Name: Bezznacznikowa izolacja i wzbogacanie komórek poprzez bezdotykową dielektroforezę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj bezznacznikową izolację komórek przez bezdotykową dielektroforezę w mikrofluidycznym urządzeniu PDMS. Ta metoda umożliwia sortowanie żywych komórek bez uszkadzania próbki i utraty sterylności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta wspierana praca została częściowo wsparta przez Narodową Fundację Nauki w ramach grantu nr. EFRI 0938047 oraz przez Virginia Tech Institute for Critical Technology and Applied Science (ICTAS). Autorzy chcieliby wyrazić wdzięczność dr Evie Schmelz i dr Paulowi Robertsowi za ich życzliwy dar w postaci komórek MOSE-L. Autorzy dziękują Angeli Anderson za pomoc w hodowli komórkowej, Caitlan Swaffar za pomoc w redagowaniu tego dokumentu i przygotowywaniu eksperymentów oraz wszystkim członkom laboratorium Bioelectromechanical Systems.

1. Wykonanie prototypu mikroprzepływowego urządzenia cDEP: Przegląd
<ol>
	<li>Zastosować wcześniej opisane procedury22, wykorzystując fotorezyst i głębokie trawienie reaktywne jonami (DRIE), aby wytrawić pożądany projekt kanałów (Rysunek 1) w waflu krzemowym (Rysunek 2). Nanieść cienką warstwę Teflonu, aby ułatwić oddzielenie mikroprzedmiotu od wafla.</li>
</ol>
<img alt="Schemat chipa mikrofluidycznego z elektrodami odpływowymi/zasilającymi, wymiarami i analizą ścieżki przepływu płynu." src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat urządzenia do ciągłego sortowania niskiej częstotliwości. Kanał z próbką przebiega od lewej do prawej i ma szerokość 500 μm z ząbkowanymi zwężeniami do 100 μm. Dwie pary kanałów elektrod fluidycznych stanowią odpowiednio elektrody odpływowe i zasilające, a od kanału z próbką oddziela je bariera z PDMS o grubości 20 μm.
<img alt="Schemat procesu fotolitografii: naświetlanie UV, wzorowanie fotorezystu na krzemie, etapy formowania PDMS." src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Proces wytwarzania urządzenia cDEP. (a) Przez 60 sec światło UV selektywnie reaguje z fotorezystem naświetlanym przez maskę z geometrią urządzenia cDEP. (b) Fotorezyst jest usuwany przy użyciu wywoływacza. (c) Do wytrawienia struktur o głębokości 50 μm zastosowano głębokie trawienie reaktywnymi jonami (DRIE), a następnie przeprowadzono 5 min trawienia mokrego w 25% roztworze wodorotlenku tetrametyl அம்மoniu (TMAH) w temperaturze 70 °C w celu zmniejszenia chropowatości ścian bocznych. (d) Naniesiono powłokę teflonową, aby ułatwić oddzielenie urządzenia od wafla. (e) Po odgazowaniu PDMS wlano na wielorazowy stempel waflowy i utwardzano przez 45 min w temperaturze 100 °F. (f) PDMS usunięto z wafla. PDMS oraz czystą szklaną lamellkę poddano działaniu plazmy powietrznej przez 2 min, a następnie ze sobą zespolono.
<ol start="2">
	<li>Owiń wafelek folią aluminiową, aby zapobiec rozlewaniu się materiału. Wymieszaj polidimetylosiloksan (PDMS) w stosunku 10:1 elastomeru do utwardzacza, odgazuj przez około 20 min i wlej na wafelek. Wygrzewaj przez 45 min w temperaturze 100 °C, aby uniknąć uszkodzenia powłoki teflonowej stempla. Pozostaw urządzenie do ostygnięcia.</li>
	<li>Po ostygnięciu usuń folię aluminiową, przytnij PDMS za pomocą skalpela i wykonaj otwory dostępowe przy wlocie/wylocie kanałów, używając tępego dziurkacza dopasowanego do rozmiaru rurek. W tym przypadku zastosowano tępy dziurkacz 1,5 mm.</li>
	<li>Oczyść szklaną płytkę mikroskopową, kolejno płukąc ją wodą z mydłem, etanolem oraz wodą DI, a następnie osusz powietrzem. Oczyść urządzenie z PDMS za pomocą taśmy Scotch Magic. Sprawdź pod mikroskopem, czy kanały są czyste. Poddaj płytkę oraz urządzenie z PDMS działaniu plazmy powietrznej przez 2 min. Mocno dociśnij stronę urządzenia z kanałami do płytki szklanej, unikając powstawania pęcherzyków powietrza między urządzeniem a płytką (Rycina 3).</li>
</ol>
<img alt="Schemat obwodu fotonicznego ze strukturami linii mikropaskowych do badań nad fotoniką mikrofalową." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. (a) Maska użyta do fotolitografii podczas wytwarzania stempla z płytki krzemowej oraz (b) gotowe urządzenie PDMS-szkło z kanałami próbki i elektrod płynnych wypełnionymi odpowiednio zielonym i czerwonym barwnikiem spożywczym. Wymiary przedstawiono na Rysunku 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
2. Przygotowanie zawiesiny komórkowej w buforze DEP
<ol>
	<li>Przygotować bufor o niskiej przewodności (100 μS/cm), który będzie określany jako „bufor DEP” (8,5% sacharozy [w/v], 0,3% glukozy [w/v], 0,725% RPMI [v/v]).16</li>
	<li>Resuspender komórki w buforze DEP do stężenia 3 x 106 komórek/ml. W tym przypadku wykorzystano nowotworowe komórki nabłonka powierzchniowego jajnika myszy w stadium późnym (MOSE-L).</li>
</ol>
Uwaga: Analiza żywotności komórek metodą wykluczania barwnika trypan blue wykazała niewielki spadek żywotności (z 95,1-91,6%) komórek MOSE we wczesnym stadium (MOSE-E) zawieszonych w buforze DEP w temperaturze pokojowej po 5 h. Przewiduje się, że podobny niewielki spadek żywotności występuje w przypadku komórek MOSE-L, co wskazuje, że komórek nie należy przechowywać w buforze DEP przez dłuższy czas.
<ol start="3">
	<li>Obarwić komórki za pomocą fluorescencyjnego barwnika przenikającego przez błony, takiego jak aktywowany enzymatycznie Calcein AM.</li>
	<li>Zmierzyć przewodność elektryczną obarwionej zawiesiny komórkowej. Przewodność powinna wynosić około 100 μS/cm. Jeśli pomiar przewodności jest zbyt wysoki, odwirować próbkę, ponownie zawiesić w buforze DEP w stężeniu 3 x 106 komórek/ml i powtórzyć pomiar przewodności.</li>
</ol>
3. Załadowanie mikroprzepływowego chipa cDEP
<ol>
	<li>Umieść chip mikrofluidyczny w próżni na 30 min.</li>
	<li>W tym czasie utnij odcinek elastycznego wężyka, który pokryje odległość od pompy strzykawkowej do stolika mikroskopu, na którym znajdzie się chip mikrofluidyczny. W tym przypadku wymagany jest odcinek wężyka o długości 6 cali. Przymocuj wężyk do końcówki igły strzykawki.</li>
	<li>Oszacuj wymaganą długość wężyka odpływowego, dzieląc docelową objętość zbieranej próbki przez pole przekroju poprzecznego rurki. Utnij odcinek wężyka o wymaganej długości.</li>
	<li>Naciągnij zawiesinę komórkową do strzykawki. Upewnij się, że w wężyku ani w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Po wyjęciu chipu z próżni włóż wężyk odpływowy i szybko przepłucz kanał próbkowy, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza w kanałach. Podczas przepłukiwania delikatnie opukuj strzykawkę, aby uniknąć przerwania cienkiej (20 μm) bariery izolacyjnej, choć zaobserwowano, że bariera ta może wytrzymać stały wysoki przepływ bliski 5 ml/hr bez uszkodzenia.</li>
	<li>Aby przepłukać kanały elektrod, szybko umieść puste końcówki pipety w jednym wylocie każdego z płynnych kanałów elektrod. Pipetuj 200 μl PBS zawierającego niewielką ilość rodaminy B i delikatnie opukuj, aby wprowadzić płyn do przeciwległego końca kanału elektrody. Utrzymuj delikatny nacisk, aż PBS z rodaminą B widocznie przesunie się w górę pustej końcówki pipety. Powtórz czynność dla każdego kanału elektrody. Rodaminy B używa się wyłącznie do wizualizacji fluorescencyjnej płynnych kanałów elektrod.</li>
	<li>Po przepłukaniu napełnij każdy zbiornik z końcówką pipety PBS z rodaminą B. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza w zbiornikach z końcówkami pipet i usuń wszelkie widoczne pęcherzyki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Odłącz wężyk odpływowy i zutylizuj go w odpowiedni sposób, a następnie włóż nowy zbiornik z wężykiem odpływowym, aby zebrać docelową objętość.</li>
</ol>
4. Charakterystyka częstotliwości crossoveru komórek przy użyciu chipa cDEP
<ol>
	<li>Umieść chip na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę cyfrową (Rysunek 4).</li>
</ol>
<img alt="Konfiguracja układu chipa cDEP z pompą strzykawkową, mikroskopem i elektrodami; stosowany w eksperymentach z dielektroforezą." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. (a) Ogólny schemat ustawienia eksperymentalnego dla doświadczeń cDEP. Chip cDEP znajduje się na platformie mikroskopu odwróconego. Kamera przesyła obrazy do komputera w celu zapisu. Pompa strzykawkowa utrzymuje stały przepływ wlotowy. Generator funkcji generuje sygnał, który jest wzmacniany przez wzmacniacz wysokiego napięcia i dostarczany do chipa cDEP za pomocą elektrod przewodowych. Oscyloskop monitoruje sygnał wysyłany do chipa. (b) Widok szczegółowy chipa cDEP oraz połączeń płynnych i elektronicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą ryciny</a>.
<ol start="2">
	<li>Zamocuj strzykawkę w pompie strzykawkowej i wprowadź elektrody druciane do zbiorników kanału elektrod płynowych.</li>
	<li>Przepompuj ciecz z prędkością 1 ml/hr, aby zapewnić dobry kontakt między pompą strzykawkową a strzykawką. Wizualnie sprawdź długość kanału, aby upewnić się, że przepływ komórek nie jest utrudniony oraz że nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków. Zmniejsz prędkość przepływu do 0,005 ml/hr. 
	Uwaga: W urządzeniach o innych geometriach osiągnięto przepustowość wynoszącą nawet 1 ml/hr31,35.</li>
	<li>Ze względów bezpieczeństwa przetestuj elektronikę, włączając generator funkcji, wzmacniacz wysokiego napięcia oraz oscyloskop i ustawiając pożądane napięcie oraz częstotliwość. W tym przypadku parametry te wynoszą 200 V i 20 kHz. Po zweryfikowaniu poprawnego działania wyłącz urządzenia. Podłącz elektrody do wzmacniacza wysokiego napięcia. 
	Uwaga: Podczas pracy z elektroniką przy wysokich napięciach stosowanych w tych eksperymentach należy przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa elektrycznego.</li>
	<li>Po uzyskaniu stabilnego przepływu przyłóż pożądane napięcie przy pożądanej częstotliwości. W tym eksperymencie napięcie wynosi 200 VRMS przy częstotliwościach w zakresie 5-60 kHz.</li>
	<li>Nagraj pliki wideo odpowiedzi komórek, a następnie zastosuj techniki przetwarzania obrazu (krok 5), aby ilościowo określić rozkład komórek w kanale i scharakteryzować częstotliwość przejścia. W tym celu utrzymuj stałe napięcie i systematycznie zmieniaj częstotliwość. Na początku i na końcu eksperymentu, a także losowo pomiędzy seriami pomiarowymi, zarejestruj kontrolny rozkład komórek, czyli rozkład komórek bez przykładania pola elektrycznego. Oszacuj czas potrzebny na przepływ komórek z wlotu do monitorowanego miejsca (tutaj 5 min). Po ustawieniu nowej częstotliwości odczekaj ten czas, a następnie rozpocznij nagrywanie (tutaj 2 min wideo rozkładu komórek).</li>
</ol>
5. Przetwarzanie obrazów w celu charakterystyki częstotliwości crossing-over
<ol>
	<li>Za pomocą skryptu obliczeniowego przeanalizuj każdą klatkę wideo, aby wyznaczyć względną pozycję y (gdzie kierunek z to głębokość kanału, kierunek y to szerokość kanału, a kierunek x to długość kanału) każdej fluorescencyjnej komórki lub cząsteczki przy określonej współrzędnej x w dole strumienia, za obszarem wysokiej siły DEP w kanale. Stwórz wykres rozkładu względnego.</li>
	<li>Porównaj linię środkową rozkładu dla każdego napięcia i częstotliwości z linią środkową rozkładu kontrolnego. Dla danego napięcia i zmieniających się częstotliwości wyznacz częstotliwość przecięcia, przy której linia środkowa pokrywa się z pozycją y próby kontrolnej.</li>
</ol>
6. Modyfikacja eksperymentu w celu przeprowadzenia sortowania lub wzbogacenia komórek
<ol>
	<li>Resuspender pożądaną mieszaninę w buforze DEP do całkowitego stężenia 3 x 106 cząsteczek/ml. W tym przypadku mieszanina składa się z komórek MOSE-L oraz fluorescencyjnych kuleczek o rozmiarze 4 μm w buforze DEP. Wykonać wcześniej opisane kroki w celu przygotowania urządzenia cDEP.</li>
	<li>Aby posortować lub wzbogacić komórki z mieszaniny, wyznaczyć częstotliwości przecięcia (crossover frequencies) komórek docelowych oraz cząsteczek tła zgodnie z wcześniejszym opisem. Przeprowadzić eksperyment przy częstotliwości znajdującej się pomiędzy częstotliwościami przecięcia komórek docelowych a cząsteczek tła, tak aby dwie populacje cząsteczek doświadczały sił DEP w przeciwnych kierunkach. Aby posortować komórki MOSE-L i kuleczki 4 μm, urządzenie mikroprzepływowe należy uruchomić przy częstotliwości powyżej 11,90±0,63 kHz, co stanowi pierwszą częstotliwość przecięcia komórek MOSE-L niedawno zgłoszoną przez Salmanzadeh et al.33</li>
	<li>Aby zebrać zawartość posortowanej próbki, po pobraniu objętości docelowej należy usunąć rurkę wylotową, przykrywając otwór wylotowy palcem w rękawiczce i delikatnie pociągając za rurkę. Prelać zebraną objętość docelową do zbiornika w celu dalszej analizy. Uwaga: Inne metody odzyskiwania próbek mogą obejmować przytwierdzenie stałego zbiornika do chipa i pobranie próbki za pomocą zwykłego pipetowania.</li>
</ol>

<ol><li>Butler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButler%2C+M+%22Cell+culture+and+upstream+processing%22">Cell culture and upstream processing</a>. , Taylor & Francis. (2007).</li>
<li>Pratt, E. D., Huang, C., Hawkins, B. G., Gleghorn, J. P., Kirby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+Cell+Capture+in+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Science%22%5BJournal%5D)">Rare Cell Capture in Microfluidic Devices.</a> Chemical Engineering Science. 66, 1508-1522 (2011).</li>
<li>Salmanzadeh, A. D., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+cells+through+their+dielectrophoretic+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature.</a> Journal of Membrane Science and Technology. 3, e112(2013).</li>
<li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting.</a> The Review of Scientific Instruments. 43, 404-409 (1972).</li>
<li>Adams, J. D., Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multitarget+magnetic+activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Multitarget magnetic activated cell sorter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18165-18170 (2008).</li>
<li>Chabert, M., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+high-throughput+encapsulation+and+hydrodynamic+self-sorting+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3191-3196 (2008).</li>
<li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+inertial+focusing%2C+ordering%2C+and+separation+of+particles+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18892-18897 (2007).</li>
<li>Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 9, 3038-3046 (2009).</li>
<li>Grover, S. C., Skirtach, A. G., Gauthier, R. C., Grover, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+single-cell+sorting+system+based+on+optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Automated single-cell sorting system based on optical trapping.</a> J. Biomed. Opt. 6, 14-22 (2001).</li>
<li>Lin, S. C. S., Mao, X. L., Huang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+acoustic+wave+%28SAW%29+acoustophoresis%3A+now+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Surface acoustic wave (SAW) acoustophoresis: now and beyond.</a> Lab Chip. 12, 2766-2770 (2012).</li>
<li>Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Article-Dielectrophoresis%3A+Status+of+the+theory%2C+technology%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Review Article-Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications.</a> Biomicrofluidics. 4, (2010).</li>
<li>Gascoyne, P. R. C., Wang, X. B., Huang, Y., Becker, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoretic+separation+of+cancer+cells+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Ieee+T.+Ind.+Appl%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoretic separation of cancer cells from blood.</a> Ieee T. Ind. Appl. 33, 670-678 (1997).</li>
<li>Pohl, H. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPohl%2C+HA+%22Dielectrophoresis+%3A+the+behavior+of+neutral+matter+in+nonuniform+electric+fields%22">Dielectrophoresis : the behavior of neutral matter in nonuniform electric fields</a>. , Cambridge University Press. (1978).</li>
<li>Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+cells+through+their+dielectrophoretic+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare cells through their dielectrophoretic signature.</a> Journal of Membrane Science. , Under-review (2012).</li>
<li>Markx, G. H., Talary, M. S., Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+Viable+and+Nonviable+Yeast+Using+Dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Separation of Viable and Nonviable Yeast Using Dielectrophoresis.</a> J. Biotechnol. 32 (94), 29-37 (1994).</li>
<li>Flanagan, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+dielectric+properties+distinguish+stem+cells+and+their+differentiated+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny.</a> Stem Cells. 26, 656-665 (2008).</li>
<li>Labeed, F. H., Coley, H. M., Thomas, H., Hughes, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+multidrug+resistance+reversal+using+dielectrophoresis+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of multidrug resistance reversal using dielectrophoresis and flow cytometry.</a> Biophys. J. 85, 2028-2034 (2003).</li>
<li>Hoettges, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis-activated+multiwell+plate+for+label-free+high-throughput+drug+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment.</a> Anal. Chem. 80, 2063-2068 (2008).</li>
<li>Lapizco-Encinas, B. H., Simmons, B. A., Cummings, E. B., Fintschenko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulator-based+dielectrophoresis+for+the+selective+concentration+and+separation+of+live+bacteria+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Insulator-based dielectrophoresis for the selective concentration and separation of live bacteria in water.</a> Electrophoresis. 25, 1695-1704 (2004).</li>
<li>Davalos, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+impact+of+dynamic+surface+coatings+on+polymeric+insulator-based+dielectrophoretic+particle+separators%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Performance impact of dynamic surface coatings on polymeric insulator-based dielectrophoretic particle separators.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390, 847-855 (2008).</li>
<li>Gallo-Villanueva, R. C., Rodriguez-Lopez, C. E., Diaz-De-La-Garza, R. I., Reyes-Betanzo, C., Lapizco-Encinas, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+manipulation+by+means+of+insulator-based+dielectrophoresis+employing+direct+current+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">DNA manipulation by means of insulator-based dielectrophoresis employing direct current electric fields.</a> Electrophoresis. 30, 4195-4205 (2009).</li>
<li>Shafiee, H., Caldwell, J. L., Sano, M. B., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contactless+dielectrophoresis%3A+a+new+technique+for+cell+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Contactless dielectrophoresis: a new technique for cell manipulation.</a> Biomed Microdevices. 11, 997-1006 (2009).</li>
<li>Park, K., Suk, H. J., Akin, D., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis-based+cell+manipulation+using+electrodes+on+a+reusable+printed+circuit+board%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board.</a> Lab Chip. 9, 2224-2229 (2009).</li>
<li>Jen, C. P., Maslov, N. A., Shih, H. Y., Lee, Y. C., Hsiao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+focusing+in+a+contactless+dielectrophoretic+microfluidic+chip+with+insulating+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Microsyst+Technol%22%5BJournal%5D)">Particle focusing in a contactless dielectrophoretic microfluidic chip with insulating structures.</a> Microsyst Technol. 18, 1879-1886 (2012).</li>
<li>Hughes, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AC+electrokinetics%3A+applications+for+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">AC electrokinetics: applications for nanotechnology.</a> Nanotechnology. 11, 124-132 (2000).</li>
<li>Pethig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis%3A+Status+of+the+theory%2C+technology%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications.</a> Biomicrofluidics. 4, 022811(2010).</li>
<li>Pethig, R. Ch. 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPethig%2C+R+%22BioMEMS+and+Biomedical+Nanotechnology%22">BioMEMS and Biomedical Nanotechnology</a>. Ferrari, M. auro, Ozkan, M. ihrimah, Heller, M. ichael J. . 4, Springer. US. 103-126 (2007).</li>
<li>Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+of+live%2Fdead+cells+using+contactless+dielectrophoresis+%28cDEP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP).</a> Lab Chip. 10, 438-445 (2010).</li>
<li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoretic+differentiation+of+mouse+ovarian+surface+epithelial+cells%2C+macrophages%2C+and+fibroblasts+using+contactless+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoretic differentiation of mouse ovarian surface epithelial cells, macrophages, and fibroblasts using contactless dielectrophoresis.</a> Biomicrofluidics. 6, (2012).</li>
<li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+prostate+tumor+initiating+cells+%28TICs%29+through+their+dielectrophoretic+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Isolation of prostate tumor initiating cells (TICs) through their dielectrophoretic signature.</a> Lab Chip. 12, 182-189 (2012).</li>
<li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M., Davalos, R. V. Isolation of Rare Cancer Cells from Blood Cells Using Dielectrophoresis. EMBC 2012., Annual International IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, Aug 28-Sep 1, San Diego, , (2012).</li>
<li>Sano, M. B., Caldwell, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+development+of+a+low+frequency+contactless+dielectrophoresis+%28cDEP%29+platform+to+sort+cancer+cells+from+dilute+whole+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Modeling and development of a low frequency contactless dielectrophoresis (cDEP) platform to sort cancer cells from dilute whole blood samples.</a> Biosens. Bioelectron. 30, 13-20 (2011).</li>
<li>Salmanzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Dielectric+Properties+of+Different+Stages+of+Syngeneic+Murine+Ovarian+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Investigating Dielectric Properties of Different Stages of Syngeneic Murine Ovarian Cancer Cells.</a> Biomicrofluidics. , (2013).</li>
<li>Salmanzadeh, A., Sano, M. B., Shafiee, H., Stremler, M. A., Davalos, R. V. Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC), 2012 Annual International Conference of the IEEE, , 590-593 (2012).</li>
<li>Sano, M. B., Salmanzadeh, A., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+contactless+dielectrophoresis%3A+Theoretical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Multilayer contactless dielectrophoresis: Theoretical considerations.</a> Electrophoresis. 33, 1938-1946 (2012).</li>
<li>Millet, L. J., Park, K., Watkins, N. N., Hsia, K. J., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+beads+and+cells+in+multi-channel+microfluidic+devices+using+dielectrophoresis+and+laminar%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar.</a> J. Vis. Exp. (48), e2545(2011).</li>
<li>Henslee, E. A., Sano, M. B., Rojas, A. D., Schmelz, E. M., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+concentration+of+human+cancer+cells+using+contactless+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).</li>
<li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li>
</ol>

Dr Rafael Davalos posiada zgłoszony patent na bezdotykową dielektroforezę.

DEP to potężna technika służąca do określania właściwości dielektrycznych cząstek oraz kierowania ich ruchem w zastosowaniach związanych z sortowaniem, izolacją lub wzbogacaniem próbek. Ze względu na szkodliwy wpływ bezpośredniego kontaktu elektrod z próbką, inni badacze przyjęli podejścia podobne do wcześniej przedstawionej metody, aby uniknąć takiego kontaktu. Na przykład Bashir et al. opracowali bezkontaktowe urządzenia DEP, wykorzystując mikrofluidyczne urządzenie z PDMS oddzielone od elektrod na płytce drukowanej cienką szkiełkiem podstawowym; technika ta jest również dostępna w formacie wideo.23,36
W niniejszej pracy przedstawiono proces wytwarzania chipa cDEP oraz elektrod płynnych przy użyciu pojedynczej podłoża z PDMS, a także protokół eksperymentalny służący do oddzielania komórek raka jajnika od mieszaniny komórek i kulek fluorescencyjnych. Przedstawiona technika została z powodzeniem zastosowana w szeregu bardziej złożonych i istotnych fizjologicznie aplikacji, w tym do sortowania komórek żywych i martwych,28 komórek inicjujących nowotwór z komórek raka prostaty,30 komórek nowotworowych z rozcieńczonych erytrocytów,31,32 a także do różnicowania stadiów raka piersi37 i raka jajnika.29 Metoda cDEP była wykorzystywana również do mieszania cząstek.38 Zastosowania te sugerują, że dzięki wykorzystaniu zaprezentowanej prostej techniki można osiągnąć różnorodne cele poprzez samą zmianę geometrii kanału.
DEP jest użyteczna w mikroskali do manipulowania cząstkami.13 W przypadku cząstek sferycznych translacyjna siła dielektroforetyczna zależy od rozmiaru i właściwości elektrycznych cząstki oraz medium zawiesiny, a także od gradientu kwadratu natężenia pola elektrycznego:
<img alt="Równanie dielektroforezy; wzór na oddziaływanie pola elektrycznego; zaawansowane pojęcie fizyczne." src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
gdzie εm to przenikalność elektryczna medium zawieszenia, r to promień cząsteczki, a Rc[k(ω)] to część rzeczywista czynnika Clausiusa-Mossottiego (CM). Czynnik CM jest miarą względnej polaryzowalności cząsteczki w porównaniu do medium zawieszenia i określa kierunek siły dielektroforetycznej. Opisuje się go jako
<img alt="Wzór na wzbudzenie optyczne, \(K(\omega) = \frac{(\varepsilon_p^* - \varepsilon_m^*)}{(\varepsilon_p^* + 2\varepsilon_m^*)}\)." src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> 
gdzie <img alt="symbol ε&lt;sub&gt;p&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;*&lt;/sup&gt;; stosowany w równaniach nauki o materiałach i analizie termodynamicznej." src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3"> oraz <img alt="Równowaga statyczna, symbol εᵐ*, wzór w fizyce, ilustracja metodologii do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 4"> to odpowiednio zespolone przenikalności elektryczne cząstki i ośrodka. Przenikalność zespolona, <img alt="Wzór na przenikalność zespoloną ε*=ε+σ/jω dla analizy elektromagnetycznej." src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 5">, zależy od przewodności (σ) i częstotliwości (ω). Współczynnik CM dla cząstek sferycznych jest teoretycznie ograniczony do wartości od -0,5 do 1. Jeśli współczynnik CM jest ujemny, cząstki ulegają nDEP, ponieważ ośrodek jest bardziej polaryzowalny niż cząstka, w związku z czym cząstki oddalają się od obszarów o wysokich gradientach pola elektrycznego. Jeśli współczynnik CM jest dodatni, cząstki są bardziej polaryzowalne niż ośrodek i ulegają pDEP, w wyniku czego przemieszczają się w kierunku obszarów o wysokich gradientach pola elektrycznego.
W przypadku cząstek biologicznych o niejednorodnej strukturze, takich jak komórki, czynnik Clausiusa-Mossottiego można wyznaczyć na podstawie efektywnej wartości przenikalności elektrycznej cząstki:
<img alt="Równanie stanu równowagi statycznej; przenikalność dielektryczna w sferach warstwowych; analiza wzoru." src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 6"> 
gdzie <img alt="Równowaga statyczna; wzór ε*cyt; reprezentacja symboliczna; edukacyjne, badawcze." src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 7"> oraz <img alt="Wzór równowagi statycznej, ε*mem, związany z potencjałem błonowym w analizie spektroskopowej." src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 8"> to odpowiednio zespolona przenikalność efektywna wnętrza komórki, np. cytoplazmy, oraz błony komórkowej; r to promień komórki, a d to grubość błony komórkowej.26
Gdy DEP występuje w przypadku cząstek zawieszonych w cieczy, ruch cząstki względem cieczy generuje siłę oporu działającą na cząstkę. Siłę oporu tę należy uwzględnić podczas określania całkowitej siły działającej na cząstkę. W analizowanych tutaj przypadkach dominują siły lepkości, a cząstki przyjmuje się za sferyczne, małe i poruszające się z relatywnie niską prędkością, zatem prawo Stokesa dostarcza dobrego przybliżenia dla siły oporu:
<img alt="Równanie siły oporu, \( \vec{F}_{\text{Drag}}{=}6\pi\eta r(\vec{u}_p{-}\vec{u}_f) \), wzór fizyczny." src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 9"> 
gdzie η to lepkość płynu, up to prędkość cząsteczki, a uf to prędkość płynu, który również może być w ruchu. Przy znanej sile dielektroforetycznej, znanych właściwościach płynu i cząsteczki oraz znanej prędkości przepływu, można rozwiązać bilans między siłą oporu a siłą dielektroforetyczną, aby oszacować prędkość cząsteczki. Szybkość ścinania, której poddawane są komórki, powinna znajdować się poniżej progu, przy którym może dojść do lizy komórek.
Charakteryzacja właściwości elektrycznych cząsteczek jest niezbędna do przewidywania i kontrolowania ich reakcji pod wpływem DEP. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy specjalnie cDEP o niskiej częstotliwości z komórkami MOSE-L, aby zaprezentować protokół wyznaczania pierwszej częstotliwości przecięcia dla komórek, a następnie wykazaliśmy ciągłe sortowanie kulek polistyrenowych i komórek MOSE-L na podstawie ich przeciwstawnych odpowiedzi DEP.
Zmiana geometrii urządzenia cDEP zmieni przestrzenne gradienty pola elektrycznego, co pozwoli na projektowanie urządzeń do pracy przy wysokich lub niskich częstotliwościach, a także na uzyskanie wysokiej selektywności i wydajności sortowania dla określonego typu komórek. Ponadto można opracować urządzenia o wysokiej przepustowości poprzez wykonanie szerszych kanałów,30 kanałów równoległych,30 lub poprzez produkcję wielowarstwową35, w której kanały elektrod są ułożone pionowo nad i pod stosunkowo głębokim kanałem z próbką. Barierę między warstwami tworzą cienkie membrany. Wstępne testy z urządzeniami wykonanymi z cienkich folii polimetakrylanu metylu (PMMA) i poliwęglanu (PC) wykazały odpowiedź DEP komórek MOSE-L. Obecnie trwają prace nad udoskonaleniem wielowarstwowych urządzeń o wysokiej przepustowości oraz nad ulepszeniem systemu peryferyjnego w celu stworzenia docelowej platformy typu plug-and-play. Aby rozszerzyć zaprezentowaną podstawową technikę eksperymentalną, zastosowania i specyfikacje urządzenia można dostosować do konkretnych wymagań, takich jak sortowanie zamiast charakterystyki lub dodanie do urządzenia zbiorników na próbki i systemu półautomatycznego.

Biologiczne wzbogacanie próbek i sortowanie cząstek jest często konieczne do późniejszej analizy. 1 Na przykład izolacja rzadkich komórek z płynów ustrojowych ma ważne zastosowania w wykrywaniu nowotworów i medycynie zindywidualizowanej. 2,3 Najczęściej stosowanymi technikami wzbogacania są sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie (FACS)4 i sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS),5 które opierają się na ekspresyjnych markerach powierzchniowych w celu różnicowania komórek. Inne strategie obejmują sortowanie hydrodynamiczne6 lub inercyjne7,8, pęsetę optyczną9, akustoforezę10 i dielektroforezę. 11,12 Dielektroforeza to ruch spolaryzowanej cząstki w obecności niejednorodnego pola elektrycznego. 13 DEP jest używany w szerokim zakresie zastosowań,2,14 w tym do sortowania komórek na podstawie żywotności,15 charakteryzowania właściwości bioelektrycznych komórek,16 oraz sortowania po wywołanych zmianach właściwości biofizycznych komórek. 17,18 Tradycyjny DEP wykorzystuje płaskie elektrody umieszczone w kanale mikroprzepływowym do przykładania napięcia i indukowania niejednorodnego pola elektrycznego. 13 Chociaż jest to skuteczna technika, mogą pojawić się pewne wyzwania, takie jak rozwarstwienie elektrod i elektroliza. Badanie dielektroforezy opartej na izolatorach (iDEP)19 rozwiązało problemy związane z zanieczyszczeniem, rozwarstwianiem elektrod i przestrzenną degradacją pola elektrody poprzez tworzenie wzorów struktur izolacyjnych, które indukują niejednorodności w polu elektrycznym prądu stałego. iDEP jest używany między innymi do selektywnego oddzielania żywych i martwych komórek bakteryjnych19, izolowania zarodników bakterii20 i manipulowania DNA21. Ogrzewanie Joule'a może być wyzwaniem, ponieważ może wystąpić w wyniku często wymaganych wysokich napięć DC. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano bezdotykowe mikrourządzenia DEP. 22-24
Przedstawiona tutaj technika wykorzystuje bezkontaktową dielektroforezę (cDEP), nazwaną tak ze względu na brak bezpośredniego kontaktu między metalowymi elektrodami a kanałem próbki. 22 Unikalną cechą tej strategii jest zastąpienie elektrod metalowych kanałami elektrod płynnych wypełnionymi roztworem o wysokiej przewodności. Te elektrody płynowe są pojemnościowo sprzężone przez cienką barierę izolacyjną z kanałem próbki za pomocą napięcia przemiennego. Wyeliminowanie kontaktu próbki z elektrodami zmniejsza problemy związane z metodami opartymi na DEP, takie jak elektroliza i tworzenie pęcherzyków, zanieczyszczenie próbki i rozwarstwienie elektrody. W rezultacie, cDEP jest szczególnie przydatny w próbkach biologicznych, ponieważ wspomaga żywotność komórek w próbce. Co ważne, cDEP może utrzymać sterylność próbki. Chip można przygotować w kapturze do hodowli komórkowej, a eksperyment można przeprowadzić bez konieczności kontaktu próbki z metalowymi elektrodami lub wymagania, aby próbka była otwarta na środowisko. Prosty zbiornik można przymocować do wylotu wióra, aby ułatwić sterylne odzyskiwanie próbki. Ponadto wytwarzanie elektrod płynnych z tego samego biokompatybilnego materiału polimerowego (PDMS) co kanał próbki zmniejsza wysokie koszty ponoszone w związku z niestandardowym modelowaniem elektrod metalowych, czas potrzebny na produkcję i ogranicza potrzebę specjalistycznego sprzętu do pomieszczeń czystych do wstępnego modelowania stempla wielokrotnego użytku z wafla krzemowego.
Ruch cząstek spowodowany DEP zależy od charakterystyki cząstki i ośrodka, a także od gradientów przestrzennych pola elektrycznego. Czynnik zależny od cząstek i częstotliwości, zwany czynnikiem Clausiusa-Mossottiego (CM), przyjmuje wartość z zakresu od -0,5 do 1 i określa kierunek siły DEP. Częstotliwość, przy której współczynnik CM wynosi dokładnie zero, nazywana jest częstotliwością zwrotnicy. Jest to punkt, w którym na cząstkę nie jest wywierana siła dielektroforetyczna, a współczynnik CM zmienia znak. Pojedyncza częstotliwość krzyżowania dla obojętnych mikrosfer stałych występuje, gdy współczynnik CM zmienia się z ujemnego na dodatni. 25 W przypadku komórek ssaków w buforze o niskiej przewodności rzędu 0,01 S/m, pierwsza częstotliwość skrzyżowania wskazująca na przejście z nDEP do pDEP występuje w pobliżu 10-100 kHz i zależy od rozmiaru, kształtu, cytoszkieletu i właściwości błony komórki. 26,27 Druga częstotliwość skrzyżowania przy przejściu z reżimu pDEP na nDEP jest rzędu 10 MHz i ma na nią wpływ stosunek jądra do cytoplazmy, przewodnictwo cytoplazmy i retikulum endoplazmatyczne. Siła 27 DEP może być przyłożona bez obecności przepływu płynu, ale tutaj wykorzystujemy płynący płyn, aby uzyskać ciągłe sortowanie zawieszonych cząstek. Połączony wpływ siły dielektroforetycznej i siły oporu Stokesa dyktuje ruch translacyjny cząstki.
Opracowaliśmy urządzenia do pracy w dwóch zakresach częstotliwości. Urządzenia o wyższej częstotliwości (100-600 kHz) działały przy użyciu pDEP i osiągały sortowanie wsadowe komórek, takich jak komórki inicjujące guz prostaty (TIC), komórki nabłonka powierzchni jajnika myszy (MOSE), komórki raka piersi MDA-MB-231 lub żywe komórki THP-1 poprzez selektywne uwięzienie komórek będących przedmiotem zainteresowania na słupkach izolacyjnych znajdujących się w kanale próbki. 28-31 Urządzenia o niższej częstotliwości (5-100 kHz) działają w sposób ciągły i gdy pracują z częstotliwością, przy której jedna populacja doświadcza pDEP, podczas gdy populacja tła doświadcza nDEP, mogą przekierowywać trajektorie cząstek w celu uzyskania sortowania. 32-34 Te urządzenia o niskiej częstotliwości były używane do sortowania komórek rakowych od czerwonych krwinek, określania zmian właściwości dielektrycznych postępującej linii komórkowej MOSE oraz do wyjaśniania wpływu nietoksycznych zabiegów sfingolipidami na odwrócenie agresywnych cech agresywnych komórek MOSE. Ponadto mikrourządzenia cDEP mogą być zaprojektowane do pracy ze zwiększoną przepustowością, obecnie do 1 ml/godz.31,35
Jak opisano, elastyczność i niski koszt procesu produkcyjnego umożliwiają projektowanie geometrii urządzeń na zamówienie, co pozwala na zastosowanie przedstawionej procedury eksperymentalnej w szerokim zakresie zastosowań. Długoterminowym celem cDEP jest realizacja sortowania i wzbogacania komórek bez znaczników na poziomie klinicznym, z odzyskiwaniem próbek do późniejszej hodowli lub przetwarzania. Przedstawiona tutaj technika jest prostą i niedrogą metodą, od produkcji po eksperymenty, co zwiększa dostępność DEP. Demonstrujemy przygotowanie chipa cDEP i protokół eksperymentalny w celu uzyskania charakterystyki i wzbogacenia komórek raka jajnika z mikrosfer fluorescencyjnych.

<table><tbody><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)Dow</td> <td>Corning, Midland, MI, Stany Zjednoczone</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane </td><td>Mikroskop Depot</td><td>76079</td><td>2x3 cale szlifowane krawędzie</td></tr><tr><td>Rurki PTFE z mikrootworem</td><td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-06417-31</td><td>Cienkościenne 20 gauge, 0,032 "ID x 0,056" OD, 100 stóp / rolka</td></tr><tr><td>Plastikowe strzykawki Luer-slip</td><td>National Scientific firma</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka igły</td><td>Howard Instrumenty elektroniczne</td><td>JG20-1.0</td><td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td></tr><tr><td>D(+)-Sacharoza</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S3-500</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glukoza, odczynnik ACS, bezwodny</td><td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td><td>AC410955000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>112-025-101</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM, Sondy molekularne</td><td>Invitrogen Corp. (technologie życia), Carlsbad, CA, USA</td><td>C3100MP</td><td>długość fali wzbudzenia 488 / długość fali emisji 516</td></tr><tr><td>Rodamina B, O</td><td>Science Lab</td><td>SLR1465-100G</td> długość <td>fali wzbudzenia 540 / długość fali emisji 625</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X)</td><td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td><td>RC-147</td><td></td></tr><tr><td>Leica, mikroskop światła odwróconego </td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, Stany Zjednoczone</td><td>Leica DMI 6000B</td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC420, kolorowa kamera</td><td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, Stany Zjednoczone</td> Generator funkcyjny <td>Leica DFC420</td><td></td></tr><tr><td> </td><td>GW Instek, Tajpej, Tajwan</td><td>GFG-3015</td><td></td></tr><tr><td>Szerokopasmowy wzmacniacz mocy </td><td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td> Wyjście <td>HFHV AL-50HF-A</td><td></td></tr><tr><td> Transformator</td><td></td><td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz wysokiego napięcia</td><td>Trek</td><td>Model 2205</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop modułowy USB, 100 MHz</td><td>AgilentTechnologies</td><td>U2701A</td><td></td></tr><tr><td>Rozszerzona myjka plazmowa</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001/002 (115/230V)</td> <td>plazma powietrzna</td></tr><tr><td>Scotch Magiczna taśma</td><td>3M</td><td></td><td>wystarczy dowolna dostępna szerokość</td></tr><tr><td>Dziurkacz 1,5 mm </td><td>Harris Uni-Core</td><td>Z708836-25EA.25</td><td></td></tr><tr><td>% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres Mikrosfery siarczanowe</td><td>Invitrogen</td><td>F8858</td><td>4,0 &mu; m, czerwona fluorescencyjna (długość fali wzbudzenia 580 / długość fali emisji 605)</td></tr> <tr><td>AZ 9260 fotorezystu </td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 400 K wywoływacz</td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek tetrametyloamonu (TMAH) 25% </td><td></td><td></td><td>dostarczony przez Virginia Tech cleanroom</td></tr><tr><td>Powłoka</td><td></td><td></td> teflonowa <td>nakładana przy użyciu maszyny DRIE</td></tr><tr><td>Silicon wafel</td><td>uniwersytecki Wafel</td><td>452</td><td>o średnicy 100 mm, 500 &mu; m grubość, jednostronnie polerowane (SSP) </td></tr><tr><td>Głębokie reaktywne trawienie jonowe (DRIE)</td><td>Alcatrel</td><td>AMS SDE 100</td><td></td></tr></tbody></table>

bezznacznikowa izolacja i wzbogacanie komórek poprzez bezdotykową dielektroforezę

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielektroforeza (DEP) to zjawisko, dzięki któremu spolaryzowane cząstki w niejednorodnym polu elektrycznym podlegają ruchowi translacyjnemu i mogą być używane do kierowania ruchem mikrocząstek w sposób niezależny od znaczników powierzchniowych. Tradycyjnie, urządzenia DEP zawierają płaskie elektrody metalowe umieszczone w kanale próbki. Takie podejście może być kosztowne i wymaga specjalistycznego środowiska w pomieszczeniach czystych. Niedawno opracowano podejście bezkontaktowe zwane bezkontaktową dielektroforezą (cDEP). Metoda ta wykorzystuje klasyczną zasadę DEP przy jednoczesnym unikaniu bezpośredniego kontaktu między elektrodami a próbką poprzez wzorowanie elektrod płynowych i kanału próbki z pojedynczego podłoża polidimetylosiloksanu (PDMS) i ma zastosowanie jako szybka strategia mikroprzepływowa przeznaczona do sortowania i wzbogacania mikrocząstek. Unikalne dla tej metody jest to, że pole elektryczne jest generowane przez kanały elektrod przepływowych zawierających płyn o wysokiej przewodności, które są oddzielone od kanału próbki cienką barierą izolacyjną. Ponieważ elektrody metalowe nie stykają się bezpośrednio z próbką, unika się elektrolizy, rozwarstwiania elektrod i zanieczyszczenia próbki. Dodatkowo umożliwia to niedrogi i prosty proces produkcji.
cDEP doskonale nadaje się do manipulowania wrażliwymi cząstkami biologicznymi. Siła dielektroforetyczna działająca na cząstki zależy nie tylko od gradientów przestrzennych pola elektrycznego generowanych przez konfigurowalną geometrię urządzenia, ale także od wewnętrznych właściwości biofizycznych ogniwa. W związku z tym cDEP jest techniką bezznacznikową, która pozwala uniknąć polegania na biomarkerach molekularnych wyrażanych powierzchniowo, które mogą ulegać zmiennej ekspresji w populacji, jednocześnie umożliwiając charakteryzację, wzbogacanie i sortowanie biocząstek.
Tutaj pokazujemy podstawy produkcji i eksperymentowania za pomocą cDEP. Wyjaśniamy proste przygotowanie chipa cDEP przy użyciu technik miękkiej litografii. Omawiamy eksperymentalną procedurę charakteryzowania częstotliwości krzyżowania się cząstki lub komórki, częstotliwości, przy której siła dielektroforetyczna wynosi zero. Na koniec pokazujemy zastosowanie tej techniki do sortowania mieszaniny komórek raka jajnika i fluoryzujących mikrosfer (kulek).

DEP powinno być obserwowane jakościowo w kanale z próbką, aby potwierdzić sprawność urządzenia w obecności pola elektrycznego. Jedną z metod testowania obecności DEP jest dostrojenie częstotliwości do wartości znacznie oddalonych od częstotliwości przecięcia, przy których przewiduje się występowanie silnego pDEP i nDEP (w przybliżeniu &gt;40 kHz dla obserwacji pDEP i &lt;10 kHz dla obserwacji nDEP w przypadku większości komórek raka ssaków w buforze o przewodności 100 μS/cm). Należy zauważyć, że obojętne mikrosfery wykazują pDEP poniżej swojej częstotliwości przecięcia i nDEP powyżej tej częstotliwości. Dla przedstawionej tutaj geometrii z elementem ząbkowanym pDEP powinno być widoczne dla komórek przy wyższej częstotliwości testowej, co objawia się tworzeniem łańcuchów przypominających perły oraz ogniskowaniem komórek lub cząstek przy ząbkowanej krawędzi kanału, natomiast przy niższej częstotliwości testowej powinno być widoczne nDEP, gdyż komórki są ograniczone do obszaru bliższego prostej krawędzi kanału. Przy tych niskich częstotliwościach komórki mogą ulec lizie wskutek elektroporacji, w związku z czym próbka może wydawać się zawierać mniej komórek, a te widoczne mogą sprawiać wrażenie powiększonych lub rozmytych w przypadku zastosowania enzymatycznie aktywnego barwnika fluorescencyjnego. Weryfikacja częstotliwości, przy których występuje pDEP i nDEP, pozwala na wyznaczenie częstotliwości przecięcia, zgodnie z opisem w protokole. Dla komórek raka ssaków, takich jak użyte tutaj MOSE-L, zaobserwowano nDEP przy 5 kHz (Rysunek 5a) oraz silne pDEP przy 60 kHz (Rysunek 5b). Komórki MOSE-L miały średnicę 17,7±3,3 μm (n = 268 komórek), a kulek nominalna średnica wynosi 4 μm. Pełną analizę właściwości dielektrycznych komórek MOSE-L w porównaniu do komórek MOSE na wcześniejszych etapach progresji można znaleźć w niedawnej pracy Salmanzadeh et al.33
Jeśli w tych ekstremalnych warunkach nie obserwuje się pDEP i nDEP, mogą występować różne problemy. Przewodność próbki może być zbyt wysoka z powodu zanieczyszczeń lub lizy komórek. Niewystarczające pole elektryczne może być wynikiem pęcherzyków powietrza uwięzionych w kanałach elektrod płynnych, co zapobiega przewodzeniu prądu do części kanałów graniczących z kanałem próbki. Niestabilny przepływ może być spowodowany pęcherzykiem uwięzionym w strzykawce lub przewodach wlotowych, pęcherzykami powstałymi w wyniku zbyt krótkiego utrzymywania urządzenia w próżni lub zbyt powolnego napełniania urządzenia po usunięciu z próżni, wyciekiem spowodowanym delaminacją słabo związanego PDMS z szkiełka przedmiotowego, rozdarciami membrany barierowej wskutek nadmiernej siły przyłożonej podczas napełniania kanałów lub prędkościami przepływu znajdującymi się na granicach zakresu pracy pompy.
Oprócz wyznaczania częstotliwości crossover komórek, technikę tę można wykorzystać do sortowania mieszaniny, co zilustrowano tutaj na przykładzie mieszaniny komórek MOSE-L i kulek. W tym przykładzie wykorzystano ujemną dielektroforezę (nDEP) wykazywaną przez kulki o rozmiarze 4 μm przy częstotliwościach, przy których komórki MOSE-L wykazują dodatnią dielektroforezę (pDEP). Urządzenie uruchomiono przy napięciu 200 VRMS i częstotliwości 10 kHz (Rysunek 6a), obserwując, że zarówno komórki, jak i kulki uległy wymieszaniu, ponieważ obie grupy doświadczały nDEP. Przy 50 kHz zaobserwowano przemieszczanie się komórek MOSE-L do górnej części kanału, podczas gdy kulki zostały ograniczone do dolnej części kanału, co umożliwiło rozdzielenie mieszaniny na dwa składniki (Rysunek 6b).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna skupisk komórkowych na powierzchni hydrofobowej, z podkreśleniem zachowania adhezyjnego." src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Pozycja komórek MOSE-L jest manipulowana poprzez zmianę częstotliwości przyłożonego pola elektrycznego. Zdjęcia zostały wykonane przy ostatnim elemencie o kształcie zęba w kanale próbkowym, a elektrody fluidyczne znajdują się w narożnikach po prawej stronie. Są one wypełnione PBS zawierającym rodaminę B, która fluorescuje w celu wizualizacji kanałów. (a) Komórki MOSE-L wykazują nDEP przy 200 VRMS i 5 kHz. (b) Komórki MOSE-L wykazują tworzenie łańcuchów perłowych oraz pDEP przy 200 VRMS i 60 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę</a>.
<img alt="Mikrografia fluorescencyjna cząsteczek DNA w elektroforezie żelowej ilustrująca proces rozdziału." src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Mieszanina komórek MOSE-L (zielone) i kulek o średnicy 4 μm (czerwone) przepływają przez ostatni element zębaty w kanale próbkowym urządzenia cDEP o niskiej częstotliwości. (a) Przy 200 V i 10 kHz komórki i kulki są wymieszane. Strzałki wskazują słabo widoczne komórki, które prawdopodobnie obumarły z powodu warunków niskiej częstotliwości. (b) Przy 200 V i 50 kHz komórki ulegają pDEP i przemieszczają się w stronę krawędzi elementu kanału, podczas gdy kulki ulegają nDEP i pozostają ograniczone do obszaru bliżej krawędzi prostej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.

Bezkontaktowa dielektroforeza (cDEP) umożliwia sortowanie i wzbogacanie cząstek dzięki ich wewnętrznym właściwościom dielektrycznym. Kanały elektrod przepływowych zastępują elektrody metalowe tradycyjne dla DEP, dostosowując cDEP do nieuszkadzającego sterylnego charakteryzowania i sortowania cząstek biologicznych. Pokazujemy, jak przygotować mikrourządzenie cDEP oraz przeprowadzić eksperymenty z charakterystyką i sortowaniem komórek.

Bezznacznikowa izolacja i wzbogacanie komórek poprzez bezdotykową dielektroforezę

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie ruchu translacyjnego komórek zawieszonych w przepływie wymuszonym ciśnieniem poprzez zastosowanie elektroforezy barwnikowej bez bezpośredniego kontaktu elektrod z próbką. Osiąga się to najpierw poprzez zawieszenie badanych komórek w buforze o niskiej przewodności. W drugim kroku do urządzenia mikroprzepływowego wprowadza się zawiesinę komórkową, a następnie wprowadza się ciecz o wysokiej przewodności do kanałów elektrod.Następnie przygotowane urządzenie zostaje podłączone do elektroniki wysokiego napięcia, a odpowiedź częstotliwościowa ruchu komórek jest rejestrowana za pomocą wideo z kamery przymocowanej do mikroskopu odwróconego. Ostatnim krokiem jest analiza obrazów wideo w celu ilościowego przewidzenia właściwości elektrycznych komórek. W końcowej fazie wykorzystuje się bezkontaktową dielektroforezę, aby wykazać, że komórki o różnych właściwościach elektrycznych mogą być sortowane w sposób bezznaczeniowy i niedestrukcyjny, przy użyciu niedrogich i prostych w wykonaniu urządzeń mikroprzepływowych.Niniejsza metoda jest przydatna w takich zastosowaniach jak sortowanie żywych komórek od martwych, izolacja komórek inicjujących guza, oddzielanie komórek nowotworowych w zależności od stopnia zaawansowania choroby oraz badanie wpływu leków na właściwości dielektryczne różnych typów komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS), jest możliwość sortowania i charakteryzowania komórek na podstawie ich wewnętrznych właściwości biofizycznych, bez konieczności znakowania biomarkerami, a także możliwość zachowania sterylności próbki dzięki wyeliminowaniu kontaktu między elektrodami a próbką. Pomysł ten pojawił się, gdy chcieliśmy opracować technikę, która pozwoliłaby uniknąć wielu problemów związanych z tradycyjnymi urządzeniami dielektroforetycznymi, takich jak zanieczyszczenie próbki, elektroliza czy kosztowna fabrication.Do izolowania komórek ssaków. Należy zastosować wcześniej opisane procedury z wykorzystaniem fotorezystu i głębokiego reaktywnego trawienia jonowego w celu wytrawienia pożądanego projektu kanałów w płytce krzemowej, nakładając cienką warstwę teflonu, aby ułatwić oddzielenie urządzenia mikroprzepływowego od płytki. Płytkę należy owinąć folią aluminiową, aby zapobiec rozlewaniu się cieczy.Wymieszaj polidimetylosiloksan (PDMS) w stosunku 10:1 elastomeru do czynnika sieciującego DGAs przez około 20 minut i wlej na wafelek. Następnie ogrzewaj wafelek przez 45 minut w temperaturze 100 °C, a po schłodzeniu zdejmij folię aluminiową, aby uniknąć uszkodzenia powłoki teflonowej stempla.Przytnij PDMS za pomocą skalpela chirurgicznego i wykonaj otwory dostępowe przy wlocie i wylocie kanału. Użyj tępego wycinaka dostosowanego do rozmiaru zastosowanej rurki; w tym przypadku użyto wycinaka o średnicy 1,5 millimeter. Następnie oczyść szkiełko przedmiotowe zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym.Oczyść urządzenie z PDMS za pomocą taśmy Scotch Magic. Sprawdź pod mikroskopem, czy kanały są czyste. Następnie poddaj preparat i urządzenie z PDMS działaniu plazmy powietrznej przez dwie minuty, a następnie mocno dociśnij stronę z kanałami urządzenia do szkiełka przedmiotowego, unikając powstawania pęcherzyków powietrza między urządzeniem a szkiełkiem.Przygotować bufor o niskiej przewodności zgodnie z opisem w protokole tekstowym, który będzie dalej określany jako bufor DEP. Zawiesić komórki w buforze DEP w stężeniu 3 milionów komórek na mililitr; w tym przypadku wykorzystuje się nowotworowe komórki nabłonka powierzchniowego jajnika myszy w późnym stadium lub komórki Moss L. Po zabarwieniu komórek za pomocą fluorescencyjnego barwnika przenikającego przez błony, zmierzyć przewodność elektryczną zawiesiny zabarwionych komórek.Przewodność powinna wynosić około 100 µS/cm. Jeśli pomiar przewodności jest zbyt wysoki, należy odwirować próbkę. Następnie ponownie zawiesić ją w buforze DEP i powtórzyć pomiar przewodności.Najtrudniejszym aspektem tego protokołu jest unikanie pęcherzyków powietrza w kanałach elektrod oraz w kanale próbki; pęcherzyki w kanałach elektrod mogą uniemożliwić połączenia elektryczne, a pęcherzyki w kanale próbki mogą zakłócić stabilność przepływu. Przed załadowaniem mikrofluidycznego chipa C dip należy bezwzględnie wykonać zademonstrowane kroki w celu uniknięcia pęcherzyków i zapewnienia stabilnego przepływu. Umieść go w próżni na 30 minut.W międzyczasie odetnij kawałek elastycznego przewodu, który pokryje odległość od pompy strzykawkowej do stolika mikroskopu, gdzie znajdzie się chip mikroprzepływowy. Wymagany jest odcinek przewodu o długości sześciu cali. Przymocuj przewód do końcówki igły strzykawki.Następnie oszacuj wymaganą długość rurki wylotowej, dzieląc docelową objętość pobranej próbki przez pole przekroju rurki. Odetnij odpowiedni odcinek rurki. Następnie pobierz zawiesinę komórkową do strzykawki.Upewnij się, że w przewodach lub strzykawce nie znajdują się pęcherzyki powietrza. Po zdjęciu chipa z próżni, podłącz przewód wylotowy i szybko przeprowadź płukanie kanału z próbką. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w kanałach, delikatnie postukaj w strzykawkę podczas płukania.Aby uniknąć przerwania cienkiej bariery izolacyjnej podczas szybkiego przygotowania kanałów elektrod, należy umieścić puste końcówki pipety w jednym z wylotów każdego kanału elektrody płynnej, naciągnąć 200 µL PBS zawierającego niewielką ilość brominy B i delikatnie uderzyć, aby wprowadzić płyn do przeciwległego końca kanału elektrody. Należy utrzymać delikatny nacisk, aż PBS z brominą B widocznie przesunie się w górę pustej końcówki pipety; czynność tę należy powtórzyć dla każdej elektrody. Brominę B stosuje się wyłącznie do znakowania fluorescencyjnego.Wizualizuj kanały elektrod fluidycznych po przygotowaniu układu. Napełnij każdy zbiorniczek końcówki pipety PBS, z R domine B. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza w zbiorniczkach końcówek pipet i usuń wszelkie widoczne pęcherzyki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Odłącz przewody odpływowe i zutylizuj je w odpowiedni sposób.Następnie włóż nowy zbiornik na rurkę wylotową. Zbierz docelową objętość. Umieść chip na stole mikroskopu odwróconego wyposażonego w kamerę cyfrową.Zamocuj strzykawkę w pompie strzykawkowej i wprowadź elektrody druciane do zbiorników kanału elektrod płynowych; pompuj płyn z prędkością 1 ml/h, aby zapewnić dobry kontakt między pompą a strzykawką. Wizualnie sprawdź długość kanału, aby upewnić się, że przepływ komórek nie jest utrudniony oraz że nie ma pęcherzyków powietrza ani wycieków. Następnie zmniejsz prędkość przepływu do 5 µl/h.W ramach zachowania zasad bezpieczeństwa należy przetestować układ elektroniczny, włączając generator funkcji, wzmacniacz wysokiego napięcia oraz oscyloskop, a następnie ustawiając pożądane napięcie i częstotliwość. W tym przypadku parametrami tymi są 200 volts i 20 kilohertz.Po potwierdzeniu uzyskania zadowalających wyników wyłącz zasilanie. Następnie podłącz elektrody do wzmacniacza wysokiego napięcia. Po osiągnięciu stabilnego przepływu przyłóż pożądane napięcie o wybranej częstotliwości. W niniejszym eksperymencie napięcie wynosi 200 V RMS przy częstotliwościach od 5 do 60 kHz.Nagraj pliki wideo odpowiedzi komórek, stosując techniki przetwarzania obrazu w celu ilościowego określenia rozkładu komórek w kanale oraz charakterystyki częstotliwości przejścia. Aby to osiągnąć, utrzymuj stałe napięcie i systematycznie zmieniaj częstotliwość na początku i na końcu eksperymentu, a także losowo pomiędzy poszczególnymi uruchomieniami doświadczenia. Zarejestruj kontrolny rozkład komórek, czyli rozkład komórek bez przyłożenia pola elektrycznego.Po ustawieniu nowej przerwy częstotliwościowej, czyli czasu wymaganego, aby komórki przepłynęły z wlotu do monitorowanego miejsca, i rozpoczęciu rejestracji, należy przeprowadzić przetwarzanie obrazu w celu charakterystyki częstotliwości przecięcia, zgodnie z opisem w protokole tekstowym; zawiesić pożądaną mieszaninę w buforze DEP przy całkowitym stężeniu 3 milionów cząstek na mililitr. W tym przypadku mieszanina składa się z komórek mchu L oraz czteromicrometr {4 µm} fluorescencyjnych kulek w buforze DEP; wykonać kroki opisane wcześniej. Aby przygotować urządzenie CEP, prowadzić eksperyment przy częstotliwości znajdującej się pomiędzy dwiema wyznaczonymi częstotliwościami przecięcia komórek docelowych a cząstek tła, tak aby obie populacje cząstek znajdowały się pod wpływem sił DEP działających w przeciwnych kierunkach.Aby zebrać zawartość różnorodnych próbek, należy usunąć rurkę wylotową po osiągnięciu docelowej objętości, przykrywając otwór wylotowy palcem w rękawiczce i delikatnie pociągając za rurkę. Przelej zebraną docelową objętość do zbiornika w celu dalszej analizy. W przypadku nowotworowych komórek ssaków, takich jak użyte tutaj komórki L, w częstotliwości 5 kHz zaobserwowano negatywną DEP oraz silną pozytywną DEP.Przy częstotliwości 60 kHz komórki MOS L mają średnicę 17,7 ± 3,3 µm, natomiast koraliki mają nominalną średnicę 4 µm. Oprócz wyznaczania częstotliwości przejścia komórek, technikę tę można wykorzystać do sortowania mieszanin, co zilustrowano tutaj za pomocą mieszaniny komórek MOS L i koralików. Ten przykład wykorzystuje negatywną dielektroforezę wykazywaną przez koraliki o średnicy 4 µm przy częstotliwościach, przy których komórki MOS L wykazują dielektroforezę pozytywną.Gdy urządzenie pracowało przy napięciu 200 V RMS i częstotliwości 10 kHz, zarówno komórki (pokazane tutaj na zielono), jak i kuleczki (pokazane tutaj na czerwono) mieszały się, wykazując negatywną DEP przy 50 kHz. Zaobserwowano przemieszczanie się komórek MOS L do górnej części kanału, podczas gdy kuleczki pozostały w dolnej części kanału, co umożliwiło rozdzielenie mieszaniny na dwa składniki. Po zastosowaniu tej procedury możliwe jest przeprowadzenie dalszych technik, takich jak hodowla komórkowa, obrazowanie immunofluorescencyjne lub analizy biochemiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące korelacji właściwości dielektrycznych z charakterystyką fizyczną komórek.Po opracowaniu ta technika otworzyła przed biologami drogę do badania, w jaki sposób zmiany w cytoszkielecie komórki indukowane przez metabolity mogą być skorelowane z ich właściwościami dielektrycznymi, z wykorzystaniem modelu raka jajnika u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wzbogacać i sortować komórki za pomocą elektroforezy bezkontaktowej.

label-free-isolation-enrichment-cells-through-contactless

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Bezetykowa izolacja i wzbogacanie komórek za pomocą bezpośredniej dielektroforezy

Wychwytywanie komórek przy użyciu urządzenia mikrofluidycznego

Dielektroforeza (DEP) jest skuteczną metodą manipulowania komórkami. Płytki drukowane (PCB) mogą stanowić niedrogie, wielokrotnego użytku i wydajne elektrody do bezkontaktowego manipulowania komórkami w urządzeniach mikroprzepływowych. Poprzez połączenie kanałów mikroprzepływowych opartych na PDMS z szkiełkami nakrywowymi na płytkach PCB, demonstrujemy manipulację i separację kulek oraz komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych.

Separacja kulek i komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych z wykorzystaniem dielektroforezy i przepływu laminarnego

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Ten protokół opisuje wykorzystanie strategii wymiany opartej na inercyjnej mikroprzepływowości do oczyszczania komórek inżynierii mikro/nanocząsteczkowej z efektywnym usuwaniem niezwiązanych cząstek.

Mikroprzepływowa wymiana buforowa w celu inżynierii komórek mikro/nanocząsteczkowych bez zakłóceń

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.

Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Komórki raka piersi wykazują inne właściwości dielektryczne w porównaniu do komórek nabłonka piersi niebędących nowotworami. Postawiono hipotezę, że w oparciu o tę różnicę we właściwościach dielektrycznych, obie populacje można rozdzielić do celów immunoterapii. Aby to wesprzeć, modelujemy urządzenie mikroprzepływowe do sortowania komórek MCF-7 i MCF-10A.

Urządzenie mikroprzepływowe do separacji komórek raka piersi bez przerzutów (MCF-7) i nienowotworowych (MCF-10A) za pomocą dielektroforezy prądu przemiennego

Tutaj prezentujemy dielektroforezę indukowaną światłem jako bezznacznikowe podejście do charakteryzowania heterogenicznych linii komórkowych, w szczególności ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC). W artykule opisano protokół wykorzystania i optymalizacji urządzenia mikroprzepływowego z warstwą fotoprzewodzącą w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego hMSC bez zmiany ich stanu natywnego.

Dielektroforeza indukowana światłem w celu scharakteryzowania zachowania elektrycznego ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Poznaj bezznacznikową izolację komórek przez bezdotykową dielektroforezę w mikrofluidycznym urządzeniu PDMS. Ta metoda umożliwia sortowanie żywych komórek bez uszkadzania próbki i utraty sterylności.

Bezznacznikowa izolacja i wzbogacanie komórek poprzez bezdotykową dielektroforezę

Przeglądaj więcej filmów