Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego

Ogólnym celem tej procedury jest zwiększenie przeżywalności i różnicowania nerwowych komórek macierzystych przeszczepionych do zmian w poważnie uszkodzonym rdzeniu kręgowym u szczurów. Osiąga się to poprzez najpierw wykonanie uszkodzenia rdzenia kręgowego, takiego jak przecięcie T 3, z nienaruszoną większością opony twardej, z wyjątkiem małego otworu do zatrzymywania przeszczepionych komórek. Drugim etapem procedury jest pobranie świeżo zdysocjowanych nerwowych komórek macierzystych z embrionalnego płodu szczura w 14. dniu leczenia.

Trzecim krokiem jest zawieszenie nerwowych komórek macierzystych przez Resus w każdym składniku matryc fibrynowych zawierających koktajle czynników wzrostu. Ostatnim krokiem jest przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w matrycach fibrynowych i czynnikach wzrostu do centrum zmian podostrych, mikroskopia immunofluorescencyjna transfekowanych i przeszczepionych rdzeni kręgowych. Po siedmiu tygodniach od przeszczepu może wykazać doskonałe przeżycie nerwowych komórek macierzystych i ich różnicowanie się w dojrzałe neurony, które rozszerzają niezwykłą liczbę aksonów do gospodarza.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą, taką jak przeszczep komórki w pożywce do hodowli komórkowej lub PBS, jest to, że żel fibrynowy może zatrzymać komórki w centrum zmiany, a koktajl tłuszczu brutto może wspierać ich przetrwanie. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w to, jak neuronalne komórki macierzyste rosną i funkcjonują w uszkodzonym rdzeniu kręgowym u dorosłych, może być również stosowana do innych systemów, takich jak urazowe uszkodzenie mózgu. Rozpocznij procedurę transakcji od znieczulenia 150 do 200 gramów dorosłej kobiety rybaka, 3 44 szczurów lub 180 do 220 gramów atymicznych nagich szczurów przy użyciu akceptowalnych metod.

Poczekaj, aż zwierzęta zostaną głęboko znieczulone i nie będą reagować na szczypanie ogona i łapy. Następnie nałóż maść na oczy, ogol górną część klatki piersiowej i oczyść skórę Betadine. Rozpocznij operację od przecięcia skóry i mięśni za pomocą ostrza numer 15 odsłoniętego kręgu T trzy za pomocą retraktora chirurgicznego, a następnie za pomocą Wykonaj laminektomię na kręgu T trzy, aby odsłonić rdzeń kręgowy T trzy cztery.

Następnie wykonaj podłużne nacięcie linii środkowej o długości dwóch milimetrów w DRA za pomocą ostrza o numerze 11. Teraz umieść nożyczki do irydektomii pod Dorą i przetnij bocznie w poprzek całego prawego półkorda. Wykonaj kolejne cięcie po tej samej stronie, 1,5 milimetra więcej coly odessać tkankę rdzenia kręgowego między dwoma przeciętymi segmentami za pomocą igły o rozmiarze 23 podłączonej do podciśnienia o umiarkowanej intensywności.

Upewnij się, że przekrój jest zakończony zarówno brzusznie, jak i bocznie. Na tym kończy się boczny odcinek HEMI w celu rozszerzenia zmiany na całą szerokość rdzenia kręgowego. Przekrój umieszcza nacięcia lustrzane w lewym sznurze hemi.

Spróbuj utrzymać nienaruszoną oponę twardą w stanie nienaruszonym, aby zachowała mocną matrycę fibryny przeszczepu. Po przeszczepieniu dwa tygodnie później zszyj mięsień, nałóż antybiotyk w proszku i ustabilizuj skórę. Bezpośrednio po operacji.

Wstrzyknąć trzy mililitry dzwonków z mleczanami zawierającymi dawki ine i ampicyliny. Następnie trzymaj szczury w ciepłym inkubatorze, aż zostanie przywrócona regulacja termiczna. Przez następne dwa tygodnie, dwa razy dziennie, opróżniaj pęcherz i wstrzykuj dzwonki oraz roztwór ampicyliny.

Można to zatrzymać, gdy powróci odruch opróżniania pęcherza. Przygotować GFPF 3 44 samice szczurów z wstrzyknięciem DESI w celu zsynchronizowania pobierania zarodków i doprowadzenia ich do dojrzałości samców wykazujących ekspresję GFP w dniu pobrania i szczepienia zarodka. Przygotuj koktajle fibrynogenu i trombiny zawierające czynnik wzrostu i przechowuj je na lodzie, aż zostaną zmieszane z komórkami.

Zbierz zarodki w dniu od 13,5 do 14,5 po cotus w zimnym buforze HBSS. Zbadaj zarodki pod kątem ekspresji GFP za pomocą nocnej latarki morskiej i okularów filtrujących lub za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Teraz aseptycznie wypreparuj rdzeń kręgowy z każdego płodu z dodatnim wynikiem GFP.

Usuń leżące opony mózgowe i przymocuj zwoje kręgosłupa za pomocą nożyczek do irydektomii i kleszczy jubilerskich. Następnie zbierz wypreparowane rdzenie kręgowe do dwóch mililitrów zimnego buforu HBSS w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Trzymaj je na lodzie.

Następnie oddziel rdzeń kręgowy. Po zakończeniu policz komórki za pomocą hemocytometru i podziel je równo na dwie mikroprobówki wirówkowe. Odwirować komórki i całkowicie usunąć snat za pomocą końcówki o niskiej próżni w ciągu jednej do dwóch minut.

Koktajli czynników wzrostu nie należy rozcieńczać pozostałym supernatantem po reusie komórek. Teraz zawiesić każdą połówkę komórek w roztworze roboczym fibrynogenu lub trombiny zawierającym czynniki wzrostu w stężeniu 250 000 komórek na mikrolitr. Przechowuj komórki na lodzie przed przeszczepem.

Przeszczep należy rozpocząć od otwarcia zmiany w rdzeniu kręgowym T trzy cztery dwa tygodnie po transakcji rdzenia kręgowego. Aby uniknąć przedwczesnej ululacji, wymieszaj komórki w fibrynogenie. Następnie za pomocą wyciągniętych szklanych pipet podłączonych do piko spritzera.

Oddzielnie wstrzyknąć około pięciu mikrolitrów komórek fibrynogenu i pięciu mikrolitrów komórek trombinowych, a następnie do dziewięciu punktów miejsca zmiany przez uszczelnioną tkankę bliznowatą i nienaruszoną Dorę bez ponownego otwierania miejsca zmiany, aby wykonać bezpośrednie wstrzyknięcie komórek bez ponownego otwierania miejsca zmiany, użyj igły o rozmiarze 27, aby utworzyć dziewięć małych otworów na powierzchni tkanki bliznowatej i nienaruszonej Dory tydzień po zmianie, następnie wstrzyknąć połowę objętości zmieszanych roztworów fibrynogenu i trombiny do trzech środkowych punktów miejsca zmiany chorobowej i ćwierć objętości do trzech punktów na granicy rostralnej i interfejsu dorszowego szczepionego szczura NSCS zawieszonego w PBS bez matrycy fibrynowej i czynników wzrostu słabo przetrwało w miejscu przecięcia T trzy. Te komórki znakowane GFP przyczepiają się tylko do marginesu gospodarza zmiany i pozostawiają większość miejsca zmiany pustej, gdy komórki były współszczepiane tylko z matrycą fibrynową NSC, przeżycie poprawiło się, ale przeszczep nie wypełnił dużych jam zmianowych. Jednak osadzenie nsc szczurów w matrycach fibrynowych za pomocą koktajlu czynnika wzrostu konsekwentnie zwiększało ich przeżywalność, pozwalało im wypełniać duże jamy chorobowe i umożliwiało różnicowanie się w neurony i komórki glejowe.

Po przecięciu rdzenia kręgowego od 15 do 17 ten sam wynik uzyskano w przypadku ludzkich NSC, które również całkowicie wypełniły jamę chorobową. Po ocenie siedem tygodni po przeszczepieniu, badanie przebiegu czasowego wykazało, że NSCS wykazujący ekspresję GFP przetrwał 24 godziny po przeszczepie, przeszczepione NSCS stopniowo stawały się gęstsze i całkowicie wypełniły jamę zmiany w pierwszym tygodniu po przeszczepie, prawdopodobnie z powodu proliferacji. Ponadto przeszczepione NSCS dobrze integrują się na granicy faz zmian gospodarza i wydają się zmniejszać regiony immunoreaktywności GFAP na obrzeżach jamy zmiany.

Część przeszczepionych NSCS zróżnicowała się w nowe i eksprymujące neurony siedem tygodni po przeszczepie. Ponadto neurony rdzenia kręgowego pochodzące z przeszczepu rozszerzały dużą liczbę aksonów do rdzenia kręgowego gospodarza, wijąc się i rozpieszczająco na duże odległości. Większe powiększenie ujawnia, że aksony pochodzące z przeszczepu rozciągały się zarówno przez istotę białą, jak i istotę szarą w rdzeniu kręgowym gospodarza.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak elektrofizjologia i analiza behawioralna, mogą być wykorzystane do poznania funkcjonalnej łączności przeszczepionych neuronów.