Stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w ludzkich makrofagach THP-1

Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie systemu modelowego hodowli in vitro w celu zbadania wewnątrzkomórkowego zachowania ludzkiego oportunistycznego patogenu grzybowego. Canida lab ratta w makrofagach pochodzących z ludzkiej linii komórek monocytowych TP one. Aby osiągnąć ten THP, jeden monocyt jest najpierw traktowany czterema estrami, aby zróżnicować je w makrofagi.

Następnie makrofagi THP one są zakażane komórkami GTA canida dwie godziny po zakażeniu. Komórki GTA niefagocytozy canida są usuwane przez myjki PBS, a wewnątrzkomórkowe komórki e są odzyskiwane do dalszych badań przez osmos zakażonych makrofagów. Protokół ten może być wykorzystany do oceny zarówno komórek GTA wirusa do canida w makrofagach, jak i dojrzałości Rossa faiza i odpowiedzi cytokin w THP na makro FIDS po zakażeniu Candida GTA.

Ponadto protokół ten można skalować w górę, aby przebadać bibliotekę mutantów współpracujących z Candida pod kątem zmienionych profili przeżycia w makrofagach TSP one w sposób średnio wysokoprzepustowy. Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest stosunkowo niedrogi, wysoce powtarzalny i łatwo dostosowuje się do różnych komórek odpornościowych, a także patogenów grzybiczych. Aby rozpocząć procedurę dwa dni przed infekcją, doprowadź THP i komórki monocytowe do 80% CO w pierwszym dniu, usuń ryzyko hodowli i powoli, delikatnie, aby doprowadzić wszystkie subtelne komórki do zawiesiny.

Przenieść zawiesinę DHP jednej komórki monocytów do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej przez cztery minuty Przy 1000 obr./min zdekanować pożywkę do pojemnika na odpady w ilości pięciu ml pożywki pre API do probówki i ponownie użyć. Zawiesić jednokomórkową osadkę THV, delikatnie pipetując pożywkę trzy, cztery razy.

Weź 10 mikrolitrów zawiesiny komórek, aby określić gęstość komórek za pomocą cytometru hemologicznego i dostosuj gęstość komórek do 1 miliona komórek na ml. Dodaj jeden mikrolitr jednego 60 mikromolowego roztworu podstawowego PMA do zawiesiny komórkowej, tak aby końcowe stężenie wynosiło 16 anomolowców i dobrze wymieszaj. Dozować jedną ml zawiesiny komórkowej odpowiadającej 1 milionowi komórek do każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i przenieść ją do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Po 12 godzinach inkubacji wyrzuć starą pożywkę. Dodaj jeden ml pożywki pre RPI do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez kolejne 12 godzin. Komórki te zostaną wykorzystane do zakażenia kanadyjskiego, które zostanie pokazane później.

Stosując odpowiednie praktyki mikrobiologiczne, zaszczepić pojedynczą kolonię EA w pożywce zawierającej ML YPD. Inkubować kielichy przez 14 do 16 godzin w inkubatorze ustawionym na 30 stopni Celsjusza po wirowaniu inkubacyjnym. Jedna kultura ML przy 4 000 obr./min przez pięć minut.

Wyrzuć sup natin i umyj muszle trzy razy sterylnym PBS. Po wyrzuceniu buforu do przemywania zawiesić paletę komórek w jednym ml sterylnego PBS, delikatnie pipetując. Następnie zmierz absorbancję zawiesiny komórek w spektrofotometrze o długości 600 nanometrów i dostosuj gęstość komórek do 2 milionów komórek na ml za pomocą PBS.

Weź 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej i rozcieńczyć sto razy na płytce rozprowadzającej PBS sto mikrolitrów hodowli na pożywce YPD AGA. Inkubować płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza i policzyć liczbę kolonii, które pojawiły się na płytce YPD po jednym lub dwóch dniach, pomnożyć tę liczbę przez odpowiedni współczynnik rozcieńczenia, aby obliczyć jednostki tworzenia kolonii w godzinie zero. Te wiele jednostek tworzących kolonie Canada Reta zostanie wykorzystane do zakażenia DHE na makrofagi.

W następnym kroku dodaj 50 makrolitrów zawiesiny komórek kanadyjskich do monowarstwy makrofagów na płytce z 24 kulturami wielorybów. Zabrudź płytkę, aby równomiernie rozprowadzić każdą komórkę i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza po dwugodzinnej inkubacji. Odrzucić pożywkę, odwracając płytkę hodowlaną do pojemnika do każdej studzienki na płytce hodowlanej w ml szeregowej PBS, ostrożnie wzdłuż boku studzienek i wyrzucić bufor.

Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Następnie, z wyjątkiem pierwszej studzienki, dodaj jedną pożywkę ML RPI do wszystkich innych studzienek, które można wykorzystać do monitorowania wewnątrzkomórkowej replikacji komórek Candida atory po 4, 6, 12 i 24 godzinach po zakażeniu, aby odzyskać wewnątrzkomórkowe komórki e po dwóch godzinach infekcji makrofagami, dodaj jedną ML wody zbożowej do fosu. Cóż, po dwóch minutach delikatnie zeskrob studzienkę jedną końcówką dudziarza ML, aby usunąć resztki makrofagów ze studni.

Opłucz studzienkę i zbierz ją w makro centrycznej probówce dla ryb. Przygotować stukrotne rozcieńczenie lizatu komórkowego microFIT w PBS i rozlać sto mikrolitrów na pożywce YPD AGA. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni i policz liczbę jednostek tworzących kolonię.

Pomnóż tę liczbę przez odpowiedni współczynnik rozcieńczenia, aby wyliczyć liczbę komórek Canida ator, które są fagocytozą przez T dwa i makrofagi po dwóch godzinach infekcji. Podobnie liczbę wewnątrzkomórkowych komórek kanida można określić w różnych punktach czasowych. Po infekcji i replikacji wewnątrzkomórkowej można przedstawić jako wzrost po 24 godzinach w porównaniu z CFU zinternalizowanymi po dwóch godzinach, pokazanych tutaj.

Inne wyniki typowego eksperymentu, w którym całkowita liczba komórek aligatora Canida zakażonych jednym makrofagiem TV wynosi sześć razy 10, dwa na cztery. Liczba komórek odzyskanych po dwóch godzinach wynosi 3,7, sześć razy 10,4. Ilustruje to, że komórki e są fagocytozowane z szybkością 62,66% podczas 24-godzinnego okresu wspólnej inkubacji.

Czy komórki inne niż 5,2-krotna replikacja wzrasta, gdy liczba wewnątrzkomórkowych komórek e wzrosła z 3,76 razy 10,4 do 1,96 razy 10,5. W tym eksperymencie wewnątrzkomórkową replikację komórek TER psowatych można również ocenić za pomocą komórek E eksprymujących GFP podczas mikroskopu konfokalnego. Przygotować i zainfekować THV i makrofagi w czterokomorowym szkiełku, stosując protokół opisany wcześniej dla 24-dołkowej płytki hodowlanej.

Dwie godziny po zakażeniu. Wyrzucić pożywkę, odwracając szkiełko do pojemnika na odpady o pojemności 500 mikrolitrów PBS do każdej komory szkiełka. Dobrze spłucz i wyrzuć PBS.

Powtórz ten krok jeszcze dwa razy w 500 mikrolitrach 3,7% formalnej wysokości, aby zamocować komórki. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 20 minut i odrzucić formalne de Wysokość. Umyj każdą studnię ceną 500 mikrolitrów PBS, aby zmobilizować makrofagi w 500 mikrolitrach trytona X po pięciu minutach inkubacji, usuń Triton X, umyj uderzenie studni PBS.

Ostrożnie zdemontuj suwak komory za pomocą wyjmowania komory i zamka pneumatycznego. Umieść jedną kroplę nośnika montażowego vector Shield zawierającego DPI na każdym sektorze szkiełka, zamontuj szkiełko nakrywkowe i uszczelnij krawędzie farbą do paznokci, uwidocznionymi komórkami pod mikroskopem konfokalnym. Pokazano tutaj reprezentatywne obrazy konfokalne makrofagów TP one zakażonych GFE wykazujących ekspresję komórek laboratoryjnych Canida typu dzikiego, około sześciokrotny wzrost liczby wewnątrzkomórkowych komórek e od dwóch do 24 godzin wskazuje na replikację laboratoryjną psowatych w TP jeden znacznik znacznika podpisu makrofagów podejście mutagenezy jest szeroko stosowane do identyfikacji czynników ulencji w patogenach mikrobiologicznych, w których duża liczba mutantów jest jednocześnie badana pod kątem wad wzrostu za pomocą unikalnego oligonukleotydu znacznik sekwencji.

Tutaj opisujemy nasz protokół dla ekranu STM w Canada Library i bibliotece mutantów, który składa się z wykonania trzech kroków. Pierwsze 96 plazmidów. Każdy z nich zawiera unikalny stos sekwencji oligonukleotydów jest unieruchomiony na nylonowej membranie.

W drugim etapie pula 96 mutantów CANIDA ator jest badana pod kątem zmienionych profili przeżycia w makrofagach THV one, a następnie odzyskiwanie YPD, hodowanych i zinternalizowanych zmutowanych komórek e makrofagów, które będą określane odpowiednio jako próbki wejściowe i wyjściowe. Wreszcie, znaczniki sygnatury DNA są amplifikowane PCI i znakowane radiowo z wejściowych i wyjściowych próbek genomowego DNA. Produkt PCR jest hybrydyzowany do unikalnych znaczników, a sygnały radioaktywne na membranie są określane ilościowo i analizowane.

Aby zmontować urządzenie 96 12 dot board, umieść mokrą nylonową membranę na wilgotnym papierze z drzewa wiatrowego i dokręć urządzenia. Umyj membranę sterylną wodą, a następnie przemyj 0,4 mu wodorotlenkiem sodu. Przenieś 200 nanogramów roztworu PLA BDNA z bloku 96 12 do odpowiednich dołków aparatu krwi kropkowej Po przepłukaniu 0,4 molowym wodorotlenkiem sodu.

Usuń błonę z aparatu krwi punktowej po ference w dwóch XXSC przecinających przenoszone osocze BDNA do błony w sieciowniku UV. Inkubuj błonę w antenowej hybrydyzacji wstępnej, buforze i wejściu oraz butelkach UNE przez dwie godziny w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Przygotuj sondy poziomu radiowego metodą PCR przy użyciu genomowego DNA wyekstrahowanego z palet komórek wejściowych i wyjściowych oraz starterów w stosunku do inwertowanego regionu flankującego unikalnych znaczników.

Denaturuj sondy na etykiecie radiowej w temperaturze 99 stopni Celsjusza przez pięć minut i rozłóż żel na lodzie. Przenieść sondy de do butelek wejściowych i wyjściowych i inkubować przez 14 do 16 godzin w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Po hybrydyzacji.

Umyj membrany wejściowe i wyjściowe zgodnie z opisem w protokole. Wyjmij membrany z butelek do wysuszenia na powietrzu i wystaw je na ekran obrazów phospho. Po dwóch do trzech godzinach zeskanuj ekran fosforowy i uzyskaj obrazy.

W tym przykładzie pokazano dwa hybrydyzowane filtry membranowe, które reprezentują badanie przesiewowe jednej puli 96 mutantów Canida Gatory pod kątem zmienionego przeżycia. W jednym makrofagach kwantyfikacja i określenie stosunku intensywności sygnału każdego punktu na wyjściu do błony wejściowej ujawniło, że znaczniki o numerach 13, 26, 75 i 85 są niedostatecznie reprezentowane na wyjściu. Te stosy są otoczone na czerwono i odzwierciedlają wzrost czterech różnych mutantów.

W przeciwieństwie do tego, mutanty stos z unikalnymi sekwencjami 11 i 81 podświetlonymi na zielono są nadreprezentowane w próbce wyjściowej. Innymi słowy, z tego ekranu, pula 96 mutantów, dwa mutanty powinny zwiększyć przeżywalność, podczas gdy cztery mutanty wykazują wzrost makrofagów. Zmienione fenotypy przeżycia zidentyfikowane w takim przesiewowym badaniu pulowym powinny zostać zweryfikowane w pojedynczych testach infekcji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wprowadzić system doustny in vitro do badania profilu wzrostu patogenu grzybowego, który Cię interesuje. Ponadto powinieneś być teraz w stanie przeprowadzić badania przesiewowe puli mutantów na dużą skalę za pomocą systemu.