Name: Stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w ludzkich makrofagach THP-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modelu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w makrofagach THP-1. Protokół umożliwia ocenę wirulencji grzyba i odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Innovative Young Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 oraz BT/PR13289/BRB/10/745/2009 grant z Departamentu Biotechnologii Rządu Indii oraz główne fundusze Centrum Odcisków Palców i Diagnostyki DNA, Hyderabad. MNR i GB są laureatami stypendiów Junior i Senior Research Fellowship Rady Badań Naukowych i Przemysłowych w celu uzyskania stopnia doktora na Uniwersytecie Manipal. SB jest laureatem stypendium Junior and Senior Research Fellowship na Wydziale Biotechnologii w celu uzyskania stopnia doktora na Uniwersytecie Manipal.

Zaleca się przeprowadzenie eksperymentów z infekcją C. glabrata w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
<ol>
	<li>Przygotowanie monowarstwy makrofagów THP-1.</li>
	<li>Przygotowanie zawiesiny komórek C. glabrata.</li>
	<li>Zakażenie makrofagów THP-1 komórkami C. glabrata.</li>
	<li>Pomiar szybkości fagocytozy i replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą testu jednostek tworzących kolonie.</li>
	<li>Monitorowanie replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.</li>
</ol>
1. Przygotowanie monowarstwy makrofagów THP-1
<ol>
	<li>THP-1 to ludzka monocytowa linia komórkowa pochodząca z krwi obwodowej rocznego dziecka płci męskiej cierpiącego na ostrą białaczkę monocytową14. THP-1, zawiesinowa linia komórkowa, jest rutynowo utrzymywana w temperaturze 37 °C w nawilżonej pożywce hodowlanej 5% CO2 in RPMI-1640 uzupełnionej 10% FBS (płodowa surowica bydlęca). Leczenie 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA, ester forbolu) powoduje końcowe różnicowanie komórek monocytowych THP-1 w makrofagi. Co ważne, leczenie PMA nie wpływa na żywotność komórek, a komórki zróżnicowane nie dzielą się.</li>
	<li>Wysiewać około 1,5 x 106 monocytów THP-1 w 100 mm szalkach hodowlanych w kompletnej pożywce RPMI-1640 (pożywka RPMI-1640 uzupełniona 10% surowicą, 2 mM glutaminą i 1x antybiotykami; 10 ml / talerz) i pozwolić komórkom rosnąć w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 2 dni.</li>
	<li>Gdy komórki THP-1 osiągną gęstość 8 x 105 komórek/ml, przenieś naczynie hodowlane do okapu z przepływem laminarnym do hodowli komórkowej i delikatnie zawiruj, aby ponownie zawiesić osadzone komórki.</li>
	<li>Odpipetować zawiesinę komórek, umieścić w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i odwirować z prędkością 1 000 obr./min (130 x g) przez 4 minuty. Odrzucić supernatant i zawiesić osad komórek THP-1 w 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki RPMI-1640.</li>
	<li>Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć zawiesinę komórek do końcowej gęstości 106 komórek/ml za pomocą wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki RPMI-1640</li>
	<li>Dodać 1 μl 160 mM bulionu PMA (roztwór 12-mirystynianu 13-octanu forbolu przygotowany w dimetylosulfotlenku) do 10 ml zawiesiny komórek THP-1 (końcowe stężenie 16 nM) i dobrze wymieszać. Dozować 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować płytkę w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 12 godzin.</li>
	<li>Usuń starą pożywkę, dodaj 1 ml podgrzanej kompletnej pożywki RPMI-1640 i pozwól komórkom odzyskać sprawność przez 12 godzin w temperaturze 37°C w 5% CO2 .</li>
	<li>Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby upewnić się, że owalne komórki monocytowe THP-1 w zawiesinie zostały zróżnicowane w spłaszczone, wrzecionowate i przylegające makrofagi. Te zróżnicowane komórki są teraz gotowe do prowadzenia badań nad infekcją C. glabrata.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny komórek C. glabrata
C. dziki szczep Bg2 zostanie użyty do infekowania makrofagów THP-1. Komórki C. glabrata są rutynowo hodowane w płynnym pożywce YPD (ekstrakt drożdżowy (1%)-pepton (2%)-dekstroza (2%)). Stałe podłoże YPD przygotowuje się przez dodanie 2% agaru przed autoklawowaniem podłoża.
<ol>
	<li>Aby przygotować kulturę C. glabrata, należy pobrać pojedynczą kolonię z płytki agarowej za pomocą sterylnej, jednorazowej pętli i zaszczepić w 10 ml płynnej pożywki YPD i inkubować przez 14-16 godzin z wytrząsaniem (200 obr./min) w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Odwirować tę kulturę (1 ml) przy 4 000 obr./min (1 800 x g) przez 5 minut w mikrowirówce stołowej, przemyć komórki trzykrotnie sterylnym PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4) i zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS.</li>
	<li>Zmierzyć OD600 zawiesiny komórek C. glabrata i rozcieńczyć odpowiednią objętością sterylnego PBS, aby uzyskać gęstość 2 x 106 komórek/ml (OD600 = 0,1). Alternatywnie, pożądaną gęstość komórek można uzyskać, licząc komórki drożdży za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
3. Zakażenie makrofagów THP-1 komórkami C. glabrata
<ol>
	<li>Dodać 50 μl zawiesiny komórek C. glabrata do makrofagów THP-1 (10 6 komórek wysianych na dołek 24-dołkowej płytki hodowlanej) w celu uzyskania MOI (wielokrotność infekcji) 0,1 i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Aby określić liczbę żywotnych drożdży, rozcieńczyć 50 μl zawiesiny komórek C. glabrata 100-krotnie w sterylnym PBS i rozlać 100 μl na pożywce stałej YPD. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C i ręcznie policzyć liczbę kolonii drożdży, które pojawiły się po 1-2 dniach. Liczby te będą odtąd określane jako 0 hr C. glabrata CFU (jednostki tworzące kolonie).</li>
	<li>Po 2 godzinach kokulturacji komórek THP-1 z komórkami C. glabrata, odrzuć pożywkę hodowlaną, odwracając 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w zbiorniku i delikatnie przemyj trzykrotnie wstępnie podgrzanym sterylnym PBS w celu usunięcia niefagocytozowanych zewnątrzkomórkowych komórek C. glabrata. Delikatne płukanie PBS jest absolutnie niezbędne, aby osiągnąć całkowite usunięcie wszystkich drożdży zewnątrzkomórkowych bez powodowania uszkodzeń monowarstwy makrofagów THP-1.</li>
</ol>
4. Pomiar szybkości fagocytozy i replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą testu jednostki tworzącej kolonię

<ol>
	<li>Liza C. glabrata zakażone makrofagi THP-1 w 1 ml sterylnegoH2Oprzez 2 minuty, delikatnie zeskrobać, aby usunąć resztki makrofagów ze studzienki i zebrać lizat komórkowy w probówce do mikrowirówki. Weryfikacja mikroskopowa całkowitej lizy makrofagów ma kluczowe znaczenie dla odzyskania wszystkich zinternalizowanych drożdży.</li>
	<li>Przygotować 100-krotne rozcieńczenie lizatu w sterylnym PBS, rozlać 100 μl na pożywce stałej YPD i inkubować na płytkach w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Po 1-2 dniach należy ręcznie policzyć liczbę kolonii C. glabrata, które pojawiły się na pożywce YPD, pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia (2 hr CFU) i obliczyć szybkość fagocytozy, która odnosi się do procentu komórek C. glabrata, które są spożywane przez makrofagi THP-1 po 2-godzinnej kokubacji, korzystając z następującego wzoru. 
	% fagocytozy = [(jtk po 2 godzinach)/(jtk po 0 godzinach)] X 100</li>
	<li>Aby zmierzyć szybkość wewnątrzkomórkowej replikacji komórek C. glabrata w makrofagach THP-1, zbierz drożdże wewnątrzkomórkowe w różnych punktach czasowych po zakażeniu, tj. 4, 6, 8, 10, 12 i 24 godzin, powtarzając kroki 3.3-4.3.</li>
	<li>Oblicz przeżycie / replikację krotności komórek C. glabrata w makrofagach THP-1, dzieląc całkowite CFU w dowolnym punkcie czasowym przez te po 2 godzinach (drożdże fagocytozowane).</li>
</ol>
5. Monitorowanie replikacji wewnątrzkomórkowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 1, nasiennych PMA umieścić 5 x 105 komórek THP-1 w każdym dołku z dwóch szkiełek czterodołkowych i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 12 godzin.</li>
	<li>Zastąp starą pożywkę wstępnie podgrzaną kompletną pożywką RPMI-1640 i pozwól komórkom zregenerować się po leczeniu PMA przez 12 godzin.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek C. glabrata znakowaną GFP (zielone białko fluorescencyjne) zgodnie z opisem w sekcji 2 i zainfekować makrofagi THP-1 do MOI 1. Jeśli szczepy C. glabrata wykazujące ekspresję GFP nie są dostępne, komórki drożdży znakowane FITC (izotiocyjanianem fluoresceiny) można wykorzystać do monitorowania wczesnych zdarzeń po zakażeniu, tj. szybkości fagocytozy i dojrzewania fagolizosomalnego po 2 godzinach.</li>
	<li>Inkubować szkiełka przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , ostrożnie je odwrócić, aby wyrzucić pożywkę i przemyć 3x sterylnym, wstępnie podgrzanym PBS.</li>
	<li>Dodać 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki RPMI-1640 do każdej komory jednego szkiełka i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 22 godziny.</li>
	<li>Aby utrwalić 2-godzinne makrofagi THP-1 zakażone C. glabrata, dodaj 500 μl 3,7% formaldehydu (przygotowanego w PBS) do każdej komory drugiego szkiełka i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.</li>
	<li>Przemyć szkiełko trzykrotnie PBS, dodać 500 μl Triton-X (0,7%) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności.</li>
	<li>Umyj szkiełko 3x PBS, wyjmij komorę z szkiełka hodowlanego i susz na powietrzu przez 3-5 min w ciemności.</li>
	<li>Ostrożnie zamontuj szkiełko nakrywkowe za pomocą podłoża montażowego Vectashield zawierającego DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) na szkiełku, unikając tworzenia się pęcherzyków. Delikatnie usuń nadmiar płynu za pomocą Kimwipe i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Przechowywać szkiełko w ciemności w temperaturze 4°C do czasu użycia.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.4 i 5.6-5.9, aby przetworzyć komórki THP-1 24 godziny po zakażeniu.</li>
	<li>Obrazowanie komórek za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (obiektyw 60-krotny zanurzony w oleju, wzbudzenie przy 405 nm i 488 nm odpowiednio dla barwienia DAPI i GFP).</li>
</ol>

<ol><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Candidiasis%3A+a+Persistent+Public+Health+Problem%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem.</a> Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).</li>
<li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+from+the+ARTEMIS+DISK+global+antifungal+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).</li>
<li>Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+opportunistic+fungal+infections+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Overview of opportunistic fungal infections in India.</a> Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).</li>
<li>Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+by+any+other+name%3A+Candida+glabrata+and+its+interaction+with+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).</li>
<li>Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata%2C+Candida+parapsilosis+and+Candida+tropicalis%3A+biology%2C+epidemiology%2C+pathogenicity+and+antifungal+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).</li>
<li>Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+glycosylphosphatidylinositol-linked+aspartyl+proteases+is+required+for+virulence+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).</li>
<li>Seider, K., Brunke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).</li>
<li>Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+Candida+glabrata-macrophage+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction.</a> PLoS Pathog. 8 (8), e1002863(2012).</li>
<li>Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+supports+Candida+glabrata+survival+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis.</a> Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).</li>
<li>Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+THP-1+Cells%3A+an+attractive+model+for+the+assessment+of+intracellular+growth+rates+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li>
<li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line%2C+THP-1%2C+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).</li>
<li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li>
<li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+leukemia+cell+line%2C+THP-1%3A+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li>
<li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li>
<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wrodzony układ odpornościowy odgrywa ważną rolę w zwalczaniu oportunistycznych infekcji grzybiczych. Makrofagi przyczyniają się do obrony przeciwgrzybiczej poprzez spożycie i zniszczenie patogenu grzybowego. W związku z tym wyjaśnienie czynników, które są niezbędne do przetrwania i/lub przeciwdziałania przeciwdrobnoustrojowym funkcjom makrofagów, pogłębi naszą wiedzę na temat strategii wirulencji grzybów. W tym kontekście ustaliliśmy system modelowy hodowli komórkowych in vitro przy użyciu makrofagów pochodzącyc...

Gatunki Candida są główną przyczyną zagrażających życiu inwazyjnych infekcji grzybiczych u pacjentów z obniżoną odpornością1. Candida glabrata, pojawiający się patogen szpitalny, jest drugim lub trzecim najczęściej izolowanym gatunkiem Candida od pacjentów Oddziału Intensywnej Terapii, w zależności od położenia geograficznego1-3. Filogetycznie C. glabrata, haploidalne drożdże pączkujące, są bliżej spokrewnione z niepatogennymi drożdżami modelowymi Saccharomyces cerevisiae niż z chorobotwórczymi Candida spp., w tym C. albicans4. W związku z tym, C. glabrata nie ma niektórych kluczowych cech wirulencji grzybów, w tym krycia, wydzielanej aktywności proteolitycznej i plastyczności morfologicznej4-5.
Chociaż C. glabrata nie tworzy strzępek, może przetrwać i replikować się u mysich i ludzkich makrofagów6-8, co sugeruje, że rozwinął unikalne mechanizmy patogenezy. Dostępne są ograniczone informacje na temat strategii stosowanych przez C. glabrata w celu przetrwania w ubogim w składniki odżywcze wewnątrzkomórkowym środowisku makrofagów i przeciwdziałania oksydacyjnym i nieoksydacyjnym reakcjom gospodarza wywoływanym przez komórki odpornościowe gospodarza5. Odpowiedni system modelowy makrofagów jest warunkiem wstępnym do nakreślenia interakcji C. glabrata z komórkami fagocytarnymi gospodarza za pomocą funkcjonalnych podejść genomicznych i proteomicznych. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) i makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) pochodzenia ludzkiego i mysiego zostały wcześniej wykorzystane do badania interakcji C. glabrata z komórkami odpornościowymi gospodarza7,9. Jednak trudności w uzyskaniu PBMC i BMDM, ich ograniczona długość życia i wewnętrzna zmienność wśród różnych dawców ssaków ograniczają wykorzystanie tych komórek jako wszechstronnych systemów modelowych.
Tutaj opisujemy metodę tworzenia systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania komórek C. glabrata w makrofagach pochodzących z ludzkiej linii komórek monocytowych THP-1. Ogólnym celem tego protokołu było wprowadzenie prostego, niedrogiego, szybkiego i powtarzalnego systemu modeli hodowli komórkowych, którym można łatwo manipulować w celu zbadania różnych aspektów interakcji między gospodarzem a patogenem grzybowym.
Komórki THP-1 były wcześniej używane do rozszyfrowywania odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko szerokiej gamie patogenów, w tym bakteriom, wirusom i grzybom10-12. Komórki monocytowe THP-1 są łatwe w utrzymaniu i mogą być różnicowane, po leczeniu estrem forbolu, do makrofagów, które naśladują makrofagi pochodzące z monocytów człowieka i wyrażają odpowiednie markery makrofagów13. Głównymi zaletami systemu modelowania makrofagów THP-1 są łatwość obsługi i brak wyrafinowanych wymagań sprzętowych.
Przedstawiony tutaj protokół można łatwo dostosować do badania interakcji innych patogenów grzybów ludzkich z komórkami odpornościowymi gospodarza. Obecna procedura może być również wykorzystana do identyfikacji czynników wirulencji dla patogenu będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu wysokoprzepustowych badań przesiewowych mutantów. Dowodem słuszności koncepcji jest udane wykorzystanie systemu modeli hodowli THP-1 do identyfikacji zestawu 56 genów, które są niezbędne do przetrwania C. glabrata w ludzkich makrofagach8.

<table><tbody><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB 202</td><td>Ludzka linia komórkowa ostrej białaczki monocytowej</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclon</td><td>SH30096.01</td><td>Do utrzymania komórek THP-1</td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octan</td><td>Phorbol Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>Uwaga: Niebezpieczny</td></tr><tr><td>YPD&nbsp;</td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>Do hodowli komórek Candida glabrata</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Do wiązania makrofagów THP-1 zakażonych C. glabrata</td></tr><tr>Bufor<td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td></td><td></td><td>Bufor (137 mM NaCl, 10 mM fosforan, 2,7 mM KCl,&nbsp; pH 7,4) do mycia</td></tr><tr><td>Cytrynian soli fizjologicznej (SSC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Bufor (3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu o 20-krotnym stężeniu) do płukania</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> prehybrydyzacyjny <td>Bufor (50% formamidu, 5x Denhardt' s solution, 5x SSC, 1% SDS) do hybrydyzacji</td></tr><tr><td>Pożywka montażowa VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>Do montażu szkiełek do mikroskopii konfokalnej</td></tr><tr><td>32znakowane P &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>Do znakowania radioizotopowego znaczników sygnatur</td></tr><tr><td>Szalki do hodowli tkankowych 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Do hodowli komórek THP-1</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>Aby przeprowadzić badania infekcji C. glabrata w makrofagach THP-1</td></tr><tr><td>4-komorowe szkiełko szklane poddane hodowli tkankowej</td><td>BD Falcon</td><td>REF354104</td><td>Do obrazowania makrofagów THP-1 zakażonych C. glabrata</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Rohem Indie</td><td></td><td>Do oznaczania liczby komórek</td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>Do wirowania komórek w mikroprobówkach</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>Do obracania komórek w probówkach 15 ml</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>Do monitorowania absorbancji komórek drożdży</td></tr><tr><td>Inkubator płytkowy</td><td>Labtech</td><td>Chłodniczy</td><td>Do uprawy komórek C. glabrata komórek</td></tr><tr><td>Inkubator Shaker</td><td>Nowy Brunszwik</td><td>Innova 43</td><td>Do uprawy komórek C. glabrata</td></tr><tr><td>Inkubator CO2&nbsp z płaszczem wodnym</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>Forma seria 2</td><td>Do hodowli komórek THP-1</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>Do obserwacji makrofagów THP-1 zakażonych C. glabrata</td></tr><tr><td>Mikroskop złożony</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>Aby obserwować C. glabrata i makrofagi THP-1</td></tr><tr><td>Maszyna do PCR</td><td></td><td>BioRad DNA Engine</td><td>Do amplifikacji unikalnych znaczników z wejściowego i wyjściowego genomowego DNA</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>Do hybrydyzacji&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>Do skanowania membran hybrydowych</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>Do denaturacji znakowanych radioaktywnie znaczników podpisu</td></tr><tr><td>Jednostka dokumentacji żelu</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>Do wizualizacji DNA barwionego bromkiem etydyny w żelach agarozowych</td></tr></tbody></table>

stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania candida glabrata w ludzkich makrofagach thp-1

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

System modelowania hodowli komórek, jeśli ściśle naśladuje warunki środowiskowe gospodarza, może służyć jako niedroga, powtarzalna i łatwa do manipulowania alternatywa dla systemów modeli zwierzęcych do badania konkretnego etapu infekcji patogenami mikrobiologicznymi. Ludzka monocytowa linia komórkowa THP-1, która po leczeniu estrem forbolu różnicuje się w makrofagi, była wcześniej wykorzystywana do badania strategii wirulencji wielu patogenów wewnątrzkomórkowych, w tym Mycobacterium tuberculosis. W tym miejscu omawiamy protokół mający na celu wprowadzenie systemu modelowego hodowli komórkowych in vitro przy użyciu makrofagów THP-1 w celu nakreślenia interakcji oportunistycznego ludzkiego patogenu drożdży Candida glabrata z komórkami fagocytarnymi gospodarza. Ten model systemu jest prosty, szybki, podatny na wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutantów i nie wymaga skomplikowanego sprzętu. Typowy eksperyment z infekcją makrofagami THP-1 trwa około 24 godzin z dodatkowymi 24-48 godzinami, aby umożliwić odzyskanym drożdżom wewnątrzkomórkowym wzrost na bogatej pożywce w celu analizy żywotności opartej na jednostkach tworzących kolonie. Podobnie jak w przypadku innych systemów modelowych in vitro, możliwym ograniczeniem tego podejścia jest trudność w ekstrapolacji uzyskanych wyników na wysoce złożony obwód komórek odpornościowych istniejący w ludzkim gospodarzu. Jednak pomimo tego obecny protokół jest bardzo przydatny do wyjaśnienia strategii, które patogen grzybowy może zastosować, aby uniknąć/przeciwdziałać odpowiedzi przeciwdrobnoustrojowej oraz przetrwać, przystosować się i namnażać w ubogim w składniki odżywcze środowisku komórek odpornościowych gospodarza.

Analizy infekcji makrofagów THP-1 traktowanych PMA komórkami C. glabrata typu dzikiego (wt) wykazały, że komórki wt były fagocytowane przez makrofagi w stopniu 55-65% po 2 h wspólnej inkubacji. Ponadto komórki C. glabrata były w stanie oprzeć się zabiciu przez makrofagi THP-1 i wykazywały umiarkowany, 5- do 7-krotny wzrost CFU po 24 h kokultury z makrofagami THP-18. Wewnątrzkomórkowa replikacja komórek typu dzikiego, przetransformowanych plazmidem wykazującym ekspresję GFP, ...

Obecny artykuł przedstawia protokół do ustanowienia systemu modelowego hodowli komórkowych in vitro do badania interakcji fakultatywnego wewnątrzkomórkowego patogenu grzyba ludzkiego Candida glabrata z ludzkimi makrofagami, co będzie użytecznym narzędziem do poszerzenia naszej wiedzy o mechanizmach wirulencji grzybów.

Stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w ludzkich makrofagach THP-1

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie modelu hodowli in vitro w celu zbadania wewnątrzkomórkowego zachowania oportunistycznego grzyba chorobotwórczego człowieka. Candida lab ratta w makrofagach pochodzących z ludzkiej linii komórkowej monocytów THP-1. Aby to osiągnąć, monocyty THP-1 poddaje się najpierw działaniu PMA w celu ich zróżnicowania w makrofagi.Następnie makrofagi THP-1 są zakażane komórkami Candida GTA. Dwie godziny po infekcji nieyfagocytowane komórki Candida GTA są usuwane poprzez płukanie w PBS, a wewnątrzkomórkowe komórki e są odzyskiwane do dalszych badań poprzez osmozę zakażonych makrofagów. Niniejszy protokół może być wykorzystany do oceny zarówno ilości wirusów w komórkach Candida GTA w makrofagach, jak i procesu dojrzewania fazy oraz odpowiedzi cytokinowej w makrofagach THP-1 po infekcji Candida GTA.Ponadto protokół ten można rozszerzyć w celu przesiewowej analizy biblioteki mutantów Candida Collaborator pod kątem zmian w profilach przeżywalności w makrofagach THP-1 w sposób półwysokoprzepustowy. Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest on stosunkowo tani, wysoce powtarzalny i łatwo adaptowalny do różnych komórek odpornościowych, jak i patogenów

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ustanowienie in vitro systemu do badania zachowania Candida glabrata wewnątrz komórek makrofagów THP-1 człowieka

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

W tym filmie przeprowadzamy test fagocytozy mikrogleju na nerwiaka zarodkowego przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Test pomaga ocenić upośledzenie funkcji mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych.

Test fagocytozy mikrogleju: test in vitro w celu ustalenia modelu fagocytozy mikrogleju dla komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu makrofagów iPSC

W tym filmie demonstrujemy test efferocytozy do badania klirensu komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Efferocytoza to wieloetapowy proces, w którym komórki apoptotyczne są pochłaniane przez fagocyty i degradowane w pęcherzykach zwanych efferosomami. Protokół ten zapewnia metodę wizualizacji zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych oraz ilościowego określenia efferocytozy.

Test esterocytozy utrwalonych: metoda badania wychwytu efferocytarnego komórek apoptotycznych przez makrofagi przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń zachodzących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza.

Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

Technika polegająca na fagocytozie konidiów grzybowych przez makrofagi jest szeroko stosowana do badań oceniających modulację odpowiedzi immunologicznej przeciwko grzybom. Celem pracy jest przedstawienie metody oceny zdolności fagocytozy i klirensu makrofagów pochodzących z ludzkiej krwi obwodowej pochodzących z monojądrowych stymulowanych Trichoderma stromaticum conidia.

Test żywotności Trichoderma stromaticum Conidia w ludzkich makrofagach pochodzenia jednojądrowego krwi obwodowej

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Poznaj metodę tworzenia modelu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w makrofagach THP-1. Protokół umożliwia ocenę wirulencji grzyba i odpowiedzi immunologicznej.

Stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w ludzkich makrofagach THP-1

Przeglądaj więcej filmów