Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie analizy genetycznej chlamydia tritus poprzez zastosowanie mutagenezy chemicznej i określenie powiązań między genotypem a fenotypem. Cel ten jest realizowany najpierw poprzez generowanie szczepów mutantów chlamydia tracom przy użyciu mutagenezy chemicznej. Następnie wszystkie mutacje wywołane chemicznie są identyfikowane za pomocą sekwencjonowania całego genomu, a następnie przeprowadzany jest montaż genomu z wykorzystaniem sekwencji referencyjnej.

Następnie identyfikowane są powiązania fenotypowo-genotypowe w szczepach mutantów. W końcowym etapie powiązania fenotypowo-genotypowe potwierdza się poprzez generowanie szczepów rekombinowanych i ich analizę. W rezultacie, dzięki połączeniu klasycznych metod chemogenetycznej mutagenezy oraz sekwencjonowania nowej generacji (NGS), można uzyskać wyniki wykazujące, że mutacja w konkretnym genie chlamydii prowadzi do pożądanego fenotypu.

Obecnie nie istnieją dostępne metody wymiany genów u chlamydii, a narzędzia genetyki molekularnej służące do jej badania są w fazie początkowej. Niniejsza metoda nie wymaga transformacji rekombinowanym DNA ani opracowania narzędzi genetyki molekularnej, a mimo to pozwala osiągnąć ten sam cel, jakim jest przypisanie funkcji poszczególnym produktom genów.

Aby przygotować hodowlę komórkową, należy wysiać około 1 × 10⁶ komórek linii vir na 25 cm² w 3 ml DMEM uzupełnionego o 10% FBS i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂. Gdy komórki osiągną konfluencję, około 24 godziny później, należy odessać medium i zainfekować komórki chlamydiami przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5. Całość należy przygotować w objętości 3 ml DMEM-FBS zawierającego 200 ng/ml cykloheksymidu. Aby rozpocząć mutogenezę w 18 godzinie po infekcji, należy przygotować pod wyciągiem chemicznym roztwór etylometanosulfonianu (EMS) o stężeniu 20 mg/ml w PBS z dodatkiem chlorku wapnia i chlorku magnezu.

EMS jest silnym mutagenem i kancerogenem. W związku z tym należy zapoznać się z protokołem tekstowym dotyczącym jego utylizacji. Odessać medium z komórek Vero i wypłukać je raz trzymili litrami PBS z chlorkiem magnezu i chlorkiem wapnia.

Następnie dodać 3 ml roztworu EMS i inkubować przez jedną godzinę w dygestorium w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć EMS i umieścić próbkę w pojemniku z 1 M wodorotlenkiem sodu, aby dezaktywować mutagen, a następnie przemyć komórki trzykrotnie w celu usunięcia pozostałości EMS. Następnie dodać 6 ml DMEM z 10% FBS, 200 ng/ml cykloheksymidy oraz 25 µg/ml gentamycyny i inkubować w 37 °C przy 5% CO2 przez 48 do 72 godzin.

Włączenia wydają się być pozbawione bakterii około 36 godzin po mutagenezie przy 72 godzinach. Około 10% włączeń jest wypełnionych bakteriami, podczas gdy pozostałe pozostają puste; aby wyekstrahować ciałka elementarne (EB), poprzez lizę hipotoniczną całkowicie odessać medium. Dodać 1 ml wody i inkubować w ruchu kołyszącym przez 10 minut, aby odłączyć komórki, a następnie przeprowadzić lizę komórek poprzez co najmniej 10-krotne pipetowanie.

Po zebraniu lizatu do probówki do wirówki mikrocentryfużowej, dodać 0,25 ml pięciokrotnego buforu sacharozowo-fosforanowo-glutaminianowego (SPG), aby uzyskać stężenie końcowe 1x, i przechowywać w temperaturze -80 °C. Przygotować konfluentne monowarstwy komórek VES w płytkach 6-dołkowych, wysiewając około 0,4 × 10⁶ komórek w 3 ml DMEM z 10% FBS na dołek; pozostawić komórki na 24 godziny w celu utworzenia jednorodnej monowarstwy. Następnie schłodzić na lodzie roztwór stokowy mutagena chlamydia.

Następnie przygotuj sześć probówek z dziesięciokrotnym rozcieńczeniem seryjnym w całkowitej objętości 200 µL na każde rozcieńczenie w DMEM z 10% FBS i umieść je w lodzie. Użyj 3 mL PBS na każdą studzienkę, aby dwukrotnie przemyć komórki Vero. Następnie dodaj 3 mL DMEM do każdej studzienki w płytkach 6-dołkowych oraz 100 µL rozcieńczenia bakterii w dwóch powtórzeniach.

Zawirować płytkę, aby zapewnić równomierne wymieszanie. Wirować zainfekowane płytki z prędkością 2 700 g przez 30 minut w temperaturze 15 °C. Następnie inkubować je w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżeniem i 5% CO2 przez jedną do dwóch godzin.

W międzyczasie przygotuj 0,54% AROS w DMEM, najpierw łącząc następujące składniki i mieszając je. Następnie dodaj 18,9 mililitrów gorącego, sterylnego 1,2% AROS w wodzie, mieszając w celu zapobiegania powstawaniu grudek. Przechowuj mieszaninę w cieple w kąpieli wodnej o temperaturze 55°C.

Odsuń zawiesinę bakteryjną z szalek i dodaj sześć mililitrów ciepłego roztworu aro. Pozostaw do całkowitego zastygnięcia w temperaturze pokojowej poza dygestorium. Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza po zdjęciu pokrywek, susz płytki przez dodatkowe 15 minut. Po wyschnięciu płytek inkubuj je w temperaturze 37 °C w inkubatorze z CO2 przez okres od siedmiu do 10 dni.

Plamki powinny być widoczne przy użyciu mikroskopu stereoskopowego na jeden dzień przed izolacją mutantów. Wysiej 10⁴ komórek w 100 µL na dołek. W płytce 96-dołkowej komórki osiągną konfluencję w ciągu 24 godzin.

Pod mikroskopem stereoskopowym zaznacz plaki do pobrania, a następnie za pomocą sterylnej pipety z filtrem o objętości 1 ml pobierz wycinki plaków. Resuspenduj plakki w 100 µl DMEM uzupełnionego o 10% FBS, 400 ng/ml cykloheksymidy oraz 50 µg/ml gentamycyny w celu namnożenia szczepów mutantów, a następnie nanieś zawiesinę na konfluentne monowarstwy komórek Vero.

Wiruj płytki przy 2 700 g i 15 °C przez 30 minut przed inkubacją i pobraniem materiału, gdy ponad 50% komórek zostanie zainfekowanych, co może nastąpić już 48 godzin po infekcji lub najpóźniej po 14 dniach. Taka liczba zainfekowanych komórek pozwala na zgromadzenie wystarczającej ilości żywych bakterii do ekstrakcji EV poprzez lizę hipotoniczną zainfekowanych komórek. Po odessaniu medium dodaj 160 µL sterylnej wody i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Aby rozbić komórki i zapewnić całkowity lizat, należy kilkukrotnie pipetować zawiesinę w górę i w dół, używając końcówek z filtrem. Następnie należy przenieść 160 µL każdego lizatu do probówek do wirówki mikrocentryfugi. Dodać 40 µL pięciokrotnego XSPG i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy i przesiewania mutantów pod kątem interesujących fenotypów.

Ekspozycja na mutagen prowadzi do powstania inkluzji, które wydają się pozbawione bakterii, prawdopodobnie z powodu śmierci komórek bakteryjnych. Zazwyczaj serowar LGVL two całkowicie lize zakażone komórki w ciągu 48 godzin po zakażeniu, lecz traktowanie mutagenami może wydłużyć ten cykl do ponad 90 godzin, a w naszych eksperymentach oczekuje się, że około 10% inkluzji ulegnie regeneracji. Zakażone komórki Vero traktowane 20 mg/mL EMS doprowadziły do 99% spadku odzyskiwalności zakaźnego potomstwa w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną, co przedstawiono na tej rycinie.

Traktowanie mutagenem doprowadziło również do pojawienia się plam o zmienionej morfologii, w tym plam małych. Inne morfologie obejmują plamy o wyglądzie ziarnistym, grudkowatym lub w kształcie plastra miodu, jak pokazano tutaj. Dawki EMS zastosowane w tych badaniach mogą prowadzić do powstania od trzech do 30 mutacji na genom KCL, co zostało ocenione eksperymentalnie za pomocą NGS.

Chociaż EBS oczyszczone w gradiencie są w dużej mierze wolne od materiału komórek gospodarza, wykrywane jest również DNA gospodarza, które stanowi około 10 do 15% preparatów genomicznych otrzymanych po zastosowaniu tej procedury. Można przeprowadzić badania w kierunku fenotypów takich jak upośledzona replikacja w hodowlach tkankowych, utrata aktywności biochemicznej lub zmiana morfologii bakteryjnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład jakie czynniki bakteryjne są wymagane do formowania i utrzymania czynników patogennych chlamydii.