Name: Długotrwałe nasilenie synapsy zakrętu perforacyjnego i zębatego u swobodnie zachowujących się myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę rejestracji długotrwałego nasilenia synapsy (LTP) u swobodnie zachowujących się myszy. Technika obejmuje chirurgiczne implantowanie mikroelektrod w zakręt zębaty i ścieżkę perforacyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować następującym: Dr. Joseph Bronzino, Dr. Khamis Abu-Hassaballah, Mr. R.J. Austin-LaFrance, oraz Pani Jessica Koranda.

Protokół ten jest odpowiedni dla myszy w wieku 3 i 18 miesięcy i przybliżonej masie ciała 30-50 g). Myszy można zdobyć w The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Wszystkie protokoły chirurgiczne i eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Trinity College i były zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie zwierząt i zabiegi chirurgiczne
<ol>
	<li>Przygotuj koktajl znieczulający zawierający ketaminę (25 mg/ml), ksylazynę (2,5 mg/ml) i acepromazynę (0,5 mg/ml). Wstrzyknąć 1 ml/kg masy ciała w prawy dolny kwadrant brzucha, uzupełniając wstrzyknięciami 0,2 ml/kg mc. co 45 minut, aby utrzymać stabilną głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania pedału.</li>
	<li>Przygotuj znieczuloną mysz do operacji, goląc futro na jej czaszce za pomocą golarki elektrycznej. Ogolony obszar powinien obejmować środek oczu do środka uszu. Upewnij się, że nie golisz wąsów, ponieważ są one częścią systemu sensorycznego lufy myszy.</li>
	<li>Użyj bawełnianych wacików, aby nałożyć alkohol izopropylowy, a następnie Betadine na ogolony obszar na głowie. Następnie, również za pomocą wacików, nałóż niewielką ilość oleju mineralnego na oczy, aby zapobiec wysuszeniu gałek ocznych.</li>
	<li>Użyj nausznic dla niemowląt szczurów zamiast zwykłych nauszników, aby zamontować głowę zwierzęcia na aparacie stereotaktycznym ramowym. Aby to zrobić, najpierw zamontuj lewe ucho na lewej mankietzie. Następnie delikatnie przyłóż prawe ucho do prawego mankietu, delikatnie podpierając głowę zwierzęcia jedną ręką i przesuwając nausznik drugą ręką. Następnie umieść poduszkę grzewczą pod ciałem zwierzęcia i ustaw ją na 86 ° F, aby utrzymać temperaturę ciała.</li>
	<li>Następnie sprawdź obustronną sztywność, próbując przesunąć głowę na boki. Zwierzę jest prawidłowo zamontowane na ramie stereotaktycznej, gdy głowa jest sztywna i nie można jej przesuwać na boki, ale można ją łatwo obracać w górę i w dół.</li>
	<li>Delikatnie oprzyj pysk myszy na zespole nosa/paska zębów, upewniając się, że siekacze delikatnie, ale bezpiecznie spoczywają w otworze zęba nosa/paska zębów.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie w linii środkowej, zaczynając od środka oczu do środka uszu. Upewnij się, że skalpel jest trzymany pod kątem 45° i wywieraj wystarczający nacisk, aby przeciąć leżącą pod spodem powięź, ale nie przez czaszkę, ponieważ spowoduje to nadmierne krwawienie.</li>
	<li>Użyj bawełnianych wacików, aby oddzielić powięź i odsłonić czaszkę. Punkty orientacyjne czaszki, bregma i lambda, powinny być wyraźnie widoczne (ryc. 1A). Upewnij się, że zwierzę znajduje się w pozycji płaskiej czaszki, regulując nos / ząb w taki sposób, aby punkty orientacyjne bregma i lambda znajdowały się w tym samym położeniu grzbietowo-brzusznym (DV) (+ 0,1 mm).</li>
	<li>Nałóż niewielką ilość sterylnego soli fizjologicznej na odsłonięty obszar i za pomocą bawełnianych wacików delikatnie wyczyść czaszkę. Następnie odczekaj 2-3 minuty, aż czaszka całkowicie wyschnie na powietrzu, zanim przejdziesz dalej.</li>
	<li>Zamontuj igłę na lewym ramieniu stereotaktycznym, aby zmierzyć pozycję DV bregmy i lambdy. Położenie DV tych dwóch punktów orientacyjnych powinno znajdować się w odległości nie większej niż 0,1 mm od siebie. Jeśli nie, nos ramy stereotaktycznej można regulować w górę iw dół, aby to osiągnąć.</li>
	<li>Umieść igłę na bregmie, aby zarejestrować jej pomiary przednio-tylne (AP), boczne (LAT) i grzbietowo-brzuszne (DV). Upewnij się, że igła dotyka czaszki i nie przebija jej.</li>
	<li>Użyj atlasu mózgu myszy, takiego jak "The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates"1, aby określić współrzędne dla struktur docelowych: przyśrodkowej ścieżki perforacyjnej (mPP) w pęczku kątowym i zakrętu zębatego (DG) hipokampa, względem odpowiednio lambda i bregma (patrz również Tabela 1). Następnie użyj cienkiego długopisu lub ołówka, aby zaznaczyć te punkty na czaszce.</li>
	<li>Zaznacz także dwa dodatkowe punkty po przeciwnej stronie czaszki. Punkty, które będą służyć jako masa (GND) i odniesienie (REF), powinny znajdować się około 3 mm od linii środkowej i być ustawione wzdłużnie względem siebie (rysunek 1A, również tabela 1).</li>
	<li>Usuń znacznik igły z lewego ramienia stereotaktycznego i zastąp go elektryczną wiertarką dentystyczną wyposażoną w uchwyt stereotaktyczny. Umieść wiertło nad każdym zaznaczonym punktem i wykonaj małe otwory w zadziorach o średnicy około 0.5 mm. Podczas wiercenia wykonuj powtarzalne ruchy góra-dół i często sprawdzaj, czy wiertło przebiło czaszkę, aby odsłonić powierzchnię mózgu.</li>
	<li>Delikatnie, ale stanowczo wkręć elektrodę śrubową (#0-80 1/8 cala maszynowe ze stali nierdzewnej, walcowy z rowkiem) w każdym z przeciwległych otworów (GND i REF) tak, aby dotykały tylko powierzchni kory mózgowej, nie penetrując jej (Rysunek 1A). Te dwie elektrody śrubowe służą jako uziemienie i odniesienie.</li>
	<li>Zamontuj elektrody stymulujące i rejestrujące w uchwytach elektrod odpowiednio na lewym i prawym ramieniu stereotaktycznym.</li>
	<li>Podłącz zaciski elektrod stymulujących do stymulatora elektrofizjologicznego z izolacją prądową, a zacisk elektrody rejestrującej do elektrofizjologicznego wzmacniacza różnicowego (wzmocnienie = 1 000, filtr pasmowoprzepustowy = 1 Hz–3 kHz), a następnie do oscyloskopu cyfrowego w celu wizualnej kontroli wywołanych odpowiedzi. Podłącz również zaciski elektrod GND i REF do wzmacniacza różnicowego.</li>
	<li>Delikatnie i powoli opuszczaj elektrody stymulujące i rejestrujące w odstępach co 0,5 mm, jednocześnie monitorując wizualnie wywołaną reakcję na wstrząs bodźcowy o natężeniu 600-800 uA. Kontynuuj opuszczanie każdej elektrody, aż osiągną odpowiednią pozycję docelową DV, a na oscyloskopie zostanie zaobserwowany stereotypowy sygnał (rysunek 1B).</li>
	<li>Następnie użyj dentystycznego cementu akrylowego, aby zrobić nasadkę, która utrzyma końcówki elektrod na miejscu; Cement dentystyczny, który dotknie skóry, powinien być natychmiast zetarty. Gdy cement dentystyczny zostanie całkowicie utwardzony, przenieś zwierzę z ramy stereotaktycznej do czystej klatki dla gryzoni. Użyj ogrzewania lamp lub podkładka, aby utrzymać temperaturę rdzenia.</li>
	<li>Monitoruj zwierzę co godzinę, aż odzyska przytomność. Wstrzyknięcie fluniksyny może być podawane jako środek przeciwbólowy.</li>
</ol>
2. Indukcja LTP
<ol>
	<li>Pozwól zwierzęciu na 5-7 dni na powrót do zdrowia po operacji. Umieść zwierzę w środowisku nagrywającym składającym się z klatki Faradaya (122 cm x 43 cm x 43 cm) wyposażonej w materiał dźwiękochłonny i 5-kanałowego komutatora obrotowego łączącego przewody elektrodowe z zestawem stymulującym/nagrywającym.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu zaaklimatyzować się przez 1-2 godziny w środowisku nagrywania przed podłączeniem elektrod do przyrządów stymulujących i rejestrujących (patrz krok 1.17).</li>
	<li>Ustaw elementy sterujące stymulatora na wyjście 400 uA i zarejestruj amplitudę średnio 10 wywołanych reakcji, upewniając się, że między bodźcami upłynęło co najmniej 10 sekund. Użyj metody pokazanej na rysunku 1C, aby określić ilościowo wywołaną odpowiedź. Powtórz tę procedurę dla 600, 800, 1,000, 1,200 i 1,400 uA.</li>
	<li>Skonstruuj krzywą wejścia/wyjścia, wykreślając średnią amplitudę wywołanej odpowiedzi w funkcji intensywności bodźca. Na podstawie tego wykresu wyznacz intensywność bodźca, która odpowiada 50% zmierzonej maksymalnej amplitudy. Użyj intensywności 50% do końca eksperymentu.</li>
	<li>Następnie, korzystając z 50% intensywności bodźca, uzyskaj linię bazową, rejestrując średnią amplitudę 5 wywołanych reakcji co minutę przez 15 minut. Ponownie upewnij się, że między bodźcami upłynęło co najmniej 10 sekund.</li>
	<li>Następnie dostarczyć stymulację tężcową składającą się z 10 impulsów po 10 impulsów dostarczanych z częstotliwością 400 Hz z częstotliwością impulsu 5 Hz do przyśrodkowej ścieżki perforacji. Uważnie monitoruj zwierzę pod kątem oznak napadu, w tym mokrych potrząsań psa. Jeżeli u zwierzęcia wystąpi napad padaczkowy, doświadczenie powinno zostać przerwane, a wszystkie dane dotyczące tego zwierzęcia powinny zostać wyłączone z wyników badania.</li>
	<li>Następnie kontynuuj rejestrowanie średniej amplitudy 5 wywołanych odpowiedzi co minutę przez 30 minut po tetanizacji. Następnie porównaj tę amplitudę z amplitudą bazową uzyskaną w kroku 2.5, obliczając procentową zmianę w stosunku do wartości wyjściowej (rysunek 2).</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentów zwierzę zostaje poddane eutanazji poprzez inhalację izofluranu – jest to metoda zgodna z wytycznymi dotyczącymi eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynarii.</li>
</ol>

<ol><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).</li>
<li>Bliss, T. V. P., Lomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+anesthetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J. Physiol. 232, 331-356 (1973).</li>
<li>Blaise, J. H., Bronzino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+stimulus+frequency+and+age+on+bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus+of+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats.</a> Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).</li>
<li>Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+isolation+stress+alters+bidirectional+long-term+synaptic+plasticity+in+amygdalo-hippocampal+synapses+in+freely+behaving+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats.</a> Brain Res. 1193, 25-33 (2008).</li>
<li>Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+dentate+gyrus+of+the+awake+freely+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).</li>
<li>Cooke, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophosphorylation+of+alphaCaMKII+is+not+a+general+requirement+for+NMDA+receptor-dependent+LTP+in+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse.</a> J. Physiol. 574, 805-818 (2006).</li>
<li>Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+duration+of+long-term+potentiation+in+the+hippocampus+of+the+freely+moving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse.</a> J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).</li>
<li>Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+hippocampus+of+awake+C57BL%2F6+and+DBA%2F2+mice%3A+interstrain+differences+and+parallels+with+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior.</a> Hippocampus. 11, 391-396 (2001).</li>
<li>Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addictive+nicotine+alters+local+circuit+inhibition+during+the+induction+of+in+vivo+hippocampal+synaptic+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation.</a> J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).</li>
<li>Tang, J., Dani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+enables+in+vivo+synaptic+plasticity+associated+with+the+addictive+drug+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine.</a> Neuron. 63, 673-682 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole zademonstrowaliśmy wiarygodną i prostą metodę badania LTP w DG u swobodnie zachowujących się myszy. Podczas gdy przeprowadzono wiele badań LTP na obudzonych szczurach3,4, bardzo niewiele z nich przeprowadzono na obudzonych myszach, głównie ze względu na złożoność techniczną wynikającą z ograniczonej powierzchni czaszki u myszy i wagi główek elektrod w stosunku do średniej masy myszy5. Kilka badań, które wykazały LTP w DG u swobodnie zachowujących się myszy, wykorzystywało albo system...

Rozwój technologii manipulowania genami doprowadził do powstania transgenicznych i nokautujących mysich modeli prawie wszystkich chorób neurodegeneracyjnych i neurologicznych. Wymagało to przekształcenia technik badań elektrofizjologicznych stosowanych wcześniej u większych gatunków gryzoni na mysi model zwierzęcy. Jedną z takich technik badań neurofizjologicznych jest zastosowanie długotrwałego wzmocnienia (LTP) w celu zbadania skuteczności połączeń synaptycznych w sieciach neuronalnych zaangażowanych w różne zaburzenia neuropatologiczne. Protokół ten opisuje techniki wiarygodnego badania elektrofizjologicznego LTP u swobodnie zachowujących się myszy. Przewagą tego protokołu nad innymi jest to, że jest prosty i łatwy do wdrożenia; Jest również mniej kosztowny, ponieważ nie wymaga stosowania drogich sterowanych komputerowo systemów mikronapędowych ani faz czołowych tranzystorów polowych; i, według naszej wiedzy, jest to pierwszy protokół wideo przewlekłych zapisów elektrofizjologicznych do badania LTP u swobodnie zachowujących się myszy. W tym celu opisujemy w tym artykule proste metodologie badania długotrwałego wzmocnienia u swobodnie zachowujących się myszy. Metodologie te można łatwo przełożyć na transgeniczne i nokautujące mysie modele zaburzeń neuropatologicznych.

<table><tbody><tr><td>Ketamina (100 mg / ml)</td><td>Henry Schein</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (20 mg / ml)</td><td>Henry Schein</td><td>33197</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazyna (10 mg / ml)</td><td>Henry Schein</td><td>2177</td><td></td></tr><tr><td>Akryl dentystyczny w proszku</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>1330CLR</td><td></td></tr><tr><td>Dentystyczny płyn akrylowy</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>1306CLR</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy (0,127 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>TGW0515</td><td></td></tr><tr><td>Rurka podskórna ze stali nierdzewnej (0,286 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>832400</td><td></td></tr><tr><td>Flunixin (50 mg/ml)</td><td>Henry Schein</td><td>14165</td><td></td></tr><tr><td>Epoxilyte</td><td>Superior Essex</td><td>EP 6001-M</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka druciana ze stali nierdzewnej (0,2 mm)</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>792900</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny aparat ramowy</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 902</td><td></td></tr><tr><td>Nauszniki (nauszniki)</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 921</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator elektrofizjologiczny</td><td>Astro-Med, Inc.</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop cyfrowy</td><td>BK Precision Corp.</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Izolator prądowy</td><td>Astro-Med, Inc.</td>Wzmacniacz różnicowy <td>PSIU-6</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>DAM-50</td><td></td></tr><tr><td>Commutator</td><td>Plastics One</td><td>SLC6</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Stoelting</td><td>58650</td><td></td></tr></tbody></table>

długotrwałe nasilenie synapsy zakrętu perforacyjnego i zębatego u swobodnie zachowujących się myszy

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Badania nad długoterminowym wzmocnieniem skuteczności synaptycznej, zależnego od aktywności zjawiska synaptycznego, posiadającego właściwości, które czynią je atrakcyjnym jako potencjalny mechanizm komórkowy leżący u podstaw uczenia się i przechowywania informacji, od dawna są wykorzystywane do wyjaśnienia fizjologii różnych obwodów neuronalnych w hipokampie, ciele migdałowatym i innych strukturach limbicznych i korowych. Mając to na uwadze, transgeniczne mysie modele chorób neurologicznych stanowią użyteczne platformy do prowadzenia długoterminowych badań nad wzmocnieniem (LTP) w celu lepszego zrozumienia roli genów w prawidłowej i nieprawidłowej komunikacji synaptycznej w sieciach neuronowych zaangażowanych w uczenie się, emocje i przetwarzanie informacji. W tym artykule opisano metodologie niezawodnego indukowania LTP u swobodnie zachowującej się myszy. Metodologie te mogą być stosowane w badaniach transgenicznych i nokautujących, swobodnie zachowujących się mysich modeli chorób neurodegeneracyjnych.

Tabela 1 przedstawia współrzędne dla DG i mPP wykorzystane w niniejszym protokole. Rysunek 1A pokazuje oznaczenia struktur docelowych na czaszce; zaznaczono również położenie elektrody uziemiającej i referencyjnej. Rysunek 1B ilustruje reprezentatywne zapisy odpowiedzi wywołanej przed i po tetanizacji u tego samego zwierzęcia. Należy zauważyć, że odpowiedź wywołana po tetanizacji jest większa niż odpowiedź przed tetanizacją, co świadczy o indukcji LTP2. <stron...

Transgeniczne i nokautujące mysie modele chorób neurologicznych są przydatne do badania roli genów w prawidłowej i nieprawidłowej neurofizjologii. W artykule opisano metodologie, które można wykorzystać do badania długotrwałego wzmocnienia, mechanizmu komórkowego, który może leżeć u podstaw uczenia się i pamięci, w transgenicznych i nokautujących, swobodnie zachowujących się mysich modelach neuropatologii.

Długotrwałe nasilenie synapsy zakrętu perforacyjnego i zębatego u swobodnie zachowujących się myszy

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie rejestracji LTP w modelu swobodnie poruszającej się myszy. Osiąga się to najpierw poprzez chirurgiczne implantowanie mikroelektrod do drogi perforującej oraz zakrętu zębatego. Drugim krokiem jest rejestracja podstawowych odpowiedzi wywołanych w zakręcie zębatym w odpowiedzi na stymulację pojedynczym impulsem drogi perforującej.Następnie LTP jest indukowane zgodnie z protokołem stymulacji. Ostatnim krokiem jest rejestracja odpowiedzi postsynaptycznych i porównanie ich z wartościami bazowymi. W rezultacie następuje zwiększenie amplitudy potencjału populacyjnego.Pomiary odpowiedzi wywołanej są wykorzystywane do wykazania sukcesywnej indukcji LTP. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak preparaty skrawkowe in vitro, jest fakt, że model myszy w warunkach swobodnego zachowania stanowi najbardziej istotną fizjologicznie platformę do testowania wpływu leków neurofarmakologicznych lub manipulacji genetycznych na modelach chorób neurologicznych człowieka. Rozpocznij tę procedurę od ogolenia futra na szczycie głowy myszy, od obszaru bezpośrednio nad oczami aż do miejsca tuż przed uszami; upewnij się, aby nie golić wibrysów, ponieważ stanowią one część beczkowego systemu sensorycznego myszy.Następnie należy oczyścić ogoloną okolicę najpierw alkoholem izopropylowym, a potem Betadyną, a następnie za pomocą patyczków watnych nanieść niewielką ilość oleju mineralnego na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu. Przenieś mysz do aparatu stereotaksycznego. Aby zamocować głowę zwierzęcia, użyj uchwytów do uszu dla szczurów noworodkowych zamiast standardowych prętów usznych, zaczynając od zamocowania lewego ucha w lewym uchwycie.Następnie delikatnie nasuń prawe ucho na prawą uchwytkę, podtrzymując głowę zwierzęcia jedną ręką i przesuwając uchwytkę ucha drugą ręką. Po tym czasie umieść pod ciałem zwierzęcia matę grzewczą i ustaw ją na 86 stopni Fahrenheita, aby utrzymać temperaturę ciała. Następnie sprawdź sztywność obustronną, próbując poruszać głową na boki; zwierzę jest prawidłowo zamocowane w aparacie stereotaksycznym, gdy głowa jest sztywna i nie można jej przesuwać na boki, ale może ona swobodnie obracać się w górę i w dół.Następnie oprzyj pyszczek myszy na elemencie stabilizującym zęby i upewnij się, że siekacze spoczywają delikatnie, lecz pewnie w otworze na zęby w belce stabilizującej. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie w linii środkowej, zaczynając od punktu pomiędzy oczami aż do środka uszu. Upewnij się, że skalpel jest trzymany pod kątem 45 stopni i przyłożono wystarczający nacisk, aby przeciąć leżącą poniżej powięź, ale nie czaszkę, ponieważ spowodowałoby to nadmierny krwawienie.Następnie należy użyć patyczków higienicznych do rozdzielenia powięzi oraz zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych, aby odsłonić czaszkę. Punkty orientacyjne czaszki, bgma i lambda, powinny być wyraźnie widoczne. Należy upewnić się, że czaszka zwierzęcia jest wypoziomowana, regulując uchwyt zębów w taki sposób, aby bgma i lambda znajdowały się na tej samej pozycji DV.Następnie oczyścić odsłoniętą czaszkę niewielką ilością sterylnego roztworu soli fizjologicznej i odczekać od dwóch do trzech minut, aż czaszka całkowicie wyschnie przed kontynuowaniem procedury. Po tym zamontować igłę na lewym ramieniu stereotaktycznym, aby zmierzyć pozycje DV dla bgma i lambda.Upewnij się, że odległość między nimi nie przekracza 0,1 millimeter. Jeśli tak nie jest, reguluj wysokość ramienia nosowego stereotypu, przesuwając je w górę i w dół, aż zostanie to osiągnięte. Następnie ustaw igłę na B bgma i zapisz jej pomiary AP L-A-T-N-D-V.Upewnij się, że igła jedynie dotyka czaszki i nie przebija jej. Skorzystaj z atlasu mózgu myszy, aby wyznaczyć współrzędne struktur docelowych względem punktów lambda i bgma. W naszym przypadku są to droga przyśrodkowa perent w pęczku kątowym oraz zakręt zębaty hipokampa.Następnie za pomocą cienkopisu lub ołówka zaznacz te punkty na czaszce. W następnej kolejności zaznacz dwa kolejne punkty po przeciwnej stronie czaszki. Punkty te, które będą pełnić rolę masy, powinny znajdować się około 3 mm od linii środkowej i być rozmieszczone względem siebie wzdłużnie.Następnie należy zdjąć znacznik igły z lewego ramienia stereotaktycznego i zastąpić go elektrycznym wiertłem stomatologicznym wyposażonym w uchwyt stereotaktyczny. Należy ustawić wiertło nad każdym zaznaczonym punktem i wykonać niewielkie otwory o średnicy około 0,5 mm. Podczas wiercenia należy stosować powtarzalny ruch góra-dół, często sprawdzając, czy wiertło przebiło czaszkę, odsłaniając powierzchnię mózgu; następnie należy delikatnie, lecz stanowczo wkręcić elektrodę śrubową w każdy z przeciwległych otworów tak, aby zaledwie dotykała ona powierzchni kory, nie penetrując jej.Te dwie elektrody śrubowe służą jako masa i referencja. Następnie zamontuj elektrody stymulujące i rejestrujące odpowiednio w uchwytach elektrod na lewym i prawym ramieniu stereotaktycznym. Po tym podłącz terminale elektrody stymulującej do stymulatora elektrofizjologicznego z izolacją prądową, a terminal elektrody rejestrującej do wzmacniacza różnicowego sygnałów elektrofizjologicznych, a następnie do oscyloskopu cyfrowego w celu wizualnej oceny odpowiedzi wywołanych.Następnie podłącz terminale elektrody uziemiającej i referencyjnej do wzmacniacza różnicowego, a potem powoli i ostrożnie obniżaj elektrodę stymulującą w kierunku przyśrodkowej drogi perirynsalnej oraz elektrodę rejestrującą w kierunku zakrętu zębatego w przyrostach 0,5 mm, wykorzystując oscyloskop do monitorowania odpowiedzi wywołanej pojedynczym impulsem stymulującym. Powtarzaj stopniowe obniżanie elektrod, aż osiągną one odpowiednie docelowe pozycje DV i na oscyloskopie zostanie zaobserwowany stereotypowy sygnał. Następnie użyj dentystycznego cementu akrylowego do wykonania kapturka, który utrzyma terminale elektrod na miejscu.Każdy cement dentystyczny, który dostanie się na skórę, należy natychmiast usunąć. Po całkowitym utwardzeniu cementu dentystycznego przenieść zwierzę z zestawu stereotaktycznego do czystej klatki dla gryzoni i użyć lampy grzewczej lub podgrzewacza, aby utrzymać temperaturę głęboką ciała. Monitorować stan zwierzęcia co godzinę, aż do odzyskania przez nie przytomności.Iniekcję fuxinu można podać jako środek przeciwbólowy po tym, jak zwierzę miało od pięciu do siedmiu dni na rekonwalescencję po zabiegu chirurgicznym. Umieść je w środowisku rejestracyjnym składającym się z klatki Faradaya wyposażonej w materiał dźwiękochłonny oraz pięciokanałowego komutatora obrotowego łączącego elektrodę z zestawem stymulacyjno-rejestracyjnym. Pozostaw zwierzę w środowisku rejestracyjnym na jedną do dwóch godzin w celu aklimatyzacji przed podłączeniem elektrod do instrumentów stymulujących i rejestrujących.Następnie ustaw sterowniki stymulatora tak, aby generowały prąd o natężeniu 400 µA. Zarejestruj amplitudę średniej z 10 odpowiedzi wywołanych, zachowując co najmniej 10 s odstępu między bodźcami, a następnie powtórz tę procedurę dla natężeń 600, 800, 1000, 1200 oraz 1400 µA. Następnie zastosuj metodę przedstawioną na tej rycinie, aby określić amplitudę odpowiedzi wywołanych.Sporządź krzywą wejście-wyjście, wykreślając średnią amplitudę odpowiedzi wywołanej w funkcji intensywności bodźca. Następnie wyznacz intensywność bodźca odpowiadającą 50% maksymalnej zmierzonej amplitudy i stosuj tę intensywność w dalszej części eksperymentu. Teraz ustal poziom bazowy, rejestrując średnią amplitudę pięciu odpowiedzi wywołanych w każdej minucie przez 15 minut, zachowując co najmniej 10 sekund odstępu między bodźcami.Następnie przeprowadź stymulację tytaniczną w obrębie drogi przyśrodkowej perent. W międzyczasie uważnie monitoruj zwierzę pod kątem objawów napadów drgawkowych, w tym tzw. otrząsów mokrego psa (wet dog shakes). Jeśli u zwierzęcia wystąpi napad drgawkowy, eksperyment należy przerwać, a wszystkie dane uzyskane od tego zwierzęcia należy wykluczyć z wyników badania.Następnie należy kontynuować rejestrację średniej amplitudy pięciu odpowiedzi wywołanych w każdej minucie przez okres 30 minut. Po przeprowadzeniu zabiegu należy porównać tę amplitudę z wcześniej uzyskaną amplitudą wyjściową, obliczając procentową zmianę względem wartości wyjściowej. Przedstawiono tutaj schematyczne rozmieszczenie elektrod na czaszce myszy, a poniżej znajdują się typowe zapisy odpowiedzi wywołanych zarówno przed, jak i po przeprowadzeniu zabiegu.Rysunek ten przedstawia indukcję LTP w synapsie drogi obwodowej przyśrodkowej zakrętu zębatego u myszy w stanie swobodnego zachowania. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje dwie godziny, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Podczas realizacji tego protokołu ważne jest, aby często kontrolować zwierzę w celu zapewnienia utrzymania odpowiedniej głębokości znieczulenia.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania zabiegu stereotaktycznego w celu chronicznej implantacji mikroelektrod, które są następnie wykorzystywane do rejestracji LTP u myszy w warunkach swobodnego zachowania.

long-term-potentiation-perforant-pathway-dentate-gyrus-synapse-freely

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Długotrwała potencjacja ścieżki perforantowej synaps dentatowych w gałęzi wolno zachowujących się myszy

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Źródło: Zhao, Z. i wsp. Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje protokół dostarczania głębokiej stymulacji mózgu o wysokiej częstotliwości do zakrętu zębatego hipokampa myszy, szczegółowo opisując jego wpływ na aktywację neuronów, plastyczność synaptyczną i neurogenezę.

Stymulacja o wysokiej częstotliwości w celu zwiększenia aktywacji neuronów i neurogenezy w zakręcie zębatym myszy

Ten artykuł przedstawia kompletną metodologię przygotowania i konserwacji in vitro ostrych wycinków hipokampa od dorosłych myszy. Protokół ten pozwala na rejestrowanie bardzo stabilnego, długotrwałego wzmocnienia (LTP) przez ponad 8 godzin ze wskaźnikiem sukcesu 95%.

Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Technika zaciskania plastrów jest skuteczną metodą analizy wywołanych uczeniem się zmian wewnętrznych właściwości i plastyczności synaps pobudzających lub hamujących.

Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować niezawodną metodę HFS u myszy. Neurony w zakręcie zębatym hipokampa są stymulowane elektrycznie przez HFS bezpośrednio i pośrednio in vivo. Aktywność neuronalną i sygnalizację molekularną bada się odpowiednio za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego c-fos i Notch1; Neurogenezę określa się ilościowo za pomocą testu znakowania bromodeoksyurydyny.

Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Tutaj opisujemy protokół indukowania długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronów w neuronach przekaźnikowych z grzbietowego bocznego jądra kolankowatego utrzymywanego w wycinkach mózgu ex vivo.

Indukowanie długoterminowej plastyczności wewnętrznej pobudliwości neuronalnej w neuronach grzbietowego bocznego jądra kolębiastego

Aktywność lokomotoryczna (LMA) to prosty i łatwy do wykonania pomiar zachowania u myszy. Sprzężenie oprogramowania do śledzenia wideo (VTS) i LMA pozwala na poprawę swoistości i czułości, zwłaszcza w porównaniu z ręczną metodą analizy LMA polegającą na przekraczaniu linii. Dodatkowo VTS umożliwia długoterminowe śledzenie LMA myszy.

Krótko- i długoterminowa aktywność ruchowa myszy analizowana przez oprogramowanie do śledzenia wideo

Poznaj metodę rejestracji długotrwałego nasilenia synapsy (LTP) u swobodnie zachowujących się myszy. Technika obejmuje chirurgiczne implantowanie mikroelektrod w zakręt zębaty i ścieżkę perforacyjną.

Długotrwałe nasilenie synapsy zakrętu perforacyjnego i zębatego u swobodnie zachowujących się myszy

Przeglądaj więcej filmów