Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Ogólnym celem tej procedury jest analiza nienaruszonych białek większych niż 100 kilodaltonów w czuły sposób za pomocą spektrometrii mas maldi. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie roztworów matrycowych. Drugim krokiem jest nałożenie cienkiej warstwy roztworu na cel.

Następnie próbka i mieszanina matryc są osadzane na tarczy. Ostatnim krokiem jest obserwacja miejsc pobierania próbek pod mikroskopem. Ostatecznie spektrometr wielomasowy służy do analizy nienaruszonych białek i rejestrowania widm masowych.

Główną zaletą spektrometrii mas maldi w porównaniu z innymi podejściami analitycznymi, takimi jak jonizacja elektronatryskowa, jest to, że jest ona bardziej tolerancyjna na sól, zanieczyszczenia i detergenty. Kolejną zaletą maldi jest to, że generuje jony przenoszące mniej ładunków w porównaniu do elektrorozpylania. Dlatego pozyskiwanie i interpretowanie danych MDI jest dość proste.

Aby rozpocząć krystalizację rech, wlej 10 mililitrów 40% etanolu do kolejki Pyrex. Następnie przy 600 miligramach matrycy za pomocą łaźni wodnej i grzałki oporowej. Ogrzej roztwór matrycy i mieszaj go, aż matryca całkowicie się rozpuści.

Powtarzaj poprzednie kroki, aż roztwór zostanie nasycony. Pozostaw roztwór do powolnego ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez kilka godzin, a następnie przechowuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jeśli kryształy nie powstaną, należy podrapać wnętrze zlewki tuż pod powierzchnią roztworu, używając szklanego pręta do wywołania krystalizacji.

Na koniec zbierz kryształy matrycy przez filtrację. Przepłukać pozostałe kryształy w kolbie minimalną ilością lodowatego rozpuszczalnika i przefiltrować je. Po zakończeniu filtracji pozwól kryształom wyschnąć, aby wyczyścić płytkę docelową maldi.

Opłucz go metanolem i delikatnie przetrzyj chusteczką kim. Następnie spłucz go wodą i wytrzyj chusteczką kim. Włóż tarczę maldi do 600-mililitrowej zlewki i przykryj ją 50% etanolem.

Następnie sonikować cel w roztworze etanolu przez 10 minut w łaźni ultradźwiękowej. Jeśli na płytce pozostały pozostałości powtórzyć poprzednie kroki. Przepłukać cel metanolem lub wodą, użyty rozpuszczalnik, określa stopień rozprzestrzeniania się próbki.

Następnie przechyl cel tak, aby cały płyn zebrał się na chusteczce Kim. Osusz cel za pomocą przepływu azotu gazowego. W kolejnym kroku rozpuść alfa CHCA w acetonie.

Aby uzyskać nasycony roztwór, zanurz końcówkę pipety o pojemności 10 mikrolitrów w roztworze nasyconym alfa CHCA, tak aby niewielka ilość roztworu spłynęła do końcówki. Szybko dotknij tarczy maldi końcówką pipety, aby nanieść roztwór alfa CHCA na tarczę maldi za pomocą plastikowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Przygotować roztwór alfa CHCA o stężeniu 20 miligramów na mililitr, rozpuszczając alfa CHCA w stosunku siedmiu do trzech objętości acetonitrylu i 5% kwasu mrówkowego, oznaczony jako roztwór alfa CHCA.

Następnie przygotuj roztwór DHB o stężeniu 20 miligramów na mililitr, rozpuszczając DHB w stosunku objętościowym nitrylu acetylu do 0,1% kwasu trifluorooctowego, oznaczonym jako roztwór DHB. Zmieszać roztwór alfa CHCA i roztwór DHB w stosunku objętościowym jeden do jednego. Aby otrzymać roztwór C-H-C-A-D-H-B przed rozpoczęciem tej procedury, opcjonalnym krokiem jest oczyszczenie próbek białka przez wymianę buforu pokazaną w wymienionym piśmiennictwie.

W przeciwnym razie należy zdeponować nieoczyszczoną próbkę białka na tarczy MALDI. Następnie nałóż 0,5 mikrolitra próbki białka na przygotowaną cienką warstwę alfa CHCA. Natychmiast po tym dodaj 0,5 mikrolitra roztworu C-H-C-A-D-H-B.

Umieść 0,5 mikrolitra wzorca Cain na płytce MALDI, a następnie dodaj 0,5 mikrolitra roztworu matrycy. Po wysuszeniu próbek i kainy można obserwować plamki pod mikroskopem, włożyć tarczę do instrumentu i wybrać odpowiednią konfigurację instrumentu. Następnie wybierz odpowiedni zakres stosunku masy do ładunku.

Zdobądź widma ca i skalibruj instrument przy użyciu odpowiedniej intensywności lasera. Pozyskać widma próbek białek. Analiza MALDI toff nienaruszonego regionu chromosomu Utrzymanie jednego białka jest pokazana tutaj.

Mieszanina C-H-C-A-D-H-B uzyskała widma masowe o wyższej jakości pod względem stosunku sygnału do szumu i czułości. W szczególności można było wykryć 0,5 pikomoli białka zdeponowanego na tarczy MALDI, podczas gdy ta sama ilość białka była ledwo wykrywalna Przy użyciu kwasu SINO NIC wykorzystującego mieszaninę C-H-C-A-D-H-B zaobserwowano wielokrotnie naładowane jony białka, co pozwoliło na określenie masy z większą dokładnością, ponieważ rozdzielczość piku jest odwrotnie proporcjonalna do stosunku ładunku głównego w przypadku osiowego instrumentu wielofunkcyjnego. Ponadto, przy użyciu mieszaniny C-H-C-A-D-H-B, naszą metodą z wyboru do osadzania matrycy było podejście cienkowarstwowe.

Metodą suszonych kropelek nie wykryto białek o masie większej niż 100 kilodaltonów. Monomeryczne białko beta collect aase było również analizowane za pomocą multi tof. Widma C-H-C-A-D-H-B były lepsze niż widma kwasu SINO NIC pod względem czułości i rozdzielczości.

Co więcej, obecność wielokrotnie naładowanych jonów umożliwiła potwierdzenie masy białka z większą dokładnością. MALDI do analizy nienaruszonej immunoglobuliny pokazano tutaj. Widma uzyskane za pomocą mieszaniny C-H-C-A-D-H-B były znacznie intensywniejsze niż widma SA i alfa CHCA.

Mówiąc dokładniej, sygnały białkowe były wyższe i miały lepszą rozdzielczość w widmach C-H-C-A-D-H-B. Zastosowanie mieszaniny C-H-C-A-D-H-B i metody osadzania cienkowarstwowego wykazało znaczną poprawę jakości dużego, nienaruszonego białka. Widma masy uzyskane za pomocą MALDI do instrumentacji.

Przedstawiony protokół ilustruje, w jaki sposób można uzyskać wysokiej jakości widma masowe białek o dużej masie cząsteczkowej za pomocą wielu instrumentów. Podczas przeprowadzania tego typu analizy ważne są trzy rzeczy. Po pierwsze, aby użyć świeżo przygotowanego rozwiązania do pomiaru metrycznego.

Po drugie, aby prawidłowo zdeponować próbkę na docelowym obszarze Mali. I po trzecie, należy użyć odpowiednich ustawień instrumentalnych, takich jak intensywność lasera.