Name: Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę analizy nienaruszonych białek powyżej 100 kDa za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Technika ta oferuje wysoką tolerancję na zanieczyszczenia i umożliwia precyzyjne oznaczanie mas dużych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Christophe'owi Masselonowi (iRTV, CEA, Grenoble) oraz członkom Grupy ds. Infekcji Wirusowych i Raka w IBS, za ich krytyczną ocenę manuskryptu i za użyteczne dyskusje. Jesteśmy wdzięczni Cyrilowi Dianowi za miły dar w postaci białka Crm1. Prace naukowe odbyły się w zakładzie spektrometrii mas w Grenoble Instruct Centre (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Projekt był wspierany finansowo przez Francuską Inicjatywę Infrastruktury na rzecz Zintegrowanej Biologii Strukturalnej (FRISBI, ANR-10-INSB-05-02), GRAL (ANR-10-LABX-49-01) [w ramach Grenoble Partnership for Structural Biology] oraz przez Francuskie Narodowe Centrum Badań Naukowych (CNRS).

1. Przygotowanie próbki białka: Wymiana buforu (opcjonalnie)
5-25 μl mikromolowych stężeń białka (1 do 20 μM) jest konieczne. Wymianę buforową można przeprowadzić za pomocą odśrodkowych urządzeń ultrafiltracyjnych (np. Vivaspin, Sartorius) lub kolumn filtracyjnych w żelu do mikrowirówek (np. kolumny chromatograficzne Micro Bio-Spin 6, Bio-Rad) 29,30. Kroki wymiany bufora można powtarzać 2-3 razy. Szczegółowy opis wymiany buforowej został wcześniej przedstawiony 29,30. Na przykład jako końcowy bufor wykorzystujemy 20 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu (tj. Tris) pH 8.
Uwaga: Ten krok można pominąć w wielu przypadkach. Należy ją przeprowadzić, gdy próbka białka zawiera cząsteczki lub, które mogą silnie zakłócać wykrywanie stwardnienia rozsianego [np. glicerol; kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy, HEPES]. Jest to również przydatne do poprawy jakości widm.
2. Rekrystalizacja matryc w celu poprawy ich czystości (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Wlać 10 ml 40% etanolu (EtOH) do kolby Pyrex.</li>
	<li>Dodać 600 mg matrycy.</li>
	<li>Używając łaźni wodnej i grzałki oporowej, ogrzej roztwór matrycy i mieszaj go aż do całkowitego rozpuszczenia matrycy za pomocą szklanego pręta lub mieszadła magnetycznego.</li>
	<li>Powtarzaj krok 2, aż uzyskasz nasycony roztwór.</li>
</ol>
Uwaga: Użycie zbyt dużej objętości rozpuszczalnika lub rozpuszczenie matrycy znacznie poniżej temperatury wrzenia roztworu spowoduje niską wydajność kryształów lub brak kryształów w ogóle.
<ol start="5">
	<li>Pozwól roztworowi powoli ostygnąć. Możesz pozostawić go w temperaturze pokojowej na kilka godzin, a następnie w temperaturze 4 °C na noc. Uwaga: jeśli kryształy nie są uformowane, krystalizację można wywołać poprzez zadrapanie wnętrza zlewki (tuż pod powierzchnią roztworu) za pomocą szklanego pręta mieszającego.</li>
	<li>Zbierz kryształy matrycy przez filtrację.</li>
	<li>Przepłucz kryształy minimalną ilością lodowatego rozpuszczalnika i przefiltruj je.</li>
	<li>Pozostaw kryształy do wyschnięcia. Na tym etapie możesz użyć próżni.</li>
</ol>
3. Czyszczenie tarczy ze stali nierdzewnej MALDI
<ol>
	<li>Opłucz płytkę MALDI metanolem (MeOH) i delikatnie przetrzyj chusteczką czyszczącą przeznaczoną specjalnie do zastosowań laboratoryjnych (np. Kimwipe).</li>
	<li>Opłucz cel za pomocąH2Oi przetrzyj go chusteczką czyszczącą.</li>
	<li>Włożyć płytkę MALDI do zlewki o pojemności 600 ml i zalać ją 50% EtOH.</li>
	<li>Sonikować cel w roztworze EtOH przez 10 minut w kąpieli ultradźwiękowej.</li>
	<li>Jeśli na płytce pozostały resztki, powtórz kroki 1-4 jeszcze raz.</li>
	<li>Na koniec opłucz tarczę MeOH (lub wodą, patrz uwaga poniżej), przechyl ją w taki sposób, aby cały płyn zebrał się na chusteczce czyszczącej. Pozostaw obiekt do wyschnięcia w temperaturze pokojowej lub przy użyciu przepływu azotu i gazu.</li>
</ol>
Uwaga: Podobna procedura została wcześniej opisana 15.
Uwaga: Rozpuszczalnik (MeOH lub woda) użyty do ostatniego płukania celu określa niektóre cechy celu. Jeśli tarcza zostanie przepłukana MeOH, próbka rozprowadza się na tarczy znacznie bardziej niż przy użyciu wody.
4. Roztwór cienkowarstwowy α-CHCA: Przygotowanie i osadzanie na tarczy MALDI
<ol>
	<li>Rozpuść α-CHCA w acetonie, aby uzyskać nasycony roztwór.</li>
	<li>Ręcznie (bez pipety) zanurzyć końcówkę o pojemności 10 μl (np. GELoader Tip, Eppendorf) w roztworze nasyconym α-CHCA: niewielka ilość roztworu spłynie do końcówki (ze względu na kapilarność).</li>
	<li>Dotknąć bardzo szybko (tj. 1 sekundę) tarczy MALDI końcówką pipety i nanieść roztwór acetonu α-CHCA na tarczę MALDI. Będzie to stanowić cienką warstwę matrycy, w której zostanie zdeponowana próbka białka. Spróbuj wygenerować cienką warstwę tak małą, jak to możliwe.</li>
</ol>
Uwaga: Używając SA jako matrycy, przygotowujemy cienką warstwę za pomocą nasyconego roztworu SA w acetonie.
5. Przygotowanie roztworów matrycowych: SA, α-CHCA, DHB i mieszaniny CHCA_DHB 25
<ol>
	<li>Przygotować roztwór SA o stężeniu 20 mg/ml w ACN, 0,1% TFA (70:30 obj.</li>
	<li>Przygotować 20 mg/ml roztworu α-CHCA w ACN i 5% kwasie mrówkowym (70:30 obj./obj.) [o nazwie "roztwór α-CHCA"].</li>
	<li>Przygotować roztwór DHB o stężeniu 20 mg/ml w ACN i 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA) (70:30 obj. / obj.) [o nazwie "roztwór DHB"].</li>
	<li>Zmieszać "roztwór α-CHCA" i "roztwór DHB" w stosunku 1:1 (obj. / obj.), aby otrzymać "CHCA_DHB roztwór".</li>
</ol>
Uwaga: Można mieszać "roztwór α-CHCA" i "roztwór DHB" w różnych proporcjach, analizując białka o masie mniejszej niż 100 kDa. Na przykład stosunek 40:60 między α-CHCA a DHB (vol/vol) daje lepszą rozdzielczość, ale mniejszą czułość (patrz dyskusja).
6. Osadzanie próbki na tarczy MALDI
<ol>
	<li>Osadzać 0,5 μl próbki białka na wcześniej przygotowanej cienkiej warstwie α-CHCA. Bezpośrednio po tym dodać 0,5 μl roztworu matrycy (tj. roztworu SA lub roztworu α-CHCA lub "mieszanki CHCA_DHB"). Oznacza to zmieszanie próbki i matrycy na tarczy.</li>
</ol>
Uwaga: Zazwyczaj miesza się próbkę białka z matrycą w stosunku 1:1. Stosunek ten ma kluczowe znaczenie dla dobrej jakości widm MALDI. Jeśli chcesz przetestować różne stężenia próbki, możesz użyć roztworu kwasu ACN_formic (opisanego powyżej) do rozcieńczenia próbki.
Uwaga: Jeśli wolisz, możesz wymieszać próbkę i matrycę w probówce, a następnie umieścić zmieszany "roztwór sample_matrix" na cienkiej warstwie.
Uwaga: Sugerujemy przetestowanie różnych stężeń próbki, ponieważ rozcieńczenie próbki pozwala na zmniejszenie interferencji zanieczyszczeń. Aby rozcieńczyć próbkę, można użyć roztworu kwasu ACN_formic (opisanego powyżej) w celu rozcieńczenia próbki.
7. Składanie Calibrant
<ol>
	<li>Wprowadzić 0,5 μl wzorca kalibru (np. "wzorzec białka II", Bruker Daltonics, Bremen), a następnie dodać 0,5 μl roztworu matrycy.</li>
</ol>
Uwaga: Załaduj kalibert na płytkę MALDI obok miejsc z próbkami białka (zobacz dyskusję).
8. Pobieranie próbek kalibrów i białek za pomocą widm MALDI
Po wysuszeniu próbek i kalibru, możesz obserwować "plamy" pod mikroskopem. Ta obserwacja jest opcjonalna i może być interesująca głównie dla nowicjuszy. Aby uzyskać widma próbki, należy wprowadzić tarczę do instrumentu MALDI-TOF i wybrać odpowiednie parametry instrumentu, które są różne dla każdego typu sprzętu. Aby uzyskać najbardziej odpowiednią konfigurację, należy postępować zgodnie z zaleceniami producenta. Ogólnie rzecz biorąc, podczas analizy nienaruszonych białek należy używać przyrządu w trybie liniowym (nie w trybie reflektorowym, który jest odpowiedni dla analiz peptydów). Zwykle używamy naszego instrumentu w trybie jonów dodatnich. Co więcej, kluczowym parametrem jest "pulsacyjna ekstrakcja jonów", która poprawia rozdzielczość instrumentalną 31. Mówiąc prościej, "pulsacyjną ekstrakcję jonów" można zdefiniować jako przerwę między generowaniem jonów próbki a czasem, w którym jony są przyspieszane w kierunku detektora. Do analizy nienaruszonych białek należy zastosować "pulsacyjną ekstrakcję jonów" (np. 500 nsec) większą niż przy obserwacji peptydów (np. 80 nsec).
Wybierz odpowiedni zakres m/z, uzyskaj widma kalibru i skalibruj instrument. Podczas uzyskiwania widm próbek należy użyć odpowiedniej intensywności lasera (patrz dyskusja).

<ol><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography+%3A+Principles%2C+Practice%2C+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science - Taylor & Francis Group. (2010).</li>
<li>Cohen, S. L., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+as+a+tool+for+protein+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics+and+biomolecular+structure%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry as a tool for protein crystallography.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).</li>
<li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry--a+useful+tool+for+the+protein+X-ray+crystallographer+and+NMR+spectroscopist%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry--a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist.</a> Structure. 2, 465-467 (1994).</li>
<li>Gans, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereospecific+isotopic+labeling+of+methyl+groups+for+NMR+spectroscopic+studies+of+high-molecular-weight+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).</li>
<li>Wilm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Principles of electrospray ionization.</a> Molecular & cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407(2011).</li>
<li>Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-plate%3A+extending+the+functionality+of+MALDI-MS+and+LDI-MS+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+spectrometry+reviews%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets.</a> Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).</li>
<li>De Hoffmann, E., Stroobant, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Hoffmann%2C+E+%22Mass+Spectrometry%3A+Principles+and+Applications%22">Mass Spectrometry: Principles and Applications</a>. , Wiley. (2007).</li>
<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10%2C000+daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Spengler, B., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+of+proteins+above+100%2C000+daltons+by+pulsed+ion+extraction+time-of-flight+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis.</a> Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+molecular+mass+determination+of+proteins+using+matrix-assisted+laser+desorption+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry.</a> Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).</li>
<li>Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+of+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers.</a> Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass-spectrometry+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins.</a> Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).</li>
<li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+increase+contaminant+tolerance+in+protein+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+by+the+fabrication+of+thin+protein-doped+polycrystalline+films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+detergent-friendly+method+for+mass+spectrometric+analysis+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins.</a> Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Fenyo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+sample+preparation%3A+the+ultra+thin+layer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">MALDI sample preparation: the ultra thin layer method.</a> J. Vis. Exp.. (3), e192(2007).</li>
<li>Gabant, G., Cadene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+full-length+integral+membrane+proteins+to+define+functionally+relevant+structural+features%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features.</a> Methods. 46, 54-61 (2008).</li>
<li>Hook, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+sequence+information+derived+by+partial+acid+hydrolysis+and+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+mass+spectrometry%22%5BJournal%5D)">Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cinnamic+acid+derivatives+as+matrices+for+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).</li>
<li>Madler, S., Boeri Erba,, E,, Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+Studying+Noncovalent+Complexes+of+Biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+current+chemistry%22%5BJournal%5D)">MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules.</a> Topics in current chemistry. , (2012).</li>
<li>Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+first+shot+phenomenon+in+MALDI+mass+spectrometry+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes.</a> The Analyst. 132, 199-207 (2007).</li>
<li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-assisted+Laser+Desorption+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry.</a> Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).</li>
<li>Liu, Z., Schey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+MALDI+TOF-TOF+mass+spectrometer+for+intact+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).</li>
<li>Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphite+supported+preparation+%28GSP%29+of+alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+%28CHCA%29+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+%28MALDI-MS%29+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).</li>
<li>Laugesen, S., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+two+matrices+results+in+improved+performance+of+MALDI+MS+for+peptide+mass+mapping+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).</li>
<li>Sparkman, D. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSparkman%2C+DO+%22Mass+Spectrometry+Desk+Reference%22">Mass Spectrometry Desk Reference</a>. , Global View Publishing. (2000).</li>
<li>Kussmann, M., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+techniques+for+peptides+and+proteins+analyzed+by+MALDI-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS.</a> Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).</li>
<li>Wang, R., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+mass+measurement+as+a+tool+for+studying+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins.</a> Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).</li>
<li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (40), e1954(2010).</li>
<li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nature protocols. 2, 715-726 (2007).</li>
<li>Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+extraction+matrix-assisted+laser+desorption+time-of-flight+massspectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiliśmy szczegółowy protokół pozyskiwania wysokiej jakości widm masowych dużych, nienaruszonych białek o masie cząsteczkowej większej niż 100 kDa, przy użyciu instrumentu MALDI-TOF. Należy dokładnie rozważyć szereg krytycznych aspektów dotyczących przygotowania próbki w celu poprawy jakości widm masowych. Matryce i rozpuszczalniki o wysokiej czystości mają kluczowe znaczenie, ponieważ wszystkie zanieczyszczenia obecne w matrycach i rozpuszczalnikach są skoncentrowane na tarczy MALDI po odparowaniu rozpuszczalnika. W celu zwiększenia czystości matryc MALDI możliwe jest ich oczyszczenie przy użyciu klasycznych metod rekrystalizacji (patrz wyżej). Zalecamy również świeże przygotowanie roztworów matryc (co najmniej raz w tygodniu) w celu poprawy krystalizacji matrycy i uniknięcia degradacji matrycy.
Podejście oparte na osadzaniu matrycy ma kluczowe znaczenie dla końcowej jakości widm. Jak opisano powyżej, metoda cienkowarstwowa jest naszą metodą z wyboru 12. Ponadto zoptymalizowaliśmy podejście do nakładania pierwszej warstwy. Gdy matryca jest rozpuszczona w acetonie w celu uzyskania nasyconego roztworu, propanon umożliwia szybkie odparowanie rozpuszczalnika, ale także sprawia, że wielkość pierwszej warstwy jest bardzo trudna do kontrolowania. Sugerujemy użycie końcówki GELoader jako małego pędzla, który zanurzasz w roztworze matrix_acetone, aby uzyskać minimalną objętość, którą szybko osadzasz na celu. Wielkość pierwszej warstwy w jakiś sposób kontroluje ostateczny rozmiar plamki MALDI: preferowana jest mała plamka (tj. 0,5-0,75 mm średnicy), ponieważ w tym przypadku stężenie próbki jest wyższe niż w przypadku dużej plamki. Uzyskanie małej plamki różni się od podejścia ultracienkiej warstwy zaproponowanego wcześniej w filmie JoVE 15. W Fenyo i wsp. cienkowarstwowy roztwór rozprowadza się po całej tarczy MALDI za pomocą boku końcówki pipety. Podejście to wymaga zbadania cienkiej warstwy, która powinna spełniać określone kryteria (np. szybkość parowania rozpuszczalnika). Jeśli kryterium nie jest spełnione, wzorzec MALDI należy umyć i przygotować nową cienką warstwę. To sprawia, że przygotowanie jest dość pracochłonne dla nowicjusza. Ponadto osadzanie mieszaniny próbka/matryca na płytce wymaga zasysania nadmiaru rozpuszczalnika za pomocą linii próżniowej i konieczny jest etap płukania przy użyciu TFA15 , co sprawia, że przygotowanie Fenyo i wsp. jest nieco trudniejsze niż nasze podejście.
Stosunek objętości między matrycą a próbką jest bardzo ważny dla pomyślnej analizy nienaruszonych białek za pomocą MALDI-TOF. Po przetestowaniu różnych proporcji sugerujemy użycie współczynnika 1:1. Inna proporcja matryca do próbki może pogorszyć jakość widm, prawdopodobnie z powodu niejednorodnej krystalizacji. Kolejność, w jakiej matryca i próbka są osadzane, ma również kluczowe znaczenie. Po nałożeniu cienkiej warstwy matrycy próbka jest osadzana i bezpośrednio po tym (zanim plamka próbki wyschnie) dodaje się CHCA_DHB mieszaninę. Procedura ta została zdefiniowana jako "metoda warstwowa" 27, w której sama próbka jest umieszczana między dwiema warstwami matrycy. Alternatywnie, roztwór CHCA_DHB i próbkę można zmieszać w probówce o pojemności 0,5 ml, a następnie nakrapić na cienkiej warstwie CHCA 12. W ten sposób powstaje plamka z jednorodną warstwą kryształów, co skutkuje wysokiej jakości widmami. Podczas analizy białek o masie mniejszej niż 100 kDa stężenie DHB może być zwiększone (np. 60:40 DHB:CHCA); Może to spowodować ostrzejsze pikowanie, ale może pogorszyć czułość pomiaru (tj. mniej intensywne piki).
W celu prawidłowej kalibracji przyrządu konieczne jest umieszczenie wzorców kalibru bardzo blisko miejsc pobierania próbek, co pozwala na uzyskanie lepszej dokładności masy. Wcześniej sugerowano "pseudo-wewnętrzną procedurę kalibracji" 15: po uzyskaniu widma próbki, punkt kalibru jest wystrzeliwany laserowo, a sygnał kalibru jest dodawany do widma próbki. Pozwala to na wewnętrzną kalibrację widma próbki przy użyciu pików kalibru.
Energia lasera powinna być również dokładnie kontrolowana podczas akwizycji widm. W większości przypadków wyższa energia zwiększa czułość, ale obniża rozdzielczość. Sugerujemy użycie jak najmniejszej energii lasera bez uszczerbku dla czułości akwizycji. Ponadto, aby poprawić jakość spektralną, można uzyskać więcej ujęć w każdym miejscu próbki. Zwykle im więcej ujęć (1,000-2,000 zdjęć), tym większa intensywność sygnału. Uderzając laserem w miejsce, należy znaleźć właściwą pozycję (tj. "sweet spot"), ponieważ próbka nie jest równomiernie rozprowadzona. Możesz strzelać w ten sam obszar, aż sygnał będzie się zwiększał, a następnie spróbować znaleźć inny obszar zawierający próbkę.
Podsumowując, wysoka czystość matryc i rozpuszczalników, metody stosowane do osadzania próbek i matryc na tarczy, położenie wzorców użytych do kalibracji, intensywność energii lasera, czas akwizycji (liczba strzałów/plamkę) są krytycznymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę podczas analizy nienaruszonych białek metodą MALDI-TOF MS.
Wkład autora
L.S. i E.B.E. zaprojektowali eksperymenty, przeprowadzili eksperymenty ze spektrometrią mas, przeanalizowali dane i napisali manuskrypt.

Biologia strukturalna opiera się na produkcji wysokiej jakości białek 1 i dlatego musi być połączona z wydajnymi i niezawodnymi technikami analizy białek 2,3. W naszym laboratorium spektrometrii mas (MS) w Instytucie Biologii Strukturalnej musimy potwierdzić pierwotną sekwencję białek, ocenić obecność mutacji i modyfikacji potranslacyjnych, degradację białek, jednorodność próbki oraz jakość znakowania izotopowego (np. białka deuterowane do badań magnetycznego rezonansu jądrowego4). Ponieważ biolodzy strukturalni używają ograniczonej proteolizy do odróżniania strukturalnie sztywnych domen od elastycznych części, musimy wiarygodnie scharakteryzować takie skrócone białka za pomocą MS.
Gdy biomolekuły są analizowane przez MS, stosuje się dwa możliwe podejścia do miękkiej jonizacji takich ciężkich i labilnych molekuł. Jonizacja elektronrozpylacyjna (ESI) jonizuje cząsteczki bezpośrednio z fazy ciekłej 5; Jonizacja desorpcji laserowej wspomagana matrycą (MALDI) wymaga, aby biomolekuły były współkrystalizowane z cząsteczkami organicznymi absorbującymi promieniowanie ultrafioletowe (tj. cząsteczkami matrycy) 6.
ESI time-of-flight (TOF) MS w połączeniu z chromatografią cieczową stała się rutynową techniką analizy nienaruszonych białek, ponieważ pozwala na określenie masy z dużą dokładnością (≤ 50 ppm). Jest jednak dość podatny na skład buforu próbki (w szczególności na sole i detergenty) oraz na zanieczyszczenia (tj. polimery), które czasami są trudne do wyeliminowania, powodując tłumienie sygnału analitu.
MALDI-TOF MS stanowi skuteczną alternatywę dla ESI-MS, ponieważ na jego wydajność w mniejszym stopniu wpływają składniki buforowe, detergenty i zanieczyszczenia, a pozwala na określenie nienaruszonej masy białka z wystarczającą dokładnością (≤ 500 ppm) do walidacji sekwencji. Po trawieniu białek, MALDI-TOF MS może być również wykorzystany do analizy otrzymanych peptydów w celu dalszego potwierdzenia sekwencji pierwotnej poprzez tzw. "odcisk palca masy peptydowej".
W naszych rękach określanie masy nienaruszonych białek, które są większe niż 100 kDa i niejednorodne (z powodu modyfikacji lub obcięć), jest łatwiejsze przez MALDI-MS niż przez ESI-MS. Wynika to z braku nakładających się na siebie rozkładów stanów ładunku obecnych w widmach ESI. Ponadto, ponieważ proces MALDI nie jest zależny od wielkości analitu7, taka metoda daje wysoką czułość, gdy masa biomolekuły przekracza 100 kDa. Niezwykłe analizy nienaruszonych białek przeprowadzono przy użyciu domowych przyrządów między końcem lat 80-tych a początkiem lat 90-tych.
MALDI-TOF może być również używany jako narzędzie przesiewowe do oceny jakości próbek białek, ponieważ wymaga mniej czasu na przygotowanie próbki i jest mniej podatny na zakłócenia spowodowane powszechnymi zanieczyszczeniami (np. solami). Po pierwszej, szybkiej ocenie przez MALDI-MS, próbka może być dalej analizowana przez ESI-TOF w celu określenia jej masy z większą dokładnością. Co więcej, MALDI generuje jony zawierające mniej ładunków niż ESI, a zatem pozyskiwanie i interpretowanie danych MALDI jest prostsze. Dzięki temu studenci zajmujący się biologią strukturalną mogą analizować swoje rekombinowane białka tuż po krótkim szkoleniu.
Dwa kluczowe czynniki wpływają na jakość widm MALDI: matryca i technika użyta do osadzania matrycy (np. wysuszona kropla 8 i cienka warstwa 12-16,17,18). Pojedyncza matryca organiczna [np. kwas sinapinowy (SA) 19-21 lub kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy (α-CHCA) 14,22,23] jest często stosowana do badania MS nienaruszonych białek i usieciowanych kompleksów białkowych. Korzystając z α-CHCA, grupa Chait przedstawiła wcześniej szczegółowy protokół przygotowania ultracienkiej warstwy przed analizą MALDI białek rozpuszczalnych i błonowych14,15. Niedawno Gorka i in. zilustrowali powłokę docelową na bazie grafitu, aby poprawić analizę MALDI peptydów i białek przy użyciu α-CHCA jako matrycy24.
Tutaj prezentujemy prosty protokół analizy nienaruszonych białek przez MALDI-TOF MS, wykorzystujący mieszaninę dwóch matryc: kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB) i α-CHCA 25. Systematycznie ocenialiśmy wydajność mieszanki DHB-CHCA w porównaniu z matrycami SA i α-CHCA, w celu kontroli nienaruszonych białek. Mieszanina matryc pozwala na lepszą rozdzielczość (tj. piki białka są znacznie ostrzejsze). Co więcej, obecność intensywnych jonów o wielu ładunkach (tj. M+2H2+, M+3H3+, itp.) umożliwia dokładniejsze określenie masy, ponieważ rozdzielczość osiowych instrumentów MALDI-TOF jest wyższa przy niższej masie nad ładunkiem (m/z) 26. Jest to szczególnie przydatne do oznaczania masy cząsteczkowej białek większych niż 100 kDa.
Wyższa czułość jest również osiągana przy użyciu mieszaniny DHB-CHCA (0,5 pmoli białka zauważone na tarczy MALDI).
Jak wspomnieliśmy powyżej, ważnym czynnikiem, który powinien być brany pod uwagę podczas korzystania z instrumentu MALDI, jest osadzanie matrycy. Laugesen i wsp. zaproponowali po raz pierwszy zastosowanie mieszaniny DHB-CHCA 25 z wykorzystaniem osadzania się wysuszonych kropel. Lepsze wyniki (np. znacznie wyższa czułość) zaobserwowaliśmy jednak, gdy zastosowaliśmy metodę cienkiej warstwy, w której pierwszą warstwę tworzy α-CHCA rozpuszczony w acetonie. Metoda cienkowarstwowa 12,27 implikuje tworzenie się jednorodnego podłoża kryształów matrycy na tarczy MALDI, co zostało opisane w filmie JoVE wcześniej 15. Następnie próbka jest osadzana na tym podłożu, a na końcu osadza się dodatkową matrycę (patrz poniżej). W tym artykule ilustrujemy również, jak zdeponować próbkę na tarczy MALDI, ale także jak oczyścić tarczę15, dokonać rekrystalizacji i przygotować matryce.
Podsumowując, naszym celem jest dostarczenie wszystkich niezbędnych informacji do analizy nienaruszonych białek naukowcom (w szczególności biologom strukturalnym), którzy muszą ocenić jakość produkowanych białek w szybki i prosty sposób, a którzy nie są tak zaznajomieni z MALDI-TOF MS. Zgodnie z przewidywaniami z połowy lat dziewięćdziesiątych XX wieku, stwardnienie rozsiane wywarło większy wpływ na badania biologiczne, ponieważ zwiększyła się jego dostępność dla biologów. Mamy nadzieję, że przekazane przez nas informacje okażą się przydatne w udostępnieniu MALDI-TOF biologom i naukowcom, którzy chcieliby rozpocząć korzystanie ze spektrometrii mas.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Trizma chlorowodorek</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizima</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin 6 kolumny chromatograficzne</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6221</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500</td><td>Sartorius</td><td>VS0122</td><td>odcięcie</td></tr><tr><td>metanolu</td><td>o</td> <td>różnej masie cząsteczkowej14262</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fluka</td><td>02860</td><td></td></tr><tr><td>KIMTECH SCIENCE Chusteczki precyzyjne Wycieraczki do tkanek</td><td>Kimberly Clark</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-kwas cyjano-4-hydroksycynamonowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy</td><td>Fluka</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>GELoader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>0030 001.222</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fluka</td><td>09676</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Protein Standard II</td><td>Bruker Daltonics</td><td>207234</td><td>Zawiera trypsynogen, białko A, albuminę surowicy-immunoglobulinę bydlęcą </td></tr><tr><td>G</td><td>ABSciex</td><td>GEN602151</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Oczyszczacz wody PURELAB Ultra Analytic</td><td>ELGA LabWater</td><td>89204-052</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex MALDI-TOF</td> instrument <td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF celownik</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (maldi-tof) analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kda

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Skuteczne określanie mas białek jest kluczowe dla wielu badań biologicznych (np. dla badań biologii strukturalnej). Dokładne określenie masy pozwala ocenić poprawność pierwszorzędowych sekwencji białek, obecność mutacji i/lub modyfikacji potranslacyjnych, możliwą degradację białka, jednorodność próbki oraz stopień włączenia izotopu w przypadku znakowania (np. znakowanie 13C).
Spektrometria mas (MS) jonizacji elektrorozpylaniem (ESI) jest szeroko stosowana do oznaczania masy zdenaturowanych białek, ale na jej efektywność wpływa skład bufora próbki. W szczególności obecność soli, detergentów i zanieczyszczeń poważnie osłabia skuteczność analizy białek za pomocą ESI-MS. Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) MS jest atrakcyjną alternatywą ze względu na tolerancję na sól oraz prostotę pozyskiwania i interpretacji danych. Co więcej, oznaczanie masy dużych białek heterogenicznych (większych niż 100 kDa) jest łatwiejsze za pomocą MALDI-MS ze względu na brak nakładających się na siebie rozkładów wysokiego stanu naładowania, które są obecne w widmach ESI.
Tutaj prezentujemy przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-czasu przelotu (TOF). Ilustrujemy zalety stosowania mieszaniny dwóch matryc (tj. kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego i kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego) oraz użyteczność metody cienkowarstwowej jako podejścia do osadzania próbki. Omówiono również krytyczną rolę czystości matrycy i rozpuszczalnika, wzorców stosowanych do kalibracji, energii lasera oraz czasu akwizycji. Ogólnie rzecz biorąc, dostarczamy informacji niezbędnych nowicjuszowi do analizy nienaruszonych białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Przeanalizowano nienaruszone białko (białko Crm1, utrzymujące region chromosomowy; masa cząsteczkowa: 123 386 Da), stosując dwie różne matryce, dwie metody nanoszenia i tę samą intensywność lasera (Rycina 1). Jako matryce wykorzystano SA oraz mieszaninę CHCA_DHB. Mieszanina ta pozwoliła na uzyskanie widm mas o wyższej jakości pod względem stosunku sygnału do szumu oraz czułości (Ryciny 1A i B). W szczególności możliwe było wykrycie 0,5 pmoli białka naniesionego na tarczę MALDI (Rycina 1C). Taka sama ilość białka była ledwie wykrywalna przy użyciu SA (Rycina 1D). Ponadto, przy zastosowaniu mieszaniny matryc, preferowaną metodą nanoszenia matrycy było podejście „cienka warstwa” (Rycina 1A). Stosując metodę „wysychającej kropli”, nie wykryto żadnego białka o masie przekraczającej 100 kDa (dane nie pokazano). Dzięki zastosowaniu mieszaniny CHCA_DHB (Ryciny 1A i 1C) zaobserwowano wielokrotnie naładowane jony białka, co pozwoliło na oznaczenie masy z większą dokładnością, ponieważ rozdzielczość piku w instrumentach MALDI-TOF w układzie osiowym jest odwrotnie proporcjonalna do m/z26.
Przeanalizowano również monomerową beta-galaktozydazę (116 300 Da) (Rycina 2). Widma CHCA_DHB charakteryzowały się lepszą czułością i rozdzielczością niż widma SA. Ponadto obecność jonów wielokrotnie naładowanych (M2+, M3+ i M4+) pozwoliła na potwierdzenie masy białka z większą dokładnością (Ryciny 2A i 2C). Wykorzystując metodę cienkiej warstwy, porównano efektywność mieszaniny CHCA_DHB, SA oraz samego α-CHCA w analizie immunoglobuliny IgG (148 500 Da) (Rycina 3). Po korelacji różnych danych stwierdzono, że sygnały białek były silniejsze i charakteryzowały się lepszą rozdzielczością w widmach CHCA_DHB. Podsumowując, zastosowanie mieszaniny CHCA_DHB oraz metody nanoszenia cienkiej warstwy wykazało znaczną poprawę jakości widm mas dużych, nienaruszonych białek uzyskanych przy użyciu instrumentu MALDI-TOF.
<img alt="Wykres spektrometrii mas; widma m/z; detekcja jonizacji białek; analiza intensywności piku." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Analiza MALDI-TOF nienaruszonego białka Chromosome region maintenance 1 (Crm1), masa cząsteczkowa: 123 386 Da. A) Przeanalizowano 1 pmole Crm1 z użyciem mieszaniny DHB_CHCA jako matrycy. B) ilość: 1 pmole; matryca: SA. C) ilość: 0,5 pmole; matryca: DHB_CHCA. D) ilość: 0,5 pmole; matryca: SA. Sygnał pików, wyrażony w dowolnej jednostce intensywności, został znormalizowany do wartości maksymalnej obecnej w każdym widmie.
<img alt="Wyniki spektrometrii mas; widma m/z, jonizacja białek; wykresy pokazują wiele stanów ładunku." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Analiza MALDI-TOF nienaruszonej beta-galaktozydazy (116 300 Da). A) ilość: 20 pmoli; macierz DHB_CHCA. B) ilość: 20 pmoli; macierz: SA. C) ilość: 5 pmoli; macierz: DHB_CHCA. D) ilość: 5 pmoli; macierz: SA.
<img alt="Wykres analizy spektrometrii masowej; piki jonów molekularnych; charakterystyka białka; macierz CHCA." fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza MALDI-TOF nienaruszonej immunoglobuliny, IgG (148 500 Da); ilość: 1,7 pmoles. Widma uzyskane przy użyciu mieszaniny CHCA_DHB były znacznie bardziej intensywne (maksimum: 8 200 jednostek arbitralnych, au) niż widma SA (maksimum: 1 200 au) i widma α-CHCA (maksimum: 4 500 au).

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest czuła analiza nienaruszonych białek o masie powyżej 100 kilodaltonów za pomocą spektrometrii mas MALDI. Jest to realizowane poprzez przygotowanie roztworów matrycy, a w kolejnym kroku poprzez naniesienie cienkiej warstwy roztworu na płytkę docelową.Następnie próbkę oraz mieszaninę macierzy nanosi się na tarczę. Ostatnim krokiem jest obserwacja plamek z próbką pod mikroskopem. W końcowej fazie wykorzystuje się spektrometr masowy MALDI-TOF do analizy nienaruszonych białek i zapisu widm masowych.Główną zaletą spektrometrii mas MALDI w porównaniu z innymi metodami analitycznymi, takimi jak jonizacja rozpylna, jest większa tolerancja na sole, zanieczyszczenia i detergenty. Inną zaletą MALDI jest generowanie jonów o mniejszej liczbie ładunków w porównaniu z jonizacją rozpylną. Dzięki temu pozyskiwanie i interpretacja danych MALDI jest dość proste.Aby rozpocząć krystalizację, wlej 10 ml 40% etanolu do kolby Pyrex. Następnie dodaj 600 mg matrycy, korzystając z łaźni wodnej i grzałki rezystancyjnej. Podgrzewaj roztwór matrycy i mieszaj go do czasu całkowitego rozpuszczenia matrycy.Powtarzać poprzednie kroki do momentu nasycenia roztworu. Pozostawić roztwór do powolnego ochłodzenia w temperaturze pokojowej przez kilka godzin, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Jeśli kryształy nie powstaną, należy zadrapać wnętrze zlewki tuż poniżej powierzchni roztworu za pomocą szklanej bagietki, aby zaindukować krystalizację.Na koniec zebrać kryształy matrycy poprzez filtrację. Pozostałe w kolbie kryształy przepłukać minimalną ilością lodowatego rozpuszczalnika i przefiltrować. Po zakończeniu filtracji pozostawić kryształy do wyschnięcia, aby oczyścić płytkę docelową MALDI.Przepłucz go metanolem i delikatnie wytrzyj chusteczką Kimwipe. Następnie przepłucz go wodą i wytrzyj chusteczką Kimwipe. Umieść płytkę docelową MALDI w zlewce o pojemności 600 ml i zalej 50% etanolem.Następnie poddaj próbkę sonikacji w roztworze etanolu przez 10 minut w kąpieli ultradźwiękowej. Jeśli na płytce pozostaną osady, powtórz poprzednie kroki. Przepłucz próbkę metanolem lub wodą; zastosowany rozpuszczalnik determinuje stopień rozprzestrzeniania się próbki.Następnie przechyl próbkę tak, aby cały płyn został zebrany za pomocą chusteczki Kim wipe. Osusz próbkę, kierując na nią strumień gazu azotowego. W kolejnym kroku rozpuść alpha CHCA w acetonie.Aby przygotować roztwór nasycony, zanurz końcówkę pipety 10 µL w nasyconym roztworze alpha CHCA, tak aby do końcówki wpłynęła niewielka ilość roztworu. Szybko dotknij tarczy MALDI końcówką pipety, aby nanieść roztwór alpha CHCA na tarczę MALDI, używając plastikowej probówki 1,5 mL. Przygotuj roztwór alpha CHCA o stężeniu 20 mg/mL, rozpuszczając alpha CHCA w acetonitrylu i 5% kwasie mrówkowym w stosunku objętości 7:3; oznacz roztwór jako roztwór alpha CHCA.Następnie należy przygotować roztwór DHB o stężeniu 20 mg/mL poprzez rozpuszczenie DHB w mieszaninie acetonitrylu i 0,1% kwasu trifluorooctowego w stosunku objętościowym 7:3, a następnie oznaczyć go jako roztwór DHB. Wymieszać roztwór alfa-CHCA i roztwór DHB w stosunku objętościowym 1:1. Aby uzyskać roztwór C-H-C-A-D-H-B przed rozpoczęciem tej procedury, opcjonalnym krokiem jest oczyszczenie próbek białek poprzez wymianę buforu, zgodnie z opisaną w literaturze metodą.W przeciwnym razie należy nanieść nieoczyszczoną próbkę białka na płytkę MALDI. Następnie nanieś 0,5 µL próbki białka na przygotowaną cienką warstwę alpha CHCA. Bezpośrednio po tym dodaj 0,5 µL roztworu C-H-C-A-D-H-B.Nanieś 0,5 µL standardu Cain na płytkę MALDI, a następnie dodaj 0,5 µL roztworu matrycy. Po wyschnięciu próbek i standardu Cain można obejrzeć plamki pod mikroskopem, włożyć płytkę do urządzenia i wybrać odpowiednią konfigurację instrumentu. Następnie wybierz odpowiedni zakres stosunku masy do ładunku.Należy zarejestrować widma wzorca i skalibrować instrument, używając odpowiedniej intensywności lasera. Następnie należy zarejestrować widma próbek białek. Przedstawiono tutaj analizę MALDI-TOF nienaruszonego regionu chromosomu Maintenance one protein.Mieszanina C-H-C-A-D-H-B pozwoliła na uzyskanie widm mas o wyższej jakości pod względem stosunku sygnału do szumu oraz czułości. W szczególności można było wykryć 0,5 picomoli białka naniesionego na tarczę MALDI, podczas gdy ta sama ilość białka była ledwo wykrywalna przy użyciu kwasu sinapowego. Stosując mieszaninę C-H-C-A-D-H-B, zaobserwowano wielokrotnie naładowane jony białka, co umożliwiło wyznaczenie masy z większą dokładnością, ponieważ w przypadku instrumentu axial multi TOF rozdzielczość piku jest odwrotnie proporcjonalna do stosunku masy do ładunku. Ponadto, przy użyciu mieszaniny C-H-C-A-D-H-B, preferowaną przez nas metodą nanoszenia matrycy była metoda cienkiej warstwy.Stosując metodę wysuszonej kropli, nie wykryto białek o masie powyżej 100 kilodaltonów. Analizie za pomocą multi TOF poddano również monomerowe białko beta-kolektany. Widma C-H-C-A-D-H-B charakteryzowały się lepszą czułością i rozdzielczością niż widma SINO NIC acid.Ponadto obecność jonów wielokrotnie naładowanych umożliwiła potwierdzenie masy białka z większą dokładnością. Przedstawiono tutaj analizę nienaruszonej immunoglobuliny metodą MALDI. Widma uzyskane przy użyciu mieszaniny C-H-C-A-D-H-B były znacznie bardziej intensywne niż widma dla SA i alfa CHCA.Bardziej szczegółowo, sygnały białek były silniejsze i charakteryzowały się lepszą rozdzielczością w widmach C-H-C-A-D-H-B. Zastosowanie mieszaniny C-H-C-A-D-H-B oraz metody osadzania cienkiej warstwy wykazało znaczną poprawę jakości analizy dużych, nienaruszonych białek. Widma masowe uzyskano przy użyciu instrumentu MALDI to.Przedstawiony protokół ilustruje sposób uzyskiwania wysokiej jakości widm masowych białek o wysokiej masie cząsteczkowej przy użyciu instrumentu typu multi. Podczas przeprowadzania tego rodzaju analizy istotne są trzy kwestie. Po pierwsze, należy użyć świeżo przygotowanego roztworu wzorcowego.Po drugie, aby prawidłowo nanieść próbkę na cel Mali. I po trzecie, aby zastosować odpowiednie ustawienia aparatury, takie jak intensywność lasera.

matrix-assisted-laser-desorptionionization-time-flight-maldi-tof-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Analiza spektrometrii masowej z czasem przelotu przy użyciu laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej przez matrycę (MALDI-TOF) dla całych białek o masie większej niż 100 kDa

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-on) został wcześniej zgłoszony jako matryca MALDI do obrazowania tkanek małych cząsteczek; protokoły użycia DT do obrazowania MALDI endogennych lipidów na powierzchni skrawków tkanek za pomocą dodatniego jonu MALDI-MS na ultrawysokiej rozdzielczości instrument kwadrupol-FTICR są dostępne tutaj.

Dithranol jako matryca do obrazowania desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą na spektrometrze mas z cyklotronem z transformacją Fouriera

Źródło obrazowania spektrometrią mas (MSI) działające pod ciśnieniem atmosferycznym zostało opracowane przez sprzężenie desorpcji laserowej w średniej podczerwieni i post-jonizacji elektrorozpylania. Egzogenna matryca lodowa została wykorzystana jako matryca pochłaniająca energię, aby ułatwić rezonansową desorpcję materiału związanego z tkanką. Ten manuskrypt zawiera protokół krok po kroku do wykonywania IR-MALDESI MSI u noworodków całego ciała.

Obrazowanie spektrometrii mas całego ciała za pomocą jonizacji elektronatryskowej z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI)

Opisano protokół charakterystyki polimerów syntetycznych wspomaganej matrycowo desorpcji laserowej, czasu jonizacji spektrometrii mas lotu (MALDI-TOF MS), w tym optymalizacji przygotowania próbek, akwizycji widma i analizy danych.

Charakterystyka polimerów syntetycznych za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF)

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Powłoka ssaków zawiera lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, które mogą dostarczyć składu chemicznego charakterystycznego dla poszczególnych gatunków.  W pracy przedstawiono rutynową metodę rozdzielania szerokich klas lipidów izolowanych z tkanek powłokowych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i oznaczania profilu triacyloglicerydów za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą.

Profilowanie zawartości triacyloglicerydów w lipidach powłokowych nietoperzy za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej i spektrometrii mas MALDI-TOF

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Pokazano protokół charakteryzujący skład chemiczny wydychanego powietrza w czasie rzeczywistym za pomocą wtórnej jonizacji nanoelectrospray sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Analiza oddechu w czasie rzeczywistym przy użyciu wtórnej jonizacji nanoelektronizacyjnej sprzężonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości

Pokazano protokół wzmacniania sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas MALDI poprzez reformowanie struktur krystalicznych podczas procesów przygotowywania próbek.

Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Poznaj metodę analizy nienaruszonych białek powyżej 100 kDa za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Technika ta oferuje wysoką tolerancję na zanieczyszczenia i umożliwia precyzyjne oznaczanie mas dużych cząsteczek.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa (Wideo) | JoVE Journal

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Przeglądaj więcej filmów