Modele i metody oceny transportu systemów dostarczania leków przez bariery komórkowe

Ogólnym celem tej procedury jest ocena transportu systemu dostarczania leku lub czynnika terapeutycznego. Jest on przenoszony przez barierę komórkową, taką jak model nabłonka przewodu pokarmowego, istotny dla doustnego podawania leków. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie hodowlę komórek Caco-2 na wkładkach Transwell, aby umożliwić różnicowanie komórek i utworzenie monowarstwy komórkowej.

Drugim krokiem jest potwierdzenie, że model ten stanowi barierę przepuszczalności, poprzez pomiar transepitelialnej oporności elektrycznej, barwienie immunocytochemiczne połączeń międzykomórkowych oraz ocenę pasywnej przepuszczalności wykrywalnej cząsteczki znacznika. Następnym krokiem jest przygotowanie systemu dostarczania leku; w tym przykładzie wykorzystano celowane polimerowe nanonośniki. Nośniki mogą zawierać ładunek leku lub nie, a w badaniu należy uwzględnić grupy kontrolne, takie jak nośniki niecelowane lub wolny lek.

Elementy te są znakowane radioizotopami w celu umożliwienia ich detekcji. Następnie, po inkubacji, nośniki są dodawane do komory apikalnej znajdującej się nad monowarstwą komórek. W różnych punktach czasowych nośniki są pobierane z komory apikalnej, komory basolateralnej oraz monowarstwy komórek, a następnie poddawane badaniu pod kątem potencjalnej degradacji znakowanego komponentu.

Na koniec oblicza się transport nanonośników przez monowarstwę komórkową, aby zbadać mechanizm transportu. Podobne eksperymenty należy przeprowadzić w obecności farmakologicznych inhibitorów transcytozy przez komórki lub z użyciem markerów transportu parakomórkowego między komórkami. Opisana tutaj technika jest adaptacją uznanych metod stosowanych do oceny szybkości i mechanizmu transportu leków oraz nanonośników leków przez monowarstwy komórkowe in vitro, które stanowią model barier komórkowych w organizmie.

Choć przykład, na którym się tutaj skupiliśmy, potwierdza transport ukierunkowanych nanocząsteczek polimerowych przez model nabłonka przewodu pokarmowego, podobne metody można zastosować do badania przenikania różnych systemów dostarczania leków przez te lub inne monowarstwy komórkowe, takie jak komórki śródbłonka, które zazwyczaj tworzą barierę między krwiobiegiem a tkankami i organami, na przykład w przypadku bariery krew-mózg. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności związane z doborem odpowiednich znaczników do prawidłowego śledzenia systemów dostarczania leków w tych badaniach, zwłaszcza jeśli są one transportowane przez komórki w niewielkich ilościach.

W tym aspekcie wykorzystamy radioizotopy do znakowania systemów dostarczania leków w naszych badaniach; kolejną istotną kwestią jest walidacja szczelności bariery komórkowej modelu oraz zastosowanie odpowiednich kontroli w celu potwierdzenia tego w trakcie eksperymentów. Procedurę tę przeprowadza się w sterylnej komorze do hodowli komórek o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, a wszystkie materiały wprowadzane do komory muszą zostać wysterylizowane etanolem; za pomocą pęsety należy umieścić wkładki Transwell z politereftalanu etylenu o porach 0,8 µm w płytce 24-dołkowej, aby uzyskać statystycznie istotne wyniki.

Każdy warunek eksperymentalny wymaga minimum czterech powtórzeń. Rozcieńczyć komórki ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego (human epithelial colorectal adenocarcinoma) lub komórki Caco-2 w uprzednio przygotowanym medium hodowlanym. Przenieść od 200 do 400 µL zawiesiny komórek do górnej lub apikalnej komory transwellu.

Wysiać komórki z gęstością 1,5 × 10⁵ komórek na centymetr kwadratowy. Wypełnić dolną komorę (bazolateralną) od 700 do 900 µL pożywki hodowlanej i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 95% wilgotności przez 16 do 21 dni, wymieniając pożywkę w komorach górnej i dolnej co trzy do czterech dni.

Wymień medium w następującej kolejności, aby utrzymać ciśnienie nad monowarstwą komórek: odessaj medium z komory dolnej, a następnie odessaj medium z komory górnej. Napełnij komorę górną od 200 do 400 µL świeżego medium i napełnij komorę dolną od 700 do 900 µL świeżego medium, aby zweryfikować barierę przepuszczalności nabłonka za pomocą TEER. Ustaw woltomierz na pomiar rezystancji i umieść pionowo elektrody w studzience zawierającej wkładkę Transwell.

Krótka elektroda powinna znajdować się w górnej komorze, a długa elektroda w dolnej komorze, dotykając dna studni. Po ustabilizowaniu się odczytu woltomierza należy zapisać wartość oporu w omach dla każdej studni. Pomiary powtarzamy co jeden do dwóch dni, aż wartości wzrosną do maksimum i osiągną plateau, co wskazuje na utworzenie bariery przepuszczalności; proces ten trwa zazwyczaj od dwóch do trzech tygodni od momentu wysiania komórek.

Aby zweryfikować obecność połączeń ścisłych w monowarstwach komórkowych w pierwszej kolejności, należy utrwalić komórki, odessać medium z obu komór i przemyć komórki trzy razy ciepłym DMEM, a następnie inkubować z zimnym 2%paraform aldehyde przez 15 minut. Po 15 minutach należy usunąć paraform aldehyde i przemyć komórki trzy razy PBS. Następnie do każdej z nich należy dodać jeden mikrogram per mililitr przeciwciała anty-okludyna.

Do kontroli negatywnej tworzenia bariery wykorzystamy studzienki z niskim stopniem uszkodzeń. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach ponownie przemyć komórki PBS, a następnie do każdej studzienki dodać znakowane przeciwciała wtórne w stężeniu 7,5 µg/mL i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Na koniec przemyć komórki PBS, ostrożnie wyciąć membranę filtracyjną, do której przytwierdzona jest utrwalona monowarstwa, i zamontować ją na szkiełkach przedmiotowych w celu obrazowania z użyciem mikroskopii epi-fluorescencyjnej lub konfokalnej.

Procedurę rozpoczyna się od znakowania przeciwciała celującego jodem 1 25 oraz obliczenia aktywności właściwej znakowanego przeciwciała w liczbach impulsów na minutę na mikrogram, zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami. W tym przykładzie przeciwciałem celującym jest mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej cząsteczce adhezji międzykomórkowej 1 lub anty-ICAM 1, w celu kontroli swoistości. Mysie IgG znakowane jodem 1 25 zostanie wykorzystane do przygotowania niecelowanych nanonośników z powłoką w celu zbadania transportu ładunku terapeutycznego.

Ładunek jest również znakowany jodem 125. W tym przykładzie ładunkiem jest alfa-galaktozozydaza A lub Alpha G, enzym terapeutyczny stosowany w leczeniu choroby Fabry, genetycznej choroby spichrzeniowej lizosomalnej. Jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest zapewnienie odpowiedniej detekcji transportowanych materiałów.

Aby zapewnić sukces, komponenty nanonośników muszą zostać znakowane odpowiednią ilością izotopów o wysokiej aktywności właściwej. Kolejnym krokiem jest sprzęgnięcie znakowanego przeciwciała anty-ICAM z powierzchnią nanonośników. W tym przypadku po prostu mieszamy znakowane jodkiem 125 przeciwciało anty-ICAM z polistyrenowymi nanikułkami o średnicy 100 nanometrów, które służą jako model dla kontroli nieswoistej.

Do śledzenia transportu ładunku należy użyć IgG znakowanego jodem 1 25 oraz kombinacji przeciwciał anty-ICAM i Alpha G znakowanego jodem 1 25. Mieszaniny należy inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić adsorpcję powierzchniową; po godzinie odwiruj próbki przy 13 000 g przez trzy minuty, a następnie usuń niepowlekane odpowiedniki z supernatantu za pomocą pipety aspiracyjnej. Osad zawierający powlekane nanonośniki należy zawiesić w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS, a następnie poddać sonikacji przy niskiej mocy, aby rozbić ewentualne agregaty cząsteczek. Do górnej komory nad konfluentnymi monowarstwami komórek Caco-2 z wysokim mianem należy dodać nanonośniki anty-ICAM znakowane jodem 1 25. Po pomiarze miana należy powtórzyć procedurę dla odpowiedników nieswoistych i terapeutycznych.

Inkubować w temperaturze 37 °C przez jeden lub więcej wybranych przedziałów czasowych. Po inkubacji ponownie zmierzyć oporność. Pomiary oporności służą do oceny wpływu nanonośników na barierę przepuszczalności.

Należy zebrać medium z komory górnej i dolnej. Komorę górną należy przemyć 0,5 milliliters DMEM w temperaturze 37 degrees Celsius, a komorę dolną jednym milliliter dejonizowanej wody. Roztwory z płukania należy zebrać w celu pomiaru całkowitej zawartości radioizotopu za pomocą licznika gamma do oznaczenia frakcji komórkowej.

Wytnij przepuszczalny filtr, używając żyletki do przecięcia go wzdłuż krawędzi. Inkubuj go w probówce do licznika gamma w 1% Triton X 100 przez 10 minut, aby uwolnić zawartość komórek przed pomiarem całkowitej radioaktywności związanej z komórkami, co pozwoli określić ilość jodu 1 25 uwolnionego z nanonośników podczas transportu lub w wyniku potencjalnej degradacji. Najpierw zmieszaj 300 µL każdej próbki z 700 µL 3% BSA w PBS oraz 200 µL kwasu trójchlorooctowego (TCA), a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Podczas tej 15 minutowej inkubacji zmierz całkowitą radioaktywność próbek w liczniku gamma; odwiruj próbki w TCA przy 3000 GS przez pięć minut, aby oddzielić nienaruszone białko od białka zdegradowanego lub frakcji jodu 1 25. Ilościowo określ radioaktywność frakcji wolnego jodu 1 25 i odejmij tę wartość od całkowitej radioaktywności zmierzonej przed wirowaniem. Pozwoli to określić ilość znakowanego białka w stosunku do frakcji radiotracera, który się od niego oddzielił. Aby ocenić transport parakomórkowy przy użyciu wycieku parakomórkowego albuminy, hoduj monowarstwy KCO dwa na wkładkach transwell, zgodnie z wcześniejszą metodą; do górnej komory, do medium nad monowarstwą komórek, dodaj albo samą albuminę znakowaną jodkiem 1 25 jako kontrolę negatywną wykazującą podstawowy poziom wycieku, albo jod.

Albumina znakowana 1 25 oraz przeciwciało nieznakowane radioaktywnie. Celowane nanonośniki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez wybrane odstępy czasu, które powinny być zgodne z tymi badanymi podczas testowania nz.Transport. Pomiar łez należy przeprowadzić, zgodnie z wcześniejszą instrukcją, przed, w trakcie i po inkubacji.

Po inkubacji należy zebrać wszystkie frakcje w celu pomiaru całkowitej zawartości jodu 1 25 oraz wolnego jodu 1 25 jako kontroli pozytywnej dla otwarcia połączeń międzykomórkowych. Do komory górnej i dolnej transwellu należy dodać pożywkę komórkową zawierającą 5 mM nadtlenku wodoru. Następnie należy włożyć próbkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Zmierz oporność elektryczną (TEER) i dodaj jodo-125-albuminę do górnej komory na wybranych odstępach czasu. Pomiarem TEER w różnych punktach czasowych w trakcie inkubacji określ spadek wartości oporności spowodowany otwarciem połączeń międzykomórkowych indukowanym przez nadtlenek wodoru. W równoległych eksperymentach oceń transport transkomórkowy lub transcytozę nanonośników celowanych jodo-125 poprzez inkubację konfluencyjnych monowarstw Caco 2 z każdym z tych inhibitorów.

50 µM MDC, inhibitor endocytozy zależnej od klatryny. 1 µg/mL filipiny, inhibitor endocytozy zależnej od klatryny. 0,5 µM Wortmannina, inhibitor kinazy 3-fosfatydyloinozytolowej, która bierze udział w makropinocytozie, oraz 20 µM EIPA.

Inhibitor makropinocytozy oraz endocytozy zależnej od chemicznych mediatorów; pomiar TEER przed, w trakcie i po inkubacji komórek z inhibitorami oraz materiałami znakowanymi izotopowo jako dodatkowa kontrola wpływu inhibitorów na przepuszczalność monowarstwy w celu walidacji monowarstw Caco-2 jako modelu transepitelialnego transportu ukierunkowanych nanonośników. Komórki Caco-2 hodowano na wkładkach Transwell w zagęszczeniu 1,5 × 10⁵ komórek na cm², a w celu oceny integralności monowarstwy mierzono transepitelialny opór elektryczny (TEER). Jak pokazano na tym wykresie, monowarstwa osiągnęła konfluencję w 12. dniu i zachowała integralność do 18. dnia. Wynik ten został dodatkowo potwierdzony obecnością dodatnich pod względem okludyny połączeń ścisłych w monowarstwach o wysokim TEER wynoszącym 380 Ω/cm² w 14. dniu, w porównaniu do słabego znakowania połączeń ścisłych przy niskim TEER wynoszącym 17 Ω/cm². W piątym dniu, w celu oceny transportu nanonośników anty-ICAM przez monowarstwy komórek Caco-2, konfluentne monowarstwy Caco-2 hodowane na wkładkach Transwell inkubowano z nanonośnikami anty-ICAM znakowanymi jodem 125, które dodano do komory apikalnej.

Zawartość jodku ¹²⁵ w komorze boczno-podstawnej mierzono w indicated punktach czasowych, aby obliczyć liczbę nanonośników transportowanych na komórkę, co przedstawiono na górnym panelu. Na dolnym panelu obliczono procent transportowanych nanonośników jako stosunek liczby nośników znalezionych w frakcji boczno-podstawnej do liczby nośników w połączonych frakcjach boczno-podstawnej i komórkowej. Parametry te, oszacowane w niniejszym przykładzie dla nanonośników przeciw-ICAM znakowanych jodkiem ¹²⁵, porównano również z parametrami kontrolnych nanonośników IgG znakowanych jodkiem ¹²⁵, aby wykazać wydajność transportu w stosunku do odpowiednika nietargetowanego; wyniki przedstawiono na górnym panelu.

Obliczono również pozorne współczynniki przepuszczalności odzwierciedlające szybkość transportu nanonośników anty-ICAM z jodkiem 125 lub nanonośników IgG z jodkiem 125, jak pokazano na dolnym panelu, gdy znacznik radioaktywny jest włączony w ładunek nanonośnika. Opisane parametry odzwierciedlają transport ładunku, którym w tym przykładzie jest enzym alfa-GAL stosowany w leczeniu genetycznej choroby spichrzeniowej znanej jako choroba Fabry'ego. Zawartość radioizotopu w frakcjach apikalnej, bazolateralnej i komórkowej zmierzono po 3 godzinach oraz 24 godzinach i przeliczono na różne wartości istotne dla transportu, jak przedstawiono w tej tabeli.

Oprócz obliczania transportu nanonośników poprzez śledzenie ładunku, dostarczanie tego enzymu terapeutycznego przez nabłonek można oszacować, wyrażając go jako liczbę cząsteczek lub pikogramów przetransportowanego Alpha-gal na komórkę. Zbadano również mechanizm transportu nanonośników anty-ICAM przez monowarstwy Caco-2. Transport transcelularny nanonośników anty-ICAM znakowanych jodem 125 przez konfluentne monowarstwy Caco-2 oceniano po 24 godzinach w obecności lub przy braku następujących inhibitorów: EIPA, filipiny, MDC lub wortmaniny. EIPA jest inhibitorem makropinocytozy i endocytozy zależnej od kawern. Filipina, MDC i wortmanina są odpowiednio inhibitorami endocytozy zależnej od klatryny, endocytozy zależnej od klatryny oraz makropinocytozy.

Jak pokazano na tym wykresie, EIPA zmniejszył transport nanonośników anty-ICAM znakowanych jodem 125 przez monowarstwy komórek Caco-2. Natomiast filipina MDC i wortmanina nie obniżyły poziomów transportu w stosunku do warunków kontrolnych. Sugeruje to, że nanonośniki anty-ICAM wykorzystują endocytozę zależną od kaweoliny w transporcie transkomórkowym, a nie transcytozę zależną od klatryny lub makropinocytozę.

Aby ocenić transport parakomórkowy, zmierzono oporność elektryczną transcelularną (TEER) podczas transportu nanonośników jodku $^{125}\text{I}$ przeciwko ICAM przez dwuwarstwy komórek Caco-2. Wartości TEER w nieobecności nanonośników przedstawiono jako kontrole, a przerywany przedział oznacza SEM średniej. Inkubacja z $5\text{ mM}$ nadtlenkiem wodoru służyła jako kontrola pozytywna otwarcia połączeń międzykomórkowych, co odzwierciedla spadek TEER do poziomów podstawowych.

Dodatkowo zmierzono i obliczono przeciek białek przez połączenia międzykomórkowe, określony jako pozorny współczynnik przepuszczalności jodyny 1 25 oraz albuminy przez monowarstwę komórkową w obecności lub przy braku 5 mM nadtlenku wodoru, nanonośników IgG lub nanonośników anty-ICAM. Nadtlenek wodoru wyraźnie zwiększył przeciek jodyny 1 25 i albuminy do komory podstawno-bocznej, pełniąc funkcję kontroli pozytywnej, co przedstawiono na tych wykresach. Inkubacja z nanonośnikami anty-ICAM nie zmieniła przecieku międzykomórkowego jodyny 1 25 i albuminy w okresie 48 godzin, podobnie jak w przypadku kontrolnych nanonośników IgG, które nie są transportowane.

Wyniki te wykluczają transport parakomórkowy i są zgodne z poprzednimi rezultatami sugerującymi, że nanonośniki anty-ICAM wykorzystują endocytozę zależną od ICAM do transportu transkomórkowego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest wybranie jednego lub kilku odpowiednich typów komórek oraz przepuszczalnego filtra o właściwej wielkości porów, średnicy materiału itp. dla modelu Transwell, a także technik znakowania w celu skutecznej kwantyfikacji systemu dostarczania leku po zakończeniu procedury. Do określenia lokalizacji transportowanych materiałów, a ponadto do sprawdzenia ich stanu, można wykorzystać inne metody, takie jak fluorescencja lub transmisyjna mikroskopia elektronowa.

Metodę Western blot można wykorzystać do pomiaru degradacji białek. Metodę EISA można zastosować do określenia zdolności celowania transportowanych nośników, natomiast aktywność ładunku leku można zmierzyć za pomocą testów spektrofotometrycznych lub innych odpowiednich technik.