Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar całkowitej zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach. Jest to realizowane poprzez przygotowanie próbki zawierającej znaną ilość liofilizowanej biomasy alg, a następnie rozbicie tej biomasy mikroalg.

Następnie ekstrahuje się i izoluje komponenty lipofilowe. Ostatnim etapem jest transestryfikacja lipidów ACell do estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Ostatecznie, do ilościowego oznaczenia kwasów tłuszczowych wykorzystuje się chromatografię gazową.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak oznaczenia triacyloglicerydów, jest jej wysoka dokładność oraz możliwość specyficznego pomiaru wszystkich kwasów tłuszczowych i wszystkich pozostałych komponentów lipofilowych. Procedurę zaprezentuje NDI Afer, technik z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem tej procedury należy określić stężenie suchej masy alg w gramach na litr w pożywce hodowlanej, zgodnie ze szczegółowym opisem w wymienionej referencji. Przenieś objętość pożywki zawierającą od 5 do 10 mg suchej masy alg do szklanej probówki wirówkowej.

Oblicz dokładną ilość przeniesionej biomasy, korzystając z wcześniej wyznaczonego stężenia biomasy; odwiruj próbkę przez pięć minut przy 1200 Gs. Odlej część supernatantu, pozostawiając w probówce około 0,25 milliliters. Następnie resusp. Resuspenduj algi w pozostałym supernatancie, delikatnie pipetując osad w górę i w dół, a następnie przenieś mieszaninę komórek do probówki do homogenizatora kuleczkowego.

Używając pipety 200 µL, przepłucz probówkę do wirowania oraz końcówkę pipety ± 0,15 mL wody z milli cube i przenieś ciecz do probówki do homogenizatora kuleczkowego. Wiruj probówkę do homogenizatora kuleczkowego przez jedną minutę przy maksymalnej prędkości obrotowej (RPM), aby upewnić się, że na dnie probówki nie pozostały pęcherzyki powietrza. Po zakończeniu liofilizuj materiał w probówce zgodnie z poniższymi instrukcjami.

Przygotować roztwór trip Penta Deano o stężeniu 50 mg/L w określonym stosunku objętościowym chloroformu do metanolu. Za pomocą pipety wyporowej dodać 1 mL roztworu tripod do probówki do homogenizacji kulkowej. Należy sprawdzić, czy w zakrętce probówki do homogenizacji nie pozostały żadne kulki, ponieważ może to doprowadzić do nieszczelności probówki.

Poddaj próbkę w probówce do homogenizacji mechanicznej (bead beater) ośmiokrotnemu homogenizowaniu przy 2 500 RPM przez 60 sekund w każdym cyklu, z 12-sekundowym odstępem między kolejnymi cyklami. Następnie przenieś roztwór z kuleczkami z probówki do homogenizacji do czystej, żaroodpornej szklanej probówki do wirowania o pojemności 15 ml z teflonową wkładką w zakrętce. Przepłucz probówkę do homogenizacji 1 ml roztworu tripod i przenieś płuczkę do szklanej probówki do wirowania.

Powtórz czynność jeszcze dwa razy. Próbkę wymieszaj w wirówce typu vortex przez pięć sekund, a następnie poddaj sonikacji przez 10 minut. Po sonikacji do probówki wirówkowej dodaj 2,5 milliliters roztworu wody w milli cube o pH siedem, zawierającego 50 millimolar triss oraz one molar chlorku sodu.

Po ponownym wymieszaniu próbki w wirówce typu vortex i sonikacji, odwiruj ją przez pięć minut przy 1200. Po zakończeniu ostrożnie przenieś dolną fazę chloroformową do czystej probówki szklanej za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie powtórz ekstrakcję z użyciem jednego mililitra chloroformu. Po zakończeniu pobierz fazę chloroformową za pomocą szklanej pipety Pasteura i połącz ją z pierwszą frakcją chloroformową.

Odparować chloroform za pomocą strumienia azotu, aby uzyskać wysuszone wyekstrahowane lipidy. Następnie do probówki zawierającej wysuszone wyekstrahowane lipidy dodać trzy mililitry metanolu zawierającego 5% kwasu siarkowego i szczelnie ją zamknąć. Próbkę mieszać w wstrząsارce (vortex) przez pięć sekund.

Inkubować próbki przez trzy godziny w temperaturze 70 °C w grzałce blokowej. Okresowo sprawdzać, czy próbki nie wrząły, i mieszać probówkę w wirówce typu vortex po każdej takiej kontroli. Po ochłodzeniu próbki do temperatury pokojowej dodać do probówki 3 mL wody Milli-Q i 3 mL n-heksanu, a następnie wymieszać w wirówce typu vortex.

Mieszać próbkę przez 15 minut za pomocą rotatora do probówek. Po wyjęciu próbek z rotatora wirować je przez pięć minut przy 1200 Gs. Za pomocą szklanej pipety Pasteura pobrać dwa mililitry górnej fazy heksanowej i przenieść ją do nowej szklanej probówki. W celu przemycia pobranej fazy heksanowej dodać do szklanej probówki dwa mililitry wody milli Q.

Następnie mieszaj próbkę w wortexie przez pięć sekund i wiruj przez pięć minut. Przy 1200 Gs przenieś fazę heksanową z probówki szklanej do fiolki do GC, używając szklanej pipety Pasteura. Następnie załóż zakrętkę na fiolkę do GC i mocno ją dokręć, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika.

Umieść fiolkę z próbką w autosamplerze urządzenia GC. Na koniec przeanalizuj próbkę na urządzeniu z nową kolumną, stosując całkowity przepływ 20 milliliters per minute oraz objętość wtrysku one microliter. Specyfikacje kolumny oraz warunki chromatograficzne znajdują się w protokole tekstowym.

Tutaj przedstawiono typowy chromatogram otrzymany za pomocą tej metody. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są rozdzielane przez kolumnę GC ze względu na wielkość i stopień nasycenia; zgodnie z zastosowanym protokołem kwasy tłuszczowe o krótszych łańcuchach oraz kwasy tłuszczowe bardziej nasycone mają krótsze czasy retencji. Zastosowana kolumna GC i protokół nie mają na celu rozdzielenia izomerów kwasów tłuszczowych, co można by jednak osiągnąć, stosując inną kolumnę GC i inny protokół.

Przedstawiono tutaj zawartość i skład kwasów tłuszczowych w C Desus UEX 3 93 w warunkach wystarczającej oraz niedoborowej podaży azotu. Całkowita zawartość kwasów tłuszczowych wynosiła odpowiednio 8,6 ± 0,5% w warunkach nasycenia azotem oraz 44,7 ± 1,7% w warunkach niedoboru azotu podczas hodowli. Wartości te wykazują, że skład i zawartość kwasów tłuszczowych są w znacznym stopniu zależne od głodzenia azotowego.

W ESBL kwas palmitowy i kwas oleinowy są dwoma najliczniej występującymi kwasami tłuszczowymi. Szczegóły dotyczące obliczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych znajdują się w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj zawartość i skład kwasów tłuszczowych w Odum Trico UEX 6 4 0 zarówno w warunkach wystarczającej podaży azotu, jak i w warunkach jego niedoboru.

Podobnie jak w przypadku ukośnych UU, zawartość i skład kwasów tłuszczowych są w dużym stopniu zależne od głodzenia azotowego. W warunkach dostatecznej oraz niedoborowej podaży azotu całkowita zawartość kwasów tłuszczowych wynosiła odpowiednio 11,7 ± 0,9% i 30,5 ± 1,1%. P trium produkuje również znaczne ilości wielोनienasyconych kwasów tłuszczowych, takich jak I csap, kwas Penta IC.

Ponadto metodą tą można wykryć również bardzo długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, takie jak kwas ligncerowy. Procedurę tę można rozszerzyć o etap oddzielania skrzepu lipidowego pomiędzy ekstrakcją lipidów a etapem transestryfikacji, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat składu klas lipidów w mikro LG, zgodnie z opisem w literaturze cytowanej w tekście protokołu.