obserwacji łagodnych oraz inwazyjnych nowotworów u Drosophila, koncentrując się na interakcji między aktywowanymi onkogenami a mutacjami w genach polarności komórkowej. Procedura obejmuje sekcję kompleksu głowowego larw w celu wizualizacji charakterystyki nowotworów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Genetyka
- Biologia rozwoju
Wprowadzenie
- Aktywne onkogeny, takie jak RAS V12, przyczyniają się do wzrostu guza.
- Mutacje w genach polarności komórkowej, takich jak scribbled, odgrywają rolę w zachowaniu nowotworu.
- Drosophila służy jako organizm modelowy do badania dynamiki guzów.
- Zrozumienie inwazyjności guzów jest kluczowe dla badań nad rakiem.
Cel badania
- W celu indukowania łagodnych i inwazyjnych guzów u *Drosophila*.
- W celu wizualizacji cech guzów poprzez sekcję larw.
- W celu zbadania interakcji między onkogenami a mutacjami polarności komórkowej.
Zastosowane metody
- Krzyżowanie wybranych szczepów Drosophila w celu wyizolowania potomstwa w stadium larwalnym.
- Disekcja larw w celu odsłonięcia kompleksu głowowego.
- Oczyszczanie z tkanek ciała tłuszczowego i jelit z wypreparowanych larw.
- Obrazowanie kompleksu głowowego do dalszej analizy.
Główne wyniki
- Skuteczne indukowanie łagodnych i inwazyjnych nowotworów u Drosophila.
- Wizualizacja cech nowotworu poprzez sekcję larw.
- Wgląd w rolę onkogenów i mutacji polaryzacji komórkowej w zachowaniu nowotworu.
- Potencjalne implikacje dla zrozumienia biologii raka.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania dynamiki guzów u Drosophila.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia inwazyjności guzów.
- Dalsze badania mogą służyć do eksploracji celów terapeutycznych w oparciu o te interakcje.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Niniejszy protokół umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniu szlaków inwazji nowotworowej poprzez modelowanie progresji od zmian łagodnych do złośliwych w systemie genetycznie manipulowalnym. Wspiera on walidację celów poprzez funkcjonalną analizę interakcji między onkogenami a genami polarności. Podejście to zapewnia pewność prognostyczną przy priorytetyzacji genetycznych modyfikatorów zachowania nowotworu we wczesnej fazie odkrywania.
Strategiczne Zastosowania w Badań i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez badanie współpracy między aktywowanym RasV12 a utratą genów scribble, discs large lub lethal giant larvae.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka w odniesieniu do szlaków inwazji poprzez ilościowe określenie progresji nowotworu od postaci zlokalizowanej do przylegającego przerostu tkanki.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych kompleksów głowowych z nowotworem do późniejszego przesiewu fenotypowego supresorów lub wzmacniaczy genetycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja procesów sekcji i wizualizacji w celu zapewnienia powtarzalnych odczytów ilościowych lokalizacji i inwazji nowotworu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest zgodna z systemami istotnymi dla chorób poprzez modelowanie konserwatywnych interakcji genetycznych w inwazywności nowotworów, które mają zastosowanie w szlakach rakowym u ludzi.
- Wartość operacyjna: Wspiera dostosowanie biomarkerów translacyjnych, umożliwiając analizę dysocjacji i wzorców migracji tkanek nowotworowych znakowanych GFP.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację związków wiodących – zapewniając skalowalną platformę do genomiki funkcjonalnej w biologii nowotworów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację ekspansji guza w nienaruszonych kompleksach głowowych w celu oceny genetycznych modyfikatorów inwazji.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów poprzez standaryzowaną izolację tkanki nowotworowej znakowanej GFP do oceny związków chemicznych lub supresorów genetycznych.
- Analityka: Generuje pomiary ilościowe przerostu guza i inwazji narządowej w celu porównania warunków w różnych liniach genetycznych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie zachowanych etapów progresji guza istotnych dla systemów ssaków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania w ramach walidacji celów w różnych projektach w potokach odkryć onkologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelach inwazji nowotworowej poprzez powiązanie określonych perturbacji genetycznych z obserwowalnymi efektami fenotypowymi.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność dzięki standaryzacji sekcji larw i przygotowania kompleksu głowowego do obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, zapewniając wczesną pewność fenotypową w przypadku kandydatów na supresory nowotworowe lub onkogeny.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez rozróżnianie łagodnych od inwazyjnych fenotypów nowotworowych w badaniach funkcjonalnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w genetyce Drosophila, mikroskopii fluorescencyjnej oraz technikach mikrochirurgicznej dyssekcji.
- Zależność od stereomikroskopii fluorescencyjnej i systemów anestezji na zimno w celu unieruchomienia larw i manipulacji tkankami.
- Konieczność międzyzespołowej standaryzacji protokołów utrzymania szczepów, harmonogramu krzyżowań oraz etapowania larw.
- Wymaga rozważenia adaptacji przy zastosowaniu modelu do innych typów nowotworów lub podłoży genetycznych poza pochodzeniem z krążka oko-czułkowego.
- Ograniczenie wynikające z potrzeby precyzyjnego etapowania (dzień 5–6 dla nowotworów łagodnych, dzień 10 dla nowotworów inwazyjnych), aby zapewnić porównywalne okna progresji nowotworu.
