Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób optyczna tomografia projecyjna może być wykorzystana do wizualizacji i trójwymiarowej oceny ilościowej zmian miażdżycowych i neointimalnych u myszy. Osiąga się to poprzez najpierw generowanie zmian tętniczych u myszy, chirurgicznie lub poprzez karmienie dietą o wysokiej zawartości cholesterolu myszom z predyspozycjami do rozwoju miażdżycy. Kolejnym krokiem jest wyizolowanie tętnicy docelowej i zeskanowanie jej za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej.

Ostatnim krokiem jest wykonanie rekonstrukcji obrazu, identyfikacja zmiany i pomiar objętości zmiany. Ostatecznie wyniki mogą wykazać anatomiczne rekonstrukcje zmiany oraz ilościowe określenie objętości zmiany i zwężenia tętnic poprzez analizę obrazu. Nasza grupa jest zainteresowana zrozumieniem mechanizmów leżących u podstaw powstawania zmian powodujących zwężenie tętnic prowadzących do zagrażających życiu powikłań, takich jak zawał serca i udar mózgu.

To zastosowanie optycznej tomografii projekcyjnej zostało opracowane w naszej grupie przez dr Nicholasa Kirkby'ego, współpracującego z dr Lucy Lowe, i zostanie zademonstrowane przez dr Jung Shi Wu, który jest naukowcem z tytułem doktora pracującym w naszych laboratoriach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak histologia i immunohistochemia, jest to, że jest mniej pracochłonna i umożliwia analizę trójwymiarową, a nie dwuwymiarową. Ta technika wywoływania zmian w tętnicy udowej jest zmodyfikowana w stosunku do technik R i spółki oraz Sada i spółki.

Protokół tekstowy wyjaśnia, w jaki sposób wywołać zmiany miażdżycowe poprzez manipulację dietetyczną. Zacznij od 10 do 12 tygodniowej czarnej myszy C 57 o wadze od 25 do 30 gramów. Po znieczuleniu umieść mysz na ciepłej podkładce, aby utrzymać temperaturę ciała i dostarczyć fluor na poziomie od dwóch do 3% przez stożek nosowy.

Gdy mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca u nogi, należy podać buprenorfinę w dawce 0,1 miligrama na kilogram. Następnie połóż mysz na plecach i ogol brzuszną powierzchnię lewej tylnej kończyny. Następnie wykonaj nacięcie, aby odsłonić mięśnie górnej kończyny tylnej między rozwidleniem tętnicy podkolanowej a ścianą brzucha.

Wykonaj rozwarstwienie, aby odizolować nerw udowy od tętnicy i żyły udowej przez cały czas trwania zabiegu. Utrzymuj tkanki wilgotne z 1% wagą objętości li psa. Następnie umieść tymczasowe ligatury jedwabne 6,0 Mers wokół tętnicy i żyły udowej w pobliżu ściany brzucha i bezpośrednio poniżej gałęzi z tętnicą podkolanową.

Mają one na celu kontrolowanie przepływu krwi. Następnie odizoluj tętnicę podkolanową, od dwóch do pięciu milimetrów dystalnie od gałęzi z tętnicą udową i podwiąż tętnicę podkolanową pod tętnicą podkolanową. Umieść drugą ligaturę.

Teraz wykonaj małe nacięcie w celu wprowadzenia drutu do tętnicy podkolanowej bezpośrednio dystalnie do gałęzi z tętnicą udową. Uciskaj proksymalną ligaturę tymczasową, aby zapobiec krwawieniu przez nacięcie i do tętnicy udowej w kierunku ściany brzucha. Włóż drut G o średnicy 0.014 cala na około 1.5 centymetra.

Pozostaw go na miejscu na 30 sekund, a następnie wyjmij. Następnie za pomocą ligatur podwiązuje się tętnicę podkolanową powyżej nacięcia. Uważaj, aby nie zatkać tętnicy udowej.

Teraz usuń tymczasowe ligatury. Zamknij ranę nieciągłymi szwami biegnącymi za pomocą 5,0 mercal. Następnie nałóż krem EMLA.

Pozwól zwierzęciu odzyskać przytomność i poruszać się w klatce ratunkowej przed powrotem do klatki domowej. Oczekuje się, że noga będzie wykazywać kulawiznę przez dwa lub trzy dni, ale nie oznacza to, że mysz musi być izolowana. W przypadku OPT mysz musi zostać poddana eutanazji, wywołać znieczulenie końcowe z pentobarbitalu.

Następnie wykonaj fiksację perfuzji trans serca z wykrwawieniem. Teraz odizoluj tętnice udowe lub łuk aorty i jej gałęzie. W trakcie tego procesu usuń wszelkie obce materiały okołopochodne.

Następnie umieść tkankę w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez noc. Następnego dnia albo przechowuj tkankę w 70% etanolu, albo kontynuuj osadzanie tętnic w przefiltrowanych 1,5% aeros LMP. Delikatnie opuść tkankę do stopionych aeros w temperaturze około 40 stopni Celsjusza.

Przytnij aeros, aby uzyskać stożkowy kształt. Teraz odwodnij ten preparat w 100% metanolu przez co najmniej 12 godzin. Po odwodnieniu oczyść naczynia w mieszaninie jednego lub dwóch alkoholi benzo-benzoesowych i benzoesanu.

Pozwól naczyniom inkubować w tym roztworze przez 12 do 24 godzin. Następnego dnia należy załadować oczyszczoną próbkę do tomografu, który powinien być wstępnie skalibrowany. Rozdzielczość jest ustawiona na 1024.

O 1024 piksele. Ustaw powiększenie dla obszaru zainteresowania. Oś Z zostanie automatycznie ustawiona na tę samą rozdzielczość.

Rozmiar woksela będzie wynosił około 200 mikronów. Następnie, korzystając z kanału Brightfield, ustaw próbkę tak, aby obracała się wokół własnej osi w środku pola widzenia. Korzystając z kanału emisji jednego filtra GFP, ustaw ostrość i dostosuj ekspozycję, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny obrazu.

Unikaj przesycenia. Teraz przeskanuj naczynie w jednym kanale emisyjnym GFP tylko z krokami co 0,9 stopnia. Próbki należy następnie przywrócić do 100% metanolu na co najmniej 24 godziny przed zatopieniem w wosku.

W celu analizy histologicznej otwórz uzyskane obrazy w oprogramowaniu zwiadowczym lub podobnym oprogramowaniu za pomocą oprogramowania do przeglądania danych. Sprawdź jakość rekonstrukcji obrazu, popraw jakość obrazu, dostosuj intensywność obrazu i pozwól oprogramowaniu skompensować wszelkie niewspółosiowości próbki od jej idealnej osi obrotu. Dla każdego skanu zdefiniuj pionowy obszar zainteresowania zawierający zmianę.

W każdej 50. linii skanowania należy prześledzić granicę między mediami a położeniem wewnętrznej blaszki elastycznej. Oprogramowanie może następnie interpolować obramowanie we wszystkich innych skanach, ręcznie sprawdzać te interpolacje i korygować je w razie potrzeby. Teraz utwórz binarny zestaw obrazów z białymi pikselami reprezentującymi neointimę i czarnymi pikselami reprezentującymi światło patentowe.

Osiąga się to poprzez zdefiniowanie progów intensywności. Gdy to zostanie osiągnięte, objętość obiektu jest całkowitą objętością zmiany, a objętość światła to całkowita objętość pomniejszona o objętość obiektu. W ten sposób ocenia się rozkład zmiany i światła na długości osiowej.

Mysie tętnice udowe pobrano 28 dni po urazie wywołanym drutem lub podwiązaniem. Pogrubienie neointimy było widoczne w projekcjach emisyjnych w zrekonstruowanych dwuwymiarowych slajdach. Można wyróżnić koncentryczne zmiany neoinsighty.

Obrazy emisyjne całego łuku aorty wykonane za pomocą tomografii projekcyjnej od myszy z niedoborem APOE zidentyfikowały oczekiwane zmiany w mniejszej krzywiźnie łuku aorty, tętnicy ramienno-głowowej oraz w początkach lewej tętnicy szyjnej i podobojczykowej. Ta sama zmiana została podzielona na segmenty i wyrenderowana na czerwono. Aby podkreślić rozkład blaszek po nałożeniu na oryginalny obraz, można było rozróżnić podłoże i światło na obrazach przekrojowych, co pokazuje, że były to zmiany ekscentryczne.

Tutaj, gdy skan przesuwa się dystalnie wzdłuż tych gałęzi, zmiany stopniowo zmniejszają się i znikają najpierw w tętnicy podobojczykowej, następnie w tętnicy szyjnej, a na końcu w tętnicy ramienno-głowowej. Co ciekawe, ta zmiana w tętnicy ramienno-głowowej przechodzi do rozdzielacza przepływu, gdy naczynie to dzieli się na prawą tętnicę szyjną i prawą tętnicę podobojczykową. Po procedurze OPT można wykonać inne metody, takie jak histologia i immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak jaki jest skład zmiany?

Tak więc po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom pracującym w dziedzinie badań naczyniowych do zbadania roli receptorów śródbłonka, lektyn i enzymów metabolizujących steroidy w rozwoju zmian neointimalnych i miażdżycowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać i przeanalizować zmiany chorobowe w tętnicach za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej.