Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar całkowitej zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie próbki zawierającej znaną ilość liofilizowanej biomasy glonów. Drugim krokiem jest rozbicie biomasy mikroglonów.

Następnie składniki lipofilowe są ekstrahowane i izolowane. Ostatnim etapem jest transestryfikacja lipidów ACell do estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Ostatecznie chromatografia gazowa służy do ilościowego oznaczania kwasów tłuszczowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak oznaczenia tric, jest to, że metoda ta jest bardzo dokładna i dokładnie mierzy wszystkie kwasy tłuszczowe i wszystkie inne składniki lipofilowe. Procedurę zademonstruje NDI Afer, technik z naszego laboratorium Przed rozpoczęciem tej procedury należy określić stężenie suchej masy glonów w gramach na litr w bulionie hodowlanym, jak wyszczególniono w podanym odniesieniu. Przenieś objętość bulionu hodowlanego, który zawiera od pięciu do 10 miligramów szklanej probówki wirówkowej z glonów o suchej masie.

Obliczyć dokładną ilość przenoszonej biomasy przy użyciu ustalonego wcześniej stężenia biomasy, odwirować próbkę przez pięć minut przy 1200 Gs. Wyrzucić część supernatantu, pozostawiając około 0,25 mililitra w probówce. Następny resus. Zawiesić glony w pozostałym supernatancie, delikatnie pipetując granulki w górę i w dół, a następnie przenieść mieszaninę komórek do rurki do ubijania.

Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów przepłucz probówkę wirówkową i końcówkę pipety plus minus 0,15 mililitra mili kostki wody i przenieś płyn do probówki z ubijakiem do kulek. Odwiruj rurkę z ubijakiem do kulek przez jedną minutę przy maksymalnych obrotach, aby upewnić się, że na dnie probówki nie pozostały pęcherzyki powietrza. Po zakończeniu liofilizuj materiał w probówce, a następnie poddaj go liofilizacji.

Przygotować 50 miligramów na litr roztworu tripu Penta Deano we wzbogaconym stosunku objętościowym chloroformu do metanolu. Za pomocą pipety wyporowej dodaj jeden mililitr statywu, bez roztworu do rurki do perlenia. Sprawdź, czy w nasadce rurki ubijaka do koralików nie pozostały żadne koraliki, ponieważ spowoduje to wyciek koralików z rurek.

Ubijaj rurkę ubijaka osiem razy z prędkością 2 500 obr./min przez 60 sekund za każdym razem w 122. przerwie między każdym koralikiem. Następnie przenieś roztwór w kulkach z rurki do ubijania kulek do czystej, żaroodpornej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów z zakrętką z wkładką teflonową. Umyj rurkę do ubijania koralików jednym mililitrem statywu, bez roztworu i przenieś płyn do szklanej probówki wirówkowej.

Powtórz jeszcze dwa razy. Wirować próbkę przez pięć sekund, a następnie poddawać ją sonifikacji przez 10 minut. Po sonikacji w 2,5 mililitra roztworu wodnego o pH siedmiu milimetrów sześciennych zawierającego 50 milimolowych trisów i jeden molowy chlorek sodu do probówki wirówkowej.

Po zawirowaniu próbki i poddaniu jej sonikacji po raz drugi, odwirować ją przez pięć minut w temperaturze 1200. Po zakończeniu, ostrożnie przenieś dolną fazę chloroformu do czystej szklanej probówki za pomocą szklanej pipety do pasti, powtórz ekstrakcję z jednym mililitrem chloroformu. Po zakończeniu zebrać fazę chloroformu za pomocą szklanej tylnej pipety i zebrać pierwszą frakcję chloroformu.

Odparować chloroform za pomocą strumienia azotu gazowego, aby uzyskać wysuszone wyekstrahowane lipidy. Następnie dodaj trzy mililitry metanolu zawierającego 5% kwasu siarkowego do probówki zawierającej wysuszone wyekstrahowane lipidy i szczelnie ją zamknij. Wirować próbkę przez pięć sekund.

Inkubować próbki przez trzy godziny w temperaturze 70 stopni Celsjusza w bryle grzewczej. Okresowo upewnij się, że próbki nie wrzą, i obracaj probówkę po każdym sprawdzeniu próbek. Po schłodzeniu próbki do temperatury pokojowej w trzech mililitrach mili sześciennej wody i trzech mililitrach n heanu do probówki po mieszaniu wirowym.

Mieszać próbkę przez 15 minut za pomocą rotatora probówki. Po wyjęciu próbek z rotatora probówki, odwiruj je przez pięć minut w temperaturze 1200 Gs. Używając szklanej pipety, zbierz dwa mililitry górnej fazy heksanowej i przenieś ją do świeżej szklanej probówki. Aby umyć zebraną fazę heksanu, dodaj dwa mililitry wody mili Q do szklanej probówki.

Następnie wirować próbkę przez pięć sekund i odwirowywać ją przez pięć minut. Przy stężeniu 1200 g przenieść fazę heksanową ze szklanej probówki do fiolki do chromatografii ogólnej za pomocą szklanej pipety o konsystencji pastiera. Następnie nałożyć nakrętkę na fiolkę GC i dokręcić ją, aby zapobiec parowaniu rozpuszczalnika.

Umieścić fiolkę z próbką w automatycznym próbniku przyrządu GC fit. Na koniec uruchom próbkę na instrumencie z nową kolumną wywoławczą, używając całkowitego natężenia przepływu 20 mililitrów na minutę i objętości wstrzyknięcia wynoszącej jeden mikrolitr. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby zapoznać się ze specyfikacją kolumn i warunkami chromatograficznymi?

Typowy chromatogram, który jest uzyskiwany w tym procesie, jest pokazany tutaj. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są rozdzielane według wielkości i stopnia nasycenia przez kolumnę GC, a protokół zastosowany w krótszym łańcuchu kwasy tłuszczowe i bardziej nasycone kwasy tłuszczowe mają krótsze czasy retencji. Zastosowana kolumna GC i protokół nie mają na celu oddzielenia izomerów kwasów tłuszczowych, ale można to osiągnąć przy użyciu innej kolumny GC i protokołu.

Zawartość i skład kwasów tłuszczowych C Desus UEX 3 93 zarówno w warunkach wystarczającej ilości azotu, jak i w warunkach jego niedoboru. Całkowita zawartość kwasów tłuszczowych wynosiła 8,6 plus minus 0,5% i 44,7 plus minus 1,7% odpowiednio w warunkach uprawy bogatej w azot i pozbawionej azotu. Wartości te pokazują, że głód azotu ma duży wpływ na skład i zawartość kwasów tłuszczowych.

W ESBL kwas palmitynowy i kwas oleinowy to dwa najobficiej występujące kwasy tłuszczowe. Szczegółowe informacje na temat obliczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych można znaleźć w protokole tekstowym? Zawartość i skład kwasów tłuszczowych w Odum Trico UEX 6 4 0 zarówno w warunkach wystarczającej ilości azotu, jak i pozbawionych azotu, przedstawiono tutaj.

Podobnie jak w przypadku ukośnych UU, na zawartość i skład kwasów tłuszczowych duży wpływ ma głód azotu. W warunkach wystarczającej i pozbawionej azotu całkowita zawartość kwasów tłuszczowych wynosiła odpowiednio 11,7 plus minus 0,9% i 30,5 plus minus 1,1%. P trium wytwarza również znaczne ilości wysoko nienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak I csap, kwas Penta IC.

Ponadto za pomocą tej metody można również wykryć bardzo długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, takie jak kwas lignerowy. Procedura ta może zostać rozszerzona poprzez włączenie etapu separacji skrzepów lipidowych między etapem ekstrakcji lipidów a etapem transestryfikacji w celu uzyskania dodatkowego wglądu w skład klasy lipidów mikro LG, zgodnie z opisem w odniesieniach w tekście protokołu.